JPH02257888A - 微生物によるパラチノース、トレハルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野］ 本発明はパラチノース（構造式Ｇｌｃα１−６βＦｒｕ
）、トレハルロース（構造式Ｇｌｃａ　１−１βＦｒｕ
）よりなる抗う触性糖源の製造法に関する。

より詳しくは、微生物によるシュークロースカラノバラ
チノース、トレハルロース反ひ両者の混合物の製造方法
に関する。

［従来の技術］ パラチノースはＧｌｃα１−１１１βＦｒｕからなる二
糖類で抗う触性を有する糖である。

また、トレハルロース１±　（ｉｌｃα１−１βＦｒｕ
からなる二糖類で、これも抗う触性を期待できる糖であ
る。

パラチノースは蜂蜜や甘しょ社中に存在しているが、現
在、シュークロースの溶液にプロタミノバクタ−属菌起
源のα−グルコシルトランスフェラーゼを作用させてパ
ラチノースを合成する方法（ドイツ特許第１０４９１１
００号）や、セラチア属菌起源のα−グルコシルトラン
スフェラーゼを作用させてパラチノースを合成する方法
（ドイツ特許第２２１７８２８号）、あるいはまたエル
ヴイニア属微生物による合成法等（欧州特許第１０８９
号）が報告されている。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らはシュークロースを炭素源として微生物の検
索を行ったところ、クレブシェラ属の微生物がパラチノ
ースとトレハルロースを生成することを突き止め１本発
明をするに至った。

本発明は、シュークロースを主炭素源として含む培地に
クレブシェラ居に属する微生物を接種し、好気的に培養
して培養液中にパラチノースとトレハルロースとの混合
物を生成蓄積すること、および培養で得られたクレブシ
ェラ属に属する微生物の菌体または菌体処理物をシュー
クロースを含む液に反応させてパラチノースとトレハル
ロースとの混合物を生成させること、並びにこれらの混
合物からパラチノース、トレハルロースを分離して得ら
れるようにしたその製造方法に係るものである。

本発明において用いる微生物はシュークロースからパラ
チノースおよびトレハルロースを生産する能力を有する
ものであり、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）Ｂ
に属する菌種である。

その−例としてのクレブシェラ番オキシト力（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ　ｏｘ７ｔｏｃａ）Ｓ−８１は上記の特性
を有し、パラチノースおよびトレハルロースを生産する
ものであって１本発明者らにより東京都の土壌から発見
された菌種であり、工業技術院微生物工業技術研究所へ
微工研菌寄第１０８３３　暑として寄託されている。

クレブシェラ　オキシト力（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａａｘ
７ｔｏｃａ）Ｓ〜８１は次ぎの国学的諸性質を有する。

なお、以下に記載の菌学的諸性質は、長谷用武治著：［
微生物の分類と判定Ｊ　（［１７５）に準拠し、また分
類方法は、ｒＢｅｒｇｅ７’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳ
７ｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ！Ｊ　（
１９８４）に準拠して行った。

ａ形態 肉汁寒天培地の生育形態において観察を行った結果は次
ぎのとおりである。

１）細胞の形及び大きさ＝０．８〜０．８ＪＬ　Ｘ　２
〜６１Ｌの好気性桿菌で ある。

２）細胞の多形性　　　：なし ３）運動性の有無　　　：なし ４）胞子の有無　　　　：なし ５）ダラム染色性　　　：陰性 ８）抗酸性　　　　　　：なし ｂ各培地における生育状態 ｌ）肉汁寒天培地培Ａ　　：良好な生育をし、円形で表
面隆起は なだらか、表面ｌ± なめらか、不透明 で色調は黄臼色。

２）肉汁寒天斜面培養　　：良好な生育をし。

表面はなめらか、 不透明で色調は黄 白色。

３）肉汁液体培養　　　　：生育し、全体が混濁状態と
なる。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。

：生育しない。

５）リドマス・ミルク Ｃ生理学的性質 ｌ）硝ｍ塩の還元　　　：陽性 ２ノ脱窒反応　　　　　：陰性 ３）ＭＲテスト　　　　　、陰性 ４）Ｖ　Ｐテスト　　　　：陽性 ５）インドールの生成　：陽性 Ｂ）硫化水素の生Ｊ＆：陰性 ７）デンプンの加水分解：陰性 ８）クエン酸の利用 ：陽性 ９）無機窒素源の利用 二ｍ酸塩、アンモニウ ム塩は陽性 ■） 目） 色素の生成　　　：なし ウレアーゼ　　　：陽性 オキシダーゼ　　：陰性 カタラーゼ　　　：陽性 生育範囲　　　　：最適ＰＨ・　・７．０最適温度・　
・３７℃ １５）酸素に対する態度：好気性 ｌ１ｌ）　０−Ｆテスト　　　：好気的にも、嫌気的に
も糖を分解して酸 を生成。

１７）糖類からの酸及びガスの生成 酸の生成　ガスの生成 １、Ｌ−７ラビノース　　＋　　　　　＋２、Ｄ−キシ
ロース ３、Ｄ−グルコース　　　＋　　　　　　＋４、Ｄ−マ
ンノース ５．０−７ラクトース ６．０−ガラクトース ７、麦芽糖 ８、ショ糖　　　　　　＋　　　　　＋９、乳糖　　　
　　　　＋　　　　　＋ｌＯ，トレハロース １１、　ｏ−ソルビット　　　　＋　　　　　　＋１２
、　Ｄ−マンニット　　　　＋　　　　　　＋１３、イ
ノジット　　　　＋　　　　　＋１４、グリセリン １５、デンプン 但し、十印は生成、−印は不生成。

以上の菌学的性質により本菌株はクレブシェラ・オキシ
ト力（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ）に属す
るものと断定された。

培養法におけるパラチノース、トレハルロース生成に用
いる培地のシュークロースの濃度は５〜４０％の範囲で
使用することができるが、好ましくは２０〜４０％が適
当である。培地にはその他機生物の増殖に必要な窒素化
合物、例えばペプトン、アミノ酸、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム等のいずれを加えてもよく、さらに酵
母エキスや燐酸塩等を加え使用する。

このように調整した培地に前培養しておいたクレブシェ
ラ・オキシト力を接種し、２（１−３７℃、好ましくは
３０℃の温度で好気的条件Ｆにおいて１〜５日間、好ま
しくは２〜３日間振とう培養するとパラチノース、トレ
ハルロースが培地中に蓄積する。

このよう°にして得られたパラチノース、トレハルロー
スを含有する培養液は、高速液体クロマトグラフィーで
示す第１図のように、生成物であるパラチノース、トレ
ハルロースのみであり、ｊｕｌであるシュークロースや
グルコース。

フラクトースその他のオリゴ糖は見られない。

また、パラチノース、トレハルロースの生成比は８：２
から６＝４と培養条件を変えることによって変えられる
。

また、培養によって得られたクレブシェラ・オキシト力
の菌体および菌体処理物によるパラチノース、トレハル
ロースの生成は、シュークロースの濃度が１〜７０％と
かなり広い範囲で使用することができるが、好ましくは
５０％程度が適当である。

反応に使用する菌体はグルコースやシュークロースまた
は他の単糖類、二糖類を炭素源とし、それに微生物の増
殖に必要な窒素化合物（ペプトン、アミノ酸、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム等）や、ミネラルを含む培
地で増殖させた菌体を使用する。

また、得られた菌体および菌体抽出物をアルギン酸カル
シウムやカラギナンなど通常の方法で固定化した・菌体
処理物を使用してもよい。

培養液または菌体反応液を遠心分離やケイ藻土濾過など
の手段によって菌体を除去し、得られた上澄み液または
極液を脱塩、濃縮することによりパラチノースとトレハ
ルロース混合物シロップを得ることができる。

また、結晶化操作によりパラチノースだけを結晶化させ
て容易に分離することも可能である。

パラチノースとトレハルロースとの混合物シロップや晶
析後の蜜からカラムクロマトグラフィーなど公知の分両
手没を適宜利用してトレハルロースやパラチノースのみ
を精製することができる。

かくして得られたパラチノース、トレハルロースはα−
グルコシダーゼによりグルコースとフラクトースに加水
分解されること、インベルターゼにより加水分解されな
いこと、またＮＭＲ分析分析等身種々析結果からパラチ
ノース、トレハルロースと断定した。

本発明において使用されるクレブシェラ属としてはクレ
ブシェラ・オキシト力（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｚｙｔ
ｏｃａ　）が挙げられる。

なお、クレブシェラ属の微生物のパラチノース、トレハ
ルロース生産能については未だ知られていなかった。

［実施例１］ シュークロース 硫酸アンモニウム 酵母エキス Ｈ２ＰＯ５ Ｎａ２ＨＰＯｉ・１２ＨｙＯ ＨｇＳＱａ・７Ｈ２０ ｐＨ ７，０ ３０，０％ ０．２％ ０．０２　％ ０．２％ ０．８％ ０．０５　％ 上記組成の培地１００ｍ　ｌを５００ｍ１容三角フラス
コにとり、別に前培養しておいたクレブシェラ・オキシ
ト力Ｓ−８１（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘ７ｔｏｃａ
　５−６Ｉ；微工研菌寄第１０１１１３３号）の培養液
１腸１を接種し、３０℃で２日間ロータリシェーカーで
振とう培ｍ（１８Ｏｒｐｍ）を行った後、培養液を遠心
分離機にて遠心分離しく１００００ｒｐ■）、菌体と上
澄液とに分けた。

高速液体クロマトグラフィーにより上澄液中のパラチノ
ース、トレハルロースを測定したところ、それぞれ１１
３．０ｇ　、　７．５ｇが検出された（第１図）。

高速液体りａマドグラフィーの条件は以下に示すとおり
である。

ポンプ二日立製作所製　８５５形 カラム：　（ｉｃａ−ＨＥＲにに製　リクロゾルプＮＨ
２（５ル） 検出器：昭和電工製　５Ｅ−５１形　示差屈折計溶離液
ニアセトニトリル：水＝　７０７３０流　　速　＝　１
．０腸１７層ｉｎ 【実施例２］ 実施例１の上澄液１００ｍ　ｌから分取用高速液体クロ
マトグラフィーにより保持時間の小さい方のメインピー
ク（パラチノース画分）を分取し、その後濃縮、凍結乾
燥を行って純度８８％のパラチノース粉末１７ｇを得た
。

分取用高速液体クロマトグラフィーの条件は以下に示す
とおりである。

ポンプ：実施例１のポンプと同じ カラム：山村化学研究所製　ＹＮＣ−Ｐａｃｋ　Ｐ＾−
４３（２０Ｘ２５０腸ｍ） 検出器：実施例１の検出器と同じ 溶離液ニアセトニトリル：水＝　７５＝２５流　　速　
：　　５．Ｏｍｌ／量ｉｎ ［実施例３］ 実施例１の上澄液１００ｍ１から分取用高速液体クロマ
トグラフィーにより保持時間の大きいピーク（トレハル
ロース画分）も実施例２と同じ条件で分取し、その後？
ａ縮、凍結乾燥を行い純度９８％のトレハルロース粉末
５．５８を得た。

［実施例４］ 実施例１の上澄液１００ｍ　ｌをイオン交換樹脂カラム
（アンバーライトＩｌ？４−４１１　、２００）へ通し
て脱増し、減圧濃縮して固形分５０％のシロップ５２ｇ
を得た。

［実施例５］ 実施例１で用いた培地１００ｍ１を５００ｍ１容三角フ
ラスコにとり、別に前培養しておいたクレブシェラ・オ
キシト力Ｓ−８１（Ｋｌｅｂｓｉｓｌｌａ　ｏｘｙｔｏ
ｃａＳＪＩ　；微工斬菌寄第１０８３３号）の培養液１
１を接種し、３０℃で２日間ロータリシェーカーで振と
う培養（１ＢＯｒｐｍ）を行った。

培養終了後遠心分離機にて遠心分離しく＋５００゜ｒｐ
ｍ）、菌体を回収した０回収した菌体を蒸留水５０ｍ１
で２回洗浄後、蒸留水５０１に懸濁した。この菌体懸濁
液にシュークロース５０ｇと１／１５Ｎ燐酸衝撃液（ｐ
Ｈ７，０）５０ｍｌを加え、　３０℃で２０時間反応を
実施した。

反応終了液中を高速液体クロマトグラフィーで測定した
ところパラチノース、トレハルロース凶■のＩｊ！す」 第 図は生成混☆物中ρ成分の高速液体クロトグラ フ ィ ーによる検出値を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュークロースを主要原料とする培地で、クレブ
   シェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属を好気条件下で培養
   してパラチノース、トレハルロースを生成蓄積させ、こ
   の生成物を採取することを特徴とする微生物によるパラ
   チノースとトレハルロースとの混合物製造方法。
2. （２）シュークロースを含む液に、培養によって得られ
   たクレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の菌体およ
   び菌体処理物を反応させてパラチノー ス、トレハルロースを生成し、この生成物を採取するこ
   とを特徴とする微生物によるパラチノースとトレハルロ
   ースとの混合物製造方法。
3. （３）特許請求の範囲第１項及び第２項の方法により製
   造されたパラチノースとトレハルロースの混合物からパ
   ラチノースおよびトレハルロースをそれぞれ分離して採
   取することを特徴とするパラチノース並びにトレハルロ
   ースの製造方法。
4. （４）特許請求の範囲第１項、第２項に記載の微生物が
   クレブシェラ・オキシトカＳ−６１（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
   ｌａｏｘｙｔｏｃａＳ−６１）であるパラチノースとト
   レハルロースとの混合物製造方 法。