CN109943550B - 一种海洋细菌来源酯酶Erp3及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋细菌来源新型耐有机溶剂酯酶Erp3及其编码基因与应用。本发明涉及的酯酶基因Erp3来自海洋细菌Erythrobacter pelagi JCM 17468，所述的酯酶基因经异源表达后，具有较高的酯酶活性，底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活为445.82U/mg。酯酶Erp3具有良好的耐有机溶剂的特性，特别是在甲醇、乙醇、二甲基亚砜和N，N‑二甲基甲酰胺条件下，酶学活性增大。该酯酶活性高，成本低廉，可应用于食品加工及风味改良、油脂水解、精细化工、制药、废水处理和环境修复等高有机溶剂条件下的工业生产。

Description

一种海洋细菌来源酯酶Erp3及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种海洋细菌来源新型耐有机溶剂酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

海洋占据地球表面积的71％，是一个巨大的微生物资源宝库，蕴含着大量的类型多样、功能未知的新型基因。近年来，为满足人们日益增长的物质需求，一些能适应极端反应条件的应用酶在工业生产中发挥了重要的作用，从海洋等极端环境中分离出具有这些特征(耐高温、耐低温、耐酸、耐碱、耐盐、耐重金属等)的新型功能基因也越来越受到人们的重视。而微生物由于其来源的酶具有产量高、反应稳定、副产物毒性小及分子生物学操作简单等优点，成为工业应用酶的主要来源。

随着基因组测序技术的发展，基于序列分析及比对的方法，使得越来越多的脂类水解酶基因从微生物基因组、数据库中被发掘出来，其优点是能够更直接更高效得筛选出序列完整的新酯酶，目前，这种基因预测分析法已经成为发现和鉴定新兴工业催化剂的一种非常重要的手段。

本发明利用生物信息学手段从一种海洋细菌中筛选到一种新型酯类水解酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有高度耐有机溶剂的特点，可用于食品加工、制药、洗涤、废水处理和环境修复等高有机溶剂含量的工业领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海洋细菌来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及一种酯酶，其是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：

(1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示蛋白质序列一致；

(2)其为SEQ ID NO:2所示蛋白质的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

本发明从一株海洋红色杆菌Erythrobacter pelagi JCM 17468(购自日本微生物菌种保藏中心)的全基因组序列中，筛选获得酯酶基因Erp3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。酯酶基因Erp3大小为954bp，碱基组成为173A(18.13％)、166T(17.40％)、314C(32.91％)和301G(31.55％)，编码蛋白大小为317个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。将该酯酶Erp3氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的酯酶来源于赤杆菌属细菌(Erythrobacter sp.HI0063)，相似性为89％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_067678891.1)。系统发育分析结果表明，酯酶Erp3属于酯酶家族中的第Ⅳ家族。氨基酸序列分析结果表明，酯酶Erp3具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为161至165)。综上所述，酯酶Erp3应为酯酶家族中的一名新成员。

在不影响酯酶Erp3蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO.2所示的远离161-165的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶Erp3活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是与其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选161-166)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶Erp3突变体具有至少与SEQID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留酯酶Erp3的生物学功能，优选该突变体具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的酯酶至少90％以上的酶活性，更优选具有至少95％以上的酶活性，最优选至少99％以上的酶活性。

本发明还涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill，1979于The Proteins，Academic Press，NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145和1988，DNA 7:127)。

同理，本发明还保护对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留Erp3蛋白生物学活性的突变体基因。优选的Erp3突变体基因具有至少与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有水解酶活性的酯酶Erp3的核苷酸序列，或由编码本发明具有酯酶Erp3活性的突变体的核苷酸序列组成。

本发明涉及编码具有酯酶Erp3活性的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；或

(b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除481-498位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明酯酶Erp3的核苷酸序列。该序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致；将该酯酶Erp3氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的酯酶来源于赤杆菌属细菌(Erythrobacter sp.HI0063)，相似性为89％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_067678891.1)。该基因编码催化活性中心氨基酸的密码子位于基因SEQ ID NO:1的481-498号碱基对。

本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除481-498位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶Erp3蛋白生物学活性的突变体基因。优选的酯酶Erp3突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明酯酶Erp3的分离的多核苷酸以提供酯酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Erp3基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶Erp3。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。

合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。

本发明涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明酯酶Erp3的分离的多核苷酸以提供酯酶Erp3的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于酯酶Erp3的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的酯酶Erp3的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶Erp3基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶Erp3。

合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达生产酯酶Erp3。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因Erp3连接到大肠杆菌表达载体Psmt3上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酶。

本发明还涉及用于产生本发明所述酯酶Erp3的方法，其包括：

(a)在有助于产生酯酶Erp3的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO：1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸；

(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述酯酶Erp3的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酯酶Erp3的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得酯酶Erp3可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。

本发明还提供了酯酶Erp3或能表达酯酶Erp3的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，酯酶Erp3具有酯酶活性。Erp3酯酶或上述能表达Erp3酯酶的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C10的短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C10短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚癸酸酯等，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活为445.82U/mg。

酯酶Erp3催化水解温度范围为10～60℃，优选为35℃；所述水解的pH值为6.0～10.0，优选为7.0。在添加EDTA和Sr²⁺或有机溶剂甲醇、乙醇、DMSO和DMF时，其酶学活性增强。

本发明自一株海洋红色杆菌Erythrobacter pelagi JCM 17468的全基因组序列中，筛选获得新的耐有机溶剂酯酶基因Erp3，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产耐有机溶剂酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的耐有机溶剂水解酶起始材料。该酶的生产可在食品加工及风味改造、制药、废水处理和环境修复等生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化酯酶Erp3的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为酯酶Erp3的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12：对硝基苯酚十二酸酯；C14：对硝基苯酚十四酸酯；C16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为C6时测定值为100％。

图3为酯酶Erp3最适反应温度图。

图4为酯酶Erp3最适反应pH图。

图5为有机溶剂对酯酶Erp3活性影响图

图6为二价阳离子对酯酶Erp3活性影响图

具体实施方式

实施例1酯酶Erp3的获取

基于一株海洋红色杆菌Erythrobacter pelagi JCM 17468(购自日本微生物菌种保藏中心)的全基因组序列、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得酯酶Erp3基因，大小为954bp，碱基组成为173A(18.13％)、166T(17.40％)、314C(32.91％)和301G(31.55％)，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。编码蛋白大小为317个氨基酸残基，其单字母氨基酸序列下所示(三字母氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)：

将该酯酶Erp3蛋白序列在GenBank中进行同源搜索，与之氨基酸序列一致性最高的是赤杆菌属细菌(Erythrobacter sp.HI0063)，相似性为89％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_067678891.1)。

系统发育分析表明，酯酶Erp3属于酯酶家族中的第Ⅳ家族。氨基酸序列分析结果表明，酯酶Erp3具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的保守区(氨基酸位置为161至165)。

综上所述，酯酶Erp3应为酯酶家族中的一名新成员。

实施例2酯酶基因Erp3重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的酯酶基因Erp3克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBIORF Finder的ORF分析获得的基因开放阅读框序列，设计扩增全基因的上游引物Erp3F(5’-TCGCGGATCCATGGCCGGTACCGAACATTTCG-3’，BamHI)和下游引物Erp3R(5’-TCCCGAGCTCTCATGCCGCGATCCGATCCAG-3’，SacI)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和SacI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和SacI双酶切的质粒pSMT3连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取阳性克隆的质粒，经BamHI和SacI双酶切鉴定，获得954bp左右的DNA片段，经测序鉴定为酯酶基因Erp3。将重组表达质粒转化到E.coliRosetta(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例3利用重组表达菌株表达重组酯酶基因Erp3

将构建好的5ml重组表达菌株转接到250ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.7，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入16℃以200r/min振荡培养20h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ULP1酶在透析袋中切除重组蛋白N端的类泛素SUMO，并采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析去除SUMO蛋白，收集样品进行SDS-PAGE检测。得到电泳纯的重组酯酶蛋白Erp3，分子量约34kDa，与预测值一致(图1)。用BCA蛋白质定量试剂盒法测定蛋白质浓度。

实施例4重组酯酶基因Erp3的活性检测

利用对硝基苯酚己酸酯法测定纯化的重组酯酶基因Erp3活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和30.89ng纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于30℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为445.82U/mg。

实施例5酯酶Erp3底物特异性分析

酯酶Erp3的底物特异性分析采用体系：100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，1mM底物，加入30.89ng纯酶蛋白，在35℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，酯酶Erp3对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C4、C6和C8)具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高(图2)。结果表明，酯酶Erp3对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例6酯酶Erp3最适反应条件分析

酯酶Erp3最适反应温度在10～65℃范围内测定。具体操作为：在反应体系中，加入1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和30.89ng纯酶蛋白，分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明酯酶Erp3的反应温度范围为10～60℃，最适反应温度为30℃(图3)。

酯酶Erp3最适反应pH在3.0～10.0范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚己酸酯和30.89ng纯酶蛋白，在30℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-磷酸氢二甲缓冲液(pH 6.0～8.0)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.0)。测定结果表明，酯酶Erp3最适反应pH为7.0，在pH 6.0～9.5范围内具有活性(图4)。

实施例7酯酶Erp3酶学稳定性分析

有机溶剂对酯酶Erp3活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂：丙酮(Acetone)、乙腈(Acetonitrile)、乙醇(Ethanol)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、异丙醇(Isopropanol)和甲醇(Methanol)，测定酶的活性。测酶活体系为：1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和30.89ng纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，酯酶Erp3活性会被乙腈、丙酮和异丙醇抑制，甲醇、乙醇、DMSO和DMF可显著增强其活性(图5)。

二价阳离子对酯酶Erp3活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mMBa²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：1mM对硝基苯酚己酸酯，100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)和30.89ng纯酶蛋白，于30℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，酯酶Erp3活性会被Co²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺和Zn²⁺离子完全抑制，在Ca²⁺存在下对酶活影响不大(保留80％以上活性)，Sr²⁺和EDTA可增强其活性(图6)。

序列表

<110> 自然资源部第二海洋研究所

<120> 一种海洋细菌来源酯酶Erp3及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 954

<212> DNA

<213> Erythrobacter pelagi

<400> 1

atggccggta ccgaacattt cgtgcgcgag gatgtgcgcg ggtttctcga catgctcgaa 60

cagatcggcg gccagggcgt ggaagaggtc ggcgcagaga tcggtcggca gcagatgcgc 120

gccatgggca gcctcgccga agcgcccgcg cgcgatatgg cggtgaagcg cgacctagcc 180

tgccccggac ctgcgggcga gataccgctg cgcttctatg atacgaaaga gacccgcgag 240

gcggggccat gcatcgtctt cttccatggc ggcgggttcg tgatcggcga tctcgaggta 300

tacgaatcgc tctgcaccga aatcgcccac cagctcgacc tgccggtggt ctcggtcgat 360

taccgcctcg cgcccgaaca ccccttcccc gccgcgcccg acgattgcga ggcggcggcg 420

cgctgggtcg catcctctcc ggcggagctg gatcgcacat tcaccggact cgtcctgacg 480

ggcgacagcg cgggcggcaa tctgaccatc gtgacgacca acgcattggt gagcgatccc 540

gcggacgtcc ccgtgctcgt ccaggccccg atctatccgg tggcgagcga tatttctgag 600

catgaaagcc tcaggcaatt ttccgaaggc tacctcctga caggcccgac catggcctgg 660

ttcaccaagc aatatggcgg cgatccgagc gatccgcgca ccacaccgat ggtcggcgat 720

tgtgcgaaca ccccgcccag tgtcatctgc accgcggggc tggacccttt gcgcgattca 780

gggcgcgaat atgccgcgca tctgatccag caggggaccg aggtcgccta tttcgaattt 840

cccggcatca tccatggctt caccacattg cggaaggcga tccccagcgg acagaaggat 900

gtcgacgcct ttctcggcgc gatccgcatc aagctggatc ggatcgcggc atga 954

<210> 2

<211> 317

<212> PRT

<213> Erythrobacter pelagi

<400> 2

Met Ala Gly Thr Glu His Phe Val Arg Glu Asp Val Arg Gly Phe Leu

1 5 10 15

Asp Met Leu Glu Gln Ile Gly Gly Gln Gly Val Glu Glu Val Gly Ala

20 25 30

Glu Ile Gly Arg Gln Gln Met Arg Ala Met Gly Ser Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Pro Ala Arg Asp Met Ala Val Lys Arg Asp Leu Ala Cys Pro Gly Pro

50 55 60

Ala Gly Glu Ile Pro Leu Arg Phe Tyr Asp Thr Lys Glu Thr Arg Glu

65 70 75 80

Ala Gly Pro Cys Ile Val Phe Phe His Gly Gly Gly Phe Val Ile Gly

85 90 95

Asp Leu Glu Val Tyr Glu Ser Leu Cys Thr Glu Ile Ala His Gln Leu

100 105 110

Asp Leu Pro Val Val Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Pro

115 120 125

Phe Pro Ala Ala Pro Asp Asp Cys Glu Ala Ala Ala Arg Trp Val Ala

130 135 140

Ser Ser Pro Ala Glu Leu Asp Arg Thr Phe Thr Gly Leu Val Leu Thr

145 150 155 160

Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Leu Thr Ile Val Thr Thr Asn Ala Leu

165 170 175

Val Ser Asp Pro Ala Asp Val Pro Val Leu Val Gln Ala Pro Ile Tyr

180 185 190

Pro Val Ala Ser Asp Ile Ser Glu His Glu Ser Leu Arg Gln Phe Ser

195 200 205

Glu Gly Tyr Leu Leu Thr Gly Pro Thr Met Ala Trp Phe Thr Lys Gln

210 215 220

Tyr Gly Gly Asp Pro Ser Asp Pro Arg Thr Thr Pro Met Val Gly Asp

225 230 235 240

Cys Ala Asn Thr Pro Pro Ser Val Ile Cys Thr Ala Gly Leu Asp Pro

245 250 255

Leu Arg Asp Ser Gly Arg Glu Tyr Ala Ala His Leu Ile Gln Gln Gly

260 265 270

Thr Glu Val Ala Tyr Phe Glu Phe Pro Gly Ile Ile His Gly Phe Thr

275 280 285

Thr Leu Arg Lys Ala Ile Pro Ser Gly Gln Lys Asp Val Asp Ala Phe

290 295 300

Leu Gly Ala Ile Arg Ile Lys Leu Asp Arg Ile Ala Ala

305 310 315

Claims (19)

1.一种酯酶，其氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示蛋白质序列一致。

2.一种编码权利要求1所述酯酶的多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致。

3.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求2的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述酯酶的产生。

4.一种重组表达载体，其包含权利要求3的核酸构建体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为大肠杆菌表达载体Psmt3。

7.一种宿主，其由权利要求4-6任一项所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

8.根据权利要求7所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主，其为E.coli细菌、甲醇酵母或中国仓鼠卵巢细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主，其为E.coli细菌。

11.一种生产权利要求1所述酯酶的方法，其包括：

(a)、在有助于产生酯酶的条件下培养权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID No:1所示核苷酸；

(b)、回收所述酯酶。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，回收方法包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

13.据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦层析、大小排阻层析或差示溶解度方法。

14.权利要求1所述的酯酶或权利要求7所述的能表达酯酶的宿主菌在催化C2-C10短碳链脂肪酸酯类水解中的应用，所述的C2-C10短链脂肪酸酯为具有C2-C10短碳链的对硝基苯酚酯。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的C2-C10短链脂肪酸酯为对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚癸酸酯。

16.根据权利要求14-15任一项所述的应用，其特征在于，所述的酯酶催化水解温度范围为10～60℃。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的酯酶催化水解温度为35℃。

18.根据权利要求14-15任一项所述的应用，其特征在于，所述的酯酶催化水解的pH值为6.0～10.0。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的酯酶催化水解pH值为7.0。

Images