JPH06319578A

JPH06319578A - トレハロースの製造法

Info

Publication number: JPH06319578A
Application number: JP6022768A
Authority: JP
Inventors: Hideki Kizawa; 秀樹木沢; Kenichiro Miyagawa; 権一郎宮川; Koyo Kanegae; 幸洋鐘ケ江; Yoshio Sugiyama; 良雄杉山
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-02-21
Publication date: 1994-11-22
Also published as: US5447856A

Abstract

(57)【要約】【目的】トレハロースを大量に製造する方法を提供す
る。【構成】グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含
量が５５mol％以上でありかつ菌体外にトレハロースを
産生する能力を有する細菌を培地に培養することを特徴
とするトレハロースの製造法。【効果】トレハロースを培養上澄中に高濃度に蓄積させ
ることができ、また、トレハロースを容易に分離精製す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるトレハロ
ース（Ｏ-α-D-glucopyranosyl-(1→1)-α-D-glucopyra
noside）の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、微生物、藻類、植物、
動物(昆虫)等広く自然界に存在し、これらの生物にとっ
て、エネルギー貯蔵物質としての役割を果たしているこ
とが知られている。近年、凍結あるいは乾燥時に細胞や
細胞内高分子物質を保護するトレハロースの作用が見い
だされ、これを契機に、食品、医薬品、化粧品等広い分
野で、保存剤としての応用が始まっている。したがっ
て、トレハロースを大量かつ安価に製造することは、産
業上きわめて意義深い。従来、トレハロースの製造法と
しては、パン酵母からの抽出法（ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイエテイ（J. Amer. Chem. S
oc.），７２，２０５９（１９５０））、ハンセヌラ(Ha
nsenula)属に属する子のう菌酵母を用いる方法（ドイツ
特許第２６６５８４号）、リゾクトニア(Rhizoctonia)
属またはスクレロチウム(Sclerotium)属に属するかびか
らの抽出法（特開平３−１３００８４）が知られてい
る。また、菌体外にトレハロースを蓄積する技術とし
て、アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter
praffineus)［アグリカルチュラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.），３３，
１９０（１９６９）］、ノカルディア・ユニフォルミス
(Nocardia uniformis)（特開昭５０−１５４４８
５）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium)属、コリ
ネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリ
ウム（Microbacterium)属またはアルスロバクター（Art
hrobacter)属に属する細菌（特開平５−２１１８８２）
が培養液中にトレハロースを蓄積することが報告されて
いる。しかしながら、上記の菌体内からトレハロースを
抽出する方法においては、培養液当りのトレハロース蓄
積量はその菌体量によって制限されるという問題点があ
った。また、上記の菌体外にトレハロースを蓄積する技
術においては、トレハロースの培養液中の蓄積量は少な
かったり、あるいは用いる主炭素源に制限があったり、
培地の浸透圧を高く保つ工夫が必要であったりして、こ
れらの細菌を用いる方法を用いたとしても、工業的に有
利にトレハロースを製造することはできないという問題
点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、菌体外に大
量にトレハロースを産生する微生物を培養することによ
り、トレハロースを大量に製造する方法を提供すること
を目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは種々研究を行ったところ、グラム陽性
球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ（グアニンおよびシト
シン）含量が５５mol％以上でありかつ菌体外にトレハ
ロースを産生する能力を有する細菌を用いることによ
り、所期の目的を達成することができることを見い出
し、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を完成
した。

【０００５】本発明は、（１）グラム陽性球菌に属し、
そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が５５mol％以上でありかつ菌
体外にトレハロースを産生する能力を有する細菌を培地
に培養しトレハロースを培養液から採取することを特徴
とするトレハロースの製造法、および（２）サイアミン，ｐ−アミノ安息香酸，ニコチンアミ
ドおよびビオチンを同時に生育に要求する性質を有する
ミクロコッカス・バリアンスNo.３９（ＦＥＲＭＢＰ−
４２３８）に関する。上記（１）項の発明の好ましい態
様として、次のものが挙げられる。（３）グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
が５５mol％以上であり、かつ菌体外にトレハロースを
産生する菌がミクロコッカス属に属する菌である上記
（１）項記載の製造法。（４）グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
が５５mol％以上であり、かつ菌体外にトレハロースを
産生する菌がダイノコッカス属に属する菌である上記
（１）項記載の製造法。（５）ミクロコッカス属菌がミクロコッカス・バリアン
スである上記（３）項記載の製造法。（６）ダイノコッカス属菌がダイノコッカス・プロテオ
ロリテイカスである上記（４）項記載の製造法。（７）トレハロースを産生する菌が、炭素源からトレハ
ロースへの変換率が３０％以上である性質を有するもの
を用いる上記（１）項記載の製造法。（８）ミクロコッカス・バリアンスがミクロコッカス・
バリアンス No. ３９（ＦＥＲＭＢＰ−４２３８）であ
る上記（５）項記載の製造法。（９）ダイノコッカス・プロテオロリテイカスがダイノ
コッカス・プロテオロリテイカスＩＦＯ１５３４５で
ある上記（６）項記載の製造法。

【０００６】本発明に用いられる微生物は、グラム陽性
球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が５５mol％以上
であり、菌体外にトレハロースを産生する能力を有する
菌であればいずれでもよい。該菌としては、公知の菌で
あってもよいし、また、新たに土壌、植物等から分離し
た菌株であってもよく、それらがグラム陽性球菌に属
し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が５５mol％以上であり、
トレハロースを菌体外に生産する能力を有するものであ
れば、本発明の製造法に使用できる。

【０００７】好ましい菌株の具体例としては、例えば、
ミクロコッカス・アギリス（Micrococcus agilis）ＩＦ
Ｏ１５３２３、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococc
us luteus）ＩＦＯ３０６７、ミクロコッカス・ルテウ
ス（Micrococcus luteus）ＩＦＯ１２７０８、ミクロ
コッカス・バリアンス（Micrococcus varians）ＩＦＯ
３７６５，ミクロコッカス・バリアンスNo.３９（Micro
coccus varians No.３９）、ダイノコッカス・エリスロ
ミキサ（Deinococcus erythromyxa）ＩＦＯ１５３４
４、ダイノコッカス・プロテオリティカス（Deinococcu
s proteolyticus）ＩＦＯ１５３４５、ダイノコッカ
ス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugnans）Ｉ
ＦＯ１５３４８などが挙げられる。なかでも、ミクロ
コッカス・バリアンスNo.３９、ダイノコッカス・プロ
テオリティカスＩＦＯ１５３４５が好適に用いられ
る。上記のミクロコッカス・アギリスＩＦＯ１５３２
３、ダイノコッカス・エリスロミキサＩＦＯ１５３４
４、ダイノコッカス・プロテオリティカスＩＦＯ１５３
４５およびダイノコッカス・ラジオプグナンスＩＦＯ
１５３４８は、財団法人発酵研究所発行のリサーチ・コ
ミュニケーション（Research Communication）、１９９
３年、に掲載されており、また、ミクロコッカス・ルテ
ウスＩＦＯ３０６７、ミクロコッカス・ルテウスＩＦＯ
１２７０８およびミクロコッカス・バリアンスＩＦＯ
３７６５は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）発行のリス
ト・オブ・カルチャーズ（List of Cultures）第９版、
１９９２年、に掲載されており、これらは、発酵研究所
から入手できる。

【０００８】上記菌株の内、ミクロコッカス・バリアン
スNo.３９（Micrococcus varians No.３９）は、新たに
土壌より分離されたトレハロース生産菌株であり、その
菌学的性質は〔表１〕、〔表２〕および〔表３〕に示す
とおりである。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】

【表３】

【００１２】該ミクロコッカス・バリアンスNo.３９株
と、他のミクロコッカス・バリアンス株（すなわち、ミ
クロコッカス・バリアンスＩＦＯ３７６５、ミクロコ
ッカス・バリアンスＩＦＯ１５３５８）との栄養要
求性を比較した。結果を〔表４〕に示す。なお、〔表
４〕においては、完全培地からその構成成分の一種ない
しは複数を除いた培地における生育の結果を示す。
「＋」は生育を、「−」は生育しない状態を示す。ま
た、〔表４〕におけるカザミノ酸は、バクト・カザミノ
酸（（商品名）、ビタミンテスト：ディフコ社製、米
国）を、核酸塩基混液は、アデニン、グアニン、シトシ
ン、チミンおよびウラシルの混合液を、ビタミン混液
は、サイアミン、リボフラビン、パントテン酸カルシウ
ム、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂、ビオチン、葉酸、ｐ-
アミノ安息香酸、ニコチンアミドおよびイノシトールの
混合液をそれぞれ示す。さらに、該完全培地の組成を、
〔表５〕に示す。上記ミクロコッカス・バリアンスＩ
ＦＯ１５３５８は、発酵研究所発行のリサーチ・コミ
ュニケーション、１９９３年に掲載されている。

【００１３】

【表４】

【００１４】

【表５】

【００１５】〔表４〕は、ミクロコッカス・バリアンス
No.３９、ミクロコッカス・バリアンスＩＦＯ３７６
５およびミクロコッカス・バリアンスＩＦＯ１５３
５８の栄養要求性を示したもので、生育因子をすべて含
む完全培地から、その構成成分の一種ないしは複数を除
去したときの生育を表している。〔表４〕より、No.３
９株は、生育のために、サイアミン、ビオチン、ｐ-ア
ミノ安息香酸およびニコチンアミドの４種のビタミンを
同時に要求する性質を有することが明らかである。上記
のトレハロース生産菌No.３９の性質をバージーズ・マ
ニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）第２
巻１９８６年に従って検索の結果、本菌はミクロコッカ
ス（Micrococcus）属に属し、ミクロコッカス・バリア
ンス（M. varians）に属する新菌株であると同定され
た。

【００１６】本微生物は、１９９３年２月２６日から財
団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ１５４４２とし
て、また、１９９３年３月１０日から通商産業省工業技
術院生命工学工業研究所にＦＥＲＭＢＰ−４２３８と
して寄託されている。

【００１７】本発明方法において用いられる微生物とし
ては、炭素源からトレハロースへの変換率が３０％以上
である性質を有する菌を用いるのが好ましい。なお、該
変換率の上限は、７０％程度までである。さらに、上記
菌株に人為的に変異を誘起させた株であっても、それが
グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が５５
mol％以上であり、トレハロースを菌体外に生産する能
力を有するものであれば、本発明の製造法に使用でき
る。該Ｇ＋Ｃ含量としては、５５mol％以上であり、７
５mol％までである。

【００１８】本発明の製造法を実施するには、まず、上
記の微生物を培地に培養する。培養は、通常の振盪培養
や通気撹拌培養などにより好気条件下で回分式、流加式
あるいは連続式に行うことができる。用いる培地は使用
する細菌が生育しうる通常の組成のものでよく、種々の
炭素源、窒素源を選択することができ、また、これらの
他に無機塩類、アミノ酸類あるいはビタミン類等の生育
必須因子や生育促進物質を添加するのがよい。炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、澱粉、粗糖、廃糖
蜜等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコ
ール類、および各種有機酸類等がそれぞれ単独または混
合して用いられる。これらの炭素源は、所定の濃度にな
るように、初めから培地に添加してもよいし、培養中に
分割添加してもよい。窒素源としては、ペプトン、大豆
粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、
尿素等の有機窒素源の他、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸、燐
酸等のアンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス
などの無機窒素源がそれぞれ単独または混合して用いら
れる。無機塩類としては、カルシウム、カリウム、ナト
リウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛等の硫
酸塩、塩酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩等
を、必要に応じてそれぞれ単独あるいは適宜組み合わせ
て用いられる。本発明に用いられるグラム陽性球菌は、
その生育にニコチンアミド、サイアミン、ビオチン、パ
ラアミノ安息香酸等のビタミンの一乃至は複数を要求す
るので、これらビタミンは培地成分として必須である。
このため、培地にはこれらビタミンもしくはその誘導体
あるいは、これらビタミンを含有する微生物菌体やその
抽出物、肉エキス等の天然有機物が添加される。この他
に、生育を促進する目的で、各種のビタミンやアミノ酸
を必要に応じて添加してもよい。要すれば、用いられる
ミクロコッカス属菌の生育およびトレハロース生産に好
ましい培地成分、およびその濃度が選ばれる。さらに、
培養開始時あるいは培養中に、消泡を目的として培地に
シリコンオイル等の消泡剤を添加するのも効果的であ
る。培地のｐＨは通常約４〜９の範囲がよく、とりわけ
約５〜８の範囲が好ましい。ｐＨをこの範囲に保つため
に、予め培地にリン酸緩衝液や炭酸カルシウムを加えて
おいてもよいし、培養中にｐＨが所定の値を下回った
時、水酸化アルカリ、アンモニア水、アンモニアガス等
を添加して、逆にｐＨが所定の値を上回った時は、塩
酸、硫酸等の鉱酸または酢酸、クエン酸等の有機酸を添
加してｐＨを修正してもよい。培養の温度は、約２０〜
４０℃の範囲から使用する菌株の生育ならびにトレハロ
ースの菌体外蓄積に好適な温度が選択される。培養時間
は、単位培養液量あたりのトレハロースの蓄積量が最大
に達するまで培養すればよく、通常約２日〜２週間でそ
の目的は達成される。

【００１９】以上の方法によって培養を行ったのち、培
養上澄液に生成したトレハロースは通常の公知の菌体分
離、クロマトグラフィー、晶出等の精製方法を組み合わ
せることにより、容易に回収、採取することができる。
すなわち、培養終了後の培養液からの菌体分離は、遠心
分離や、フィルタープレス、限外濾過、セラミック濾過
器等による濾過分離によって行えばよい。得られた上澄
液を、要すれば濃縮したのち、活性炭や陽イオンおよび
/または陰イオン交換樹脂によるカラムクロマトグラフ
ィーに付し、トレハロース画分を集める。この画分をト
レハロースの濃度が約４０〜６０W/V％になるまで濃縮
したのち、エタノール濃度によるトレハロースの溶解度
差を利用して、終濃度が約７０〜９０V/V％になるよう
にエタノールを添加して晶出する。晶出はまた、温度に
よる溶解度の差を利用して水から行うこともできる。得
られた粗結晶が、品質的に不十分な場合は、粗結晶を再
び水に溶解したのち、上記と同様にして再晶出を行い、
精結晶を得ればよい。このようにして、トレハロースの
二水和物の白色結晶を得ることができる。

【００２０】本発明の方法によれば、より効率的にトレ
ハロースを製造することができる。すなわち、炭素源か
らのトレハロースへの転換収率がよいため、培養液当り
のトレハロースの蓄積量は大幅に向上する。従って、ト
レハロースを工業的に大量に生産することができる。ま
た、本発明方法によれば、トレハロースを培養上澄中に
高濃度に蓄積させることができるので、トレハロースを
容易に分離精製できる。

【００２１】このようにして製造されたトレハロース
は、従来公知の用途、例えば甘味料や保存剤としての食
品素材、保湿剤としての化粧品素材、ペプチド製剤にお
ける保護剤，リポソーム製剤における安定化剤、血液製
剤における保護剤、などとして用いることができる。た
とえば、トレハロースを重量にして約０.５から１５％
の濃度で含有させ、高温での乾燥による変性から食品を
保護することに用いられる（特表平２−５０３８６
４）。

【００２２】

【実施例】以下に実施例をもって本発明をより具体的に
説明するが、これらはいずれも本発明の範囲を限定する
ものではない。

【００２３】実施例１日本国茨城県つくば市の土壌から採取した土壌サンプル
０．５ｇを２ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁し、適宜希釈
してその０.１ｍｌをＰ寒天平板培地（バクトペプトン
（登録商標、DIFCO社製）、１.０w/v％，酵母エキス０.
５w/v％，塩化ナトリウム７.５w/v％，グルコース０.１
w/v％および寒天１.５w/v％）に塗布した。この寒天平
板を３２℃で３日間保温した後、生じたコロニーの形態
および菌形を顕微鏡観察しコロニーの色調が淡黄色ない
し黄色である球菌約２００株を選び出し、寒天斜面培地
（トリプチケースソイブロス（登録商標、BBL Microbio
logy Systems : Becton Dickinson and Company社製）
３.０w/v％，グルコース１.０w/v％および寒天２.０w/v
％）に釣菌した。次に、上述の寒天斜面培地に生育した
菌の一白耳を以下の実施例２の〔表６〕の主培地Ａ３０
ｍｌを含む２００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３２℃
で５日間培養後、培養液を遠心し、菌体を分離して上澄
液を高速液体クロマトグラフィー（カラム、Shodex Sug
ar SZ5532（商品名、昭和電工株式会社）；溶離液、ア
セトニトリル：水＝８０：２０(V/V)；流速、１mｌ/mi
n．；温度、５０℃；検出器、示差屈折計）で分析し
た。分析の結果、リテンションタイムが標準として用い
たシグマ社製トレハロースのそれと一致するピークが検
出された株を選び出した。該株は、バージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology）第２巻１
９８６年に従って検索の結果、ミクロコッカス・バリア
ンスに属する菌であると同定された。本菌をミクロコッ
カス・バリアンスNo.３９と称することとした。

【００２４】実施例２以下の〔表６〕に示す種培地Ａ２０mｌを含む２００mｌ
容三角フラスコに、寒天斜面培地（トリプチケースソイ
ブロス３.０W/V％、グルコース１.０W/V％および寒天
２.０W/V％）上に生育したミクロコッカス・アギリス
（Micrococcus agilis）ＩＦＯ１５３２３、ミクロコ
ッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）ＩＦＯ３０
６７、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteu
s）ＩＦＯ１２７０８、ミクロコッカス・バリアンス
（Micrococcus varians）ＩＦＯ３７６５およびミク
ロコッカス・バリアンスNo.３９（Micrococcus varians
No.３９）（ＩＦＯ１５４４２，ＦＥＲＭＢＰ−４２
３８）の一白金耳を各々接種し、ロータリーシェーカ
ー（２００rpm）上で３２℃、１８時間培養した。ただ
し、ミクロコッカス・アギリス（Micrococcus agilis）
ＩＦＯ１５３２３は２４℃で培養した。

【００２５】

【表６】

【００２６】この種培養液の１.５mｌを，上記〔表６〕
に示す主培地Ａ３０mｌを含む２００mｌ容三角フラスコ
に移植し、ロータリーシェーカー（２００rpm）上で３
２℃、５日間培養した（ただし、ミクロコッカス・アギ
リス（Micrococcus agilis）ＩＦＯ１５３２３は２４
℃で培養した）。培養終了液（５ml）を遠心分離（50
00 X g 15 分）により上澄液と菌体に分け、得られた上
澄液中のトレハロース含量を実施例１に記載のそれと同
様の高速液体クロマトグラフィーで測定した。結果を
〔表７〕に示す。

【００２７】

【表７】

【００２８】ミクロコッカス・バリアンスNo.３９の場
合の炭素源からトレハロースへの変換率は、３４％と計
算された。

【００２９】実施例３ミクロコッカス・バリアンスNo.３９（Micrococcus var
ians No.３９）（ＩＦＯ１５４４２，ＦＥＲＭＢＰ−
４２３８）の種培養液を上記実施例２に記載の方法に従
って調製した。その１.５mｌを、上記実施例２の〔表
６〕に示す主培地Ｂ３０mｌを含む２００mｌ容三角フラ
スコに移植し、ロータリーシェーカー（２００rpm）上
で３２℃，４日間培養した。培養終了後、実施例１に記
載した方法で、トレハロース量を測定したところ、培養
上澄液中に１６.７mg/ml のトレハロースが蓄積してい
た。このことから、蓄積されたトレハロースの使用した
炭素源に対する収率（変換率）は５７％と計算された。

【００３０】実施例４上記実施例２の〔表６〕に示す種培地Ｂ２０mｌを含む
２００mｌ容三角フラスコに、寒天斜面培地（トリプチ
ケースソイブロス３.０W/V％、グルコース１.０W/V％
および寒天２.０W/V％）上に生育したミクロコッカス・
バリアンスNo.３９（Micrococcus varians No.３９）
（ＩＦＯ１５４４２，ＦＥＲＭＢＰ−４２３８）の一
白金耳を接種し、ロータリーシェーカー（２００rpm）
上で３２℃、１８時間培養した。この種培養液の１.５m
ｌを、上記実施例２の〔表２〕に示す主培地Ｃ３０mｌ
を含む２００mｌ容三角フラスコに移植し、ロータリー
シェーカー（２００rpm）上で３２℃で培養した。培養
開始後２日目と４日目にグルコースの６０％溶液を各々
１.５mｌずつ添加し１３日間培養を行なった。上記実施
例１に記載した方法で、培養上澄液中のトレハロース量
を測定したところ、３６.０mg/ml のトレハロースが蓄
積していた。炭素源からトレハロースへの変換率は、４
０％であった。

【００３１】実施例５上記実施例４で得られた培養終了液から以下の手順でト
レハロースを精製、採取した。すなわち、培養終了液
２００ml を遠心分離(５０００×ｇ、１５分)して上澄
液を得、この内の１８０ml を活性炭(ＬＨ２Ｃ炭、武
田薬品製)のカラム（３×３０cm）に負荷した。カラム
を蒸留水約８００ｍｌで洗浄したのち、１０V/V％エタ
ノールで溶出を行った。トレハロースを含む画分（３０
０mｌ）を集め、減圧蒸留により１０mｌに濃縮した。こ
の濃縮液に、エタノールを終濃度が８０V/V％になるよ
うに撹拌しながら徐々に加えたのち、４℃で一夜放置し
た。析出した結晶を濾過によって集め、８mlの蒸留水に
溶かし、エタノールを加えて上述操作を再度行い、析出
した結晶を少量のエタノールで洗浄し、６０℃で５時間
乾燥した。このようにして、最終的に４.８ g の白色結
晶を得た。本結晶の比旋光度を測定したところ、［α］
_D ²⁵＝＋１７５.４であり、また熱天秤示差熱分析の結
果、水分含量９.６４％，融点２０６.７℃であった。こ
れらの値は,対照として用いたシグマ社（ＵＳＡ）製ト
レハロース・二水和物（Ｄ(＋)Trehalose dihydrate、c
rystalline、Product Number T5251）の値とよく一致し
た。また、本品の赤外線吸収スペクトルもシグマ社製ト
レハロースのそれと極めてよく一致した。以上の結果か
ら、本結晶がトレハロースの二水和物であることが確認
された。

【００３２】実施例６実施例２の〔表６〕に示す種培地Ａ２０mｌを含む２０
０mｌ容三角フラスコに、寒天斜面培地（トリプチケー
スソイブロス３．０W/V％、グルコース１.０W/V％およ
び寒天２.０W/V％）上に生育したダイノコッカス・エリ
スロミキサ（Deinococcus erythromyxa）ＩＦＯ１５３
４４、ダイノコッカス・プロテオリティカス（Deinococ
cus proteolyticus）ＩＦＯ１５３４５およびダイノ
コッカス・ラジオプグナンス（Deinococcus radiopugna
ns）ＩＦＯ１５３４８の一白金耳を各々接種し、ロー
タリーシェーカー（２００rpm）上で３２℃、１８時間
培養した。この種培養液の１.５ mｌを，実施例２の
〔表６〕に示す主培地Ａ３０mｌを含む２００mｌ容三角
フラスコに移植し、ロータリーシェーカー（２００rp
m）上で３２℃、５日間培養した。培養終了液（５m
l）を遠心分離（5000 X g 15 分）により上澄液と菌体
に分け、得られた上澄液中のトレハロース含量を実施例
１に記載のそれと同様の高速液体クロマトグラフィーで
測定した。結果を〔表８〕に示す。

【００３３】

【表８】

【００３４】ダイノコッカス・プロテオリティカスＩＦ
Ｏ１５３４５の場合の炭素源からトレハロースへの変換
率は、３１％と計算された。

【００３５】

【発明の効果】本発明の方法、即ち、グラム陽性球菌に
属し、そのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量が５５mol％以上であり
かつ菌体外にトレハロースを産生する能力を有する細菌
を培地に培養することによって、培養上澄液中にトレハ
ロースを高濃度に蓄積させることができる。そのため、
トレハロースの分離精製が容易である。このように、本
発明方法は、産業上有用な物質であるトレハロースを、
工業的に大量に、効率良く製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋
Ｃ含量が５５mol％以上であり、かつ菌体外にトレハロ
ースを産生する菌を培地に培養しトレハロースを培養液
から採取することを特徴とするトレハロースの製造法。
【請求項２】グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋
Ｃ含量が５５mol％以上であり、かつ菌体外にトレハロ
ースを産生する菌がミクロコッカス属に属する菌である
請求項１記載の製造法。
【請求項３】グラム陽性球菌に属し、そのＤＮＡのＧ＋
Ｃ含量が５５mol％以上であり、かつ菌体外にトレハロ
ースを産生する菌がダイノコッカス属に属する菌である
請求項１記載の製造法。
【請求項４】ミクロコッカス属菌がミクロコッカス・バ
リアンスである請求項２記載の製造法。
【請求項５】ダイノコッカス属菌がダイノコッカス・プ
ロテオロリテイカスである請求項３記載の製造法。
【請求項６】トレハロースを産生する菌が、炭素源から
トレハロースへの変換率が３０％以上である性質を有す
るものを用いる請求項１記載の製造法。
【請求項７】ミクロコッカス・バリアンスがミクロコッ
カス・バリアンスNo.３９（ＦＥＲＭＢＰ−４２３８）
である請求項４記載の製造法。
【請求項８】ダイノコッカス・プロテオロリテイカスが
ダイノコッカス・プロテオロリテイカスＩＦＯ１５３
４５である請求項５記載の製造法。
【請求項９】サイアミン，ｐ−アミノ安息香酸，ニコチ
ンアミドおよびビオチンを同時に生育に要求する性質を
有するミクロコッカス・バリアンスNo.３９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４２３８）。