JP3514799B2 - リパーゼ及びこれを産生する微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、有機溶媒に耐性を有
し、かつリパーゼを産生する微生物及びこの微生物が産
生するリパーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】リパー
ゼはトリグリセリドをグリセリンと脂肪酸に分解する酵
素である。現在、リパーゼは、洗剤、パルプ加工、合成
反応等の多くの用途において有用性が見込まれ、非常に
研究が活発化している酵素である。

【０００３】しかし、リパーゼを用いた合成反応におい
ては、原料が水に不溶であり、反応が不均一となること
から、大規模な反応系に利用するには技術的課題が多
く、アミラーゼ、プロテアーゼのような大規模な工業化
は困難であった。従って、現在、固定化法等について種
々の検討がなされている状況である。

【０００４】また、リパーゼを用いた合成反応は、通常
常温常圧下で進行するが、原料である油脂類は常温常圧
下では固体又は半固体状である場合が多く、原料を有機
溶媒により溶解して反応させることが必要となる。

【０００５】一方、洗剤及びパルプ加工においても、リ
パーゼは有機溶媒、その他の薬剤の共存下で使用される
場合が多い。

【０００６】従って、工業的には、有機溶媒に対して耐
性を持ち、酵素活性を維持するリパーゼ及びこれを産生
する微生物が望まれていた。

【０００７】これに対し、有機溶媒たるトルエンに耐性
を有する微生物（特開平１−１２４３９４号公報）、耐
熱性リパーゼを産生するシュードモナス ＫＷＩ−４株
（特開平４−４１９９３号公報）、微生物への影響の小
さい有機溶媒から影響の大きなものへ順次微生物を接触
させて有機溶媒耐性微生物を取得する方法（特開平３−
２６６９７６号公報）等の報告があるが、耐性を有する
有機溶媒の種類が少ない、耐性が弱い等の欠点がある。
また、リパーゼを産生し、かつ種々の有機溶媒に耐性を
有する微生物については報告されていない。

【０００８】従って本発明の目的は、多種類の有機溶媒
に対し耐性を有し、工業的に有用な微生物およびリパー
ゼを提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】斯かる実状に鑑み本発明
者らは鋭意研究を行った結果、油脂類と有機溶媒の共存
する培地を用いてスクリーニングする方法を見出し、こ
の方法を用いて広く自然界より目的とする微生物を探索
した結果、多種類の有機溶媒に対し耐性を有する微生物
及びリパーゼを見出し本発明を完成した。

【００１０】すなわち本発明は、シュードモナス エル
ギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａ）ＬＳＴ−０３の産生するリパーゼであって、作用
温度２０〜６０℃、作用pH６〜１０、最適pHが９．０〜
９．５で、かつドデカン、２−プロパノール、１−ヘプ
タノール、トルエン、ｎ−デカン、ｎ−オクタン、１‐
オクタノール、メタノール、ｎ−ヘプタン、ｐ−キシレ
ン、シクロヘキサン、クロロホルム、デカノール、アセ
トン、エタノール、ジメチルスルホキシド、ベンゼン又
はｎ−ヘキサン共存下において、水中よりも高い酵素活
性を有することを特徴とするリパーゼを提供するもので
ある。また、本発明は上記リパーゼを産生するシュード
モナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）ＬＳＴ−０３と命名され、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４０８６
として寄託された微生物を提供するものである。

【００１１】本発明において微生物が耐性を有する有機
溶媒には、ｌｏｇＰ値が２以上の有機溶媒から選ばれる
１種又は２種以上の混合物が含まれる。例えばトルエ
ン、シクロヘキサン、１−オクタノール、ｎ−ヘキサ
ン、ベンゼンなどである。

【００１２】本発明の微生物は、土壌サンプル等を油脂
類と有機溶媒を含有する培地を用いて培養することによ
り得られる。ここで用いる油脂類としては、生ミルク、
ヒマシ油、牛脂、オリーブ油、大豆油、Ｔｗｅｅｎ８０
（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等が
挙げられ、用いる有機溶媒は、ｌｏｇＰ値を参考にして
決定することが好ましい。ｌｏｇＰ値は分配係数（Ｐ）
の対数で、分配係数（Ｐ）は、混ざり合わない２種の溶
媒系における平衡状態での物質の濃度比で、活性度の比
として表され、物質の濃度が小さい場合は、その濃度を
活動度とみなすことができる（寺田引、化学の領域、増
刊１２２号ｐ７３，１９７９）。ここでは、ｌｏｇＰ値
が３．１（ｐ−キシレン）〜３．４（シクロヘキサン）
の範囲の有機溶媒が好ましい。

【００１３】ここで基本培地としては、後述する微生物
の通常の培養と同様とすれば良い。この培地１０mlに対
して上記油脂類０．００５〜２ｇ、好ましくは０．１〜
１．５ｇ加え、さらに上記有機溶媒類１〜９ml、好まし
くは２〜５ml加える。この培地に土壌サンプルを接種
し、培養温度２５〜３０℃、１〜３週間培養を行う。そ
の培養液１０〜５００μｌ好ましくは５０〜２００μｌ
を平板培地に塗布し、さらに上記有機溶媒類１〜１５ml
好ましくは５〜１０mlを平板培地に流入し、１〜５日
間、２５〜３０℃で培養する。得られたコロニーを、そ
れぞれ平板培地に塗布してシングルコロニー化を行うこ
とにより、本発明の微生物を得ることができる。

【００１４】このようにして得られた本発明の微生物と
しては、シュードモナス属に属し、リパーゼ産生能を有
し、かつ有機溶媒に対して耐性を有する限り、特に制限
されないが、例えばシュードモナス エルギノーザＬＳ
Ｔ−０３株が挙げられ、当該菌株は下記に示すような菌
学的性質を示す。なお、この菌学的性質の検討は、「微
生物の分類と同定」（長谷川武治著、学会出版センタ
ー）、「医学細菌同定の手引き」（Ｓ．Ｔ．Ｃｏｗａｎ
著、坂崎利一訳、近代出版）、「新細菌培地学講座」
（坂崎利一著、近代出版）に記載された方法、培地組成
を用いた。

【００１５】また、有機溶媒（炭化水素類、アルコール
類）耐性については、寒天を含む平板培地上面に、有機
溶媒を流入し、３０℃で１日間静置培養を行った結果の
生育状況を評価した（試験例１）。

【００１６】

【表１】菌学的性質 （ａ）形態 １．細胞の形及び大きさ：長さ１．２〜２．５ミクロ
ン、幅０．５〜０．７ミクロンの桿菌 ２．細胞の双形成：なし ３．運動性：あり。極鞭毛を有する（１本）。 ４．胞子：なし ５．グラム染色：陰性 ６．抗酸性：陰性

【００１７】

【表２】（ｂ）生育状態 １．肉汁寒天平板培養：円形、半レンズ状、表面は滑ら
かで光沢がある。わずかに褐色。青緑の色素生産。 ２．肉汁寒天斜面培養：生育は普通。糸状、表面は滑ら
かで光沢がある。わずかに褐色。 ３．肉汁液体培養：生育は普通。混濁。 ４．肉汁ゼラチン穿刺培養：上部に生育。上部のみ液
化。 ５．リトマスミルク：ミルクの凝固なし。赤変なし。

【００１８】

【表３】（ｃ）生理学的性質 １．硝酸塩の還元：陽性 ２．脱窒反応：陽性 ３．ＭＲテスト：陰性 ４．ＶＰテスト：陰性 ５．インドールの生成：陰性 ６．硫化水素の生成：陽性 ７．加水分解 デンプン：陰性 ゼラチン：陽性 ポリヒドロキシ酪酸：陰性 Ｔｗｅｅｎ２０：陽性 Ｔｗｅｅｎ４０：陽性 Ｔｗｅｅｎ６０：陽性 Ｔｗｅｅｎ８０：陽性 ８．クエン酸の利用：陽性 ９．無機窒素の利用 硫酸アンモニウムの利用：陽性 硝酸ナトリウムの利用：陽性 10．色素の生産：ＫｉｎｇＡ，Ｂ培地の両方で緑色の色
素を生産する。 11．ウレアーゼ：陰性 12．オキシダーゼ：陽性 13．カタラーゼ：陽性 14．生育の範囲 pH：３．５〜１０．５で生育。 温度：４１℃付近以下で生育するが、４℃、４５℃では
生育がみられない。 15．酸素に対する態度：好気性。 16．Ｏ−Ｆテスト：好気的に酸を生成。 17．糖類から酸及びガスの生成 Ｌ−アラビノース：酸もガスも発生せず。 Ｄ−キシロース：酸もガスも発生せず。 Ｄ−グルコース：酸を生成、ガスは発生せず。 Ｄ−マンノース：酸もガスも発生せず。 Ｄ−フルクトース：酸を生成、ガスは発生せず。 Ｄ−ガラクトース：酸もガスも発生せず。 麦芽糖：酸もガスも発生せず。 ショ糖：酸もガスも発生せず。 乳糖：酸もガスも発生せず。 トレハロース：酸もガスも発生せず。 Ｄ−ソルビット：酸もガスも発生せず。 Ｄ−マンニット：酸を生成、ガスは発生せず。 イノシット：酸もガスも発生せず。 グリセリン：酸を生成、ガスは発生せず。 デンプン：酸もガスも発生せず。 18．プロトカテキン酸の分解：オルト型 19．アルギニンの分解：陽性 20．リパーゼの生産：陽性 21．炭化水素類に対する耐性（表４） ドデカン：陽性 ｎ−デカン：陽性 ｎ−オクタン：陽性 イソオクタン：陽性 ｎ−ヘプタン：陽性 ｎ−ヘキサン：陽性 シクロヘキサン：陽性 ｐ−キシレン：陽性 トルエン：陽性 ベンゼン：陽性 22．アルコール類に対する耐性 デカノール：陽性 オクチルアルコール：陽性 １−ヘプタノール：陽性

【００１９】以上の菌学的性質を基準として、バージー
ズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
１９８４年版を用いて検索したところ、本菌株はシュー
ドモナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）に極めて近い分類学的性質を持つ
が、有機溶媒耐性を有し、かつリパーゼ産生能を有する
などの相違点から、新規菌株であると判断し、シュード
モナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ）ＬＳＴ−０３株と命名した。本菌株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に微生物受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１４０８６として寄託した。

【００２０】本菌株の培養は、通常のシュードモナス
エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉ
ｎｏｓａ）と同様の方法で行えばよく、例えば培養温度
２０〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃、pHは、３．５
〜１０．５、特に５〜９．５で行うことが好ましい。ま
た、ここで用いる培地は微生物が増殖できるものであれ
ば一般的な培地でよいが、さらに窒素源としてポリペプ
トン、イーストエキストラクト、硫安等、炭素源として
グルコース等の糖類等、無機塩類として、カリウム、ナ
トリウム、マグネシウム、カルシウム、マンガン、亜
鉛、鉄又はこの塩等の添加も、増殖に好ましい場合があ
る。

【００２１】このようにして得られた培養液から本発明
のリパーゼを得るには、培養液から菌体を遠心分離等に
よって除去し、また、必要により、菌体破砕後の分離液
を得て、その上清液を採取する等常法により行うことが
できる。さらに、この上清液を硫安分画（２０〜５５
％）等により濃縮し、活性度を向上させることも可能で
ある。

【００２２】次に本発明のリパーゼの特徴を以下に述べ
る。むろん、本発明のＬＳＴ−０３株が産生するリパー
ゼもこの特徴を有するのはいうまでもない。なお、リパ
ーゼ活性の測定はＢＡＬＢ−ＤＴＮＢ法（Ｓ．Ｋｕｒｏ
ｏｋａ，Ｓ．Ｏｋａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｍ．Ｈａｓｈｉ
ｍｏｔｏ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１，３６１−３６
９（１９７７））を用い、１分間に１マイクロモルのＳ
Ｈ基を遊離する酵素量を１単位（以下Ｕと表示）とす
る。本発明のリパーゼはトリグリセリドを基質として、
これを脂肪酸とグリセリンまで加水分解でき、作用温度
は２０〜６０℃である（図１）。また、作用pH範囲は６
〜１０であり、最適作用ｐHは９．０〜９．５でである
（図２）。本発明のリパーゼはドデカン、２−プロパノ
ール、１−ヘプタノール、トルエン、ｎ−デカン、ｎ−
オクタン、１−オクタノール、メタノール、ｎ−ヘプタ
ン、ｐ−キシレン、シクロヘキサン、クロロホルム、デ
カノール、アセトン、エタノール、ジメチルスルホキシ
ド、ベンゼン又はｎ−ヘキサンの様な有機溶媒の存在下
でも活性を維持する。ｐH８．０において、２０℃以
下、６０℃以上で５〜１５分間処理すると、２０〜５０
％活性低下。７０℃で５〜１５分間処理すると８０％以
上活性低下。

【００２３】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００２４】実施例１ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３５％（ｗ／ｖ）、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１
０％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％（ｗ
／ｖ）、ＮａＣｌ ０．２５％（ｗ／ｖ）、（ＮＨ₄）₂
ＳＯ₄ １．００％（ｗ／ｖ）、オリーブ油１０．０％
（ｗ／ｖ）（以下培地Ｉという）よりなる液体培地１０
mlを２４φ試験管に加え、オートクレーブにより加熱滅
菌した。この培地に大阪府堺市畑地土壌より採取した土
壌サンプルの生理食塩水懸濁液０．１mlを加え、３mlシ
クロヘキサンを添加してクロロプレンゴム製栓により栓
をし、恒温振とう機を用いて３０℃毎分３００回転の条
件下で１週間振とう培養を行った。次に２０mlの培地Ｉ
に１．５％（ｗ／ｖ）寒天を加えてなる平板培地に上記
培養液１００μｌを塗布し、さらに、その上面に７mlシ
クロヘキサンを流し込み、３０℃で２日間静置培養し
た。以上の実験操作を数回繰り返し行った結果、０．５
％（ｗ／ｖ）トリ−ｎ−ブチリン、１．５％（ｗ／ｖ）
寒天を含み、オリーブオイルを含まない培地Ｉ（平板培
地）において、最終的に２１菌株を得た。

【００２５】実施例２ ２１菌株それぞれについて、１．５％（ｗ／ｖ）寒天を
含む、ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、イーストエキ
ストラクト０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース０．５％
（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ０．２５％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５％（ｗ／ｖ）よりなる平板培地
において、３０℃で２日間静置培養し、そのコロニーを
ポリペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、イーストエキストラ
クト０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース０．５％（ｗ／
ｖ）、ＮａＣｌ ０．２５％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０．０５％（ｗ／ｖ）よりなる液体培地（以下、
培地IIとする）１０mlを含む２４φ試験管に植菌し、３
０℃毎分３００回転の条件下で、３６時間振とう培養を
行った。そののち、各培養液を４℃毎分１５，０００回
転の条件下で５分間遠心分離を行い、菌体を取り除いた
上清液を得た。それぞれの上清液についてリパーゼ活性
を測定し、最も高い活性が得られた菌株をＬＳＴ−０３
株と命名した。

【００２６】実施例３ 実施例２で得られたＬＳＴ−０３株を、２０ml培地Ｉに
１．５％（ｗ／ｖ）寒天を加えてなる平板培地に植菌
し、その上面に７mlの各種有機溶媒（ドデカン、ｎ−デ
カン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、
ｐ−キシレン、１−オクタノール、トルエン、１−ヘプ
タノール、ベンゼン）を流入し、３０℃で１日間静置培
養を行った。その生育状況を表４に示す。本菌株は、各
種有機溶媒に対して耐性を示すことが判る。

【００２７】

【表４】

【００２８】実施例４ 培地II１０mlを含む、２４φ試験管に、ＬＳＴ−０３株
を植菌し、クロロプレンゴム製栓をして３０℃毎分３０
０回転の条件下で２４時間前培養を行った。その培養液
を培地II１０mlを含む２４φ試験管に１％（ｗ／ｖ）植
菌し、３０℃毎分３００回転の条件下で３６時間培養を
行った。

【００２９】得られた培養液を４℃毎分１５，０００回
転の条件下で遠心分離し、菌体を取り除き上清液を得
た。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（pH８）中で
各温度における上清液のリパーゼ活性を測定した。その
結果を図１に示す。また、同様に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝溶液（pH６〜１０）中で各pHにおける上清液
のリパーゼ活性を測定した。その結果を図２に示す。

【００３０】実施例５ 実施例４と同様に培養及び、菌体分離を行い、上清液を
得た。上清液５mlにシクロヘキサン１．５mlを加えた
後、３０℃毎分１２０回転条件下で、１２４時間振とう
し、リパーゼ活性の経時変化をＢＡＬＢ−ＤＴＮＢ法に
より測定した。その結果を図３に示す。本菌株より得ら
れるリパーゼは、図３より、水系よりも有機溶媒共存系
において高い安定性を示す特徴を有することが明らかで
ある。

【００３１】実施例６ 用いる有機溶媒をシクロヘキサンからトルエン、エタノ
ール、アセトンに変更した以外は、実施例５と同一の方
法で有機溶媒共存下におけるリパーゼ活性の安定性を評
価した。無添加と各種溶媒共存下での１００時間後の各
々のリパーゼ活性を測定し、無添加の場合におけるリパ
ーゼ活性に対する、有機溶媒の添加効果を評価した。結
果を表５に示す。表５より明らかなように、シクロヘキ
サン以外の有機溶媒もリパーゼ活性の安定性を高めるこ
とが判る。

【００３２】

【表５】

【００３３】実施例７ 実施例４と同様に培養及び、菌体分離を行い、上清液を
得た。上清液に硫酸アンモニウムを添加し、常法に従っ
て硫安分画（２０〜５５％）を得た。１０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）中で透析を行い、リパーゼ粗
酵素液を得た。粗酵素溶液５mlに種々の有機溶媒１．５
ml加え、３０℃で２４時間振とうした後、リパーゼ活性
をＢＡＬＢ−ＤＴＮＢ法により測定した。結果を表６に
示す。

【００３４】比較例１ 市販のリパーゼ標品であるシュードモナス由来リパーゼ
ＡＫ（天野製薬（株）社製）を０．１Ｍ−Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（pH８．０）にて０．４mg／mlに調整し、こ
の酵素液５mlに種々の有機溶媒１．５mlを加え、３０℃
で２４時間、振とうした後、リパーゼ活性をＢＡＬＢ−
ＤＴＮＢ法により測定した。この結果を表６に示す。

【００３５】

【表６】

【００３６】

【発明の効果】本発明の微生物の取得方法によれば、従
来のスクリーニング方法に比べ容易に有機溶媒耐性リパ
ーゼ生産菌を得ることができる。さらに本発明の微生物
は、ドデカン、ｎ−デカン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサ
ン、シクロヘキサン、ｐ−キシレン、１−オクタノー
ル、トルエン、１−ヘプタノールなどの有機溶媒に対し
て耐性を示し、さらにｌｏｇＰ値が２．０であるベンゼ
ン存在下においても増殖可能で、有機溶媒存在下での化
学反応等に応用が可能である。また、本発明のリパーゼ
は、水系よりも多種の有機溶媒共存下において酵素活性
が安定的に維持され、工業利用面で極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】リパーゼ活性への反応温度の影響を示す図であ
る。

【図２】リパーゼ活性へのpHの影響を示す図である。

【図３】ＬＳＴ−０３株培養液におけるリパーゼ活性の
安定性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:385） (56)参考文献 特開 平３−266976（ＪＰ，Ａ) Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ ｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ，1991， Ｖｏｌ．57， Ｎｏ. ６， ｐ．1740−1745 Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．，1992， Ｖｏｌ．56， Ｎｏ．１， ｐ．145−146 Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．，1992， Ｖｏｌ．56， Ｎｏ．11， ｐ．1872−1873 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎ ｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ，1991， Ｖｏｌ．71, Ｎｏ．３， ｐ．194−196 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シュードモナス エルギノーザ（Ｐｓｅ
   ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＬＳＴ−０
   ３の産生するリパーゼであって、作用温度２０〜６０
   ℃、作用pH６〜１０、最適pHが９．０〜９．５で、かつ
   ドデカン、２−プロパノール、１−ヘプタノール、トル
   エン、ｎ−デカン、ｎ−オクタン、１‐オクタノール、
   メタノール、ｎ−ヘプタン、ｐ−キシレン、シクロヘキ
   サン、クロロホルム、デカノール、アセトン、エタノー
   ル、ジメチルスルホキシド、ベンゼン又はｎ−ヘキサン
   共存下において、水中よりも高い酵素活性を有すること
   を特徴とするリパーゼ。
2. 【請求項２】 請求項１記載のリパーゼを産生するシュ
   ードモナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
   ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＬＳＴ−０３と命名され、工業
   技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４０
   ８６として寄託された微生物。