JPH0378998B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はイプシロン−ポリ−Ｌ−リシン（以下
εPLと略記する）の製造方法に関する。 （従来の技術とその問題点） εPLは以下の構造式で表されるように、Ｌ−リ
シンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リシンの
カルボン酸とアミド結合で結合した高分子化合物
である。 当該物質は必須アミノ酸であるＬ−リシンのポ
リマーであるので安全性が高くかつカチオン含量
が高いので特異な物性を有する。従つて、それら
の性質を利用してトイレタリー用品、化粧品、飼
料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等
の用途が期待できる。 従来、当該物質はストレプトマイセス属に属す
るεPL産生菌であるストレプトマイセス・アルブ
ラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus subsp.
lysinopolymerus）No.346−Ｄ株（微工研菌寄第
3834号）を培地に培養して、得られる培養物から
分離精製して得られている（特公昭59−20359
号）。 しかし、この先願の菌株では培養液１当りせ
いぜい0.5ｇ程度εPLの生産性しかなく、従つて
生産コストが高く、当該物質の広範な利用が妨げ
られていた。 本発明者らは、εPLを著量に生産する株を得、
これを用いてεPLを多量に製造することを目的と
して研究を重ね、以下に述べる発明に到達した。 （問題点を解決するための手段） 本発明はストレプトマイセス・アルブラス・サ
ブスピーシーズ・リジノポリメラス
（Streptomyces albulus subsp.
lysinopolymerus）菌株をＬ−リシンのアナログ
物質に耐性を有する変異株に変異処理して、得ら
れた該変異株を培地に培養し、培養液中にイプシ
ロン−ポリ−Ｌ−リシンを生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするεPLの製造方法であ
る。 Ｌ−リシンのアナログ物質は、Ｓ−アミノエチ
ル−Ｌ−システイン、または、このＳ−アミノエ
チル−Ｌ−システインにＬ−スレオニン、グリシ
ン、Ｌ−ホモセリンおよびＬ−メチオニンの中か
ら選ばれる一種または数種の物質を添加したもの
が好ましい。 変異株は、ストレプトマイセス・アルブラス・
サブスピーシーズ・リジノポリメラスNo.346−Ｄ
株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインにグリシ
ンを添加したものに耐性をもつ変異株11011A−
１株（微工研条寄第1109号）が好ましい。 以下に本発明を詳細に説明する。 先ず、本発明の菌株の取得方法を述べる。Ｌ−
リシンのアナログ物質に耐性を有する変異株、例
えばＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに耐性変
異株は、例えば以下の方法で取得する。 ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピー
シーズ・リジノポリメラスNo.346−Ｄ株の胞子を
トリス−マレイン酸緩衝液（PH9.0）に懸濁し、
これにＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−N′−ニトロソ
グアニジンを添加する。 これを振とう後、遠心分離機により胞子を集
め、滅菌水で洗浄し、培地に接種し、振とう培養
して菌を生育させる。菌を含む培地（以下、培養
液という）を希釈する。次に、Ｓ−アミノエチル
−Ｌ−システイン、あるいはこれにグリシン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−メチオニン
のアミノ酸類から一種あるいは数種を選んで前記
培地と同じ組成の寒天培地に添加する。 その際、寒天培地１ml当り0.5〜10mg、好まし
くは２mgの濃度になるようにＳ−アミノエチル−
Ｌ−システイン、または同じ濃度になるようにＳ
−アミノエチル−Ｌ−システインと寒天培地１ml
当り0.2〜５mg、好ましくは１mgの濃度になるよ
うに前記アミノ酸類を加えたものを用いる。この
寒天培地に、先の培養希釈液を塗布する。この寒
天培地を保温した後、コロニーとして生育した菌
株がＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異
株である。このとき、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−シ
ステインのみを添加した寒天培地で生育した菌株
が耐性変異株81512株であり、Ｓ−アミノエチル
−Ｌ−システインにグリシンを添加した寒天培地
に生育した菌株が耐性変異株11011A−１株（微
工研条寄第1109号）であり、さらに、Ｓ−アミノ
エチル−Ｌ−システインにＬ−スレオニンを添加
した寒天培地で生育した菌株が耐性変異株81502
株である。 また、プラスミド増幅性変異株は、例えば以下
の方法で取得する。ストレプトマイセス・アルブ
ラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスNo.
346−Ｄ株あるいは、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−シ
ステイン耐性変異株を培地に接種し、振とう培養
した後にクロラムフエニコールを添加し、培養を
続ける。遠心分離して菌体を集め、洗浄した後、
寒天培地に菌を塗布する。静置培養した後、ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus）を含む普通寒
天培地を重層し、さらに培養し生成したブドウ球
菌の生育阻止円の大きな株が、目的のプラズミド
増幅性εPL高生産株、すなわち、プラスミド増幅
性変異株50833株（（微工研条寄第1110号）であ
る。これらの変異株のうち、11011A−１株およ
び50833株の菌学的性質を示すと次の通りである。 (1) 形態学的性質 シユークロース・硝酸塩寒天培地上で30℃、10
日間生育した11011A−１株および50833株の気菌
糸および基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に
示す。 胞子形成菌糸の分枝法および形態：単純分
枝、閉鎖らせん状（closed spiral） 胞子の数：数十個 胞子の表面構造および大きさ：胞子は円な
いし楕円形で大きさは約1.2〜1.5μであり、
その表面構造はスパイニー（Spiny）であ
る。 鞭毛胞子、菌核および胞子のうの有無存在
が認められない。 胞子柄の着生位置：気菌糸上 (2) 各種培地上における生育状態 下記の各種培地上における性状はそれぞれ30
℃で10〜14日間培養後の観察結果である。

【表】

【表】

【表】 生理的性質 11011A−１株および50833株の生理的性質は
次の通りである。 生育温度範囲 約15〜40℃。生育最適温度：30℃付近。 ゼラチンの液化、でん粉の加水分解および
脱脂牛乳のペプトン化：すべて陽性 脱脂牛乳の凝固：陰性 メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地では褐色の色素を生成す
る。 細胞壁組成 細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の
型についてベツカー（Becker）らの方法
〔アプライド・マイクロバイオロジー第13巻
第236頁（1965年）参照〕により分析した結
果、Ｌ，Ｌ型であつた。 (4) 各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴツトリ
ープ寒天培地上） Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−ガラクトース ＋ シユークロース − ラフイノース − Ｄ−マンニトール ＋ ｉ−イノシトール ＋ サリシン − 註）＋：同化する、−：同化しない。 以上記述したように、変異株の菌学的性質は原
菌株であるストレプトマイセス・アルブラス・サ
ブスピーシーズ・リジノポリメラスNo.346−Ｄ株
の菌学的性質と類似している。 次にこれらの方法で得られた変異株を用いて本
発明方法によりεPLを製造する。なお、文中の％
は特に記さないかぎり重量（ｇ）／容量（ml）％
を示す。 まず、得られた変異株を培地に接種して培養
し、培養液から生成蓄積したεPLを分離・精製す
る。培地は炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンが
含まれていれば、いかなるものでもよいが、好ま
しくは炭素源としてブドウ糖５％、あるいはグリ
セリン５％を含み、窒素源として硫酸アンモニウ
ム、あるいはＬ−リシンあるいはペプトンを含む
ものが良い。培養途中で炭素源、窒素源を逐次添
加してもよい。PHは培養初期はPH4.0になるまで
下がるにまかせ、その後水酸化ナトリウム水溶液
等のアルカリでPH4.0を維持するようにしても良
い。培養液から遠心分離機あるいはフイルターで
菌体を除いた後、濾過液を精製・脱色し、これを
濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノール等の
有機溶媒でεPLを晶析する。 （発明の効果） 本発明によれば、ストレプトマイセス・アルブ
ラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス菌株
をＬ−リシンのアナログ物質に耐性を有する変異
株に変異処理し、該変異株を培養することによつ
て公知の菌株を用いるよりも、生産性が改良され
著量にεPLを産生することができるので、εPLの
生産コストを従来に比べて大幅に引き下げること
ができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例につき詳細に述べる。 実施例 １ Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性株の取
得： ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピー
シーズ・リジノポリメラス（Streptomyces
albulus subsp.lysinopolymerus）No.346−Ｄ株の
胞子１白金耳量をトリス−マレイン酸緩衝液（PH
9.0）５mlに懸濁し、これにＮ−メチル−Ｎ−ニ
トロ−N′−ニトログアニジンを1.5mg／mlの濃度
になるように添加した。これを、30分間、30℃で
振とうした後、遠心分離機により胞子を集め、滅
菌水で洗浄し、ブドウ糖５％、硫酸アンモニウム
１％、酵母エキス0.5％、リン酸二水素一カリウ
ム・７水塩0.136％、リン酸一水素二ナトリウ
ム・12水塩0.158％、硫酸マグネシウム・７水塩
0.05％、硫酸亜鉛・７水塩0.004％、硫酸第一
鉄・７水塩0.003％、PH6.8培地（以下第１培地と
呼ぶ）５mlに接種し、一昼夜30℃で振とう培養
し、菌を生育させた。 その培養液をMS溶液（組成は硫酸マグネシウ
ム・７水塩0.05％、塩化ナトリウム0.5％、ツイ
ーン80 0.05％）で500倍に希釈する。次いで、こ
の希釈培養液を、寒天培地１ml当り２mgの濃度に
なるようにＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン、
またはこの濃度になるようにＳ−アミノエチル−
Ｌ−システインおよび寒天培地１ml当り１mgの濃
度になるようにグリシンまたはＬ−スレオニンを
添加した前述の第１培地と同じ組成の寒天培地に
塗布した。この寒天培地を、30℃で48時間保温
し、コロニーとして生育させ、Ｓ−アミノエチル
−Ｌ−システイン耐性変異株を得た。 このうち、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン
のみ添加した寒天培地中の１株が81512株である。
Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システインにグリシンを
添加した寒天培地中の１株が11011A−１株（微
工研条寄第1109号）である。Ｓ−アミノエチル−
Ｌ−システインにＬ−スレオニンを添加した寒天
培地中の１株が81502株である。 εPLの生産： 前記第１培地と同じ組成の培地５mlにＳ−アミ
ノエチル−Ｌ−システイン耐性株81512株を１白
金耳量接種し、30℃で８日間振とう培養した。培
養終了後、培養液中のεPLの濃度をイツアキ
（Itzhaki）の方法で測定した。 その結果を表１に示す。 実施例２および３ Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株
81512株の代わりに、Ｓ−アミノエチル−Ｌ−シ
ステイン＋グリシン耐性変異株11011A−１株
（微工研条寄第1109号）（実施例２）、Ｓ−アミノ
エチル−Ｌ−システイン＋Ｌ−スレオニン耐性変
異株81502株（実施例３）を用いた以外は、実施
例１と同様の方法で培養し、εPLの濃度を同様の
方法で測定した。 その結果を表１に示す。 実施例 ４ プラスミド増幅性変異株の取得： 実施例１で得られたＳ−アミノエチル−Ｌ−シ
ステイン耐性変異株を、実施例１に記載した第１
培地と同じ組成の培地５mlに接種する。 これを30℃２日間振とう培養した後に、クロラ
ムフエニコールを培養液１当り50から500mg、
好ましくは100mgの濃度になるように添加し、さ
らに５から10時間好ましくは８時間培養を続け
る。遠心分離して菌体を集め、滅菌水あるいは生
理食塩水で洗浄した後、第１培地と同じ組成の培
地に寒天1.7％を加えた寒天培地に菌を塗布する。 ８日間30℃で静置培養した後、ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus）を含む普通寒天培地
を重層し、さらに１夜培養し生成したブドウ球菌
の生育阻止円の大きな株がプラスミド増幅性εPL
高生産株である。この中の１株が、50833株（微
工研条寄第1110号）である。 εPLの生産： 得られたプラスミド増幅性変異株50833株を用
いた以外は、実施例１と同様の方法で培養し、
εPLの濃度も同様の方法で測定した。 その結果を表１に示す。 比較例 １ Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株
81512株の代わりに、ストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスNo.
346−Ｄ株を用いた以外は、実施例１と同様の方
法で培養し、εPLの濃度を同様の方法で測定し
た。 その結果を表１に示す。

【表】 実施例 ５ 実施例１に記載した第１培地と同じ組成の培地
1.5に0.05容量％のポリオキシアルキレンゲリ
コール誘導体消泡剤を加え、Ｓ−アミノエチル−
Ｌ−システイン耐性変異株11011A−１株を前培
養した培養液50mlを接種し、600rpm、通気量２
／min、30℃で培養した。 24時間後に、ブドウ糖５％、硫酸アンモニウム
１％を無菌的に添加した。PH低下後、PHが4.0以
下にならないように6N水酸化ナトリウムをPHコ
ントローラーで自動的に連続制御しながら加え
た。培養後、遠心分離機で菌体を除去し培養液中
のεPLをアニオン交換樹脂IRA−402、カチオン
交換樹脂IRC−50、活性炭カルボラフイン50wで
精製して表２に示す結果を得た。 比較例 ２ Ｓ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株
11011A−１株の代わりに、ストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリ
メラスNo.346−Ｄ株を用いた以外は実施例５と同
様の方法で培養し、同様に精製して表２に示す結
果を得た。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ
   ーシーズ・リジノポリメラス（Streptomyces
   albulus subsp.lysinopolymerus）菌株をＬ−リ
   シンのアナログ物質に耐性を有する変異株に変異
   処理して得られた該変異株を培地に培養し、培養
   液中にイプシロン−ポリ−Ｌ−リシンを生成蓄積
   せしめ、これを採取することを特徴とするイプシ
   ロン−ポリ−Ｌ−リシンの製造方法。 ２ Ｌ−リシンのアナログ物質が、Ｓ−アミノエ
   チル−Ｌ−システイン、または、このＳ−アミノ
   エチル−Ｌ−システインにＬ−スレオニン、グリ
   シン、Ｌ−ホモセリン、およびＬ−メチオニンの
   中から選ばれる一種または二種以上の物質を添加
   したものである特許請求の範囲第１項記載の製造
   方法。 ３ 変異株が、ストレプトマイセス・アルブラ
   ス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス
   （Streptomyces albulus subsp.
   lysinopolymerus）No.346−Ｄ株のＳ−アミノエ
   チル−Ｌ−システインにグリシンを添加したもの
   に耐性を持つ変異株11011A−１株（微工研条寄
   第1109号）である特許請求の範囲第１項記載の製
   造方法。