JP2001037469A - エピクロロヒドリンの微生物分解 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 エピクロロヒドリンの分解のための強力な新
規微生物及びその微生物を利用するエピクロロヒドリン
の分解、特に排水、廃液中に含有されるエピクロロヒド
リンを分解する方法の提供。 【解決手段】 新規な微生物アルスロバクター・ウレア
ファシエンス３ＣＬ７（Arthrobacter ureafaciens 3CL
7）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５０菌株、ミクロバクテリウ
ム・スピーシズＣＬ１３（Microbacterium sp. CL13）
ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５２菌株又はエルヴィニア・カロ
トボラ４ＣＬ５（Erwinia carotovora 4CL5）ＦＥＲＭ
Ｐ−１７４５１菌株から選ばれる菌株を用いたエピク
ロロヒドリンの分解方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はエピクロロヒドリン
の製造又はエピクロロヒドリンを使用する工程から排出
されるエピクロロヒドリンを含む排水の処理する方法に
関する。エピクロロヒドリンは、化学品の合成原料とし
て大量に製造・消費されている。

【０００２】

【従来の技術】エピクロロヒドリンの様なハロゲン炭素
の結合を持つ有機化合物の工業的な規模での処理には特
別な難しさがある。すなわち、炭素−ハロゲン共有結合
が安定である為に、これを切断するのに多大のコストを
要する事である。従来これらハロゲン化された有機物質
は化学的・物理的方法及び生物的方法により分解され
る。ここで使用される物理的方法としてはたとえば活性
炭による吸着、及び抽出法である。しかし、この方法は
ハロゲン化有機化合物で汚染された大量の活性炭や抽出
物が生じるという問題があり、これらの処理に多大の費
用がかかる。次に化学的な処理としては多くの場合酸化
的雰囲気で高温、高圧条件でハロゲン化合物を分解する
方法である。例えば、特開平６−３２０１９４号公報及
び米国特許５４７８４７２号公報に示されている様に、
排水を熱的アルカリ処理後、セルロモナス属細菌等のグ
ラム陽性菌及びアルカリゲネス属細菌等のグラム陰性菌
を使用して生物処理を行っている。さらに、場合により
化学的酸化処理を行っている。しかしこの方法では特別
な装置が必要な上エネルギーコストが大きく、経済的な
処理法とは言えない。特開昭５０−０３２７６７号公報
には電気分解したのちにイオン交換膜で処理する方法も
示されている。がこれも同様に多くのエネルギーを必要
とする。その他、有機ハロゲン化合物と高い反応性を持
つ金属又は金属水素化物で処理する方法もあるが、これ
もコストが高く又分解率も十分とは言えない。

【０００３】以上の様に現状では、経済性のあるすぐれ
たエピクロロヒドリンの分解法がないために多大のエネ
ルギーを使用して廃液の焼却処理を余儀なくされてい
る。しかし、近年のようにダイオキシンの発生が世界的
に大きな問題になっており、燃焼する事も難しくなって
おり、環境に負荷の少ない、経済的な処理法が求められ
ていた。

【０００４】マリケンら（Eur. J. Biochem. 202, 1217
(1991)）は、アグロバクテリウム・ラジオバクター（A
grobacterium radiobacter AD1）が、エピクロロヒドリ
ンを単一の炭素源として生育することについて報告して
いるが、本発明の微生物とは異なる。またエピクロロヒ
ドリンの培養濃度は、5mMまでである。笠井ら（Agric.
Biol. Chem. 54. 3185 (1990)）は、シュウドモナス・
スピーシズ（Pseudomonas sp. OS-K-29）が、エピクロ
ロヒドリンを単一 の炭素源として生育することを述べ
ているが、本発明の微生物とは異なる。またエピクロロ
ヒドリンの培養濃度は、約25mM（0.2%）までである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エピ
クロロヒドリンの分解のための強力な新規微生物及びそ
の微生物を利用するエピクロロヒドリンの分解、特に排
水、廃液中に含有されるエピクロロヒドリンを分解する
方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、エピクロロ
ヒドリンの新しい生物化学的処理方法を開発するため
に、自然界に菌株を広範囲にスクリーニングしたとこ
ろ、いくつかの細菌がエピクロロヒドリンを分解するこ
とを見出した。すなわち、日本の山口県の土壌中から、
高濃度のエピクロロヒドリンを分解する新たな菌種を取
得し、これら菌株をエピクロロヒドリンを含む水性媒体
と接触させることによるエピクロロヒドリンの生物化学
的処理方法を提供することにより解決される。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）微生物 本発明において新たに分離された３ＣＬ７株、ＣＬ１３
株及び４ＣＬ５株は、山口県下の土壌からスクリーニン
グして単離したものであり、高いエピクロロヒドリン分
解活性を有する。これら新菌株は、以下に示すものであ
る。

【０００８】アルスロバクター・ウレアファシエンス３
ＣＬ７株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ Ｐ−１７４５０として寄託されている。

【０００９】 ミクロバクテリウム・スピーシズ ＣＬ
１３は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１７４５２として寄託されている。

【００１０】エルヴィニア・カロトボラ４ＣＬ５は、工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７
４５１として寄託されている。以下に、これら新菌株の
菌学的性質を示す。

【００１１】 ３ＣＬ７株 ＣＬ１３株 ４ＣＬ５株 （ａ）形態的性質 １ 細胞の形 桿菌 桿菌 桿菌 ２ 細胞の大きさ（μｍ） ０．６×１ ０．６×２ ０．８×１ ２ 多形成の有無 ＋ ＋ − ３ 運動性の有無 − − ＋ ４ 胞子の有無 − − − （ｂ）培養的性質 １ 肉汁寒天平板培養（３０℃、３日間） イ）コロニー形状（直径、mm） ２ ２ ３ ロ）コロニーの形 円形 円形 円形 ハ）コロニーの表面の形状 平滑 平滑 平滑 ニ）コロニーの隆起状態 低凸状 低凸状 低凸状 ホ）コロニーの周縁 全縁なめらか 全縁なめらか 全縁なめらか ヘ）コロニーの色調 黄色 黄色 クリーム ト）コロニーの透明度 不透明 不透明 不透明 チ）コロニーの光沢 あり あり 鈍光沢 リ）可溶性色素の生成 なし なし なし ２ 肉汁寒天斜面培養（３０℃、３日間） イ）生育の良否 良好 良好 良好 ロ）コロニーの光沢 あり あり あり ３ 肉汁液体培養（３０℃、７日間） イ）表面の生育 あり あり あり ロ）濁度 濁る 濁る 濁る ハ）沈殿 粉状 粉状 粉状 ニ）ガス発生 なし なし なし ４ 肉汁ゼラチン（３０℃、７日間） ゼラチン液化 ＋ − − ５ リトマス・ミルク （３０℃、７日間） 青変 赤変 青変 （ｃ）生理学的性質 １ グラム染色 ＋ ＋ − ２ 硝酸塩の還元 − − ＋ ３ 脱窒反応 − − − ４ ＭＲテスト − − − ５ ＶＰテスト − − ＋ ６ インドール生成 − − ＋ ７ 硫化水素の生成 − − − ８ デンプンの加水分解 − − − ９ クエン酸利用 イ）Koser ＋ ＋ ＋ ロ）Christensen ＋ ＋ ＋ 10 色素の生成 イ）King A培地 − − − ロ）King B培地 − − − 11 ウレアーゼ − − − 12 オキシダーゼ − − − 13 カタラーゼ ＋ ＋ ＋ 14 生育の範囲 イ）ｐＨ ５−９ ６−９ ６−８ ロ）温度 ３０℃ ＋ ＋ ＋ ３７℃ ＋ − − ４１℃ ＋ − − 15 酸素に対する態度 通性嫌気性 好気性 通性嫌気性 16 Ｏ−Ｆテスト（グルコース） 酸化的 酸化的 発酵的 17 糖類からの酸及びガスの生成 酸 ガス 酸 ガス 酸 ガス 1 Ｌ−アラビノース − − − − ＋ − 2 Ｄ−キシロース − − − − ＋ − 3 Ｄ−グルコース − − − − ＋ ＋ 4 Ｄ−マンノース − − − − ＋ − 5 Ｄ−フラクトース − − − − ＋ − 6 Ｄ−ガラクトース − − − − ＋ − 7 マルトース − − − − ＋ − 8 シュークロース − − ＋ − ＋ − 9 ラクトース − − − − ＋ − 10 トレハロース − − − − ＋ − 11 Ｄ−ソルビット − − − − ＋ − 12 Ｄ−マンニット − − − − ＋ − 13 グリセリン − − − − ＋ − 14 デンプン − − − − ＋ − 15 ラフィノース − − − − ＋ − 16 イヌリン − − − − ＋ − 17 Ｄ−リボース − − − − ＋ − 18 ソルボース − − ＋ − ＋ − 19 カルボキシメチルセルロース − − − − − − 20 グリコーゲン − − − − − − （ｄ）その他の諸性質 ビタミン要求性 なし なし なし アルギニンの分解 ＋ ＋ − ヒスチジノールの分解 − − − ニコチンの分解 − − − 耐塩性 ５％ ＋ − ＋ ７％ ＋ − − １０％ − − − フェニルアラニン脱アミノ酵素 − − − 細胞壁アミノ酸 リジン オルニチン

【００１２】上記の菌学的性質に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー
（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology）の
記述に従って、前記３ＣＬ７、ＣＬ１３、４ＣＬ５の各
菌株を次のように同定した。

【００１３】すなわち、３ＣＬ７株は、グラム陽性、短
桿菌（０．６×１μｍ）、黄色色素産生、胞子の形成な
し、運動性なし、通性嫌気性、オキシダーゼ陰性、各種
炭水化物の資化能なし、細胞の経時的形態変化において
球菌−桿菌の生活環が観察される。また、グルコースか
らの酸の生成は見られず、細胞壁にはリジンを含むこと
からアルスロバクター属に属する。また、デンプンを加
水分解しないこと、ニコチンおよびヒスチジノールの資
化性がないこと、２−ヒドロキシピリジン寒天上で緑色
の色素を呈さないことから、アルスロバクター・ウレア
ファシエンスと同定した。

【００１４】ＣＬ１３株は、グラム陽性、短桿菌（０．
６×２μｍ）、胞子の生成なし、好気性、オキシダーゼ
陰性、各種炭水化物の資化能なし、黄色色素産生、運動
性なし。細胞壁アミノ酸分析よりジアミノピメリン酸を
含まずオルニチンを含むこと、デンプンを加水分解しな
いこと、グルコースからの酸を産生しないこと、１６Ｓ
ｒＤＮＡの配列解析からミクロバクテリウム・ルテオ
ラムに対して９５．８％と高い相同性を示した。しか
し、同一の性質を示す種が知られていないことから、ミ
クロバクテリウム属に属する一細菌として、ミクロバク
テリウム・スピーシズと同定した。

【００１５】４ＣＬ５株は、グラム陰性、短桿菌（０．
８×１μｍ）、胞子の生成なし、運動性あり、通性嫌気
性、カタラーゼ陽性、グルコースを発酵的に分解し酸お
よびガスを産生する。オキシダーゼ陰性、クエン酸の利
用性あり、インドール産生あり、硫化水素産生なし、ア
セトイン産生あり、グルコース、Ｄ−マンニトール、イ
ノシトール、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ラムノースなどの
各種炭水化物の資化能あり、マロン酸塩の利用性がな
い、マルトースおよびトレハロースから酸を産生、アセ
トインを生成することから、エルヴィニア・カロトボラ
と同定した。

【００１６】なお、これらの菌株に変異を生じさせて一
層生産性の高い菌株を得ることもできる。また、これら
の菌株の細胞中に存在するエピクロロヒドリンの分解に
関与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクタ−例え
ばプラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿
主、例えばエッシェリッヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）や酵母のごとき異種宿主もしくはア
ルスロバクター属、ミクロバクテリウム属、あるいはエ
ルヴィニア属細菌のごとき同種宿主を形質転換すること
により、本発明のエピクロロヒドリン分解株を人為的に
創成することもできる。

【００１７】（２）微生物の培養方法 前記の微生物を培養して本発明のエピクロロヒドリン分
解活性株を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば硫
安、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複
数種類を含有する。また、この培地には必要に応じて炭
素源としてグルコ−ス、デンプン、グリセリン等を加え
ることができる。この培地には無機塩類、例えばリン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加
えることが好ましい。また、酵素の誘導物質となりうる
少量のエピクロロヒドリン等、エポキシド化合物を添加
することも好ましい。エピクロロヒドリンの添加量は、
基礎培地の組成、培養する菌株の性質により異なるが、
およそ０．０１〜５％である。

【００１８】培養は固体培地又は液体培地のいずれを用
いてもよいが、高活性株を多量に得るためには、液体培
地を用い、振盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条
件下で培養を行うのが好ましい。培養温度は菌が生育
し、エピクロロヒドリンが分解される温度範囲内であれ
ばいずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜４５℃で
ある。ｐＨは５〜１１、好ましくは６〜１０の範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜７２時間である。

【００１９】 細菌菌体の様態としては、特に制限はな
いが、細胞を含有する培養液、エピクロロヒドリン分解
酵素源を含む処理物、培養上清液、培養上清液又は、培
養液から分離した菌体の処理物、これから得た酵素剤、
さらに、これらの酵素又は、酵素含有物を常法によって
固定化したもの等、酵素反応手段として実施される方法
であれば反応に供することができる。

【００２０】（３）エピクロロヒドリンの分解 エピクロロヒドリンの分解の様態については、特に制限
はないが、通常は前記の細菌菌体を含む反応液に基質と
してのエピクロロヒドリン、及び水が含まれていれば反
応が進行する。

【００２１】原料のエピクロロヒドリンは反応を阻害し
ない程度であれば、反応液中の細菌菌体の濃度等により
異なり特に限定されないが、１〜５００ｇ／Ｌとするの
が便利である。エピクロロヒドリンはバッチ式反応にお
いては反応開始時に一度に添加することもでき、又反応
の進行と共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加
することもできる。

【００２２】反応媒体としては、水、又は、アセトン、
アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミド等を含む水性液、例えば、水性緩衝液を用いる
ことができる。緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸
緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等を使用することができ
る。また、ケトン、エーテル、炭化水素、芳香族オレフ
ィン、ハロゲン化炭化水素、有機酸エステル、アルコー
ル、ニトリル等水と混合しない有機溶媒をも用いること
もできる。例えば、メチルブチルケトン、イソプロピル
エーテル、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、シクロ
ヘキサン、四塩化炭素、クロロフォルム、二塩化メチレ
ン、トリクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ヘキサノー
ル、オクタノール等を使用することができる。また、そ
れらの有機溶媒の混合物を使うこともできるし、水を飽
和させた有機溶媒、水性緩衝液との二層系あるいは、ミ
セル、逆ミセル、エマルジョンとして反応させることも
できる。

【００２３】反応のｐＨとしては、ｐＨ５〜１１、好ま
しくはｐＨ６〜１０とする。反応の温度も反応のｐＨと
同様に考えることができるが、通常は２０〜６０℃、好
ましくは２５〜５０℃である。反応時間は、特に限定さ
れないが、反応混合物の基質濃度、酵素力価等、に依存
して基質エピクロロヒドリンが充分に分解されるまで反
応を維持する。

【００２４】

【実施例】次に実施例によりこの発明をさらに具体的に
説明する。

【００２５】実施例１ ペプトン０．５％、ＮａＣｌ０．３％、肉エキス０．３
％を含有し、ｐＨ７．０に調製したＮｕｔｒｉｅｎｔ培
地５ｍＬを試験管に入れ、１２０℃、１５分間加熱殺菌
した後、エピクロロヒドリンを０．５から５００ｍＭと
なるように加え、それぞれ、アルスロバクター・ウレア
ファシエンス３ＣＬ７（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５０）、
ミクロバクテリウム・スピーシズＣＬ１３（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７４５２）、エルヴィニア・カロトボラ４ＣＬ５
（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５１）を接種し３０℃で２日間
振盪培養した。アルスロバクター・ウレアファシエンス
３ＣＬ７は、３０ｍＭまで、ミクロバクテリウム・スピ
ーシズＣＬ１３は、２６ｍＭまで、エルヴィニア・カロ
トボラ４ＣＬ５は、２４ｍＭまでのエピクロロヒドリン
での生育が認められた。

【００２６】実施例２ Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．５６％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．２４
％、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４０．１％ 、食塩０．１％、Ｍ
ｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０２％、酵母エキス０．０１
％、ビタミン混液、微量金属塩を含有し、ｐＨ７．０に
調製した培地０．４Ｌを１２０℃、１５分間加熱殺菌し
た後、エピクロロヒドリンを１０ｍＭとなるように（３
７０ｍｇ／０．４Ｌ）加え、アルスロバクター・ウレア
ファシエンス３ＣＬ７（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５０）を
接種し３０℃で振盪培養した。培地中の塩素イオンの濃
度は、Ｉｗａｓａｋｉの方法（Ｉｗａｓａｋｉ他、Ｂｕ
ｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ， ２５，
２５６ （１９５２）．）により測定した。培地中に
含まれていた１０ｍＭのエピクロロヒドリンは培養経過
と共に減少し、約４０時間で完全に消失した。菌の生育
は、約１００時間で最高になった。培地中の塩素イオン
濃度は約１５０時間後に最高になり、１０ｍＭに達し
た。

【００２７】実施例３ 実施例２と同様の培地を調製し、アルスロバクター・ウ
レアファシエンス３ＣＬ７（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５
０）を接種し３０℃で振盪培養した。０．４Ｌの培地か
らの菌体を生理的食塩水で洗浄した後、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬに懸濁し、エピクロロヒ
ドリンを１０ｍＭなるよう添加して、３０℃で１６０ｒ
ｐｍで振盪した。１０ｍＭ含まれていたエピクロロヒド
リンは時間経過と共に減少し、約１４０分間で完全に消
失した。

【００２８】実施例４ 実施例２と同様の培地を調製し、ミクロバクテリウム・
スピーシズＣＬ１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５２）を接
種し３０℃で振盪培養した。培地中に含まれていた１０
ｍＭのエピクロロヒドリンは培養経過と共に減少し、約
１００時間で完全に消失した。菌の生育は、約１００時
間で最高になった。培地中の塩素イオン濃度は約１２０
時間後に最高になり、１０ｍＭに達した。

【００２９】実施例５ 実施例２と同様の培地を調製し、ミクロバクテリウム・
スピーシズＣＬ１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５２）を接
種し３０℃で振盪培養した。０．４Ｌの培地からの菌体
を生理的食塩水で洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）４０ｍＬに懸濁し、エピクロロヒドリン
を１０ｍＭとなるよう添加して、３０℃で１６０ｒｐｍ
で振盪した。１０ｍＭ含まれていたエピクロロヒドリン
は時間経過と共に減少し、約７０分間で完全に消失し
た。

【００３０】実施例６ 実施例２と同様の培地を調製し、エルヴィニア・カロト
ボラ４ＣＬ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５１）を接種し３
０℃で振盪培養した。培地中に含まれていた１０ｍＭの
エピクロロヒドリンは培養経過と共に減少し、約８０時
間で完全に消失した。菌の生育は、約１５０時間で最高
になった。培地中の塩素イオン濃度は約１２０時間後に
最高になり、５ｍＭに達した。

【００３１】実施例７ 実施例２と同様の培地を調製し、エルヴィニア・カロト
ボラ４ＣＬ５（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５１）を接種し３
０℃で振盪培養した。０．４Ｌの培地からの菌体を生理
的食塩水で洗浄した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）４０ｍＬに懸濁し、エピクロロヒドリンを１０
ｍＭとなるよう添加して、３０℃で１６０ｒｐｍで振盪
した。１０ｍＭ含まれていたエピクロロヒドリンは時間
経過と共に減少し、約１５分間で完全に消失した。

【００３２】

【発明の効果】本発明によってもたらされる新規なエピ
クロロヒドリンの分解のための強力な新規微生物及びそ
の微生物を利用するエピクロロヒドリンの分解、特に排
水、廃液中に含有されるエピクロロヒドリンの効率良い
分解方処理が可能となる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルスロバクター・ウレアファシエンス
   ３ＣＬ７（Arthrobacter ureafaciens 3CL7）ＦＥＲＭ
   Ｐ−１７４５０菌株、ミクロバクテリウム・スピーシ
   ズＣＬ１３（Microbacterium sp. CL13）ＦＥＲＭ Ｐ
   −１７４５２菌株又はエルヴィニア・カロトボラ４ＣＬ
   ５（Erwinia carotovora 4CL5）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４
   ５１菌株から選ばれる菌株を用いたエピクロロヒドリン
   の分解方法。
2. 【請求項２】 アルスロバクター・ウレアファシエンス
   ３ＣＬ７（Arthrobacter ureafaciens 3CL7）ＦＥＲＭ
   Ｐ−１７４５０菌株。
3. 【請求項３】 ミクロバクテリウム・スピーシズＣＬ１
   ３（Microbacteriumsp. CL13）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５
   ２菌株。
4. 【請求項４】 エルヴィニア・カロトボラ４ＣＬ５（Er
   winia carotovora 4CL5）ＦＥＲＭ Ｐ−１７４５１菌
   株。