JP3915505B2 - ε−ポリ−L−リジンの製造法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ε―ポリ−L−リジン(以下εPLという)の製造法に関する。さらに詳しくは、ε―ポリ−L−リジンを発酵生産するストレプトマイセス(Streptomyces)属微生物を好気的に培地に培養して、ε―ポリ−L−リジンを採取する方法において、発酵終了後に発酵上澄み液と菌体を分離させるまでの間、常に発酵終了後の発酵液中に炭素源を残存させておくことを特徴とするε―ポリ−L−リジンの製造法に関する。
【0002】
εPLは、必須アミノ酸であるL−リジンのポリマーであるため安全性が高く、かつカチオン含量が高いので特異な物性を有する。したがって、トイレタリー用品、化粧品、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等への用途が期待されている。特に食品添加物の分野では、天然物系の添加物として大きく注目されている。
【0003】
【従来の技術】
従来の該εPLの発酵製造法では、発酵中の炭素源濃度については記載されているが(特開平10-174596号公報)、発酵終了後の発酵液中の炭素源濃度について着目したものは報告がない。通常、発酵製造法においては、炭素源コストを削減するため、炭素源を使い切る形で発酵反応を終了するか、もしくはごく少量の炭素源を発酵液中に残して発酵反応を終了させるのが一般的である。しかしながら、このような方法でストレプトマイセス属微生物を用いたεPLの発酵を行うと、発酵液中のεPL濃度が発酵終了後に低下する現象が起こり、εPLの生産性の低下を招くといった問題が生じる。特に発酵液量が多くなり、菌体除去工程に時間がかかるようになると、発酵終了後の発酵液中のεPL量の低下が著しくなる。したがって、従来の製造法では、εPLの生産性が未だ低く、種々の用途に対応しうるεPLを収率よく製造するのは困難であった。そこで、生成したεPLの安定性を高めることにより、工業的に収率のよい製造法が望まれていた。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、εPLを工業的に収率よく製造する方法について鋭意検討を重ねた。その結果、εPL生産能を有するストレプトマイセス属微生物を培養してεPL発酵を行った後の発酵終了後の発酵液においても、菌体を除去するまでの間は、常に炭素源を残存させておくことによってεPLの減少が阻止できることを見いだし、すなわち、安定した収率でεPLを生産することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、発酵終了後のεPLの生産量の低下を抑制し、収率よくεPLを製造する方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記から構成される。
(1)ε―ポリ−L−リジンを発酵生産するストレプトマイセス(Streptomyces)属微生物を好気的に培地に培養して、ε―ポリ−L−リジンを採取する方法において、発酵終了後に発酵上澄み液と菌体を分離させるまでの間、常に発酵終了後の発酵液中に炭素源を残存させておくことを特徴とするε―ポリ−L−リジンの製造法。
【0006】
(2)発酵終了後の発酵液中の炭素源の残存濃度が1g/リットル〜100g/リットルである前記第1項記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
【0007】
(3)発酵終了後の発酵液中の炭素源の残存濃度が2g/リットル〜20g/リットルである前記第1項記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
【0008】
(4)発酵液中に残存させておく炭素源が、グルコース、フラクトース、グリセリン、スターチ、ガラクトース、マンニトール、イノシトール、サリシンの中から選ばれた1種以上である前記第1項〜第3項のいずれか1項記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
【0009】
(5)ε―ポリ−L−リジンを発酵生産するストレプトマイセス(Streptomyces)属微生物が、ストレプトマイセス・アルブラス・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)B21021株(FERM BP−5926)である前記第1項記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
【0010】
本発明に使用できる微生物は、εPLを生産する能力のあるストレプトマイセス属微生物であればいずれでも使用可能である。かかるストレプトマイセス属微生物の具体的な例としては、ストレプトマイセス・アルブラス・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)B21021株(FERM BP−5926)があげられる。
【0011】
本発明の製造法にあっては、発酵終了後の発酵中にも炭素源を残存させておくものであり、使用する炭素源としては、発酵中に使用した炭素源と同じものが好ましいが、発酵終了後に残存させる炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセリン、スターチ、ガラクトース、マンニトール、イノシトール、サリシン等のεPL生産菌が資化可能なものならいずれも使用できる。
【0012】
本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適当に含有する培地ならばいずれも使用できる。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセリン、スターチ、ガラクトース、マンニトール、イノシトール、サリシン等のεPL生産菌が資化可能なものならいずれも使用できる。培地中の残存炭素源濃度は、菌体の増殖及びεPLの生産とともに低下する。残存炭素源濃度が低下したら、炭素源を逐次的にもしくは連続的に添加してもかまわない。また、窒素源としては有機体窒素や無機体窒素のいずれでもかまわないが、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニア態窒素が最適である。培養液中の残存窒素濃度が低下したら、炭素源と同様、窒素源を逐次的にもしくは連続的に添加してもかまわない。無機物としては、りん酸イオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン等があげられる。その他の栄養素として、酵母エキスを適当量含有させることは、菌の生育を良くし、εPLの生産にも好ましい結果を与える。
【0013】
培養は、振とう培養、攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は25℃〜35℃が好ましい。発酵終了後の発酵液保存温度は25℃以下が好ましいが、さらに好ましくは15℃以下である。培地のpHは中性付近(pH6〜8)が好ましいが、培養開始後に生産菌の生育ともにpHは低下する。pHが3.5以下、好ましくはpH4以下にならないように、アルカリを添加してpHを維持する。アルカリはpHを維持できるものであれば、何でもかまわないが、好ましくはアンモニア水である。通常は、培養1〜7日間でεPLが蓄積される。
【0014】
本発明の製造法にあっては、発酵終了後の発酵液を遠心分離もしくはフィルタ−等による濾過により、菌体を除去するまでの間、炭素源を残存させることが特徴であるが、このときの炭素源の濃度は、発酵液中、好ましくは1g/リットル〜100g/リットル、より好ましくは2g/リットル〜20g/リットルである。この濃度範囲に残存炭素源濃度を維持すれば生成εPL量の低下が抑えられ、収率よく、εPLを製造することができる。
【0015】
上記εPL及び残存炭素源を含有する発酵液は遠心分離もしくはフィルター等で菌体を除いた後、菌体除去液を精製、脱色し、これを濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより、目的の該発酵液の保存中はグルコースを添加することによりが得られる。
【0016】
【実施例】
本発明を実施例により更に詳細に説明する。尚、培養液中のεPL濃度は、イツアキ(Itzhaki):アナリティカルバイオケミストリー(Analytical Biochemistry)50,569,(1972)の方法により測定した。すなわち、培養液を遠心分離して菌体を除いた後、菌体除去液(εPL:0〜200μg)2mlと1mMメチルオレンジ水溶液2mlとを混合し、室温で30分間放置してεPL―メチルオレンジコンプレックスを生じさせる。その後、遠心することにより、該εPL―メチルオレンジコンプレックスを除いた上澄水の465nmにおける吸光度を測定し、εPL量を求めた。また、実施例中の%は特に断らない限り、重量(g)/容量(dl)%である。
【0017】
実施例1
グルコース50g/リットル、酵母エキス5g/リットル、硫酸アンモニウム10g/リットル、K2HPO4 0.8g/リットル、KH2PO4 1.36g/リットル、MgSO4・7H2O 0.5g/εPL、 ZnSO4・7H2O 0.04g/リットル、 FeSO4・7H2O 0.03g/リットル、pH6.8に調製した2リットルの培地を3リットル容ジャーに入れ、これにストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus)B21021株(FERM BP-5926号)の前培養液100mLを接種し、30℃、700rpm、通気量3リットル/分で3日間培養を行った。ただし、培養開始後、培養液中の残存グルコース濃度が10g/リットル以下になった時点で、残存グルコース濃度が50g/リットルになるようにグルコースを逐次添加した。硫酸アンモニウムについても、グルコース添加と同時にグルコースの1/10倍量(重量比)を逐次添加した。pH調整については、10%アンモニア水を用いてpHを4に維持した。
尚、培養3日後の発酵終了時点での残存グルコース濃度は20g/リットルであった。この発酵液を、通気だけを行いながら室温で24時間保存した。発酵終了時及び24時間保存後のεPL濃度とグルコース濃度を表1に示した。
【0018】
実施例2
実施例1に準拠して、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus)B21021株(FERM BP-5926号)の前培養液100mLを培地に接種して培養を行った。培養3日後の発酵終了時点でのグルコース濃度は5g/リットルであった。該発酵液の保存中はグルコースを添加することにより、グルコース濃度を常に3〜5g/リットルに維持した。発酵終了時及び24時間保存後のεPL濃度とグルコース濃度を表1に示した。
【0019】
比較例1
実施例1に準拠して、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp.lysinopolymerus)B21021株(FERM BP-5926号)の前培養液100mLを培地に接種して培養を行った。培養3日後の発酵了時点でのグルコース濃度は5g/リットルであった。該発酵液の保存中はグルコースの添加はしなかった。発酵終了時及び24時間保存後のεPL濃度とグルコース濃度を表1に示した。
【0020】
表1の実施例1,2から明らかなように、発酵終了後も発酵液中にグルコースを常に残存させることにより、εPL量の低下が抑制され、安定的に該εPLを採取することができることがわかる。
【0021】
【表1】
注:表中、Lはリットルを表す。
【0022】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、εPLを安定的に採取することができることから、生産量を増大させることが可能となり、収率よくεPLを製造することができる。
Claims (5)
- ε―ポリ−L−リジンを発酵生産するストレプトマイセス(Streptomyces)属微生物を好気的に培地に培養して、ε―ポリ−L−リジンを採取する方法において、発酵終了後に発酵上澄み液と菌体を分離させるまでの間、常に発酵終了後の発酵液中に炭素源を残存させておくことを特徴とするε―ポリ−L−リジンの製造法。
- 発酵終了後の発酵液中の炭素源の残存濃度が1g/リットル〜100g/リットルである請求項1項記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
- 発酵終了後の発酵液中の炭素源の残存濃度が2g/リットル〜20g/リットルである請求項1記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
- 発酵液中に残存させておく炭素源が、グルコース、フラクトース、グリセリン、スターチ、ガラクトース、マンニトール、イノシトール、サリシンの中から選ばれた1種以上である請求項1〜3のいずれか1項記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。 - ε―ポリ−L−リジンを発酵生産するストレプトマイセス(Streptomyces)属微生物が、ストレプトマイセス・アルブラス・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus)B21021株(FERM BP−5926)である請求項1記載のε―ポリ−L−リジンの製造法。
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