JPH04287691A - 酵素法によるインジゴの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インドールから酵素法
により、効率よくインジゴを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、インジゴは工業用染料として広く
利用されており、化学合成法により製造されている。し
かしながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収
率が悪く、また化学的分解による副生物が多い等の欠点
があった。

【０００３】また、インジゴを製造する種々の方法の中
で有望視されている方法として、キシレンオキシゲナー
ゼ又はナフタレンジオキシゲナ−ゼを含有する微生物を
酵素触媒として用い、インド−ルから製造する方法が知
られている（Ｂｕｒｔ　Ｄ．Ｅｎｓｌｅｙ，Ｂａｒｒｙ
　Ｊ．Ｒａｔｚｋｉｎ，Ｔｉｍｔｈｙ　Ｄ．Ｏｓｓｌｕ
ｎｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｙ　Ｊ．Ｓｉｍｏｎ；Ｓｃｉｅｎ
ｓｅ，ｖｏｌ．２２２，Ｐ．１６７〜１６９（１９８３
））。しかしながら、実際的な製造技術を確立するには
至っておらず、効率良くインジゴを製造する方法の開発
が望まれている。

【０００４】また、下記の反応ステップからなるインジ
ゴ生成反応は、好気条件下で実施することが必要である
が、反応液中の溶存酸素（以下ＤＯと略す）濃度がイン
ジゴ生成に影響する。

【０００５】

【化１】

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酵素
法により、効率よくかつ高収率でインジゴを製造するこ
とを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、インジゴ
生成能を有する菌又はその処理物を利用して酵素法によ
りインジゴを製造する方法を確立すべく、反応条件等に
ついて鋭意検討した結果、反応液を特定のＤＯ濃度に維
持しながら反応させると効率良くインジゴを生成させる
ことができることを見出し、本発明を完成するに至った
。

【０００８】本発明の第一は、インド−ルを含有する水
溶液に、溶存酸素濃度を０．５〜３．５ｐｐｍ　に維持
しながら、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を
有する菌体又はその処理物を作用させ、酵素法によりイ
ンジゴを製造する方法である。

【０００９】本発明の第二は、インジゴ生成能を有する
シュードモナス・ＳＰ．　ＭＹ−６菌株である。

【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいては、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を
有する菌が用いられるが、特にシュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）　・ＳＰ．　ＭＹ−６菌株が好適に
用いられる。本菌株の菌学的性質とその分類学的性質は
次の通りである。

【００１１】Ｉ．顕微鏡的性質 （ａ）　細胞の形及び大きさ：桿菌、１×２〜４μｍ（
ｂ）　多形性の有無：無し （ｃ）　運動性：有り （ｄ）　鞭毛の着生状態：極鞭毛 （ｅ）　胞子の有無：無し （ｆ）　グラム染色：陰性

【００１２】ＩＩ．培養的性質 （ａ）　肉汁寒天培地における生育：有り（ｂ）　資化
可能な炭素源：グルコース、酢酸、コハク酸、フマル酸
、Ｌ−リンゴ酸、乳酸、クエン酸、グリセロール、Ｌ−
バリン、β−アラニン、ＤＬ−アルギニン

【００１３】
ＩＩＩ．生育条件 （ａ）　生育温度：１０〜４０℃ （ｂ）　生育ｐＨ：６〜８ （ｃ）　酸素要求性：好気性

【００１４】ＩＶ．生理学的性質 （ａ）　オキシダーゼ：陽性 （ｂ）　カタラーゼ：陽性 （ｃ）　ＤＮＡ中のグアニン、シトシン（ＧＣ）含量：
６１％ （ｄ）　デンプンの加水分解：陰性 （ｅ）　プロトカテキン酸の分解：陽性

【００１５】以
上の諸性質を「バージーズ・マニュアル・オブ・システ
マティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）」第２巻（１９８６年）より検索した。 その結果、本菌はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ｕｓ）　属に属する菌株であると同定されたが、種につ
いては炭素源の資化性その他の性質から合致しない点が
あり、新種と考えられた。従って本発明においてはシュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　・ＳＰ．　Ｍ
Ｙ−６と呼称することとする。なお本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第１
１９６３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９６３）として寄託
されている。

【００１６】微生物の培養に用いる培地の炭素源として
は、グルコース等の炭水化物、キシレン、トルエン等を
利用できるが、中でもｍ−キシレン、ｐ−キシレンが好
ましい。

【００１７】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩
；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等
の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。

【００１８】無機物としては、リン酸カリウム、硝酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を用いることができ
る。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の栄養
源を添加することができる。

【００１９】培養温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは
３０℃〜４０℃であり、培養中の培地のｐＨは６〜９、
好ましくは７〜８である。培養は、好気的に行う。

【００２０】培養した菌体を本酵素反応に利用する場合
、該菌体はそのまま使用することができるが、菌体の処
理物、例えば該菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、
又はその破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或いは
該抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈殿させ
た粗精製物の形で使用することもでき、さらに、該菌体
又はこれら処理物を必要により固定化して用いることも
できる。

【００２１】該菌体又はその処理物をインドールと反応
させるには、通常の酵素反応と同様に、例えば０．１Ｍ
　リン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）あるいは水溶液（ｐＨ６
〜９）中で、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃の
温度で、通常１０〜７２時間反応させる。反応は、攪拌
しながら行うのが好ましい。

【００２２】反応液中のＤＯ濃度を０．５〜３．５ｐｐ
ｍ　に維持するには、例えば、ユニバーサルオキシゲン
アナライザー［オリエンタル電気（株）タイプＲＡ］に
より、反応液中のＤＯ濃度を経時的に測定しながら、攪
拌回転数又は／及び通気量を調整しながら行うことがで
きる。

【００２３】微生物菌体又はその処理物の添加量は、特
に制限されるものではないが、一般に、０．５〜１０％
（ｗｔ／ｖｏｌ）　が用いられる。反応後、反応液から
のインジゴの分離、精製は、それ自体該知の方法、例え
ば、溶媒（クロロホルム）抽出等の方法で行うことがで
きる。

【００２４】

【実施例】（参考例） （ＮＨ２　）ＳＯ４　：３ｇ，ＫＨ２　ＰＯ４：０．５
ｇ，Ｋ２　ＨＰＯ４　：０．５ｇ，ＭｇＳＯ４　・７Ｈ
２　Ｏ：０．５ｇ，ＣａＣｌ２　・２Ｈ２Ｏ：１０ｍｇ
，ＮａＣｌ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ：１
０ｍｇ、酵母エキス１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐ
Ｈ７．０）の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラ
スコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに
ｍ−キシレン１ｍｌを添加後、シュードモナス・ＳＰ．
　ＭＹ−６菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振盪培養
した。

【００２５】また、上記と同様の滅菌培地１０００ｍｌ
を５０００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、ｍ−キシレン
１０ｍｌを添加後、上記振盪培養液２０ｍｌを接種し、
これを３０℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養
液の１０００ｍｌを遠心分離（８００ｒｐｍ　，１５分
間、４℃）して集菌した該集菌菌体を酵素源とした。

【００２６】（実施例１）上記の方法で調製した菌体を
、反応液（１００ｍＭリン酸緩衝液、インドール２ｍＭ
、ｐＨ７．０）１０００ｍｌに懸濁後、３０００ｍｌ容
の通気攪拌装置に入れ、表１に示した各実験区のＤＯ濃
度にて３０℃で１０時間反応させた。生成したインジゴ
量を、常法［Ｈ．　ＫＥＩＬ，　Ｃ．Ｍ．　ＳＡＩＮＴ
　ａｎｄ　Ｐ．Ａ．　ＷＩＬＬＩＡＭＳ，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１６９，Ｎｏ
．２，Ｐ．７６４−７７０（１９８７）　］に従い定量
した。結果を表１に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、酵素法により、
高収率でインジゴを製造することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　インド−ルを含有する水溶液に、溶存
   酸素濃度を０．５〜３．５ｐｐｍ　に維持しながら、シ
   ュードモナス属に属するインジゴ生成能を有する菌体又
   はその処理物を作用させ、酵素法によりインジゴを製造
   する方法。
2. 【請求項２】　　インジゴ生成能を有するシュードモナ
   ス・ＳＰ．　ＭＹ−６菌株。