JPS62239998A - 光学活性なシス−イミダゾリジンジカルボン酸誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般式（Ｉ） （式中、凡は低級アルキル基を示す。Ｂｚｌはベンジル
基を示す。４位、５位の配位は４Ｓ１５Ｒの配位である
。） で示される光学活性なシス−イミダゾリジンジカルボン
酸誘導体の製造法に関するものである。 すなわち本発明は一般式（Ｉ［） （式中、Ｉｔは低級アルキル基を示す。Ｂｚｌはベンジ
ル基を示す。） ヅ で示されるシス−イミダゾリジン、カルボン酸ジエステ
ル類（以下ジエステル類と略称する。）に好アルカリ性
パシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属を含むパシラス属に属
するエステラーゼ生産菌または好アルカリ性パシラス属
を含むバシラス属に属するエステラーゼ生産菌由来のエ
ステラーゼを接触せしめることにより、前記一般式（Ｉ
）で示される光学活性シス−イミダゾリジンジカルボン
酸誘導体（以下、ハーフェステル類と略称する。）を製
造する方法を提供するものである。 一般式（１）および（Ｉｔ）において低級アルキル基と
はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−
ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル基等
のり１〜Ｃ６アルキル基を意味する。 本発明によって得られる光？！活性ハーフェステル類（
Ｉ）はビオチンおよびその他国薬品の合成中間体として
極めて重要な化合物である。 従来、微生物による光学活性ハーフェステル類（Ｉ）の
製造方法としては、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属によるもの（特開昭５８−１
９０８９５　）Ｌ／か知られていなかった。 そこｐ本発明者らは、新たに自然界から分離された微生
物を用いてジエステル類Ｃ［［）から光学活性ハーフェ
ステル類（Ｉ）の製造方法を鋭意検討した。その結果、
好アルカリ性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属を含むバ
シラス属に属するエステラーゼ生産菌または好アルカリ
性パシラス属を含むパシラス属に属するエステラーゼ生
産菌由来のエステラーゼを用いた場合、光学活性なハー
フェステル類（Ｉ）が得られることを見い出し、本発明
を完成するに至った。 本発明の方法においては、好アルカリ性パシラス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）　Ｑを含むパシラス属に属するエステラ
ーゼ生産菌または好アルカリ性バシラス属を含むバシラ
ス属に属するエステラーゼ生産菌由来のエステラーゼを
ジエステル類（ＩＩ）に接触せしめることにより半加水
分解する。この際、反応は緩和な条件下で収率よく進行
し、本発明の目的化合物ハーフェステル類（Ｉ）を得る
ことができ、しかも半加水分解反応は立体選択的又は特
異的に進行する。 即ち、メソ体であるジエステル類（Ｉ［）を半加水分解
する際、２種類の光学対掌体の生成が考えられるが、本
発明の方法を用いればそれらの２種類のうちいずれか一
方の対掌体のみが過剰に生産し、さらに場合によっては
一方的に１種類の対掌体のみを生産するといういわゆる
不斉加水分解が生ずるのである。 本発明の方法により、選択的に得られるハーフェステル
類（１）は４８．５８配位をもつものであり、光学活性
なｄ−ビオチンに変換することができる。たとえば、そ
の−例は特開昭５８−１９（Ｈ３９５に記載されている
。 本発明に用いられる微生物は、バシラス属に属するパシ
ラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＶＡ−４
ｒ株１に工研ｍＷｍ　＆’７）ｔ）号）又は好アルカリ
性バシラス・エスピー　ＭＡ−６２株（微工研菌寄第　
２″７，２７Ｐ　　号）ならび０こ当該微生物に紫外線
、Ｘ線、ｒ線等の照射、化学変異処理剤、ファージ接触
、形質転換、形質導入、接合による遺伝子組換、細胞融
合による遺伝子組換、プラスミドによる遺伝子導入など
の変異処理を施して得られる人工変異株もしくは自然変
異株を包含するほか、バシラス属に属しジエステル類（
■）を光学活性ハーフェステル類（Ｉ）に変換する菌株
を一般に包含する。 なお、上記に例示の菌株は、いずれも新菌極であり、主
要な菌学的性状は、次の通りである。 （ａ）　　形態的性質（肉汁寒天培地及び肉汁培地）（
ｂ）　　各種培地における生育状態 （１）　　肉汁寒天平板培養　（３０”Ｃ１２日間）（
２）肉汁寒天斜面培養（８０″Ｃ，２日間）（３）肉汁
液体培養１８０″Ｃ，８日間）（４）　　肉汁ゼラチン
穿刺培養

【２２”Ｃ１１カ月】（５）　　リドマスミル
ク培養（８０°Ｃ，１力月）（Ｃ）　　生理学的性質 以上の菌学的性質に示されたように、これら（１）２菌
株は、好気的条件下に生育する有胞子性桿菌であること
からパージエイズ・マニュアル・ｔブ・デターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎ
ｕａｌ　　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）＠８版の検索式１こ従いバシラ
ス属に属することは、明らかである。さらにＭＡ−４７
株と同居中の菌種を比較すると、類似菌株としてハシラ
ス・ファスティディオサｘ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆａ
ｓｔｉｄｉｏｓｕｓ）及ヒバシラス・アルカロフィラズ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｋａｌｏｐｈｉ　ｌｕｓ　）が
あげラレルカ、ハシラス・ファスティディオサスは、細
胞の大きさが直径Ｌ−５〜２．５　μｒｎ　１長さ３〜
６μｍとＶＡ−４７株より大きく、硝酸塩の還元能もな
い点でＶＡ−４７株とは異なる。ハシラス・アルカロフ
ィラスは、好アルカリ性の株でｐＨ７では生育せず、硝
酸塩の還元能もない点でＶＡ−４７株とは異なる。 またＶＡ−６２株について同居の菌属と比較すると、類
似菌としてハシラス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂ
ｒｅｖｉｓ　）及びハシラス・アルカロフィラＸ　（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ　）があげ
られるが、ハシラス・プレビスは、生育の最高温度が４
０〜６０゛Ｃでスターチ加水分解力がなく、耐塩性もＭ
ａｉｌ　　５％以下である点でＶＡ−６２株とは異なる
。ハシラス・アルカロフィラスは、アルカリ性の培地で
のみ生育する点がＶＡ−６２株と同じであるが、ふくら
みを持った胞子のうを形成せず、硝酸塩の還元能もない
点でＶＡ−６２菌とは異なる。 以上のことから、本発明者らは、ＶＡ−４７株及びＶＡ
−６２株をパシラス属に属する新菌種と認め、ハシラス
・エスピー　ＶＡ−４７及びハシラス・エスピー　ＶＡ
−６２と命名した。 これらの２菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に
受託番号微工研菌寄第　（Ｐ’７．）θ　号及び受託番
号微工研菌寄第ｐ’）ｉｐ　　号として寄託されている
。 本発明に用いられる微生物を培養する培地としては、通
常行われる微生物の培養に常用される炭素源、窒素源、
無機物等を含む各種の培地を使用することができる。培
地の炭素源としては、たとえばグルコース、フラクトー
ス、シュクロース、デンプン、グリセリン、糖蜜などの
炭水化物、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸、
などの有機酸類、グリシン・グルタミン酸、アラニン、
アスパラギンなどのアミノ酸類、ｎ−パラフィンなどの
炭化水素類などである。窒素源としてはたとえば肉エキ
ス、ペプトン１１＃母エキス、乾燥酵母、味液、大豆粉
、ないしはその加水分解物、カゼインないしその加水分
解物、各種アミノ酸、各柵アンモニウム塩、硝酸塩など
である。無機物の例は、リン酸塩、あるいはマグネシウ
ム、カリウム、カルシウム、ナトリウム、鉄、マンガン
などの塩類である。 培養は通常好気的に行われ、振とう培養あるいは通気攬
はん培養が好適である。培養日数は、通常半日から７日
間が適当である。バシラス・エスピー　ＶＡ−４７株の
培養温度は、通′＃！１２５〜８７′Ｃが好ましく、培
養液ｐＨは、６．５〜８程度が好ましい。パシラス・エ
スピー　ＶＡ−６２株の培養温度は、２０〜ａｏ’ｃが
好ましく培養液ｐｆｔは、８〜１０が好ましい。 本菌株の培養により光学活性ハーフェステルＭ　（Ｉ）
を１０るには、生育の当初からあるいは後にジエステル
類（１［）を培養液に添加し、培養を継続し、半加水分
解を行わせる方法が最も簡便である。Ｔ５筑ρ度は０，
１〜１０％程度が適当である。 培養物中に蓄積された光学活性ハーフェステル類（１１
を単離精製するには、有機化合物の単離精製に通常用い
られる単離精製手段を適用すればよい。 光学活性ハーフェステル類（１）はまた本菌株の培養液
から遠心分離またはろ過等により集菌した微生物細胞を
用いて半加水分解する方法、あるいは微生物の細胞から
超音波処理、リゾチーム処理等により酵素を遊離させ冷
却下遠心分離、硫安分画、沈殿透析等によりエステラー
ゼを得てこれを用いて半加水分解する方法にても実施で
きる。これらの場合には、ジエステル類（ｎ）を好まし
くはＴ）ｌｌｉ６〜９に調製した水溶液又は緩衝溶液に
けん濁するか溶解し、ジエステル類（Ｉｔ）に対して微
生物の細胞もしくはエステラーゼを好ましくは０．００
１〜０．１重量比添加し、好ましくは１０〜４０°Ｃで
攪はんすることにより反応が進行し、通常１時間〜数日
間で反応が終了する。 上述、水溶液とは硫酸、塩酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、
クエン酸等の有機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウム等の無機塩基、トリエチルアミン、
ピリジン等の有機塩基、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウ
ム等の塩を添加した水溶液を意味する。 緩衝溶液とは、リン酸二水素カリウム・水酸化ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム・リン酸−水素ナトリウム、
フタル酸水素カリウム・塩酸、グリシン・塩化ナトリウ
ム・水酸化ナトリウム等の一般的緩衝浴故を意味し、反
応を妨げるもの以外は特に制限はない。 又、必要に応じメタノール、エタノール、ｎ−プロパツ
ール、イソプロパツール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノ
ールの如きアルコール系溶媒、エーテル、テトラヒドロ
フラン、ジオキサンの如きエーテル系溶媒、ベンゼン、
トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、アセトン、メチル
エチルケトン、ジエチルケトン等のケトン系溶媒、トリ
エチルアミン、ピリジン等のアミン系溶媒、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、又、
ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノラウレー
ト等の如り界面活性剤を添加する事もできる。 以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれらにより限定されないことは勿論のこと
である。 実施例１） 可溶性デンプン　ｔｇ、酵母エキス　０．５ノ、ペプト
ン　０．５　ｙ、　ＫｔＬＬＰ０４　０．１９１Ｍｇ５
（Ｊ４−７　Ｈｚｏ　　０．０２　ｆ、　ＵｕＳ（Ｍ　
−５ＨｇＵＯ，０００５ｆ、ＭｎＣ１４・４　Ｈ２（Ｊ
　　Ｏ，０００５ｆ、　Ｚｎ５（Ｊ４・７　Ｉ：Ｌ２Ｕ
　　Ｏ，０００１ｆ、　Ｆｅ５Ｏｎ・７　Ｈ２（Ｊ　　
Ｏ，０００２ｆ　、蒸溜水１００−からなる溶液を補水
酸化ナトリウムにてｐＨ７，６に調整した。 この液体培地を１２０”Ｃにて２０分間滅菌した後、ハ
シラス・エスピー（ｎａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＶＡ−
４７株を接種し、２８゛Ｃで４８時間振とう培養した。 これにシス−１，８−ジベンジル−２−オキソイミダゾ
リジン−４，５−カルボン酸ジメチルエステル４００η
を添加した後、さらに２８”Ｃで７２時間振とう反応さ
せた。 この反応液に酢酸エチル１００−を加え、希塩酸にて酸
性とした後、セライトろ過した。 ろ故を分液し、有機溶媒層を水にて洗浄後、無水硫酸マ
グネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。残さに６％重そ
う水２０−を加え、溶解後エーテル２０−にて洗浄し、
分液した。 水層を希硫酸にてｐＨ２とし、析出した白色結晶をろ過
し、水にて洗浄後乾燥した。 （４１：１，５ル）−１，８−ジベンジル−５−メトキ
シカルボニル−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボ
ン酸が、ａｏｏｑ得られた。 融点　　１４９〜１５１　℃ ［α］−２８，０°　（Ｃ＝１、ｌ）ＭＦ　）であった
。 実施例２） 可溶性デンプン　ｌ　ｆ、　酵母エキス　０．５１１ペ
プトン０．５９　、　Ｋ２ＨＰＯ４０，１ｊ’、Ｍｇ５
Ｕ４・７　Ｈｚ（Ｊ　　Ｏ，０２ｆｌｏｕｒ（Ｊ４・５
　ｋｉｚＵＯ，０００５ｆ１ＭｎＣ１４・４ＨｇＵ　　
ｏ、０００５１／　％Ｚｎ８Ｕａ　−７Ｈｇ（Ｊ　　Ｏ
ｌＱ　Ｏ０１ｆ、　Ｆｅ８（Ｊ４・７Ｈ２Ｕ　　Ｏ，０
００２ｆ、蒸溜水１００−からなる浴液を希水酸化ナト
リウムにてｐ　Ｈ９，０に調整した。 この液体培地を１２０　”Ｃにて２０分間滅菌した後、
ハシラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＭＡ
−６２株を接種し、２８°Ｃで４８時間振とう培養した
。これにシス−１，３−ジベンジル−２−オキソイミダ
ゾリジン−４，５−カルボン酸ジメチルエステル４００
ｑを添加した後、さらに２８゛Ｃで７２時間振とう反応
させた。 この反応液に酢酸エチル１００１ｒＬｔを加え、希塩酸
にて酸性とした後、セライトろ過した。 ろ液を分液し、有機溶媒層を水にて洗浄後、無水硫酸マ
グネシウムにて乾燥し、減圧濃縮した。残さに５％重そ
う水２Ｇ−を加え、溶解後エーテル２０ｒｎｔにて洗浄
し、分液した。 水層を希硫酸にてｐＨ２とし、析出した白色結晶をろ過
し、水にて洗浄後乾燥した。 （４８，５ル）−１、８−ジベンジル−５−メトキシカ
ルボニル−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸
が、３２０Ｉｎ９得られた。 融点　　１４９〜１５１”Ｃ ［α］　　　−２８，０’　　（Ｕ＝ｉ　ＤＭＦ）８（
ｉ５ であった。 実施例３） 実施例１）で用いた液体培地１０ｍ１の入った試験管を
１２０　”Ｃにて２０分間滅菌した後、ハシラス・エス
ピー　ＭＡ−４７株を接種し、２８°Ｃで２日間振とう
培養して得た前培養５―ずつを、下記の培地Ａ　２５０
　＋ｄの入った２Ｌ坂ロフラスコ４本に接種し、３ｏ−
ｃで４０時間振とう培養した。 １　１）ｌｌｉ７．６（１０％　ＮａＣ（Ｊａで調整）
　　　　　１培養液を８０００　ｒｐｍ　２０分間、冷
却下で遠心分離して集菌した。菌体を０．８５％食塩水
１００ｆｎｔにて８回洗浄（遠心分離にて）し、洗浄湿
菌体Ｌ５．７ｆを得た。 洗浄湿菌体１５．７ｙとシス−１，３−ジベンジル−２
−オキソイミダゾリジン−４，５−カルボン酸ジメチル
エステル５．０ｇをｐＨ８，００，ＯＩＭ−リン酸緩衝
５００ｆｎｔにけん濁Ｌ／、ｌｆｉ定水酸化ナトリウム
水溶液にてｐＩｉ８付近に調整しながら８０”Ｃで１７
０時間攪はんした。 この反応液を遠心分離し、菌体と上清液に分離した（菌
体は回収）。上清液を希硫酸にてｐＨ２とし析出した白
色結晶をろ過し、水にて洗浄後乾燥した。 （４Ｓ、５凡）−１，８−ジベンジル−５−メトキシカ
ルボニル−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸
が、４．５ｙ得られた。 融点　　１４５〜１４７”Ｃ ［α］　　　−２５，００（Ｃ＝１、ＤＭＦ）であった
。 実施例４） 実施例１）で用いた液体培地１０−の入った試験管を１
２０℃にて２０分間滅菌した後、パシラス・エスピー　
ＶＡ−６２株を接種し、２８”Ｃで２日間振とう培養し
て得た前培養液５−ずつを、下記の培地Ｂ２５０−の入
った２Ｌ坂ロフラスコ５本に接種し、８０″Ｃで４０時
間振とう培養した。 培養液を８０　Ｏｒｐｍ　２０分間、冷却下で遠心分離
して集菌した。菌体を０．８５％食塩水１００−にて８
回洗浄（遠心分離にて）し、洗浄湿菌体１０．５ｙを得
た。 洗浄湿菌体１０．５ｙとシス−１，３−ジベンジル−２
−オキソイミダゾリジン−４，５−カルボン酸ジメチル
エステル５．０ｇをｐＨ８，００，ＯＩＭ−リン酸緩衝
５００−にけん濁し、ｌ規定水酸化ナトリウム水溶液に
てｐＨ８付近に調整しながら８０℃で１００時間攪はん
した。 この反応液を遠心分離し、菌体と上清液に分離した。上
清液を希硫酸にてｐＨ２とし析出した白色結晶をろ過し
、水にて洗浄後乾燥した。 （４Ｓ、５ル）−１，８−ジベンジル−５−メトキシカ
ルボニル−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン酸
が、４．Ｇ／得られた。 融点　　１４６〜１４８”Ｃ ［α］　　　　−２６，０°　（Ｃ＝１、ＤＭＦ）′ｏ
６６ であった。 実施例５） 実施例３〕で回収した菌体とシス−１，８−ジベンジル
−２−オキソイミダゾリジン−４，５−カルボン酸ジメ
チルエステル５．０ｇをｐＨ８，００，ｏｌＭ−リン酸
ｆｆｌｆ７５００ｍｌにけん濁し、１規定水酸化ナトリ
ワム水溶液にてｐ　Ｍ　３付近に調整しながら８０”Ｃ
で１９０時間攪はんした。 この反応液を遠心分離し、菌体と上清液に分離した。上
清液を希硫酸にてｐＬＬ２とし析出しｒコ白色結晶をろ
過し、水にて洗浄後乾燥した。 （４Ｓ、５ＬＬ）−１，８−ジベンジル−５−メトキシ
カルボニル−２−オキソイミダゾリジン−４−カルボン
酸が、４．４ｆ得られた。 融点　　１４９〜１５１°Ｃ ［α］　　　　−２８，０°　（Ｃ＝１、ＤＭＦ）であ
った。 手続補正書（自発） 昭和６１年６月３０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは低級アルキル基を示す。Ｂｚｌはベンジル
   基を示す。） で示されるシス−イミダゾリジンジカルボン酸ジエステ
   ル類に好アルカリ性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属を
   含むバシラス属に属するエステラーゼ生産菌または好ア
   ルカリ性バシラス属を含むバシラス属に属するエステラ
   ーゼ生産菌由来のエステラーゼを接触せしめることを特
   徴とする一般式▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは低級アルキル基を示す。 Ｂｚｌはベンジル基を示す。 ４位、５位の配位は４Ｓ、５Ｒの配位である。） で示される光学活性なシス−イミダゾリジンジカルボン
   酸誘導体の製造法