CN107794251A - 一种深海新型耐碱酯酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋冷泉细菌来源新型高活力酯酶E25的应用及其编码基因。本发明涉及酯酶基因e25克隆自深海冷泉沉积物细菌Altererythrobacter epoxidivorans CGMCC 1.7731^T，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述酯酶基因e25经异源表达后，为对硝基苯酚己酸酯(C6)的底物催化活性最高，酶活为1,730U/mg。酯酶E25酯酶催化水解最适温度为45℃；在添加有机溶剂甘油时，酶活增大；在添加有机溶剂甲醇、二甲基亚砜和去垢剂吐温80、TritonX‑100时，仍能保持50％以上酶学活性。该酯酶具有耐受温度较高和耐碱、耐有机溶剂的特征，可在有机碱性废水处理、食品发酵产业和药物合成代谢等工业生产中得到应用。

Description

一种深海新型耐碱酯酶及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种海洋冷泉细菌来源耐碱酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

脂类水解酶是一类经由水解作用，将脂类降解为脂肪酸和醇类的催化酶。根据催化底物链的长短来分，脂类水解酶分为酯酶(EC 3.1.1.1)和脂肪酶(EC 3.1.1.3)，酯酶优先水解短链脂肪酸，通常情况下碳链长度小于10个碳原子，脂肪酶则优先水解长链脂肪酸。1935年，Kirsh发现草酸青霉菌能够产脂肪酶，是最早报道的微生物脂类水解酶。脂类水解酶的优点包括：不需要辅醇和辅因子参与反应、底物谱较为广泛、具有较高手性催化的选择性、有机溶剂耐受性和催化作用稳定性等等。其中，酯酶能够降解酯类，其水解产物被广泛应用于食药加工、化妆品废水处理等领域，是一种具有重要工业应用价值的水解酶。深海环境丰富多样且具有独特的特征，其中蕴藏着丰富的新基因、新材料资源，为开发海洋药物、利用新能源、修复环境等技术研发提供了宝贵材料。

自2008年以来，高通量测序技术飞速发展，我们已经能够廉价、快速获得微生物的全基因组序列，并利用生物信息学工具，直接从基因组序列中获得酶蛋白的编码基因。微生物全基因组为酶学研究提供了巨大的“基因池”，而从中挖掘具备工业应用价值的新型酶成为了目前一种有效的重要方法。

酯酶应用范围广泛，在医药日化生产工业、食品加工及风味改良、油脂水解处理、纺织原料脱脂和废水处理等涉及发酵产热的工业流程中，能得到很好的应用。目前授权的高温细菌酯酶专利还较少，中国专利CN201610730362.5、CN201610727345.6和CN201610594944.5分别提供了三个宏基因组文库来源酯酶及其编码基因，能够在高温下发挥酶学活性并高效去除废纸浆中胶黏物；另外，中国专利CN201410758970.8和CN201410549641.2分别报道了来源于嗜热细菌细菌的高温乙酰木聚糖酯酶和新型酯酶基因及其蛋白表达应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海洋冷泉沉积物细菌来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及具有酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

本发明所述的具有酯酶活性的多肽，其来源于细菌种属Altererythrobacterepoxidivorans。

本发明针对分离自深海沉积物的细菌Altererythrobacter epoxidivoransCGMCC 1.7731^T。该细菌分离自日本鹿儿岛(Kagoshima Bay)冷泉沉积物，分类命名为Altererythrobacter epoxidivorans。保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.7731^T，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(100101)。该菌种于保藏之日起即向社会公众公开并不受限制使用。

基于全基因组序列分析筛选获得酯酶基因e25，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。酯酶基因e25大小为948bp，碱基组成为：189A(19.94％)、279G(29.43％)、167T(17.62％)和313C(33.02％)，编码蛋白大小为315个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。将该酯酶的氨基酸序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的是同属细菌Altererythrobacter xiamenensis中的脂肪酶，相似性为84％(其在GenBank数据库中登录号为WP_086438717)。综合E25氨基酸序列与第IV家族参考序列(PDB数据库登录号4YPV、3AIM、4V2I和1JJI)的ClustalW比对结果及系统发育分析结果，表明酯酶E25属于酯酶家族中的第IV家族。第IV家族因其氨基酸序列近似于哺乳动物的HSL蛋白而得名HSL家族(荷尔蒙敏感酯酶)，其催化活性中心常存在G-D-S-A-G的高度保守序列。氨基酸序列分析结果显示，酯酶E25活性位点丝氨酸附近序列为具有甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为161至165位)，163位丝氨酸与255位天冬氨酸和285位组氨酸共同构成酯酶活性催化中心。

在不影响酯酶E25蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到酯酶突变体。如前所述，本发明所述的酯酶E25的催化中心为SEQ ID NO:2所示的161-165、255和285氨基酸位置。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域161-165、255和285位氨基酸位置的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶E25突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留原蛋白质E25酯酶的生物学功能，优选该突变体具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的酯酶至少90％以上的酯酶活性，更优选具有至少95％以上的酯酶活性，最优选至少99％以上的酯酶活性。

本发明涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill，1979于The Proteins，Academic Press，NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145和1988，DNA 7:127)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有酯酶活性的酯酶E25的核苷酸序列，或由编码本发明具有酯酶E25活性的突变体的核苷酸序列组成。

本发明涉及编码具有酯酶E25活性的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；

(b)多核苷酸，其为编码SEQ ID NO:1所示的远离催化中心氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体的多核苷酸，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

本发明还提供了编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酯酶基因e25，其与SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列一致。酯酶基因e25大小为948bp，碱基组成为：189A(19.94％)、279G(29.43％)、167T(17.62％)和313C(33.02％)。本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除481-495、763-765和853-855位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶E25蛋白生物学活性的突变体基因。优选的酯酶E25突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明酯酶的分离的多核苷酸以提供酯酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶E25基因连接到合适的载体上。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于酯酶的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的酯酶的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶E25基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶E25。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达生产酯酶。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因e25连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，并转化到大肠杆菌BL21中，经诱导表达出高活性的重组酯酶。

本发明还涉及用于产生本发明所述酯酶的方法，其包括：(a)在有助于产生酯酶的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述酯酶的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酯酶的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得酯酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。

本发明还提供了酯酶E25或能表达酯酶E25的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯酶E25或上述能表达E25酯酶的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C6短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C6短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯和对硝基苯酚己酸酯，另外E25酯酶的宿主菌对具有C10、C12和C14短碳链也表现出微弱的水解活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活为1,730U/mg。

E25酯酶催化水解温度范围为10～60℃，优选为45℃左右；所述水解的pH值为5.0～10.0，优选为9.0。在添加Ca²⁺、Cu²⁺和Ba²⁺条件下，对酶活影响不大；在添加EDTA、Sr²⁺和Mg^{2 +}的条件下，仍有一定酶活；在添加有机溶剂甲醇、二甲基亚砜、吐温80和TritonX-100时，仍能保持50％以上酶学活性。

本发明从海洋冷泉沉积物来源细菌Altererythrobacter epoxidivorans CGMCC1.7731^T中筛选获得能在较高温度下表现最高活性的耐碱酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具备应用于催化解酯和酶法合成酯产品流程中的工业生产潜力。获得的酯酶基因可克隆到合适的原核宿主中实现异源活性表达，能实现工业化生产耐碱酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的耐碱酯酶起始材料。该酶的生产可在医药日化生产工业、食品发酵和废水处理等含碱生产工艺中显示出重要的经济和社会利用价值。

附图说明

图1为酯酶E25的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12：对硝基苯酚十二酸酯；C14：对硝基苯酚十四酸酯；C16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为C6时测定值为100％。

图2为酯酶E25最适反应温度图。

图3为酯酶E25最适反应pH图。

图4为二价阳离子对酯酶E25活性影响示意图。

图5为有机溶剂和去垢剂对酯酶E25活性影响示意图。

具体实施方式

实施例1酯酶基因e25的获取

基于海洋冷泉沉积物来源细菌Altererythrobacter epoxidivorans CGMCC1.7731^T全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因并获得对应的氨基酸序列。通过NCBI网站的在线同源检索工具blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知酯酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得e25基因，大小为948bp，碱基组成为：189A(19.94％)、279G(29.43％)、167T(17.62％)和313C(33.02％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为315个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该基因氨基酸序列在GenBank中同源搜索得到与之相似性最高的是同属细菌Altererythrobacter xiamenensis中的脂肪酶，相似性为84％，该同源序列在GenBank数据库中登录号为WP_086438717。

氨基酸序列分析结果显示，酯酶E25活性位点丝氨酸附近序列具有甘氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为161至165位)，163位丝氨酸与255位天冬氨酸和285位组氨酸共同构成酯酶活性催化中心。E25与参考序列的比对结果和对其进行的系统发育分析，表明E25属于酯酶第IV家族。

实施例2酯酶基因e25的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的酯酶基因e25克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBIORF Finder在线分析获得的酯酶基因的开放阅读框序列，设计扩增酯酶全基因的上游引物e25F(5’-TCGCGAATTCATGGCCGATAACCAGCCCTATG-3’，EcoRI)和下游引物e25R(5’-TCCGGCGGCCGCTCAGTTCTGTCCTAGGAAC-3’，NotI)，PCR扩增后经过琼脂糖电泳和Sanger测序确认基因全长序列。采用EcoRI和NotI双酶切克隆的方法构建表达质粒，即用纯化的PCR产物与经EcoRI和NotI双酶切的质粒pET28a连接，采用CaCl₂热激转化法转化至E.coli DH5α中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆。进而采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取获得阳性克隆质粒，经EcoRI和NotI双酶切鉴定，获得1kbp左右的DNA片段，经测序鉴定为酯酶基因e25。将重组表达质粒转化到E.coliBL21表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例3利用重组表达菌株表达重组酯酶基因e25

将3ml重组表达菌株培养液转接到100ml含有20μg/ml(终浓度)卡那霉素和34μg/ml氯霉素(终浓度)的LB液体培养基中，37℃振荡培养2.5h左右至OD₆₀₀达到0.6，加入0.5mM(终浓度)的IPTG进行诱导表达，置入25℃培养箱，以150r/min转速振荡培养8h。4℃低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(含500mM氯化钠，10mM咪唑，20mMTris盐酸；pH 8.0)中，冰浴进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测，得到电泳纯的重组酯酶蛋白E25，分子量约33.7kDa。用Lowry法测定蛋白质浓度，得到约2mg/100ml发酵液的表达量。

实施例4重组酯酶基因e25的活性检测

利用对硝基苯酚已酸酯法(C6)测定纯化的重组酯酶E25活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)和20ng纯酶蛋白(为10μl经稀释的纯化酶液)，采用DU800紫外可见光分光光度计(Beckman，美国)于45℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为1,730U/mg。

实施例5酯酶E25底物特异性分析

酯酶E25的底物特异性分析采用体系：100mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)，1mM底物，加入20ng纯酶蛋白，在45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，酯酶E25对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C2、C4和C6)具有较好的催化活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，对硝基苯酚葵酸酯(C10)、对硝基苯酚十二酸酯(C12)和对硝基苯酚十四酸酯(C14)也具有一定的催化活性(图1)。结果表明，酯酶E25对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力明显优于长链脂类，但对二碳链水解活性不高。

实施例6酯酶E25最适反应条件分析

酯酶E25最适反应温度在10～60℃范围内测定。具体操作为：100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，1mM对硝基苯酚丁酸酯，加入20ng纯酶蛋白，分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明E25的反应温度范围为10-60℃，最适反应温度为45℃，说明酯酶E25具有耐受较高温度的特性(图2)。

酯酶E25最适反应pH在3.0～10.0范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚己酸酯和20ng纯酶蛋白，在25℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～7.5)，100mMTris-盐酸缓冲液(pH 7.5～8.5)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5～10.0)。测定结果表明，酯酶E25最适反应pH为9.0，在pH 6.0～10.0范围内具有活性(图3)。

实施例7酯酶E25酶学稳定性分析

二价阳离子对酯酶E25活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mMNi²⁺、Co²⁺、Sr²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：100mM2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)，1mM对硝基苯酚己酸酯，20ng纯酶蛋白，于45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，酯酶E25活性会被Ni²⁺、Co²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺完全抑制，在EDTA、Sr²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和Ba²⁺存在下仍具备酶活(图4)。

有机溶剂和去垢剂对酯酶E25活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂(异丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、甘油和二甲基甲酰胺)和1％去垢剂(w/v或v/v)(SDS、吐温20、吐温80和Triton X-100)然后测定酶的活性。测活体系为：2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)，1mM对硝基苯酚己酸酯，20ng纯酶蛋白，于45℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定结果表明，酯酶E25活性会被SDS完全抑制，而在添加有机溶剂甲醇、二甲基亚砜和去垢剂吐温80、TritonX-100时，仍能保持50％以上酶学活性(图5)。

序列表

<110>国家海洋局第二海洋研究所

<120>一种深海新型耐碱酯酶及应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>948

<212>DNA

<213>未知

<400>1

atggccgata accagcccta tgttcgcgag gacgtgaaag cattcctgac cttgctggaa 60

gcggcaggcg gccctgccct ggctgacatg acgctggaag aagcgcgcca aagctatgtc 120

gcattgcacg gaatggccga cgccccggcg cgtgacctgg cagtcattcg caacctctgc 180

tgccccggcc ccgccggtga tattcctctg cgcctgtacg atgcacgaga gagccgcgat 240

ccatcgcctg taatcatgtt ttaccacggc ggcgggttcg tgatcggcga cctcgatacg 300

caccacaatc tgtgcacgga aatcgcacac cagatggacc tgccggtggt cgcagtcgat 360

taccggcggg cgcccgaaaa tcccttccct gcagcaatcg aggattgtga agcggctgca 420

cgatgggtcg caggatcgcc cgaggaactg ggacgcaagg cgaccggcat cgtgaatatc 480

ggcgacagcg ctggcggcaa cgccacgatc gtcgtgacac agcaactggc gaagaacgcc 540

gccaacgtgc cggtagtcct tcaggtgccg atcttcccgc tggcgacaga tgccatcggc 600

tcgcacagcc tcgatgaatt tgccgaaggc tacatcctga ccaaggcagc tatcctgttc 660

ttcgatgcag cctatgtgcc cgaccgcaag gatccgcgcg ctatgccgat cctgggccag 720

cacgagggca ccccgcccac cgtcgttgcc acggcaagcc tcgatcccat tcgcgattcc 780

ggtcgcgact acgcagcggc cctatcccat gccggcgtcg accatgtttt cctcgaggtg 840

tcgggcggaa cgcacagctt cactaacctg cgccaggcga tccccagcta ccagggcgag 900

cttgagcgcg tgttcgcagc catgaagatg ttcctaggac agaactga 948

<210>2

<211>315

<212>PRT

<213>未知

<400>2

MADNQPYVRE DVKAFLTLLE AAGGPALADM TLEEARQSYV ALHGMADAPA RDLAVIRNLC 60

CPGPAGDIPL RLYDARESRD PSPVIMFYHG GGFVIGDLDT HHNLCTEIAH QMDLPVVAVD 120

YRRAPENPFP AAIEDCEAAA RWVAGSPEEL GRKATGIVNI GDSAGGNATI VVTQQLAKNA 180

ANVPVVLQVP IFPLATDAIG SHSLDEFAEG YILTKAAILF FDAAYVPDRK DPRAMPILGQ 240

HEGTPPTVVA TASLDPIRDS GRDYAAALSH AGVDHVFLEV SGGTHSFTNL RQAIPSYQGE 300

LERVFAAMKM FLGQN 315

Claims (10)

1.一种具有酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的具有酯酶活性的多肽来源于细菌种属Altererythrobacter epoxidivorans。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述酯酶的催化中心为SEQ ID NO:2所示的161-165、255和285号氨基酸位置。

4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的突变体为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失小于5个氨基酸得到的突变体。

5.一种编码具有权利要求1所述多肽的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；

(b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除481-495、763-765和853-855位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

6.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求5的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。

7.一种重组表达载体，其包含权利要求6的核酸构建体。

8.一种宿主，其由权利要求7所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

9.一种产生权利要求1-4任一项所述多肽的方法，其包括：

(a)、在有助于产生酯酶的条件下培养权利要求8所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID N0:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸；

(b)、回收所述多肽。

10.权利要求1所述的酯酶或权利要求8所述的能表达酯酶的宿主菌在催化酯类水解中的应用。