JPH012592A - ピロロキノリンキノンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ピロロキノリンキノンの製造法に関し、さら
に詳細には、細菌を使用したピロロキノリンキノンの製
造法に係わる。

ピロロキノリンキノンは、別名２，７．９−）リカルボ
キシーＩＨ−ピロロ（２，３ｆ）キノリンキノン−４，
５−ジオンとも称される化合物である。

ピロロキノリンキノンは、１９７９年にメタノール資化
性細菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として精製、結
晶化され、構造決定がなされた（Ｓ、Ａ。

５ａｌｉｓｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、第
２８０巻、第８４３頁。

（１７９７））　。

さらに、近年、細菌にかぎらず、真核生物のカビ、酵母
、さらには、哺乳動物にもピロロキノリンキノンが存在
していることが明らかになった。

このように、ピロロキノリンキノンは、補酵素として酵
素反応または物質代謝系を活性化するものであり、医薬
品として重要な役割を果たす物質と考えられている。

〔従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕従来、
ピロロキノリンキノンの製造法としては、有機化学合成
法が知られている〔たとえば、ＪＡＣＳ、　。

第１０３巻、第５５９２〜５６００頁（１９８１）　）
。しかしながら、有機化学合成法は、多段階の合成反応
から成るために、製造に長時間を要し、異性体をはじめ
とする副生物が多量に生成され、この副生物の除去のた
めに煩雑な操作を必要とし、また、ピロロキノリンキノ
ンの収率も低いという問題があった。

また、醗酵法による製造法（特開昭５９−１１３８９６
）も知られているが、その生産量は極めて低く、実用に
供するには、まだ、充分ではなく、ピロロキノリンキノ
ンの生産性の大きい微生物の発見が期待されている。

本発明は、細菌を使用し、効率よくピロロキノリンキノ
ンを製造する方法を提供することを目的とする。

〔問題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、ピロロキノリンキノンを多量に生産する
菌株を見出すべく研究を重ねた結果、オリゴモナス属に
属する菌株が、多量のピロロキノリンキノンを生産し、
菌体外に排出することを見出して、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、オリゴモナス属に属し、ピロロキ
ノリンキノンを生産する能力を有し、かつ、メタノール
を資化し得る細菌を、炭素源であるメタノールの存在下
で培養し、得られた培養液または培養上澄液からピロロ
キノリンキノンを分離採取することを特徴とするピロロ
キノリンキノンの製造法である。

本発明に用いられる細菌は、アルカリ性で生育、増殖し
、メタノールを唯一の炭素源として資化することができ
、グラム陰性で、かつ、ピロロキノリンキノンを生産す
る細菌である。本細菌は、その菌学的性質によれば、従
来知られている属、種には該当するものはみられず、本
細菌は、新しい属に属する細菌と判断した。

本発明者らは、本細菌について、新居を設立する必要が
あると考えてオリゴモナス０１　ｉｇｏｍｏｎａｓ属と
命名した。

本発明のアルカリ性メタノール資化性細菌のうち、代表
的な菌株である０−３（微工研菌寄第９２８０号）。

０−７５（微工研菌寄第９２８１号）および０−１００
（微工研菌寄第９２８２号）のそれぞれの菌学的性質を
示す。

菌学的性質： （１）　　顕微鏡的形態 Ｎａ、ＣＯ，で、ｐ）Ｉ　９．０に調整した肉汁液体培
地および肉汁寒天培地で３０°Ｃで３日間培養した。

■　細胞の形状および大きさ 通常は、球菌または短桿菌、幅０．５〜０　、８　ｍ　
。

長さ０．５〜１．５μ ■　運動性　　　　　　　なし。

■　胞子の有無　　　　　生産されない。

■　グラム染色　　　　　グラム陰性 ■　抗酸性　　　　　　　陰性 （２）各種の培地における生育状態 ■　Ｎａ、ＣＯ，でｐｌ＋　９．０に調整した肉汁平板
培養３０°Ｃで３日間培養。

中程度の生育を示す。

コロニーの形状：外形は円形、大きさは２〜３ｆｆｌｆ
ｌｌ、隆起は半球状、構造は均質、表面は平滑、辺縁は
平滑で金縁、色は黄白色で光沢あり、透明度は不透明、
硬度はバター質。

■　メタノール含有寒天平板培養 ３０°Ｃで３日間培養。

■と同じ。

■　Ｎａ、ＣＯ，でｐｌ（９，０に調整した肉汁寒天斜
面培養 ３０℃で３日間培養。

接種線に一様に旺盛に生育する。

隆起は中程度、表面は平滑、辺縁は平滑で金縁、色は黄
白色で光沢あり、透明度は不透明、硬度はバター質。

■　メタノール含有寒天斜面培養 ３０℃で３日間培養。

■と同じ。

■　Ｎａ、ＣＯ，でｐｎ　９．０に調整した肉汁培養３
０°Ｃで３日間培養。

全体に生育する。沈澱あり。

■　Ｎａ１ＣＯ３でｐｏ　９．０に調整したペプトン水
３０°Ｃで５日間培養。

全体に生育するンしかし、生育は旺盛ではない。

■　メタノール含有液体培地 ３０℃で３日間培養。

全体に生育する。沈澱あり。

・■　Ｎａ、ＣＯ，でｐｕ　９．０に調整した肉汁寒天
穿刺培３０℃で３日間培養。

小乳頭状に一様に生育する。培地表面では、直径２〜４
朧ぐらいの円状に生育する。

■　メタノール含有穿刺培養 ３０°Ｃで３日間培養。

小乳頭状に一様に生育する。培地表面では、直径２〜４
Ｍぐらいの円状に生育する。

［相］　Ｎａ、ＣＯ３でｐＨ９，０に調整した肉汁ゼラ
チン高層培養 ２０°ＣでｌＯ日間培養。

菌の生育はみられるが、ゼラチンは液化されない。

■　ＮａｚＣＯ＊でｐｉ　９．０に調整したリドマスミ
ルク３０℃で４週間培養。

菌の生育はみられるが、リドマスミルクの凝固はおこら
ない。

（３）生理学的性質 ■　硝酸塩の還元 硝酸塩を亜硝酸塩に還元する。

ただし、０−３株の還元能は弱い。

■　ＶＰテスト　　　　　陰性 ■　インドールの生成　　陰性 ■　硫化水素の生成　　　陰性 ■　でん粉の加水分解　　陰性 ■　くえん酸の利用（クリステンセンＣｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ培地）　　　　　　　陰性 ■　窒素源の利用 アンモニウム塩、硝酸塩、尿素およびペプトンを窒素源
として利用する。

■　色素の生成　　　　　生成しない。

■　ウレアーゼ　　　　　陽性 ［相］　カタラーゼ　　　　　陽性 ■　アンモニアの生成　　生成する。

＠　脱窒反応　　　　　　陰性 ＠　オキシダーゼ　　　　陽性 Ｑ　　Ｏ−Ｆテスト　　　　陰性 ■　生育の範囲 ｐＨ７〜ｌＯの範囲で生育する。　ｐｉ　７．５〜９．
５が好ましい、　ｐＨ８〜９が特に好ましい。

５°Ｃ１３７°Ｃでは生育しない。

［相］　ＩＪ！類の資化性 ＋　（Ｗ）　：弱く生育する ■　糖類以外の炭素源の資化性 ［相］　耐塩性 ３重量％ＮａＣ１含有培地で弱く生育する。

［相］　ビタミン要求性 ビオチンを要求する。

＠ＩＧｃ（グアニン＋シトシン）含量 ０−３　　　　　　　　６３．９ｍｏｌχ０−７５　　
　　　　　　６４．７ｍｏ１％０−１００　　　　　　
　６４．４ｍｏｌＸ■　主要な菌体脂肪酸組成 モノ不飽和脂肪酸　　Ｃ＋Ｓ＋ｔ ＠　主要なヒドロキシ酸 ３−ヒドロキシ酸Ｃ１１ｌｉ。

３−ヒドロキシ酸ＣＩａ＝。

＠　キノンタイプ ユビキノンＱ−１０ ■　分離源 土壌 バージイズ　マニュアル　オブ　システマティック　バ
クテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
）第１巻〔編集者　クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）およびホル
ト（Ｈｏｌ　ｔ）　）　　：ウィリアムズ　アンド　ゥ
ィルキンス社（Ｗｉｌｌｉａｓｓ　ｌ　Ｗｉｌｋｉｎｓ
）。

（１９８４）　）によると、これらの菌株は、ダラム陰
性、球菌または短桿菌および好気性であることから、’
５ｅｃｔｉｏｎ　４のＧｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ａ
ｅｒｏｂｉｃ　Ｒｏｄｓ　ａｎｄＣｏｃｃｉ　」に含ま
れるものと考えられる。この５ｅｃｔｉｏｎには、３７
の属が記載されている。本細菌をこれらの属と比較する
と、球菌または短桿菌であり、運動性がなく、ＧＣ含量
の点から、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に近いといえる。し
かしながら、本細菌は、脱窒能がない点からＰａｒａｃ
ｏｃｃｕｓ属についての記載と一致しない。また、Ｐａ
ｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する菌種としては、Ｐ、ｄｅｎ
ｉｔｒｉｆ　１ｃａｎｓ　とＰ、ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓとが存在するが、これらの菌種とは脱窒
能および生育ｐＨＯ点で異なる。

従って、本発明者らは、本細菌を新居に属させることと
して、オリゴモナス（Ｏｌｉｇｏｍｏｎａｓ）属と命名
し、また、菌種としてオリゴモナス　メタノリカ（０１
ｉｇｏａ＋ｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）と命名
した。

本発明において、菌学的性質を調べるための実験方法は
、前記のバージイズ　マニュアル、医科学研究所学友会
編「細菌学実習提要Ｊ　　（１９５Ｂ）および長谷用　
武治　編著「微生物の分類と同定」（１９７５）に準拠
した。

また、メタノール含有寒天平板培地、メタノール含有寒
天斜面培地として次の組成の培地を用いた（実施例でも
同様）。すなわち、ＣＮＩＩａ）　２Ｓ０４３　ｇ　。

ＫＨｇＰＯｎ　１．４ｇ、　ＮａｚＨＰＯａ　２．１８
１Ｍｇ５Ｏｎ・７８ｇ００．２ｇ。

ＣａＣ１ｇ・２Ｈｚ０３０■、　ＦｅＣＪｓＯｔ°ＸＨ
＊０３０ｍｇ、　ＭｎＣ１ｚ。

４！１２０５ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏａ・７Ｈｚ０５ｍｇ、　
Ｃｕ５Ｏａ・５Ｈｔ００．５■およびデイフコ（Ｄｉｒ
ｃｏ）社製寒天（バタトアガ−ＢａｃＬｏ−ａｇａｒ）
　１５　ｇを純水ｌｊ！に溶解し、これをｐｏ　７．１
に調整し、１ｋｇ／ｃｄＧで２０分間殺菌したのち１０
重量％Ｎａ、ＣＯ，水溶液を無菌的に加え、ｐｉｔを９
．０に調整した。また、さらにメタノール８−を無菌的
に添加して、平板培地または斜面培地を作成した。また
、メタノール含有液体培地としては、前記の培地におい
て寒天を添加しないものを用いた。

土壌からの本細菌の分離は、前記のメタノール含有培地
を用い常法で行った。

これらのピロロキノリンキノン生産細菌を培養するため
に用いられる培地または培養液には、炭素源として、少
なくとも、メタノールを含有することが必要である。

培地中または培養液中のメタノールの濃度は、使用する
細菌によって異なり、−概に特定し得ないが、実用上、
一般に６重量％以下、好ましくは３重量％以下とされる
。

使用する細菌が資化し得るメタノール以外の炭素源−た
とえば、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グル
コース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、ローソル
ビトール、Ｄ−マンニトールおよびイノシトールなどを
併用することもできる。

さらに、炭素源以外の培地成分として、通常使用される
窒素源および無機物などの適量が使用される。

窒素源としては、たとえば、アンモニウム塩、硝酸塩な
どの無機窒素化合物および／または、たとえば、尿素、
コーンステイープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母
エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。

また、無機成分としては、たとえば、カルシウム塩、マ
グネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、りん酸塩、
マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバ
ルト塩、はう素化合物およびよう素化合物が用いられる
。

さらに、アミノ酸、核酸、ビタミン、酵母エキスおよび
麦芽エキスなどの生育促進物質も使用される。

また、使用される細菌が、栄養要求性を示す場合には、
その要求物質を存在させる必要がある。

培養条件は、温度２０〜４２°Ｃ１好ましくは２５〜４
０”Ｃ，ｐＨ７〜１０、好ましくは７．５〜９．５であ
る。このような条件で好気的に培養を行う。これらの条
件をはずれて培養した場合には、本細菌の増殖は比較的
悪くなるが、これらの条件をはずして培養することを妨
げない。

また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通
常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通
気量を調節したり、撹拌したり、通気ガスとして酸素も
しくは酸素と空気との混合ガスを使用したり、また、培
養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。

培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい
。

窒素源としてアンモニウム塩を使用した場合ニは、培養
期間中にアンモニアが菌体生産のために消費されて培養
液のｐＨが低下する。この場合に、培養液のｐＨを所定
の値に保つために、アンモニア、苛性カリおよび苛性ソ
ーダなどのアルカリを添加するが、アンモニアを添加す
ることが好ましい。

このようにして、細菌を培養したのち、菌体を培養液か
ら分離する。分離には通常の固液分離手段が採用される
。すなわち、固液分離手段としては、たとえば、培養液
そのものをそのまま遠心分離するとの手段、培養液中に
本細菌よりも大きい他の微生物を濾過助剤として加えた
り、または、プレコートすることにより培養液から菌体
を濾過分離するとの手段、培養液に種々の凝集剤を加え
て菌体を凝集させて、この凝集菌体を濾過もしくは遠心
分離により培養液から分離するとの手段、培養液のｐＨ
を５以下にすることにより、または、ｐ）１を５以下に
しさらに５０〜１００°Ｃで加熱することにより菌体を
凝集させて、この凝集菌体を濾過もしくは遠心分離によ
り培養液から分離するとの手段などを適用し得る。

菌体を分離した後の培養上澄液、または、場合によって
は菌体を含有する培養液そのものからピロロキノリンキ
ノンが分離される。

培養上澄液および培養液のぞれぞれからのピロロキノリ
ンキノンの分離、採取方法は、それ自体公知の方法によ
って行なわれる。

すなわち、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、
濃縮物のゲル濾過法、凍結乾燥物の溶媒抽出またはアフ
ィニティ・クロマトグラフィーなどが利用できる。

このようにして分離、採取されたピロロキノリンキノン
の同定には、たとえば、ペーパー・クロマトグラフィー
、薄層クロマトグラフィー、元素分析、核磁気共鳴スペ
クトルおよび質量分析などの手段を使用することができ
る。

また、ピロロキノリンキノンの定量は、たとえば、給出
らの「シュードモナス　エルギノーザのローグルコース
脱水素酵素活性欠損変異株を用いる方法（ＦＥＢＳ　Ｌ
ｅｔｔｅｒ、　　第１３０巻、第１７９〜１８３頁（１
９８１）　）　Ｊまたは高速液体クロマトグラフィーな
どに拠ることができる。

〔実施例〕

実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。なお
、本発明は、実施例に限定されるものではない。

実施例１ オリゴモナス　メタノリカの菌　の 土壌サンプル約０．５〜１ｇを殺菌水１０−に無菌的に
入れ、この懸濁液１−をメタノール含有寒天平板培地上
に液深がほぼ一様になるように入れ、水分をこの寒天培
地に吸収させたのち、２８℃で約７日間静置培養を行な
った。この寒天培地上に生成シタコロニーの一部分をさ
らにメタノール含有寒天平板培地で培養して得られた単
一コロニーを、メタノール含有寒天斜面培地に植菌して
培養して、オリゴモナス　メタノリカＯ−３、同０−７
５および同０−１００　　のそれぞれを得た。

ピロロキノリンキノンの１造 純水１１あたり、（ＮＨ４）　ｔｓｏ４３　ｇ　、に８
２ＰＯ４１，４ｇ　。

ＮａｚｌｌＰＯａ　　２．１ｇ１Ｍｇ５Ｏｎ’７ＨｚＯ
０，２ｇ、　ＣａＣ１ｇ’２Ｈｚ０３０ｍｇ、　ＦｅＣ
Ｊ、Ｏ，・ＸＨｇ０　３０ｍｇ、　ＭｎＳＯ４°７Ｈｚ
０　５ｍｇ１ＺｎＳＯｎ”７Ｈｚ０　５ｍｇ、　Ｃｕ５
Ｏｎ’５ＨｚＯｏ、５ｍｇ＋　　Ｎａ２ＣＯ＝２．５ｇ
、ビオチン２ｊ！ｇおよびメタノール８ｄを溶解し、ｐ
）１９．０に調整された液２００−を１２容フラスコに
入れ、１２０℃で２０分間殺菌し、これを培地Ａとした
。

あらかじめ、培地Ａを使用して３０°Ｃで３日間前培養
して得られた各菌株の種母液を、この培地Ａに、１容量
χ接種し、３０℃で回転振盪培養を行なった。

７日間、培養を継続して、得られた培養液から遠心分離
によって菌体を分離除去して上澄液を得、この上澄液の
ピロロキノリンキノン含量を定量した。結果を第１表に
示す。

（以下余白） 第１表 ＊ピロロキノリンキノン 実施例２ 純水ｉｚあたり、（ＮＨａ）ｚｓＯ４３ｇ、　Ｋｌｌ□
ＰＯ４１，４ｇ　。

ＮａＪＰＯ４２，１ｇ９ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ１，Ｏｇ
＋　　Ｍｎ５Ｏｎ’７ＨｚＯ１ｍｇｔ　　Ｎａ２ＣＯ＝
　　２．５　ｇ　＋　ビオチン２１１ｇおよびメタノー
ル８ｄを溶解し、ｐＨ９，０に調整された液２０〇−を
１！容フラスコに入れ、１２０°Ｃで２０分間殺菌し、
これを培地Ｂとした。

同定試験に用いたメタノール含有液体培地を用いて３０
℃で３日間前培養して得られた各菌株の種母液を、この
培地Ｂに１容量χ接種し、３０°Ｃで回転振盪培養を行
なった。

７日間、培養を継続して、得られた培養液から遠心分離
によって菌体を分離除去して上澄液を得、この上澄液の
ピロロキノリンキノン含量を定量した。結果を第２表に
示す。

第２表 〔発明の効果〕 本発明によれば、工業生産により安定して容易に入手し
得る物質を原料として使用することができ、さらに、細
菌を使用して、ピロロキノリンキノンを容易に、効率よ
く、しかも、安定して製造することが可能となる。

また、特に、本発明における細菌は、好アルカリ性細菌
なので培養における雑菌による汚染が著しく低減される
。

特許出願人　三菱瓦斯化学株式会社 代表者長野　和書

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. オリゴモナス属に属し、ピロロキノリンキノンを生産す
   る能力を有し、かつ、メタノールを資化し得る細菌を、
   炭素源であるメタノールの存在下で培養し、得られた培
   養液または培養上澄液からピロロキノリンキノンを分離
   採取することを特徴とするピロロキノリンキノンの製造
   法