JPS5810074B2 - 新規微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新菌種フラボバクテリウム・アミノゲネスに
関する。

本発明者らは、有機化学的に合成される５−ヒドロキシ
トリプトファンヒダントインを生化学的にＬ−５−ヒド
ロキシトリプトファンに変換させる方法についての研究
の過程において、５−ヒドロキシトリプトファンヒダン
トインをＬ−５−ヒドロキシトリプトファンに変換する
酵素を生産する能力を有するフラボバクテリウム属の新
菌種フラボバクテリウム・アミノグネスに属する菌株を
取得し、本発明を完成した。

本発明のフラボバクテリウム・アミノゲネスに属する微
生物には、例えば本発明者らが土壌より分離したフラボ
バクテリウム・アミノケネスＡＪ３９１２（微工研菌寄
第３１３３号）、およびこれよりＮ−メチル−Ｎ／−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジンに接触せしめて変異誘
導したＡＪ−３９３９（微工研菌寄第３１３４号）およ
びＡＪ−３９４０（微工研菌寄第３１３５号）等がある
。

フラボバクテリウム・アミノゲネスＡＪ−３９１２の菌
学的性質は以下の通りである。

（ａ） 形態 細胞の形および大きさ：桿菌０．３〜０．５ＸＯ，７〜
０．９μ 細胞の多形性：なし 運動性：なし 胞子：形成しない ダラム染色性：陰性 抗酸性：なし くｂ）各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養 コロニーの生育状態：貧弱 コロニーの形状二円形 コロニーの隆起：凸円状からの隆起状 コロニーの円縁：金縁 コロニーの色状ニスドロー色 ■ 肉汁寒天斜面培養 生育状態：適度 表面の状態：円滑 光沢：半透明、内光 形状：糸状 色状：アンバー色 ■ 肉汁液体培養 混濁の程度二適度、均一ににこる 液面の生育：％になし 沈澱：粘質性沈澱を生ず ■ 肉汁ゼラチン穿刺培養二層状に液化する■ リドマ
ス・ミルク：リドマスを還元せず、液化せず、中性 ■ Ｂ、Ｃ，Ｐ、 ミルク：弱酸性、液化せず（Ｃ）
生理学的性質 ■ 硝酸塩の還元：還元する ■ 脱窒反応：陰性 ■ ＭＲテスト：陰性 ■ ｖｐテスト：陰性 ■ インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成：陽性 ■ デンプンの加水分解：陰性 ■ クエン酸の利用： Ｋｏｓｅｒ培地では利用しない
が、ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地では利用する■ 無機
窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩をオリ用し
ない ］ 色素の生成：水溶性色素を生成しない（ロ）ウレア
ーゼ：陰性 に）オキシダーゼ二弱陽性 ０ カタラーゼ：陽性 ［株］ 生育の範囲 生育出来るｐＨ範囲：６〜９ 生育限界最高温度：３４℃ ［相］ 酸素に対する態度：好気性 ［相］ Ｏ−Ｆテスト：オキシテイテイブ＠ 糖類から
酸およびガスの生成 糖 類 酸 ガス （１）Ｌ−アラビノース −− （２）Ｄ−キシロース −− （３）Ｄ−グルコース 〜 −（４）Ｄ−マ
ンノース −− （５）Ｄ−フラクトース − （６）Ｄ−ガラクトース − （７） 麦芽糖 〜（８）ショ
糖 −− （９）乳糖 −− （１０） ）レバロース −（１１）
Ｄ−ンルビット − （１２） Ｄ−マンニット − （１３）イノジット −− （１４）グリセリン − （１５）デンプン −− （１６） Ｄ−リボース −−（［７）Ｌ−
ラムノース −− （１８）ラフィノース − （１９）エリスリット − （２０）ズルシット −− （２１）セロビオース −− （２２）メルビオース − （２３）アトニット − （２４）サリシン −− （２５）エスクリン − ］カゼインの分解性二分解する 。

ＤＮＡの分解性：分解する］ 塩化ナトリウムの耐
性：２％で生育するが５％で生育しない ■ デソキシコレート培地における生育：生育しない ］ 炭水化物の資化性 資化性 （１）パラオキシ安息香酸 − （２）グルコン酸 − （３）酢酸 ＋ （４）乳酸 ＋ （５）グルコース ＋ （６）キシロース ＋（７）ラクト
ース − （８）マンニット ＋（９）プロト
カテコール ＋ ｏＤＮＡのＧＣ％二６９．０％ 以上の菌学的諸性状を基準としてＢｅｒｇｅｙ’ｓＭａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版（１９７４）の分類基準によ
り検索すると、ＡＪ３９１２菌は、■ダラム陰性桿菌、
■非運動性、■好気性、■オキシダーゼ陽性（但し微弱
）、■グルコースを酸化的に徐々に分解する、■カタラ
ーゼ陽性、■集落は黄色であることから、Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍに属する細菌である。

Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に含まれる種について
検索すると、ＡＪ３９１２菌に一致する公知の菌種は見
出せない。

Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ第８版の記載によると
、Ｆ ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の菌種はＤＮＡ中
のＧＣ含量により２つのセクションにわかれていて、セ
クション■はＧＣ含量２６〜４３％、セクション■は６
３〜７０％となっている。

ＡＪ３９１２菌のＧＣ含量は６９％であるのでセクショ
ン■に入る。

セクション■の中には６つの種があげられているが、そ
のうち４種は運動性があり、２種は運動性がない。

ＡＪ３９１２鉋は運動性がないのでＦ。

ｃａｐｓｕｌａｔｕｍおよびＦ、１ｕｔｅｓｃｅｎｓの
何れかに該当すると考えられる。

しかしＦ、ｃａｐｓｕｌａｔｕｍは耐塩性が高く、ゼラ
チンを液化せず、グルコース以外の糖類ラフ）−ス、シ
ュクロース、マルトース、キシロース、ソルビット、ラ
フィノースより酸を生成するのに対し、ＡＪ３９１２菌
は耐塩性が低（、ゼラチンを液化し、クルコース以外の
糖類からは酸の生成が認められない点で相違する。

またＦ、１ｕｔｅｓｃｅｎｓとＡＪ３９１２菌を比較す
ると、Ｆ、１ｕｔｅｓｃｅｎｓは耐塩性が高く、３７℃
で生育し、澱粉を加水分解するが、ＡＪ３９１２菌は耐
塩性が低く、３７℃で生育せず、澱粉を加水分解しない
点で異なる。

以上のことがらＡＪ３９１２菌は Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに属する新菌種と認め、
フラボバクテリウム・アミノゲス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）と命名した。

分離方法：土壌１１をグルコース０．５グ／ｄｌ、ＫＨ
２ＰＯ４０，２グ／ｄｌ、ＭｇＳＯ４・７ａｑ ０．０
１？／ｄｌ、ＦｅＳＯ４・７ａｑ ０１００１１／ｄｌ
、ＭｎＳＯ４・４ａｑ Ｏ，ＯＯ１グ／ｄｌ、ＤＬ−５
−インドリルメチルヒダントイン０．５？／ｄｌ、サイ
アミン塩酸塩０．１ｍ９／ｄｌ、リボフラビ７０．１ｍ
９／ｄｌ、ニコチン酸０．１ｍ９／ｄｌ、パントテン酸
０．１ｍ９／ｄｌ、ｐ−アミノ安息香酸０．０２ｍｇ／
ｄｌ、葉酸０．００１ｍｇ／ｄｌを含む液体培地（ｐＨ
７，０，５０ｍＡ１５００ｍｌフラスコ）に投入し、３
０℃にて５日間振盪培養した。

生育した菌株を、グルコース０．５？／ｄｌ、酵母エキ
ス１．０ｇ／ｄｌ、ペプトン１．Ｏｇ／ｄｌ、ＮａＣ１
０，５？／ｄｌ、寒天２．０ｇ／ｄｌを含む固体培地に
接種し培養して純化、分離した。

本発明の微生物は５−（５’−ヒドロキシインドリルメ
チル）ヒダントインをＬ−５−ヒドロキシトリプトファ
ンに不斉水解する酵素活性を有する。

これらの微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無
機イオン更に必要ならば有機栄養源を含有する通常の培
地である。

炭素源としては、グルコース、キシロース、シュクロー
ス、澱粉の分解物、セルロースの分解物、澱粉、糖蜜な
どの糖類、酢酸、乳酸などの有機酸、；エチルアルコー
ル、メチルアルコール、クリセロールなどのアルコール
類等、資化されるものならば、いづれも使用できる。

窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アン
モニアガス、アミノ酸等か、無機イオンとしては、リン
酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、カルシウム
イオン、カリウムイオン、銅イオン、マンカンイオンそ
の他が適宜用いられる。

有機栄養源としてビタミン、アミノ酸等および、これら
を含有する酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンス
テイープリカー、カゼイン分解物などが適宜用いられる
。

培養は、好ましくは、ｐＨ６〜９．温度２０〜４０℃に
調節しつつ、好気的な条件下に１〜５日行う。

この様にして得られた培養物は、そのまま酵素源として
用いる事ができるが、また粗酵素標品、精製酵素標品は
もちろん、生繭体、またはその処理物（凍結乾燥菌体、
アセトン乾燥菌体、摩砕物。

超音波処理物等）も酵素源として用いる事ができる。

Ｄ−、Ｌ−１もしくはＤＬ−５−ヒドロキシトリプトフ
ァンヒダントインをＬ−５−ヒドロキシトリプトファン
に変換する反応は、上記酵素もしくは、酵素源の存在下
に、温度１５〜７０℃、好ましくは、３０°〜５０℃、
ｐＨ６〜１１、好ましくは７〜１０に保ちつつ行う。

上記の基質濃度は０．１〜５０％、好ましくは０．５〜
１０％であり、必要ならば基質は反応の間、追補添加さ
れる。

かくして５〜１５０時間後には、高い収率で。

著量のＬ−５−ヒドロキシトリプトファンが反応液中に
蓄積される。

Ｌ−５−ヒドロキシトリプトファンの定量は、ペーパク
ロマトグラフィーで展開された該当部分を切りぬき、０
．ＩＮ塩酸で抽出後、２７５ｍμのＵＶ吸収を測定する
事により行なった。

反応生成物が、Ｌ体である事は、生成結晶につき、ＮＭ
Ｒスペクトル、Ｘ線回折スペクトル、液体クロマトグラ
フィー、および比旋光度のデータが、Ｌ−５−ヒドロキ
シトリプトファンのそれらと一致する事により確認した
。

実施例 １ グルコース ０５グ／ｄｌ、酵母エキス１．０グ／ｄｌ
、ペプトン１０グ／ｄβ、食塩０．５？／ｄｌ、ＤＬ−
トリプトファンヒダントイン０．２？／ｄｌを含む培地
（ｐＨ７，０）を５００ｍ１容フラスコに５０ｍ１入れ
１２０℃で１５分間 殺菌した。

これにフラボバクテリウム・アミノケネス ＡＪ−３９
１２を接種し、３０℃で１６時間、振盪培養した。

この培養液より菌体な遠心分離により採取し、培養液と
同量の生理食塩水で一回洗浄した後、培養液と同量の０
．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した。

この懸濁液性５ｍｌに１５ｍｇの亜硫酸ナトリウムおよ
び５０ｍ９のＤ−または、ＤＬ−５−ヒドロキシトリプ
トファンヒダントインを加え、２４時間、３７℃に保持
した。

結果を第−表に示す。

実施例 ２ フラボバクテリウム・アミノゲネス ＡＪ３９１２を実
施例１と同様に培養した。

この培養液より菌体を遠心分離し、培養液と同量の生理
食塩水で一回洗浄し、更に遠心分離して菌体を集めた。

この菌体５０１を３？の亜硫酸ナトリウムおよびＬＯＰ
のＤ−５−ヒドロキシトリプトファンヒダントインな含
む１１のｐＨ８，０のリン酸緩衝液に加え、２４時間、
３７℃に保持した。

反応終了後、遠心分離により菌体を除いた。

上清中には０．７３＠のＬ−５−ヒドロキシトリプトフ
ァンが存在した。

この上清液を分子量１万のメツシュの膜を使用して限外
濾過し、濾液を３０ｍ１に濃縮し、冷却して結晶を得た
。

この結晶を水、エタノール混合溶媒で再結晶し、０．５
３ｇ（取り上げ収率通算７３％）の結晶を得た。

この結晶についてＮＭＲスペクトル、Ｘ線回折スペクト
ル、液体クロマトケラフィー、および比旋光度などのデ
ータからＬ−５−ヒドロキシトリプトファン標品と一致
する事を認めた。

尚、旋光度純度は、９９．２％であった。

実施例 ３ グルコース０．５グ／ｄｌ、硫安０．５グ／ｄｌ、リン
酸−カリウム０．１？／ｄｌ、リン酸二カリウム０．３
グ／ｄｌ、硫酸マグネシウム七水塩０．Ｏ１ｇ／ｄｌ、
塩化カルシウムニ水塩０．ＯＯ１？／ｄｌ、コーンステ
イープリカー５ｍｌ／ｄｌを含む培地（ｐＨ７，０）を
５００ｍ１容フラスコに入れ、１２０℃で１５分間殺菌
した。

これにフラボバクテリアム・アミノゲネスＡＪ３９４０
を接種し、３０℃で１２時間前培養を行った。

一方、上記培地にＤＬ−トリプトファンヒダントイン０
．３５％を添加した培地を調製し、５００ｍ１容フラス
コに５ｏｍｌ入れ殺菌後、上記前培養液を２．５ｍｌ接
種し、３０℃２０時間培養した。

この培養液より菌体を遠心分離により採取し、菌体を培
養液と同量の生理食塩水で一回洗浄した後、培養液と同
量の０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した。

この懸濁液を試験官に５ｍｌ入れ、これに亜硫酸ナトリ
ウム１５ｍ９およびＤＬ−５−ヒドロキシトリプトファ
ンヒダントイン２５０〜を加え１００時間、４０℃に保
持したところ９．Ｉｍ９／ｍｌのＬ−５−ヒドロキシト
リプトファンが生成していた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下の性質を有する新菌種フラボバクテリウム・ア
   ミノゲネスに属する微生物 （ａ）形態 細胞の形および大きさ：桿菌０．３Ｘ０．５Ｘ０．７〜
   ０．９μ 細胞の多形性：なし 運動性：なし 胞子：形成しない ダラム染色性：陰性 抗酸性：なし くｂ）各培地における生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養 コロニーの生育状態：貧弱 コロニーの形状：円形 コロニーの隆起：凸円状からの隆起状 コロニーの円縁：金縁 コロニーの色状ニスドロー色 ■ 肉汁寒天斜面培養 生育状態：適度 表面の状態：円滑 光沢二半透明、内光 形状：糸状 色状：アンバー色 ■ 肉汁液体培養 混濁の程度：適度、均一ににごる 液面の生育二％になし 沈澱：粘質性沈澱を生ず ■ 肉汁ゼラチン穿刺培養：層状に液化する■ リドマ
   ス・ミルク：リドマスを還元せず、液化せず、中性 ■ Ｂ、Ｃ，Ｐ、ミルク：弱酸性、液化せず（Ｃ）生理
   学的性質 ■ 硝酸塩の還元：還元する ■ 脱窒反応：陰性 ■ ＭＲテスト：陰性 ■ ｖｐテスト：陰性 ■ インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成：陽性 ■ デンプンの加水分解：陰性 ■ クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒ培地では利用しないが
   、ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地では利用する■ 無機窒
   素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩を利用しない ■ 色素の生成：水溶性色素を生成しない０ ウレアー
   ゼ：陰性 ０ オキシダーゼ：弱陽性 ０ カタラーゼ：陽性 ０ 生育の範囲 生育出来るｐＨ範囲：６〜９ 生育限界最高温度：３４℃ ０ 酸素に対する態度：好気性 ０Ｏ−Ｆテスト：オキシテイテイブ ０ 糖類から酸およびガスの生成 糖 類 酸 ガス （１）Ｌ−アラビノース −− （２）Ｄ−キシロース −− （３）Ｄ−グルコース ＋ −（４）Ｄ−マ
   ンノース −− （５）Ｄ−フラクトース −− （６）Ｄ−ガラクトース −− （７）麦芽糖 −− （８）ショ糖 −− （９）乳糖 −− （１０） ）レバロース −−（１１）
   Ｄ−ソルビット −−（１２） Ｄ−マンニ
   ット −−（１３）イノジット − （１４）グリセリン −− （１５）デンプン −− （１６）Ｄ−リボース −− （１７）Ｌ−ラムノース −− （１８）ラフィノース −− （１９）エリスリット −− （２０）ズルシット −− （２１）セロビオース −− （２２）メルビオース −− （２３）アトニット −− （２４）サリシン −− （２５）エスクリン − ０カゼインの分解性：分解する ］ ＤＮＡの分解性二分解する ＠ 塩化ナトリウムの耐性：２％で生育するが５％で生
   育しない ■ テンキシコテート培地：生育しないにおける生育 ］ 炭水化物の資化性 資化性 （１）パラオキシ安息香酸 − （２）グルコン酸 − （３）酢酸 十 （４）乳酸 ＋ （５）グルコース ＋ （６）キシロース ＋ （７）ラクトース −（８）マンニ
   ット ＋ （９）グロトカテコール ＋ ］ ＤＮＡのＧＣ％：６９．０％