JPH08512204A - モニックアシッドの酵素的調製 - Google Patents

モニックアシッドの酵素的調製

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JPH08512204A JP7503786A JP50378695A JPH08512204A JP H08512204 A JPH08512204 A JP H08512204A JP 7503786 A JP7503786 A JP 7503786A JP 50378695 A JP50378695 A JP 50378695A JP H08512204 A JPH08512204 A JP H08512204A
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スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 対応するシュードモニックアシッドまたはそのエステルを、適当な微生物、特にストレプトミセス種由来の加水分解酵素と接触させることからなるモニックアシッドの製法。

Description

【発明の詳細な説明】 モニックアシッドの酵素的調製 本発明は、シュードモニックアシッド（Pseudomonic acids）およびそのエス テルの対応するモニックアシッド（monic acid）への変換方法に関する。 シュードモニックアシッドはよく知られた抗菌性を有する。既知のシュードモ ニックアシッドはテトラヒドロピラニル化合物であるシュードモニックアシッド Ａ（ネイチャー（Nature）、１９７１年、第２３４巻、４１６頁；ジャーナル・ オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキン・トランザクションズＩ（JCS Perk in Trans.I）、１９７７年、２９４頁）、シュードモニックアシッドＢ（ジャー ナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキン・トランザクションズＩ、１ ９８２年、２８２７頁）、シュードモニックアシッドＣ（ジャーナル・オブ・ケ ミカル・ソサイエティー・パーキン・トランザクションズＩ、１９８２年、２８ ２７頁）、およびシュードモニックアシッドＤ（ジャーナル・オブ・ケミカル・ ソサイエティー・パーキン・トランザクションズＩ、１９８３年、２６５５頁） を包含する。 特に、本発明は、シュードモニックアシッドＡ（ムピロシン）（Ｉ）の モニックアシッドＡ（II）への変換、または シュードモニックアシッドＣ（III）、またはそのメチルエステルの モニックアシッドＣ（IV）への変換方法を提供する。 モニックアシッドは、特に医薬上、生物学的に活性な化合物を製造するための 出発物質として有用である。ビーチャム・グループ・パブリック・リミテッド・ カンパニー（Beecham Group plc）ＧＢ １ ５８７ ０５８は、モニックアシッド の化学的製造を記載している。化学的製法に伴う一つの問題点は生成物の抽出に 関するものであった。 そこで、シュードモニックアシッドをモニックアシッドに化学的に加水分解す る方法に代わるものに対する要求がある。多くの加水分解酵素が知られているが 、驚くべきことに、本発明者らは、今までに試した６０かそこらの一般に入手で きる、動物、植物、および微生物の加水分解酵素（例えば、シグマ・ケミカル・ カンパニー（Sigma Chemical Company）、プール、ドーセットより入手）がいず れも適切な活性を有さないことを見いだした。例えば、サブチリシンＥ.Ｃ.３. ４. ２１.１４は、シュードモニックアシッドＡのアナログに由来の９−ヒドロキシ ノナン酸エステルを加水分解しないことが判明した（シム（Sime）ら、１９８７ 年、テトラヘドロン・レターズ（Tet．Lett.）第２８巻（４３）、５１６９−７ ２頁）。 フレール（Freer）ら（シンセシス・アンド・アプリケーションズ・オブ・ア イソトピカリー・ラベルド・コンパウンズ（Synthesis and Applications of Is otopically labelled compounds）、（１９８８年）、プロシーディングズ・サ ード・インターナショナル・シンポジウム（Proceedings 3rd International sy mposium）、エルゼビア（Elsevier））は、哺乳動物酵素（ブタの肝エステラー ゼ）を用いて、［２−14Ｃ］ムピロシンを［２−14Ｃ］モニックアシッドに変換 した。本発明者らは、これも所望のレベルの活性を提供しないことを見いだした 。 本発明者らは、現在、本発明プロセスにおいて使用に適した酵素が、ある種の アクチノマイセツ（Actinomycetes）、特にキタサトスポリア（Kitasatosporia ）、キブデロスポランギウム（Kibdelosporangium）種、およびあるストレプト ミセス（Streptomyces）種から由来することを見いだした。 従って、本発明は、対応するシュードモニックアシッドまたはそのエステルを 適当な微生物からの加水分解酵素と接触させることからなる、モニックアシッド の製造方法を提供する。 シュードモニックアシッドのエステルは、本発明の加水分解酵素によって分解 され、対応するモニックアシッドを製造するものを包含する。適当なエステルは 、（Ｃ1−Ｃ6）エステル、特にメチルエステルを包含する。 本発明はまた、シュードモニックアシッドのモニックアシッドへの変換能を有 する微生物のスクリーニング方法であって、微生物をシュードモニックアシッド と一緒にインキュベートし、シュードモニックアシッド標品と比較して抗菌活性 の喪失をアッセイすることによる方法を提供する。 特に適当な微生物は、エス・リビダンス（S.lividans）、特にエス・リビダン ス（S.lividans）ＮＣＩＭＢ１１４１６、エス・グリセオフスクサス （S.griseofuscsus）ＡＴＣＣ２３９１６、およびエス・アンボファシエンス（S .ambofaciens）ＡＴＣＣ２３８７３、およびキブデロスポランギウム・アリダム （Kibdelosporangium aridum）ＡＴＣＣ３９９２２を包含する。キタサトスポリ ア（Kitasatosporia）ＮＣＩＭＢ４０５６８株は新規微生物であり、それ自体が 、本発明のさらなる態様を形成する。この株は、１９９３年６月１４日にナショ ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（ National Collection of Industrial and Marine Bacteria）（ＮＣＩＭＢ）、 アバディーン（Aberdeen）、スコットランド（Scotland）に受託番号ＮＣＩＭＢ ４０５６８で寄託された。 キタサトスポリア（Kitasatosporia）種ＮＣＩＭＢ４０５６８は、灰色胞子形 であり、以下の性質：細胞壁ペプチドグリカン：ＬＬ−Ａ2pm／メソ−Ａ2pm［バ ハナン・アール・イー（Buchanan，R．E.）およびギボンズ・エヌ・イー（Gibbo ns，N．E.）、バージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテ リオロジー（Bergey's manual of Determinative Bacteiology）］を有する。 本発明による微生物培養用の培地は、適切には、無機塩と共に同化炭素源およ び窒素源を含有する。適切な窒素源は、コーンスティープリカー、酵母抽出物、 大豆粉、肉抽出物、綿実、小麦粉、麦芽、蒸溜器乾燥可溶物、アミノ酸、蛋白質 水解物、およびアンモニウムおよび硝酸性窒素を包含する。適当な炭素源は、グ ルコース、ラクトース、マルトース、デンプン、グリセロールおよび糖蜜（例え ば、フォウラーズ（Fowler's））を包含する。 適当には、培地はまた、アルカリ金属イオン（例えば、ナトリウム）、ハロゲ ンイオン（例えば、塩素）およびアルカリ土類金属イオン（例えば、カルシウム およびマグネシウム）ならびに鉄およびコバルトのごとき微量元素を含有する。 適当には、細胞を遠心または濾過により収穫する。 本発明のバイオトランスフォーメーション／プロセスを、全細胞、無細胞抽出 物、浸透可能とされた細胞、または微生物から単離された酵素、あるいはこれら のうちのいくつかの固定化された形態を用いて行うことができる。 バイオトランスフォーメーションを細胞全体を用いて行う場合、微生物は、生 育培養、静止培養、洗浄菌糸体、固定化細胞、またはプロトプラストの形態であ ってもよい。 無細胞抽出物を用いる場合、適切には、物理的および／または化学的、または 酵素的溶解、または他の破壊方法、好ましくは超音波によって無細胞抽出物が製 造され、次いで、所望によりその後、細胞の破片を除去し、溶液中に酵素活性を 残存させる。 酵素は、適当には、以下の実施例に従って製造される。酵素は、通常の方法、 特に好気条件下、適当な液体または半固体培地中で微生物を培養することによっ て製造してもよい。培養条件は、温度が５ないし５０℃の範囲で、pＨは３ない し９の範囲、好ましくは６−８、最も好ましくは７.２であろう。 酵素を単離し、精製された形態、純粋でない状態で得られた場合、部分的に精 製された形態にて、破壊細胞調製物からの濾液として、または粗細胞ホモジネー トとして使用してもよい。最適には、酵素を、例えば、少なくとも精製し、出発 物質または酵素の分解も触媒するかもしれない他の酵素を除去する。 本発明のさらなる態様において、ストレプトミセス／キタサトスポリア／キブ デロスポランギウムからの菌糸体を、以下の実施例５および／または７（および ６）に従って、遠心し、細胞を破壊し（超音波）、続いて、分画およびクロマト グラフィーを行って処理することで得られる、シュードモニックアシッドのモニ ックアシッドへの加水分解能を有する酵素を提供する。 最適には、例えば、フォガーティ・アンド・ケリー（Fogarty & Kelly）編の マイクロバイアル・エンザイムズ・アンド・バイオテクノロジー（Microbial En zymes and Biotechnology）、３６９−３９４頁中、ポウェル（Powell）（１９ ９０年）によって議論された方法のように、酵素を不溶性の支持体に固定化する 。この方法は、収率および処理量を増大させる利点を提供する。 出発物質のシュードモニックアシッドはＧＢ１,３９５,９０７に記載された方 法によって製造することができる。 バイオトランスフォーメーションを細胞全体を用いて行う場合、インキュベー ション培地は、静止細胞培地：１リットルの脱イオン水（pＨ６.５、またはpＨ 調整した水系）中、ＫＨ2ＰＯ4（２ｇ）、Ｋ2ＨＰＯ4（１.５ｇ）、ＫＣl（０. ２ｇ）、ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ（０.２ｇ）、Ｎa2ＳＯ4・１０Ｈ2Ｏ（０.２２g）、 グルコース（１.０ｇ）からなる。 バイオトランスフォーメーションを無細胞抽出物を用いて行う場合、インキュ ベーション培地は適当な緩衝液からなる。 酵素反応混合物は、基質に加えて、１つまたはそれ以上の他の補因子、例えば 金属イオンまたは安定剤、例えばチオールを含有してもよい。 本発明プロセスは、適当には、水性培地中で行われ、反応混合物を適当にはp Ｈ４−９の範囲、より適当には６ないし８、好ましくは７.２付近、例えばpＨ７ .４に維持する。適当には、pＨを、緩衝剤を用いて、または好ましくは酸または 塩基滴定物の添加により調整する。反応温度は、一般には、好ましくは５−５０ ℃、より好ましくは２２−４５℃、最も好ましくは３２−３７℃の範囲とするべ きである。 別法として、反応を有機溶媒中、または有機溶媒、例えば、アセトン、メチル イソブチルケトン（ＭＩＢＫ）の存在下で行うことができる。 反応時間は、反応物質ならびに補因子の濃度、温度およびpＨのごとき因子に 依存する。 反応終了後、産物を通常の方法および以下の実施例に示すようにして単離でき る。最初の精製は、簡便にはクロマトグラフィー工程を包含する。 次に実施例を用いて本発明を説明する。 実施例１−スクリーニングおよびアッセイ方法１.１ 一次スクリーニング： バイオトランスフォーメーションは抗菌活性の喪失を伴うので、これをシュー ドモニックアシッドのモニックアシッドへの変換能を有する微生物を同定するた めのアッセイの基本原理として用いた。（例えば、寒天プレートからの生育した アクチノミセツ菌糸体を）２４穴マイクロタイタープレート中に分注された３ｘ １ｍｌ体積のＧ１培地（実施例２）に植菌し、次いで、振盪しながら４日間２８ ℃でインキュベートした。植菌しなかった対照プレート（Ｇ１培地のみ含有）も インキュベートした。０.０５ｍｇ／ｍｌのシュードモニックアシッドをプレー トに添加し、プレートを再び２４時間インキュベートした。次いで、５０μｌの 培地（２系にして）を、適当なシュードモニックアシッド感受性株、例えばスタ フィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）（例えば、Ｖ５７３） またはイー・コリ（E．coli）（例えば、ＥＳＳ株）を含有するバイオアッセイ プレートに添加した。一晩３７℃でインキュベーションした後、阻害域を測定し た。１.２ 二次スクリーニング 基質濃度を上昇させながら、インキュベーションを行い、高濃度の基質で所望 される変換能を有する培養を見いたした。Ｇ１培地（実施例２）（１００ｍｌ） を含有するフラスコ（５００ｍｌ）に、水中０.０２％ツイン（Tween）８０中の １.５ｍｌの培養／菌糸体を各々植菌した。そのフラスコを２８℃で４日間振盪 し（２４０ｒｐｍ）、次いで、内容物を遠心し、次いで、静止細胞培地に再懸濁 させた（実施例２）。種々の生育密度を補うために、培養物を２ないし６ｘブロ ス密度の間で再懸濁させた（生育後得られた元来の細胞密度は、１ｘブロス細胞 密度に等しい）。濾過滅菌後、０.０５Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4（pＨ７.０）中のシュー ドモニックアシッド（１０ｍｇ／ｍｌ）を各々のフラスコに添加し、最終濃度０ .５ｍｇ／ｍｌとした。２８℃で２４時間振盪後、フラスコの内容物を遠心し、 上清の体積を測定し、その一部をＨＰＬＣ解析用に採取した（実施例２）。 特に良好な結果が２種の培養で得られた：キタサトスポリア（Kitasatosporia ）ＮＣＩＭＢ４０５６８（モニックアシッドに８７％変換、ブロス細胞密度は２ ）およびキブデロスポランギウム・アリダム（Kibdelosporangim aridum）ＡＴ ＣＣ３９９２２（７６.９％変換、ブロス細胞密度は２）。ストレプトミセス・ リビダンス（Streptomyces lividans）ＮＣＩＭＢ１１４１６でも匹敵する結果 が得られた。さらに、基質濃度が２、および５.５ｍｇ／ｍｌでのインキュベー ションも少数の陽性培養について行った。１.３ 抽出および解析 ＮaＣlを加え、冷却した（０−５℃）上清を飽和させることにより抽出を行い 、５Ｍ ＨＣlを用いてpＨを３.０に変更した。酢酸エチルを溶媒抽出に用い（３ ｘ１／３倍容量）、次いで、ＭgＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションに 付す前に濾過した。少量（０.５ｍｌ）を一晩冷却下で放置して結晶を生成し、 次いで、それを乾燥した。ＨＰＬＣによる純度アッセイ（実施例２）および1Ｎ ＭＲは、その構造がモニックアシッドであることを確認した。 1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ）解析では、試料を重水素化ＤＭＳＯ中で操作し、 モニックアシッド標品と比較した。 実施例２−キタサトスポリア（Kitasatosporia）種を用いる全細胞系反応 キタサトスポリア（Kitasatosporia）種ＮＣＩＭＢ４０５６８の０.０２％ツ イン８０を含有する水（１.５ｍｌ）中菌糸体懸濁液を用いて、Ｇ１培地（１０ ０ｍｌ）を含有する５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに植菌した。Ｇ１培 地は、pＨ６.８に調整された脱イオン水（１Ｌ）中、デキストリン（３０ｇ）、 フォウラーズ（Fowler's）糖蜜（２０ｇ）、細菌学上のペプトン（７ｇ）からな る。フラスコを２８℃で４日間振盪し、その後、ブロスを遠心し、次いで、２５ ０ｍｌのフラスコ中の静止細胞培地（２５ｍｌ）（pＨ６.５に調整された脱イオ ン水（１Ｌ）中、ＫＨ2ＰＯ4（０.５g）、Ｋ2ＨＰＯ4（１.５ｇ）、ＫＣl（０. ２ｇ）、ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ（０.２ｇ）、Ｎa2ＳＯ4・１０Ｈ2Ｏ（０.２２ｇ）お よびグルコース（１.０ｇ））に再懸濁させた。０.０５Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4（pＨ７. ０）中のシュードモニックアシッド（１０ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度５００μｇ／ ｍｌになるように添加した。 ２８℃で２４時間振盪後、フラスコの内容物を遠心し、その一部をＨＰＬＣ（ ＨＰＬＣアッセイ：−Ｃ１８カラム４.６ｘ２５０ｍｍ、３０％ＭｅＯＨ／０.０ ５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（pＨ４.８）、２３０ｎｍ、１.５ｍｌ／分、モニックアシッ ドＲｔ＝４.９分）により解析した。これにより、基質がモニックアシッドに８ ７％変換されたことが確認された。1ＨＮＭＲ解析（２５０ＭＨｚ）を行い、そ の構造がモニックアシッドであることを確認した。 実施例３−キタサトスポリア（Kitasatosporia）種を用いる無細胞系反応 キタサトスポリア（Kitasatosporia）種ＮＣＩＭＢ４０５６８を、実施例２に おいて前記したごとくＧ１培地を含有するフラスコ中に植菌し、２８℃で４８時 間フラスコを振盪した。この種培養フラスコからのブロス２ｍｌを用い、各々、 １００ｍｌのＧ１培地を含有する別の６つのフラスコに植菌した。そのフラスコ を２８℃で７２時間振盪し、その後、ブロスを遠心し、上清を除き、細胞を６０ ｍｌの０.２Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液（pＨ７.４）に再懸濁させた。細胞を１０ ｍｌバッチ中で超音波を用いて（ＭＳＥソニプレップ（MSE Soniprep）、２０秒 間入、４０秒間切の５サイクル）破壊し、この破壊された細胞懸濁液を遠心し、 上清を残した。２５０μｌの細胞上清に２５０μｌのシュードモニックアシッド 溶液（８ｍｇ／ｍｌ、０.３Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液（pＨ７.４）中）を添加し た。その反応物を３７℃で２４時間振盪しながらインキュベートした。次いで、 メタノール（５００μｌ）を添加し、その混合物を氷中で１０分間冷却した。沈 澱したタンパク質を遠心によって除去し、上清を、実施例２に記載のごとくモニ ックアシッドについてアッセイした。モニックアシッドを基質変換９２％で同定 した。 実施例４−エス・リビダンス（S．lividans）を用いる無細胞系反応 ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＮＣＩＭＢ１１４ １６を実施例３に記載のごとく、種培養フラスコを用いて培養し、各々、１００ ｍｌのＧ１培地を含有する５つの産生用フラスコに植菌した。細胞を実施例３に 記載のごとく破壊し、ブロスから得られた細胞を、まず３８ｍｌの０.２Ｍトリ ス／ＨＣl緩衝液（pＨ７.４）に再懸濁した。２５０μｌの細胞上清に２５０μ ｌのシュードモニックアシッド（２ｍｇ／ｍｌ、０.２Ｍトリス／ＨＣl緩衝液（ pＨ７.４）中）を添加した。反応物を２８℃で２４時間振盪しながらインキュベ ートした。反応を実施例２に記載のごとく停止し、モニックアシッドについて ＨＰＬＣによりアッセイした。モニックアシッド産生を基質変換５９％で同定し た。 実施例５−キタサトスポリア（Kitasatosporia）種ＮＣＩＭＢ４０５６８由来の 半精製酵素調製物を用いる加水分解 キタサトスポリア（Kitasatosporia）種ＮＣＩＭＢ４０５６８を、実施例３に おいて記載したごとく培養し、前記した超音波破壊の前に、生育培地５００ｍｌ からの菌糸体ペレットを５０ｍｌの０.２Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝液（pＨ７.４） に再懸濁した。回収した上清を５ｍＭジチオスレイトールおよび１％ｗ／ｖの硫 酸ストレプトマイシンで処理し、次いで、０℃で３０分間貯蔵した。遠心し、つ づいて上清４１ｍｌを取り出し、その上清に５分間にわたって硫酸アンモニウム （９.１６ｇ）を０℃で静かに撹拌しながら添加した。さらに１５分間撹拌した 後、試料を遠心し、上清を残した。この上清（４３ｍｌ）に硫酸アンモニウム（ ５.３ｇ）を同様にして添加した。 得られた懸濁液の一部（９ｍｌ）を遠心し、残ったペレットを２.５ｍｌの０. １Ｍ ＮaＣl、１０％ｗ／ｖグリセロールおよび１ｍＭジチオスレイトールを含 有する混合物に再び溶解した。ゲル濾過により脱塩した後、調製物を−２０℃で 貯蔵した。 このタンパク質調製物の一部１ｍｌを解氷し、０.２Ｍ塩化ナトリウム溶液（ １.０ｍｌ）で希釈し、得られた溶液のpＨを、０.０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液 を添加することにより７.０１に調整した。この撹拌した溶液に３０℃でシュー ドモニックアシッド溶液（pＨ７.４の脱イオン水（０.７８ｍｌ）中２ｍｇ）を 添加し、得られた混合物のpＨを０.０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の添加により７ .４に維持した。 塩基を添加してモニター観察し、５時間後、シュードモニックアシッドがモニ ックアシッドに８２％変換し、この段階でのＨＰＬＣは８８％の変換を示した。 １０時間後、１モル等量の塩基を反応混合物に添加し、pＨが一定に保たれたこ とは、反応が停止したことを示す。反応終了時のＨＰＬＣアッセイは、モニック ア シッドへの９６％の変換を示した。 実施例６ ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＮＣＩＭＢ１１４ １６からの固定化調製物を用いたシュードモニックアシッドのモニックアシッド への変換 ２０％シュークロース中−７０℃で貯蔵したエス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＮＣＩＭＢ１１４１６の芽胞を、１リットル当たり酵母抽出物（２ ５ｇ）、ＮaＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（２ｇ）、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（１ｇ）、ＭnＳＯ4 ・４Ｈ2Ｏ（０.０１ｇ）、ＦeＯ4・７Ｈ2Ｏ（０.０１ｇ）、ＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ （０.０８ｇ）およびグリセロール（１５ｇ）を含有する培地（pＨ６.８、４０ ０ｍｌ）を各々含有する５個の１リットルフラスコに植菌した。これらのフラス コを回転振盪インキュベーター中、３０℃で４８時間インキュベートし、次いで 、植菌物容器に合し、次いで、１０００Ｌ容量の標準型の円盤状タービン撹拌器 付き発酵装置中、８００リットルのＤＦＯ３Ａ培地（１リットル当たり、酵母抽 出物（２７.５ｇ）、グリセロール（３３ｇ）、ＮaＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ（２.２ｇ ）、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（５ｇ）、ＭnＳＯ4・４Ｈ2Ｏ（０.０１ｇ）およびフォ ーマスター（Foamaster）ＴＤＢ１（ヘンケル（Henkel））（１ｇ）、pＨ６.８ ）に植菌した。最初の作動条件は２５０ｒｐｍ、３０℃、１５ｐｓｉヘッド圧、 空気流量４０ｍ3／時間、pＨ６.８（アンモニア調整）であった。作動中、撹拌 を３００ｒｐｍに増加させ、空気流量を８０ｍ3／時間に上昇させ、ヘッド圧を ２０ｐｓｉに上昇させることにより、溶解酸素レベルを飽和値の約５％に維持し た。３８時間後、フラスコを約５℃に冷却し、空気流量を減少させ、撹拌速度を 低下させた。 スラッジ除去遠心（ウエストファリア（Westphalia）モデルＳＡＭＲ５０３６ 、流速１０−２０／（分））に通すことにより、ブロスの体積を約１２０Ｌに減 少させた。この濃縮された菌糸体ペーストのうち４０Ｌを、温度を３０℃以下に 保ちながらホモジナイザー（ＡＰＶマントン−ゴウリン（APV Manton-Gaulin） ＬＡＢ６０モデル、１０,０００ｐｓｉ、１リットル／分）に通すことによりホ モ ジナイズした。ホモジネートに４０Ｌの０.１Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4（pＨ７.０）を添 加することにより部分的に清澄化し、スラッジ除去遠心に通した。上清（８０Ｌ ）の体積を、ＤＤＳ Ｍ３８限外濾過装置を使用することにより約２５Ｌにまで 減少させた。８Ｌのこの物質を、エス・リビダンス（S.lividans）抽出物に添加 する前に２Ｍ Ｈ3ＰＯ4でpＨ７.８に調整した１リットルＨ2Ｏ中のポリエチレン イミン（９０ｇ）の溶液を用いて０.５％ポリエチレンイミンにした。室温で１ ５分間撹拌後、混合物を４６００ｒｐｍ（ミストラル６０００セントリフュージ （Mistral 6000 centrifuge）、１Ｌ瓶）で２０分間遠心し、ペレットを除去し た。上清を硫酸アンモニウムで飽和レベルの６５％に調整した。１５分後、沈澱 を遠心（上記と同じ条件）により回収し、３Ｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（０.０３ ９Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4、０.０６１Ｍ Ｎa2ＨＰＯ4、pＨ７.０）に再懸濁した。 酵素溶液を０.５Ｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.０）で希釈し、２００ｇの (ＮＨ4)2ＳＯ4を添加し、導電率を４０ｍＳに上昇させた。４００ｇのドゥオラ ウニー（Chauny）、フランス）を添加し（樹脂１ｇ当たり３１ｍｇタンパク質） 、混合物を１Ｍ ＮaＯＨでpＨを７.０に制御しながら一晩撹拌し、加水分解酵素 の吸着を行った。酵素−樹脂を濾過により回収し、２００ｍｌの蒸留水でフィル ターを洗浄し、３.５Ｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.０）中０.２％グルタル アルデヒドに添加した。混合物を１時間撹拌し、酵素−樹脂を濾過により回収し 、３.５Ｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ７.０）を添加した。この混合物を１時間 撹拌し、酵素−樹脂を濾過により回収し、４℃で湿気中にて貯蔵した。 ２５０ｇの酵素−樹脂を１リットルの０.２５％シュードモニックアシッドに 添加し、１Ｍ ＮaＯＨでpＨを７.４に維持しながら、混合物を３２℃で撹拌した 。２４時間後、酵素−樹脂を濾過により回収した。濾液をモニックアシッドにつ いて（ＨＰＬＣアッセイ：１０μ Ｃ１８カラム（３.９ｘ３００ｍｍ、ボンダパ ック（Bondapak））、３０％メタノール、０.０５Ｍ ＮaＨ2ＰＯ4、pＨ３.８、 １.５ｍｌ／分、Ｒｔ＝４.５分）、およびシュードモニックアシッドについて（ ＨＰＬＣアッセイ：１０μ Ｃ１８カラム（３.９ｘ３００ｍｍ、ボンダパック、 ６ ７％メタノール、０.０６Ｍ酢酸アンモニウム、pＨ６.３、１.５ｍｌ／分、Ｒｔ ＝５.５分）、ＨＰＬＣにより解析した。その解析により、溶液中にシュードモ ニックアシッドは残存しておらず、モニックアシッドのモル収率は６３％である ことがわかった。酵素−樹脂をさらに３回以上再使用したが、繰り返す各反応毎 にシュードモニックアシッドの消失に要する時間が増加し、４回目の酵素反応で は９６時間かかった。４回の酵素反応を通じてモニックアシッドの平均収率は８ ０％であった。 最初の酵素反応からのモニックアシッド溶液を２℃に冷却し、３００ｇの塩化 ナトリウムで飽和した。５Ｍ ＨＣlを滴下し、pＨを３.０に調整した。酢酸エチ ル（３５０ｍｌ）を添加し、混合物を分離前に５分間激しく撹拌した。水層を酢 酸エチル（３５０ｍｌ）でさらに２回以上抽出した。酢酸エチル抽出物を合し、 ＭgＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーターを用いて１５０ｍｌに濃縮し（温 度は３０℃以下に維持）、沈澱が生じるまで氷浴中で撹拌し、次いで、一晩２℃ で貯蔵した。 生成物を濾過し、酢酸エチルで洗浄し、減圧下で乾燥し、ＨＰＬＣおよび1Ｈ ＮＭＲにより解析した。その解析により、生成物はモニックアシッドであること が確認された。０.６ｇのモニックアシッドが回収された（抽出効率５５％）。 実施例７ エス・リビダンス（S．lividans）ＮＣＩＭＢ１１４１６からの加水分解酵素の 精製 ８Ｌの限外濾過濃縮物（実施例６）をデオキシリボヌクレアーゼ（シグマ（Si gma）、ＤＮ−２５、３２０ｍｇ）で処理し、４℃で１時間放置し、遠心した（ ６,０００ｘｇ、３０分、４℃）。固体の硫酸アンモニウム（シグマグレードＩ ＩＩ（Sigma grade III））を撹拌しながら添加することにより、分離した上清 を硫酸アンモニウムの３０％飽和レベルにした。その上清を１５分間放置し、次 いで、遠心した（６,０００ｘｇ、３０分、４℃）。沈澱を吸引濾過（ワットマ ン（Whatman）ＧＦ／Ｄ濾紙）することにより除去した。濾液に硫酸アンモニ ウムを添加して８０％飽和レベルにした。１５分後、懸濁液を遠心した（１７, ７００ｘｇ、２５分、５℃）。上清の除去後、沈澱を得た。 次いで、５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム緩衝液（pＨ７.０）中の１Ｍ硫酸ア ンモニウムを２.５Ｌになるように添加することにより沈澱物を可溶化し、次い で、蒸留水を添加して最終体積を５.０Ｌにした。この操作により、５０ｍＭリ ン酸水素二ナトリウム緩衝液（pＨ７.０）中の１Ｍ硫酸アンモニウムの導電率に 等しい導電率レベルを得た。この調製物を、予め前記緩衝液で平衡化した疎水的 相互作用樹脂カラム（ブチルアガロース６ＸＬ、アフィニティ・クロマトグラフ ィー・リミティド（Affinity Chromatography Ltd.）、８.０ｃｍｘ９.０ｃｍ） に加え、室温で作動させた。 カラムを同じ緩衝液で洗浄し、５０ｍＭリン酸緩衝液中の硫酸アンモニウム濃 度を０.１Ｍ硫酸アンモニウムにまで減少させる段階的勾配を用いて溶出した。 ５０μｌの試料を４５０μｌのシュードモニックアシッドＡ（２ｍｇ／ｍｌ、０ .２Ｍトリス／ＨＣl緩衝液（pＨ７.４）中）に添加することにより、カラム画分 をエステラーゼ活性についてアッセイした。反応物を３７℃で１時間インキュベ ートし、メタノール（５００μｌ）を添加した。その混合物を氷中で１０分間冷 却し、沈澱したタンパク質を遠心により除去した。上清を実施例２に記載したご とくモニックアシッドについてアッセイした。タンパク質濃度をブラッドフォー ド（Bradford）法（アナリティカル・バイオケミストリー（Anal．Biochem.）、 １９７４年、第７２巻、２４８−２５４頁）により決定した。 活性画分を集めて１５００ｍｌにし、限外濾過（アミコン（Amicon）ＹＭ３０ ）により８００ｍｌに濃縮した。この濃縮物を４℃で一晩、５Ｌの０.５Ｍ塩化 ナトリウムおよび１０％ｖ／ｖグリセロールを含有する５０ｍＭリン酸水素二ナ トリウム（pＨ７.０）からなる緩衝液に対して透析（スペクトロポア（Spectrop ore）４）した。その溶液を、予め最後の緩衝液で平衡化した金属キレートアフ ィニティ樹脂カラム（銅イオンで電荷した、キレーティング・セファロース・フ ァスト・フロー（Chelating Sepharose Fast Flow）、ファルマシア(Pharmacia) )、１９.０ｃｍｘ２.６ｃｍに加えた。負荷体をこの緩衝液で洗浄し、次いで、 塩化 アンモニウム濃度を０−１Ｍに上昇させる緩衝液を用い、直線勾配に付した。カ ラム画分を前記した方法と類似の方法でエステラーゼ活性をアッセイした。活性 を有する溶出画分をプールし（１１０ｍｌ）、限外濾過（ＹＭ３０）で１５ｍｌ に濃縮した。限外濾過の間に、別の緩衝液（１０％ｖ／ｖグリセロール中の２５ ｍＭビス・トリス・プロパン（Bis Tris Propane）pＨ７.０）を緩衝液交換とし て導入した。 濃縮物を、予め前記緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂（リソースＱ（Reso urce Q）、１ｍｌ、ファルマシア）に加えた。洗浄後、０−１Ｍに上昇させる濃 度の塩化ナトリウムを含有するこの緩衝液を用い、直線溶出勾配に付した。酵素 活性アッセイは、溶出物中、３つの活性画分を示した。 活性画分のクマシブルー染色を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ファスト・ゲル（Phast Gel）、ファルマシア、勾配１０−１５％）による 解析は、最大酵素活性に関係している、中央の画分のピーク濃縮物が均質なタン パク質であることを示した。このデータは、逆相ＨＰＬＣ解析（溶出液＝０.０ ８％トリフルオロ酢酸中の０−８０％メタノールの勾配、λ＝２１５ｎｍ）によ り支持された。 活性画分のタンパク質アッセイは、全部で０.５ｍｇタンパク質を示した（Ｂ ＳＡ標品）。 実施例８ エス・リビダンス（S．lividans）ＮＣＩＭＢ１１４１６の加水分解酵素の分 子量の決定 最終のイオン交換精製における最大活性の画分（実施例７）は、逆相ＨＰＬＣ （ＲＰ−ＨＰＬＣ）上で１つのピークを与えた。この物質をフィンニガン・レー ザーマットインストルメント（Finningan Lasermatt Instrument）上でのレーザ ー−デソープション・マス．スペクトロメトリー（Laser-desorption mass spec trometry）（ＬＤ−ＭＳ）により解析し、全分子量（ＬＤ−ＭＳによる）は、５ ４０４８（＋−２００）ダルトンであった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ， ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シム，ジョン・トーマス イギリス国サリー・アールエイチ３・７エ イジェイ、ベッチワース、ブロッカム・パ ーク（番地の表示なし） スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 ウォロニエキ，ステファン・ローランド イギリス国サリー・アールエイチ３・７エ イジェイ、ベッチワース、ブロッカム・パ ーク（番地の表示なし） スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 イーンドル，デイビッド・アラン イギリス国ウエスト・サセックス・ビーエ ヌ14・８キューエイチ、ワージング、クラ レンドン・ロード（番地の表示なし） ス ミスクライン・ビーチャム・ファーマシュ ーティカルズ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 対応するシュードモニックアシッドまたはそのエステルを適当な微生物 由来の加水分解酵素と接触させることを特徴とするモニックアシッドの製法。 ２． シュードモニックアシッドが、シュードモニックアシッドＡ（Ｉ） またはシュードモニックアシッドＣ（III）またはそのメチルエステル である請求項１記載の方法。 ３． 微生物がストレプトミセス、キタサトスポリアまたはキブデロスポラン ギウム種に属する請求項１または２記載の方法。 ４． 微生物の無細胞抽出物を用いる請求項３記載の方法。 ５． 酵素を固定する請求項１〜４記載のいずれか１つの方法。 ６． キタサトスポリア種ＮＣＩＭＢ４０５６８である微生物。 ７． 実施例５、６または７の操作に従って、請求項６に記載の微生物または エス・リビダンスＮＣＩＭＢ１１４１６由来の菌糸体を、遠心および細胞破壊に 、つづいて分画およびクロマトグラフィーに付して処理することによって得られ る、シュードモニックアシッドのモニックアシッドへの加水分解能を有すること を特徴とする酵素。 ８． 約５４,０００ダルトンの分子量を有する請求項７記載の酵素。 ９． シュードモニックアシッドのモニックアシッドへの変換能を有する微生 物のスクリーン法であって、該微生物をシュードモニックアシッドと一緒にイン キュベートし、シュードモニックアシッド標品と比較して抗菌活性の喪失につい てアッセイすることを特徴とするスクリーン法。
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