JPH04287690A - 酵素法によるインジゴの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インドールから酵素法
により、効率よくインジゴを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、インジゴは工業用染料として広く
利用されており、化学合成法により製造されている。し
かしながら、化学合成法は、反応が多段階になるので収
率が悪く、また化学的分解による副生物が多い等の欠点
があった。

【０００３】また、インジゴを製造する種々の方法の中
で有望視されている方法として、キシレンオキシゲナー
ゼ又はナフタレンジオキシゲナ−ゼを含有する微生物を
酵素触媒として用い、インド−ルから製造する方法が知
られている（Ｂｕｒｔ　Ｄ．Ｅｎｓｌｅｙ，Ｂａｒｒｙ
　Ｊ．Ｒａｔｚｋｉｎ，Ｔｉｍｔｈｙ　Ｄ．Ｏｓｓｌｕ
ｎｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｙ　Ｊ．Ｓｉｍｏｎ；Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，ｖｏｌ．２２２，Ｐ．１６７−１６９（１９８３
））。しかしながら、実際的な製造技術を確立するには
至っておらず、酵素活性を低下させることなく、効率良
くインジゴを製造する方法の開発が望まれている。

【０００４】また、インジゴ生成能を有する微生物又は
その処理物の存在下に、インド−ルからインジゴを製造
するときに、インド−ル濃度が微生物のインジゴ生成活
性に影響する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酵素
法により、効率よくかつ高収率でインジゴを製造するこ
とを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、インジゴ
生成能を有する菌体又はその処理物を利用して酵素法に
よりインジゴを製造する方法を確立するために、反応条
件等について鋭意検討した結果、インド−ルを特定の濃
度を超えないように調節して作用させることにより、加
算的なインジゴ生成阻害傾向が回避でき、高収率でイン
ジゴを生成させることができることを見出し、本発明を
完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、インド−ルを含有す
る水溶液に、反応液中のインド−ル濃度が０．８ｍＭを
超えないように調節して、シュードモナス属に属するイ
ンジゴ生成能を有する菌体又はその処理物を作用させ、
酵素法によりインジゴを製造する方法である。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいては、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を
有する菌が用いられるが、特にシュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）　・ＳＰ．　ＭＹ−６菌株が好適に
用いられる。本菌株の菌学的性質とその分類学的性質は
次の通りである。

【０００９】Ｉ．顕微鏡的性質 （ａ）　細胞の形及び大きさ：桿菌、１×２〜４μｍ（
ｂ）　多形性の有無：無し （ｃ）　運動性：有り （ｄ）　鞭毛の着生状態：極鞭毛 （ｅ）　胞子の有無：無し （ｆ）　グラム染色：陰性

【００１０】ＩＩ．培養的性質 （ａ）　肉汁寒天培地における生育：有り（ｂ）　資化
可能な炭素源：グルコース、酢酸、コハク酸、フマル酸
、Ｌ−リンゴ酸、乳酸、クエン酸、グリセロール、Ｌ−
バリン、β−アラニン、ＤＬ−アルギニン

【００１１】
ＩＩＩ．生育条件 （ａ）　生育温度：１０〜４０℃ （ｂ）　生育ｐＨ：６〜８ （ｃ）　酸素要求性：好気性

【００１２】ＩＶ．生理学的性質 （ａ）　オキシダーゼ：陽性 （ｂ）　カタラーゼ：陽性 （ｃ）　ＤＮＡ中のグアニン、シトシン（ＧＣ）含量：
６１％ （ｄ）　デンプンの加水分解：陰性 （ｅ）　プロトカテキン酸の分解：陽性

【００１３】以
上の諸性質を「バージーズ・マニュアル・オブ・システ
マティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）」第２巻（１９８６年）より検索した。 その結果、本菌はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ｕｓ）　属に属する菌株であると同定されたが、種につ
いては炭素源の資化性その他の性質から合致しない点が
あり、新種と考えられた。従って本発明においてはシュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　・ＳＰ．　Ｍ
Ｙ−６と呼称することとする。なお本菌株は工業技術院
微生物工業技術研究所に微生物寄託番号微工研菌寄第１
１９６３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９６３）として寄託
されている。

【００１４】微生物の培養に用いる培地の炭素源として
は、グルコース等の炭水化物、キシレン、トルエン等を
利用できるが、中でもｍ−キシレン、ｐ−キシレンが好
ましい。

【００１５】窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩
；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等
の硝酸塩；アンモニア等を用いることができる。

【００１６】無機物としては、リン酸カリウム、硝酸マ
グネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等を用いることができ
る。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の栄養
源を添加することができる。

【００１７】培養温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは
３０℃〜４０℃であり、培養中の培地のｐＨは６〜９、
好ましくは７〜８である。培養は、好気的に行う。

【００１８】培養した菌体を本酵素反応に利用する場合
、該菌体はそのまま使用することができるが、菌体の処
理物、例えば該菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、
又はその破砕物をさらに水等で抽出した抽出物、或いは
該抽出物をさらに硫安等で処理して酵素成分を沈殿させ
た粗精製物の形で使用することもでき、さらに、該菌体
又はこれら処理物を必要により固定化して用いることも
できる。

【００１９】該菌体又はその処理物をインドールと反応
させるには、通常の酵素反応と同様に、例えば０．１Ｍ
　リン酸緩衝液（ｐＨ６〜９）あるいは水溶液（ｐＨ６
〜９）中で、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃の
温度で、通常１０〜７２時間反応させる。反応は、攪拌
しながら行うのが好ましい。

【００２０】反応液中の平均インド−ル濃度が０．８ｍ
Ｍを超えないように調節するには、反応液の最初のイン
ド−ル添加量は勿論、反応液中でインド−ルを連続的に
又は逐次的に反応液に添加する場合の添加量を調節する
。 反応液中のインド−ル濃度は、例えば比色定量法（Ｏ．
Ｈ．Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ：「Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　」，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　ＮｅｗＹｏｒ
ｋ（１９６２），ｖｏｌ　５，　ｐ．７９４〜８０６　
）に従い、逐次定量することにより管理することができ
る。

【００２１】微生物菌体又はその処理物の添加量は、特
に制限されるものではないが、一般に、０．５〜１０％
（ｗｔ／ｖｏｌ）　が用いられる。反応後、反応液から
のインジゴの分離、精製は、それ自体該知の方法、例え
ば、溶媒（クロロホルム）抽出等の方法で行うことがで
きる。

【００２２】

【実施例】（参考例）（ＮＨ２　）ＳＯ４　：３ｇ，Ｋ
Ｈ２　ＰＯ４　：０．５ｇ，Ｋ２　ＨＰＯ４　：０．５
ｇ，ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ：０．５ｇ，ＣａＣｌ２
　・２Ｈ２　Ｏ：１０ｍｇ，ＮａＣｌ：０．５ｇ，Ｆｅ
ＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ：１０ｍｇ、酵母エキス１ｇ及び
蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ７．０）の培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１
５分間滅菌処理したものにｍ−キシレン１ｍｌを添加後
、シュードモナス・ＳＰ．　ＭＹ−６菌株を植菌し、３
０℃にて２４時間振盪培養した。

【００２３】また、上記と同様の滅菌培地１０００ｍｌ
を５０００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、ｍ−キシレン
１０ｍｌを添加後、上記振盪培養液２０ｍｌを接種し、
これを３０℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養
液の１００ｍｌを遠心分離（８００ｒｐｍ，１５分間、
４℃）して集菌した該集菌菌体を酵素源とした。

【００２４】（実施例１）上記の方法で調製した菌体を
、反応液（１００ｍＭリン酸緩衝液　ｐＨ　７．０）１
００ｍｌに懸濁後、上限のインド−ル濃度が表１に示し
た各実験区のようになるように反応途中でインド−ルを
添加調節し、振盪しながら３０℃で反応させた。また、
各区のインド−ルの最終添加濃度はいずれも６ｍＭであ
った。２４時間反応させた後、生成したインジゴ量を、
常法［Ｈ．　ＫＥＩＬ，　Ｃ．Ｍ．　ＳＡＩＮＴａｎｄ
　Ｐ．Ａ．　ＷＩＬＬＩＡＭＳ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１６９，Ｎｏ．２，
Ｐ．７６４−７７０（１９８７）　］に従い定量した。 結果を表１に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、酵素法により、
高収率でインジゴを製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　インド−ルを含有する水溶液に、反応
   液中のインド−ル濃度が０．８ｍＭを超えないように調
   節して、シュードモナス属に属するインジゴ生成能を有
   する菌体又はその処理物を作用させ、酵素法によりイン
   ジゴを製造する方法。