JPS6328385A - 微生物菌体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な細菌を使用して、その細菌菌体を製造
する方法に係わる。

従来、微生物菌体自体を得るため、または、敵へ生物菌
体から有用物質を製造するために、微生物を工業的に培
養する必要があるが、この培養における炭素源として、
一般に糖蜜および亜硫酸バルブ廃液などの天然物ならび
に天然物に由来する糖類などが使用されてきた。しカル
ながら、これらの天然物は工業原料としては供給が不安
定であって、定常的に多量入手しうるとは限らず、また
、価格の変動の幅が大きく、また、その頻度が多く問題
があった。そこで、これらの天然物を資化しうるが、天
然物以外にもメタノールおよびエタノールなどの合成有
機化合物をも資化しうる微生物を発見腰これを使用でき
れば、微生物菌体および微生物菌体からの有用物質を安
定して製造することが可能となる。

〔従来技術１発明が解決しようとする問題点〕メタノー
ル資化性を有する微生物としては、多くのダラム陰性メ
タノール資化性細菌が報告されている（たとえば、醗酵
工学会誌　第６４巻　第２号　第９９〜１１４頁　１９
８６年）。しかしながら、メタノール資化性細菌の中で
ダラム陽性の細菌は、はとんど知られてない。

〔問題を解決するための手段１作用〕 本発明者は、多くの微生物を探索して、たとえば糖類な
どの天然炭素源および、たとえば、メタノールなどの合
成炭素源の両者を責化しうる新種の細菌を発見して本発
明に到達した。

すなわち、本発明は　ミコバクテリウム属に属しメタノ
ールを資化しうる細菌を、培地成分として該細菌が資化
しうる炭素源を少なくとも含有する培地に培養して得ら
れた培養液から該細菌の菌体を分離することを特徴と微
生物菌体の製造方法である。

本発明における細菌は、ミコバクテリウム属に属し、炭
素源として少なくともメタノールを資化しうる細菌であ
れば特に制限はないが、本発明者が発見した新菌種を使
用することが好ましい。この新菌種はその菌学的性質に
よれば、ミコバクテリウム属に属する細菌とみられるが
、ミコバクテリウム屈に属する公知の菌種と比較した場
合に種々の点で相違があり、新菌種と断定され、ミコバ
クテリウム　メタノリカ（Ｍｙｃ＊ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｍｅｔａｎｏ−１ｉｃａ）と命名された。

この新菌種に属する細菌のうち代表的な菌株であるミコ
バクテリウム　メタノリカＢＴ−８４（？＆工研菌寄第
８８２３号）、同ＢＴ−１４３（微工研菌寄第８８２４
号）、同Ｐ−２３（微工研菌寄第８８２５号）、同Ｐ−
２６（微工研菌寄第８８２６号）および同Ｐ−８５（微
工研菌寄第８８２７号）のそれぞれの菌学的性質を示す
。

菌学的性質 （１）顕微鏡的形態 肉汁液体培地および肉汁寒天培地で３７°Ｃで３日間培
養した。

■　細胞の形状および大きさ 通常は短桿菌。幅０．５〜０．８μ、長さ１〜３μ。Ｖ
型の分裂細胞が認められる。

■　運動性　　　　なし。

■　胞子の有無　　生産されない。

■　グラム染色　　グラム陽性 ■　抗酸性　　　　陽性 （２）各種の培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養　３７℃で３日間培養。

中程度の生育を示す。

コロニーの形状：外形は円形、大きさは２〜３ｍ、隆起
は半球状、構造は均質９表面は粗面２辺縁は波状１色は
黄白色で光沢なし、透明度は不透明、硬度はバター質。

■　メタノール含有寒天平板培養 ３７°Ｃで３日間培養。

肉汁寒天平板培養と同じ。

■　肉汁寒天斜面培養 ３７℃で３日間培養。

接種線に一様に中程度な生育を示す。

隆起は中程度２表面は粗面２辺縁は波状。

色は黄白色で光沢なし、透明度は不透明。

硬度はバター質。

■　メタノール含有寒天斜面培養 ３７℃で３日間培養。

肉汁寒天斜面培養と同じ。

■　肉汁液体培養　３７℃で３日間培養。

白クリーム色の画壇を形成する。また、皮膜を形成する
。

■　ペプトン水液体培養　３７°Ｃで３日間培養。

肉汁液体培養と同じ。

■　メタノール含有液体培養 ３７℃で３日間培養。旺盛に生育する。

白クリーム色の画壇を形成する。また、皮膜を形成する
。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０℃で４週間培養。

生育する。しかし、ゼラチン液化性はない。

■　リドマスミルク培養　３７℃で４週間培養。

生育し、培養液はアルカリに変化（ｐＨ６，８−ｐＨ８
，３）するが、ペプトン化はしない。

＠ｌ　１％小川培地培養　３７℃で３日間培養。

旺盛に生育する。集落性状はスムースであある。

■　ＨＡ培地（塩酸ヒドロキシルアミン５００μｇ／ｍ
ｌ添加１％小川培地）培養 ３７℃で５日間培養。

旺盛に生育する。

＠　　ＰＡＳ培地（パラアミノサリチル酸ナトリウム２
　ｍｇ　／　ｍ　ｅ添加１％小川培地）培養３７℃で７
日間培養。

旺盛に生育し、培地が黒変する。

Ｐ−２３株のみ培地の黒変はみられない。

■　ピクリン酸培地（０，２％ピクリン酸添加変法５ａ
ｕｔｏｎ寒天培地）培養 ３７℃で２週間培養。

旺盛に生育し、培地が赤褐色となる。。

Ｐ−２３株のみ培地が赤褐色にならない。

■　ＰＮＢ培地（パラニトロ安息香酸５００μｇ／１Ｔ
ｌｌ添加１％小川培地）培養 ３７°Ｃで７日間培養。

旺盛に生育する。

■　ＥＢ培地（エタンブトール５μｇ／ｍｅ添加１％小
川培地）培養 ３７°Ｃで７日間培養。

旺盛に生育する。

（３）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元 硝酸塩を亜硝酸塩に還元する。

■　ＭＲテスト　　　　　　陰性 ■　ｖｐテスト　　　　　　陰性 ■　インドールの生成　　　陰性 ■　硫化水素の生成　　　　陽性 ■　でんぷんの加水分解　　陰性 ■　窒素源の利用 アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、およびペプトンを窒素
源として利用する。

■　色素の生成　　　　　　生成しない。

■　ウレアーゼ　　　　　　陽性 ［相］　カタラーゼ　　　　　　陽性 ■　アンモニアの生成　　　生成する。

＠　脱窒反応　　　　　　　陰性 ■　オキシダーゼ反応　　　陰性 Ｑ　　Ｏ−Ｆテスト　　　　　陰性 ■　生育の範囲 ｐＨ５〜９の範囲で生育する。ｐＨ６〜８が好ましい。

５℃、４３℃で生育しない。２５〜４０’Ｃが好ましい
。

［相］　酸素に対する態度　　　好気性０　耐塩性 ３重蓋％ＮａＣ１含有培地で旺盛に生育する。

６重量％ＮａＣ１含有培地で、ＢＴ−８４，ＢＴ−１４
３株は弱く生育するが、Ｐ−２３、Ｐ−２６、Ｐ−８５
株は生育しない。

［相］　ビタミン要求性　　　　なし ■　光発色試験　　　　　　陰性 ■　暗発色試験　　　　　　陰性 ■　ツイーン８０水解試験　　陰性 ［相］　ミコール酸の含有　　　陽性 ０ＧＣ（グアニン＋シトシン）含量 ＢＴ−８４６６，２ｍｏ１％ ＢＴ−１４３６６，２ｍｏ１％ Ｐ−２３６７，２ｍｏ１％ Ｐ−２６６６，８ｍｏ１％ Ｐ−８５６８，７ｍｏ１％ ［相］　主要な菌体脂肪酸組成物 直鎖脂肪酸　　　　Ｃ１６＋。

モノ不飽和脂肪酸　Ｃ＋　ｂ　：　＋　＋　　Ｃ＋　１
１　＋　１１０メチル脂肪酸　　１０−ｍｅｔｈｙｌ　
Ｃ１９：。

０　キノンタイプ　　　メナキノン　ＭＫ−９（Ｈｚ）
［相］　細胞壁の構造　　　ｍｅｓｏ−ジアミノピメリ
ン酸を含有する。

［相］　分離源　　　　　　土壌 バージイズ　マニュアル　オブ　デターミネイティブ　
バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）第８版〔績集者ブフキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ）
　、ギボンズ（Ｇｉｂｂｏｎｓ）　＋コワン（Ｃｏｗａ
ｎ）　、ボルト（）ｌｏｌｔ）、　　リストン（Ｌｉｓ
ｔｏｎ）。

ムレ−（Ｍｕｒｒａｙ）　＋−イヴン（Ｎ　ｉ　ｖｅｎ
）　＋ラヴイン（Ｒａｖｉｎ）およびスタニイア（Ｓｔ
ａｉｎｉｅｒ）　：ウィリアムズ　アンド　ゥィルキン
ス社（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、　（１
９７４））によると、これらの菌株は、桿菌であり、運
動性がなく、ダラム陽性であり、抗酸性であり、ミコー
ル酸を含有し、好気的であることから、ミコバクテリウ
ム属（Ｍｙｃｏｂａｃ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）に属するもの
と判断した。このことは、ＧＣ含量。

菌体脂肪酸組成、キノン・タイプおよび細胞壁の構造の
点からも支持される。

しかしながら、ミコバクテリウム属に属する公知の菌種
と比較すると、メタノールをはじめとする各々の炭素源
の資化性、炭素化合物からの酸の生成、耐塩性、生育温
度などの点から一敗するものは見当たらない。また、ミ
コバクテリウム属に属する細菌でメタノール資化能を有
する細菌は見出されてはおらず、この新菌種が最初であ
る。

実験方法は前記のバージイズ　マニュアルおよび医科学
研究所学友会編「細菌学実習提要Ｊ　（１９５８）に従
った。

また、メタノール含有寒天平板培地、メタノール含有寒
天斜面培地として次の組成のものを使用した。すなわち
、（ＮＨ＜）ｚｓＯａ　３ｇ、　ＫＨｚＰＯａ　１．４
ｇ。

％ａＪＰＯ４２，１ｇ＋　ＭｇＳＯ４・７１１ｚ００．
２ｇ、　ＣａＣ１ｚ−２１（ｚ。

３重ｍｇ、　ＦｅＣｂＨ５０ｔ・ｘＨｚｏ　３０ｍｇ、
　ＭｎＣ１ｚ−４！（ｚｏ　５ｍｇＺｎＳＯ４−７Ｈｚ
０５ｍｇ、　ＣｕＳＯ４・５Ｈｔ００．５ｇおよびディ
フコ（Ｄｉｒｃｏ）社製寒天（バクトアガ−Ｂａｃｉｏ
−ａｇａｒ）１５ｇを純水ＩＥに溶解し、これをｐｌ（
７，１に調整し１ｋｇ　／　ｃｔｌ　Ｇで２０分間殺菌
したのち、メタノール１０ｇを無菌的に添加し、平板培
地あるいは斜面培地を形成し、また、メタノール含有液
体培地としては、前記の培地において、寒天を添加しな
いものを用いた。

分離源の土壌からのこの新凹種に属する細石の分離は、
前記のメタノール含有寒天平板培地を用い常法で行った
。

本細菌（本発明で使用される細菌　以下同様）の培養に
使用する培地は、本細菌が資化し得る炭素源を少なくと
も含有していることを要し、さらに適量の窒素源および
無機物などを含有する培地ならば合成培地および天然培
地のどちらでもよい。

炭素源としては、本細菌が資化しうる炭素源であれば特
に制限はないが、メタノール２エタノールなどの合成炭
素源を好適に使用しうるが、その他の炭素源−たとえば
、グルコース、フラクトース、ソルビトール、マンニト
ールおよびイノシトールなどの糖類、糖蜜、ペプトンお
よび酵母エキスなどの糖含有物などの天然物、また、こ
はく酸などの有機酸なども使用することができる。これ
らのうち、工業用の酩酵原料としては、メタノールが最
も好ましい。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素
源の種類により適宜選択される。たとえば、培養液のメ
タノールのイ；度は６重里％以下が好ましく、菌の生育
および増殖の良好さからは３重量％以下が好ましい。

窒素源としては、たとえば、アンモニウム塩。

硝酸塩などの無機窒素化合物および／または、たとえば
、尿素、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン、ペプ
トン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用
いられる。

また、無機成分としては、たとえば、カルシウム塩、マ
グネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、りん酸塩、
マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩。

モリブデン塩、コバルト塩、はう素化合物およびよう素
化合物が用いられる。

培養条件は、温度２０〜４２°Ｃ１好ましくは２５〜４
０’Ｃ，ｐＨ５〜９．好ましくは６〜８である。このよ
うな条件で好気的に培養を行う。これらの条件をはずれ
て培養した場合には、本細菌の増殖は悪くなるが、これ
らの条件をはずして培養することを妨げない。

また、培養液の溶存酸素４度には特に制限はないが、通
常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通
気量を調節したり、攪拌したり、酸素を使用したり、ま
た、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。

また、培養方式は、四分培養または連続培養のいずれで
もよい。

窒素源としてアンモニウム塩を使用した場合には、培養
期間中にアンモニアが菌体生成のために消費されて培養
液のｐＨが低下する。この場合に、培養液のｐｉ（を所
定の値に保つために、アンモニア。

苛性カリ、苛性ソーダなどのアルカリを添加することが
好ましい。

このようにして、細菌を培養したのち、菌体を培養液か
ら分離する。分離には通常の固液分離手段が採用される
。たとえば、培養液そのものをそのまま遠心分離すると
の手段、培養液中に本細菌よりも大きい他の微生物の細
胞を濾過助剤として加えたり、あるいは、プレコートす
ることにより培養液から菌体を濾過分離するとの手段、
培養液に種々の凝集剤を加えて菌体を凝集させてこれを
°濾過あるいは遠心分離により培養液から菌体を分離す
るとの手段、培養液のｐＨを５以下にすることにより、
あるいは、ｐＨを５以下にしさらに５０〜１００°Ｃで
加熱することにより菌体を凝集させ、これを°濾過ある
いは遠心分離にかけ菌体を分離するとの手段などを適用
しうる。分離された菌体は、さらに必要に応じて各種の
有機溶剤あるいは水で洗浄され湿潤菌体を得る。湿潤菌
体はそのまま、もしくは乾燥され、またはさらに種々の
処理がほどこされた後、たとえば、飼料などとしてｆｉ
ｌ用されるほかに、たん白質樹脂、糊剤およびたん白質
泡消火剤などのそれぞれの原料として使用しうろことは
通常の微生物菌体と同様である。また、得られた菌体か
ら、補酵素、酵素、核酸、ビタミン類。

たん白質または脂質などの菌体に含有されている物質が
、単独の物質として、またはこれらの相互の混合物とし
て抽出され、食品、医薬品、飼料。

飼料添加剤および工業原料などに有効に使用される。

なお、本発明で得られた菌体はミコール酸もしくはその
誘導体の原料として好適に使用される。

また、有効成分を抽出したのちの廃菌体も、通常の微生
物の廃菌体と同様に飼料および肥料などとしてならびに
たん白質樹脂、糊剤およびたん自進消火剤などの原料と
して使用しろる。

〔実施例〕

実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。なお
、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ 純水１１あたり、メタノール１０　ｇ　、ＫＨｚＰＯａ
　１．４　ｇ　。

（Ｎｌ（４）　２Ｓ０４３　ｇ　、ＮａｚＨＰＯａ　２
．１　ｇ　５Ｍｇ５Ｏａ４ＨＪ　Ｏ，２ｇ　。

ＦｅＣ６Ｈ５０ｔ・ＸＨｚＯ３０ｎＷ、ＣａＣＩｚ・２
Ｈｚ０３０　ｍｇ、ＺｎＳＯ４゜７Ｈ２０５ｍｇ、Ｍｎ
ｃｌｚ−４Ｈｚ０５ｍｇおよびＣｕ５Ｏ＜、５１１ｚ０
０．５■を溶解し、ｐＨ７，１に調整した培地（培地Ａ
）３０ｍｌを１００ｍ　Ｉｌ！容三角フラスコに分注し
、１２０’Ｃで２０分間殺菌した。培地Ａに寒天１５ｇ
／６を添加したメタノール含有寒天斜面培地で２８°Ｃ
で３日間培養したミコ）Ｎクテリウム　メタノリカＢＴ
−８４の１白金耳を、１００ｍ　！！容三角フラスコ中
の培地Ａ３０ｍ／に接種し３０°Ｃでロータリー・シェ
ーカーで回転数２２０回／分の回転を与え４日間培養を
行った。

この培養液５ｍｊ！を、１β容三角フラスコに入れて殺
菌した前記の培地Ａ　２００ｍρに接種して、３゜°Ｃ
で４日間ロータリー・シェーカーで回転数２２０回／分
の回転振とう培養を行った。この培養液を種ＦＯ，液と
した。

工業用水１ｐあたり（ＮＨ１４）　ＺＳＯ４１ｇ　、　
ＭｇＳＯ４’７Ｈ２０１，５ｇ　、ＫＨ２ＰＯ４４，５
ｇ　、ＦｅＣ４Ｈ５０７・ｘＨｚｏ　３０ｗ、ＣａＣ１
ｚ、２１１ｚＯ９０ｍｇ、ＺｎＳＯ４４Ｈｚ０１５ｍｇ
１ＭｎＣ１ｚ、４）１ｚ０１５ｍｇ。

ＣｕＳＯ４・５ｔｌｚ０１５１１Ｗ、（ＮＨ４）８ＭＯ
７ｏｚｎｌｌｌｚｏ　１．Ｏｍｇ＋Ｃｏｃ＋ｚ−２１１
Ｚｏ　１．Ｏｍｇ、ｔｌ：＋ＰＯｔ　１．ｏｍｇ、Ｎａ
Ｃ１５０ｍｇおよびＫｌ　１．０■を含みｐＨ７，０に
調整した培地（培地Ｂ）１５７！を３゜２容培養槽に入
れ、殺菌後、メタノール３０ｇおよび種母液２００ｍβ
を添加した。細菌が増殖するに従って培養液中のメタノ
ール濃ＪＦは低下したが、排ガス中のメタノール濃度を
連続的にガスクロマトグラフィで分析することにより、
培養液中のメタノール濃度を検知し、培養液中のメタノ
ール濃度が０．０５〜０．１５呵χになるように、メタ
ノールを補給した。培養温度３０’Ｃ，培養ｐＨ７，０
，撹拌機の回転数８００回／分および通気量１νｖｍで
通気（空気を使用）撹拌培養を行った。培養開始から５
５時間後に、培養液を遠心分＾鍾して生菌体３８０　ｇ
　（乾物換算７６ｇ）を得た。

実施例２ 純水１βあたりグルコース１０ｇ、ペプ）ンｌＯｇ。

酵母エキス１０ｇおよびＮａＣｌ　５ｇを溶解し、ｐＨ
７，０に調整した培地（培地Ｃ）３０ｍ１２を１００ｍ
　Ｎ容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで２０分間殺
菌した。培地Ｃに寒天１５ｇ／βを添加した寒天斜面培
地で３０°Ｃで３日間培養したミコバクテリウム　メタ
ノリカＢＴ−１４３の１白金耳を、１００ｍβ容三角フ
ラスコ中の培地Ｃ３０ｍｆｆ１に接種し、３０℃でロー
タリー・シェーカで回転数２２０回／分の回転を与え、
２日間培養を行った。

１で容三角フラスコに入れて殺菌した培地Ｃに、この培
養液５ｍＡを接種し、３０゛Ｃで２日間ロータリー・シ
ェーカで回転数２２０回／分の回転振とう培養を行った
。

工業用水ｌβあたりグルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ
、酵母エキス１０ｇおよびＮａＣｌ　５ｇを含みｐＨ７
，０に調整した培地１５ｍ　ｌを３０！容培養ぽに入れ
殺菌後、種母液２００ｍ　ｌを添加した。培養温度３０
°Ｃ９培養ｐｉ（７，０，攪拌機の回転数８００回／分
および通気量１ｖｖｎ＋で、攪拌培養を行い、培養開始
から３８時間後に培養液を遠心分離し、生菌体５８０ｇ
（乾物ＦｆＡ算８２ｇ）を得た。

実施例３・ ミコバクテリウム　メタノリカＰ−２３を使用し、かつ
、培地Ｂでの培養時間を５０時間とした以外は、実晦例
１と同様にして培養し、生菌体４００ｇ（乾物換算８０
ｇ）を得た。

実施例４ ミコバクテリウム　メタノリカＰ−２６を使用し、かつ
、培地Ｂでの培養時間を５２時間とした以外は、実施例
１と同様にして培養し、生菌体３６０　ｇ　（乾物換算
７２ｇ）を得た。

実施例５ ミコバクテリウム　メタノリカＰ−８５を使用し、かつ
、培地Ｂでの培養時間を５０時間とした以外は、実施例
１と同様にして培養し、生菌体４１０ｇ（乾物換算８２
ｇ）を得た。

〔発明の効果〕

本発明によれば、微生物菌体の工業生産において、安定
して容易に入手しうる物質をも原料として使用すること
ができ、しかも、種々の有用物質の原料である菌体を、
安価に、安定的に得ることができる。

特許出願人三菱瓦斯化学株式会社 代表者　長野　和書

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ミコバクテリウム属に属しメタノールを資化しうる細菌
   を、培地成分として該細菌が資化しうる炭素源を少なく
   とも含有する培地に培養して得られた培養液から該細菌
   の菌体を分離することを特徴と微生物菌体の製造方法