JP3011472B2 - 酵素法によるインジゴの製造法 - Google Patents
酵素法によるインジゴの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、インドールから酵素法
により、効率よくインジゴを製造する方法に関する。
により、効率よくインジゴを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、インジゴは工業用染料として広く
利用されており、化学合成法により製造されている。し
かしながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収
率が悪く、また化学的分解による副生物が多い等の欠点
があった。
利用されており、化学合成法により製造されている。し
かしながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収
率が悪く、また化学的分解による副生物が多い等の欠点
があった。
【０００３】また、インジゴを製造する種々の方法の中
で有望視されている方法として、キシレンオキシゲナー
ゼ又はナフタレンジオキシゲナ−ゼを含有する微生物を
酵素触媒として用い、インド−ルから製造する方法が知
られている(Burt D.Ensley,Barry J.Ratzkin,Timthy D.
Osslund and Mary J.Simon;Science,vol.222,P.167−16
9(1983))。しかしながら、実際的な製造技術を確立する
には至っておらず、酵素活性を低下させることなく、効
率良くインジゴを製造する方法の開発が望まれている。
で有望視されている方法として、キシレンオキシゲナー
ゼ又はナフタレンジオキシゲナ−ゼを含有する微生物を
酵素触媒として用い、インド−ルから製造する方法が知
られている(Burt D.Ensley,Barry J.Ratzkin,Timthy D.
Osslund and Mary J.Simon;Science,vol.222,P.167−16
9(1983))。しかしながら、実際的な製造技術を確立する
には至っておらず、酵素活性を低下させることなく、効
率良くインジゴを製造する方法の開発が望まれている。
【０００４】また、インジゴ生成能を有する微生物又は
その処理物の存在下に、インド−ルからインジゴを製造
するときに、インド−ル濃度が微生物のインジゴ生成活
性に影響する。
その処理物の存在下に、インド−ルからインジゴを製造
するときに、インド−ル濃度が微生物のインジゴ生成活
性に影響する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酵素
法により、効率よくかつ高収率でインジゴを製造するこ
とを目的とする。
法により、効率よくかつ高収率でインジゴを製造するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、インジゴ
生成能を有する菌体又はその処理物を利用して酵素法に
よりインジゴを製造する方法を確立するために、反応条
件等について鋭意検討した結果、インド−ルを特定の濃
度を超えないように調節して作用させることにより、加
算的なインジゴ生成阻害傾向が回避でき、高収率でイン
ジゴを生成させることができることを見出し、本発明を
完成するに至った。
生成能を有する菌体又はその処理物を利用して酵素法に
よりインジゴを製造する方法を確立するために、反応条
件等について鋭意検討した結果、インド−ルを特定の濃
度を超えないように調節して作用させることにより、加
算的なインジゴ生成阻害傾向が回避でき、高収率でイン
ジゴを生成させることができることを見出し、本発明を
完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、インド−ルを含有す
る水溶液に、反応液中のインド−ル濃度が０．８mMを超
えないように調節して、シュードモナス属に属するイン
ジゴ生成能を有する菌体又はその処理物を作用させ、酵
素法によりインジゴを製造する方法である。
る水溶液に、反応液中のインド−ル濃度が０．８mMを超
えないように調節して、シュードモナス属に属するイン
ジゴ生成能を有する菌体又はその処理物を作用させ、酵
素法によりインジゴを製造する方法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいては、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を
有する菌が用いられるが、特にシュードモナス(Pseudom
onas) ・SP. ＭＹ−６菌株が好適に用いられる。本菌株
の菌学的性質とその分類学的性質は次の通りである。
おいては、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を
有する菌が用いられるが、特にシュードモナス(Pseudom
onas) ・SP. ＭＹ−６菌株が好適に用いられる。本菌株
の菌学的性質とその分類学的性質は次の通りである。
【０００９】Ｉ．顕微鏡的性質 (a) 細胞の形及び大きさ：桿菌、１×２〜４μm (b) 多形性の有無：無し (c) 運動性：有り (d) 鞭毛の着生状態：極鞭毛 (e) 胞子の有無：無し (f) グラム染色：陰性
【００１０】II．培養的性質 (a) 肉汁寒天培地における生育：有り (b) 資化可能な炭素源：グルコース、酢酸、コハク酸、
フマル酸、Ｌ−リンゴ酸、乳酸、クエン酸、グリセロー
ル、Ｌ−バリン、β−アラニン、ＤＬ−アルギニン
フマル酸、Ｌ−リンゴ酸、乳酸、クエン酸、グリセロー
ル、Ｌ−バリン、β−アラニン、ＤＬ−アルギニン
【００１１】III.生育条件 (a) 生育温度：１０〜４０℃ (b) 生育pH：６〜８ (c) 酸素要求性：好気性
【００１２】IV．生理学的性質 (a) オキシダーゼ：陽性 (b) カタラーゼ：陽性 (c) ＤＮＡ中のグアニン、シトシン（ＧＣ）含量：６１
％ (d) デンプンの加水分解：陰性 (e) プロトカテキン酸の分解：陽性
％ (d) デンプンの加水分解：陰性 (e) プロトカテキン酸の分解：陽性
【００１３】以上の諸性質を「バージーズ・マニュアル
・オブ・システマティク・バクテリオロジー(Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology)」第２巻（１９８
６年）より検索した。その結果、本菌はシュードモナス
(Pseudomonus) 属に属する菌株であると同定されたが、
種については炭素源の資化性その他の性質から合致しな
い点があり、新種と考えられた。従って本発明において
はシュードモナス(Pseudomonas) ・SP. ＭＹ−６と呼称
することとする。なお本菌株は工業技術院微生物工業技
術研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第１１９６３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６３）として寄託されている。
・オブ・システマティク・バクテリオロジー(Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology)」第２巻（１９８
６年）より検索した。その結果、本菌はシュードモナス
(Pseudomonus) 属に属する菌株であると同定されたが、
種については炭素源の資化性その他の性質から合致しな
い点があり、新種と考えられた。従って本発明において
はシュードモナス(Pseudomonas) ・SP. ＭＹ−６と呼称
することとする。なお本菌株は工業技術院微生物工業技
術研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第１１９６３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６３）として寄託されている。
【００１４】微生物の培養に用いる培地の炭素源として
は、グルコース等の炭水化物、キシレン、トルエン等を
利用できるが、中でもｍ−キシレン、ｐ−キシレンが好
ましい。
は、グルコース等の炭水化物、キシレン、トルエン等を
利用できるが、中でもｍ−キシレン、ｐ−キシレンが好
ましい。
【００１５】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム
等の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム
等の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。
【００１６】無機物としては、リン酸カリウム、硝酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を用いることができ
る。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の栄養
源を添加することができる。
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を用いることができ
る。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の栄養
源を添加することができる。
【００１７】培養温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは
３０℃〜４０℃であり、培養中の培地のpHは６〜９、好
ましくは７〜８である。培養は、好気的に行う。
３０℃〜４０℃であり、培養中の培地のpHは６〜９、好
ましくは７〜８である。培養は、好気的に行う。
【００１８】培養した菌体を本酵素反応に利用する場
合、該菌体はそのまま使用することができるが、菌体の
処理物、例えば該菌体を超音波処理等で破砕した破砕
物、又はその破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或
いは該抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈殿
させた粗精製物の形で使用することもでき、さらに、該
菌体又はこれら処理物を必要により固定化して用いるこ
ともできる。
合、該菌体はそのまま使用することができるが、菌体の
処理物、例えば該菌体を超音波処理等で破砕した破砕
物、又はその破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或
いは該抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈殿
させた粗精製物の形で使用することもでき、さらに、該
菌体又はこれら処理物を必要により固定化して用いるこ
ともできる。
【００１９】該菌体又はその処理物をインドールと反応
させるには、通常の酵素反応と同様に、例えば０．１M
リン酸緩衝液（pH６〜９）あるいは水溶液（pH６〜９）
中で、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃の温度
で、通常１０〜７２時間反応させる。反応は、攪拌しな
がら行うのが好ましい。
させるには、通常の酵素反応と同様に、例えば０．１M
リン酸緩衝液（pH６〜９）あるいは水溶液（pH６〜９）
中で、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃の温度
で、通常１０〜７２時間反応させる。反応は、攪拌しな
がら行うのが好ましい。
【００２０】反応液中の平均インド−ル濃度が０．８mM
を超えないように調節するには、反応液の最初のインド
−ル添加量は勿論、反応液中でインド−ルを連続的に又
は逐次的に反応液に添加する場合の添加量を調節する。
反応液中のインド−ル濃度は、例えば比色定量法（O.H.
Smith and C.Yanofsky：「Methods in Enzymology 」,A
cademic Press Inc., NewYork(1962),vol 5, p.794〜80
6 ）に従い、逐次定量することにより管理することがで
きる。
を超えないように調節するには、反応液の最初のインド
−ル添加量は勿論、反応液中でインド−ルを連続的に又
は逐次的に反応液に添加する場合の添加量を調節する。
反応液中のインド−ル濃度は、例えば比色定量法（O.H.
Smith and C.Yanofsky：「Methods in Enzymology 」,A
cademic Press Inc., NewYork(1962),vol 5, p.794〜80
6 ）に従い、逐次定量することにより管理することがで
きる。
【００２１】微生物菌体又はその処理物の添加量は、特
に制限されるものではないが、一般に、０．５〜１０％
（wt/vol) が用いられる。反応後、反応液からのインジ
ゴの分離、精製は、それ自体該知の方法、例えば、溶媒
（クロロホルム）抽出等の方法で行うことができる。
に制限されるものではないが、一般に、０．５〜１０％
（wt/vol) が用いられる。反応後、反応液からのインジ
ゴの分離、精製は、それ自体該知の方法、例えば、溶媒
（クロロホルム）抽出等の方法で行うことができる。
【００２２】
【実施例】（参考例）（ＮＨ2 ）ＳＯ4 ：３ｇ，ＫＨ2
ＰＯ4 ：０．５ｇ，Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ，ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ，ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ：１０
mg，ＮａＣｌ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：１０
mg、酵母エキス１ｇ及び蒸留水：１０００ml（ｐＨ７．
０）の培地１００mlを５００ml容の三角フラスコに分注
し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものにｍ−キシレ
ン１mlを添加後、シュードモナス・SP. ＭＹ−６菌株を
植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養した。
ＰＯ4 ：０．５ｇ，Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ，ＭｇＳＯ
4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ，ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ：１０
mg，ＮａＣｌ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：１０
mg、酵母エキス１ｇ及び蒸留水：１０００ml（ｐＨ７．
０）の培地１００mlを５００ml容の三角フラスコに分注
し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものにｍ−キシレ
ン１mlを添加後、シュードモナス・SP. ＭＹ−６菌株を
植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養した。
【００２３】また、上記と同様の滅菌培地１０００mlを
５０００ml容の三角フラスコに入れ、ｍ−キシレン１０
mlを添加後、上記振盪培養液２０mlを接種し、これを３
０℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養液の１０
０mlを遠心分離（８００rpm，１５分間、４℃）して集
菌した該集菌菌体を酵素源とした。
５０００ml容の三角フラスコに入れ、ｍ−キシレン１０
mlを添加後、上記振盪培養液２０mlを接種し、これを３
０℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養液の１０
０mlを遠心分離（８００rpm，１５分間、４℃）して集
菌した該集菌菌体を酵素源とした。
【００２４】（実施例１）上記の方法で調製した菌体
を、反応液（１００mMリン酸緩衝液 pH ７．０）１００
mlに懸濁後、上限のインド−ル濃度が表１に示した各実
験区のようになるように反応途中でインド−ルを添加調
節し、振盪しながら３０℃で反応させた。また、各区の
インド−ルの最終添加濃度はいずれも６mMであった。２
４時間反応させた後、生成したインジゴ量を、常法［H.
KEIL, C.M. SAINTand P.A. WILLIAMS, Journal of Bac
teriology, 169,No.2,P.764−770(1987) ］に従い定量
した。結果を表１に示す。
を、反応液（１００mMリン酸緩衝液 pH ７．０）１００
mlに懸濁後、上限のインド−ル濃度が表１に示した各実
験区のようになるように反応途中でインド−ルを添加調
節し、振盪しながら３０℃で反応させた。また、各区の
インド−ルの最終添加濃度はいずれも６mMであった。２
４時間反応させた後、生成したインジゴ量を、常法［H.
KEIL, C.M. SAINTand P.A. WILLIAMS, Journal of Bac
teriology, 169,No.2,P.764−770(1987) ］に従い定量
した。結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、酵素法により、
高収率でインジゴを製造することができる。
高収率でインジゴを製造することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内田 康一 茨城県稲敷郡阿見町中央１−11−５− 104 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央６−23−９ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 17/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 インド−ルを含有する水溶液に、反応液
中のインド−ル濃度が０．８mMを超えないように調節し
て、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を有する
菌体又はその処理物を作用させ、酵素法によりインジゴ
を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7429991A JP3011472B2 (ja) | 1991-03-15 | 1991-03-15 | 酵素法によるインジゴの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7429991A JP3011472B2 (ja) | 1991-03-15 | 1991-03-15 | 酵素法によるインジゴの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04287690A JPH04287690A (ja) | 1992-10-13 |
| JP3011472B2 true JP3011472B2 (ja) | 2000-02-21 |
Family
ID=13543118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7429991A Expired - Fee Related JP3011472B2 (ja) | 1991-03-15 | 1991-03-15 | 酵素法によるインジゴの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3011472B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102690529B (zh) * | 2012-04-28 | 2014-01-22 | 贵州丹寨宁航蜡染有限公司 | 蓝靛膏的工业制备方法 |
-
1991
- 1991-03-15 JP JP7429991A patent/JP3011472B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04287690A (ja) | 1992-10-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |