CN112941094B - 活性型突变酶及可溶性化突变蛋白的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及活性型突变酶及可溶性化突变蛋白的制造方法，其为对失活型酶或不溶性蛋白进行特定，对失活型酶或不溶性蛋白的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸、存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定，制备对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸、存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行替换而成的氨基酸序列进行编码的基因，或者对失活型酶的氨基酸序列中的序列同源性的保守性相对低的氨基酸进行特定，制备将该氨基酸用保守性比该氨基酸高的氨基酸进行替换而成的氨基酸序列进行编码的基因，在异源表达系统中使该基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择活性型突变酶或可溶性化突变蛋白。

Description

活性型突变酶及可溶性化突变蛋白的制造方法
本申请是申请日为2016年6月10日、优先权日为2015年6月10日、中国专利申请号为201680002626.3、发明名称为“活性型突变酶的制造方法及新型活性型突变酶、以及可溶性化突变蛋白的制造方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及活性型突变酶的制造方法及活性型突变酶以及可溶性化突变蛋白的制造方法。更详细地说，本发明涉及通过在异源表达系统中作为失活型酶表达的酶中导入突变、获得活性型突变酶的方法，该方法为包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法的方法，以及通过该方法获得的活性型突变酶。此外，本发明还涉及通过在异源表达系统中作为不溶性型蛋白表达的蛋白中导入突变、获得可溶性化突变蛋白的方法，其包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法。
相关申请的相互参照
本申请主张2015年6月10日申请的日本特愿2015-117808号的优先权，其全部记载特别是作为公开内容援引在此。
背景技术
在异源表达系统中使酶蛋白基因表达时，蛋白多不作为活性型酶表达，这成为利用异源宿主进行酶蛋白的大量表达中的最大问题。为了解决该问题，一直以来进行了各种尝试。例如，作为以大肠杆菌为宿主使其作为活性型酶进行表达的手法，研究了菌体培养条件(专利文献1)；与通过共表达的分子伴侣形成正确的立体结构的伴侣进行共表达的方法(专利文献2)；与信号肽或提高溶解度的标签相融合使其表达的方法(专利文献3、专利文献4)；或者在利用改性剂等将形成有包涵体的蛋白等解开之后，卷回成正确的高级结构的重折叠方法(专利文献5、专利文献6、专利文献7)等。另外，作为解决方法还开发了不使用大肠杆菌、而是在酵母或昆虫、动物的培养细胞(非专利文献1、非专利文献2)中表达与野生型相同的氨基酸序列的酶基因的方法；在试管内进行从基因的转录至翻译的全部过程的无细胞翻译系统(专利文献8)等。
但是，还存在很多通过与伴侣基因的共表达未将包涵体消除的蛋白，另外其他方法还存在操作繁琐或昂贵等问题，目前需求利用最廉价、简单的方法将酶基因作为活性型酶进行表达的新技术。
到目前为止，作为使用大肠杆菌将异源酶作为活性型突变酶进行表达的例子，有报告指出在植物来源的醇腈酶基因中随机地导入突变、使其可溶性表达(专利文献9)。另外，还报告了在将目标蛋白的基因序列随机地突变之后，附加报告蛋白，挑选作为活性型突变酶进行表达的序列的手法(非专利文献3)。但是，还没有关于能够特定可使蛋白作为活性型突变酶表达的基因的突变部位及突变氨基酸的方法的报告。
另外，当在异源表达系统中对含有酶的各种蛋白的基因进行表达时，有时未作为溶解性蛋白进行表达，这成为各种蛋白在利用异源宿主进行大量表达时的大问题。为了解决该问题，已知有与分子伴侣蛋白的共表达(非专利文献4)、作为与麦芽糖结合蛋白等的融合蛋白的表达(非专利文献5)等方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-44888号公报
专利文献2：日本特开平11-9274号公报
专利文献3：日本特开2012-116816号公报
专利文献4：日本特开2012-179062号公报
专利文献5：日本特开平11-335392号公报
专利文献6：日本特开2011-46686号公报
专利文献7：日本特表2001-503614号公报
专利文献8：日本特开2004-105070号公报
专利文献9：WO2006/041226
非专利文献
非专利文献1：Meth.In Molecular Biol.，Protocols 103(1998)
非专利文献2：J.Biol.Chem.，264，pp.8222-8229(1989)
非专利文献3：Microb.Cell Fact.，4，pp.1-8(2005)
非专利文献4：Appl.Environ.Micorobiol.，64，pp.1694-1699(1998)
非专利文献5：Protein science，8，pp.1669-1674(1999)
非专利文献6：J.Mol.Biol.，157，pp.105-132(1982)
非专利文献7：Sci.Rep.，5doi：10.1038/srep08193(2015)
发明内容
发明所要解决的技术问题
如上所述，作为使在异源表达系统中作为失活型酶表达的蛋白作为活性型突变酶进行表达的手法，开发了与伴侣基因的共表达或者使用酵母或动物细胞等的方法。但是，这些方法均存在操作繁琐或者昂贵等问题，另外，应用这些方法进行了可溶化的酶种有限，难以广泛应用于用于产业利用的酶中。另外，虽然报告了部分酶通过导入突变、作为活性型突变酶进行表达，但还没有有效地发现对于使广泛范围的酶作为活性型突变酶表达有效的基因的突变部位及突变氨基酸的方法。即使是在异源表达系统中作为不溶性蛋白进行表达的蛋白，也与失活型酶同样，仍没有有效地发现对于使其作为可溶性蛋白表达有效的基因的突变部位及突变氨基酸。
因此，本发明的目的在于提供一种方法，其为将在异源表达系统中作为活性型酶不表达、或者即便活性型酶表达也很微量的酶作为活性型突变酶使其表达的方法，其包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法。此外，本发明的目的还在于提供利用该方法获得的活性型突变酶。
此外，本发明的目的还在于提供一种方法，其为将在异源表达系统中作为可溶性蛋白不表达、或者即便可溶性蛋白表达也很微量的蛋白作为可溶性化突变蛋白使其表达的方法，其包含选定有效的突变导入位置及突变后的氨基酸的手法。
用于解决课题的方法
本发明者们为了达成上述目的，对酶的基因的突变部位与异源表达系统中的活性型突变酶基因的表达的关系进行研究发现：(1)通过将存在于酶蛋白的α螺旋结构部分的亲水性区域中的疏水性氨基酸替换成某种亲水性氨基酸、或者将存在于该部分的疏水性区域中的亲水性氨基酸替换成某种疏水性氨基酸，可以作为活性型的突变酶使其表达，和/或(2)通过制成将保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性更高的氨基酸替换而成的氨基酸序列，可以作为活性型的突变酶使其表达，且(3)这些方法是具有可以适用于在异源表达系统中为失活型的各种野生型酶的通用性的活性型突变酶的制备方法，从而完成本发明。
本发明者们通过向在大肠杆菌等异源表达系统中作为活性型酶不表达、或者即便活性型酶表达也很微量的微生物或植物、动物来源的酶的基因中导入突变之后，组合调研利用电泳法进行的蛋白表达的确认和目标酶的活性测定发现，显示活性的蛋白中的突变位置是“存在于疏水性区域的亲水性氨基酸、或存在于亲水性区域的疏水性氨基酸”。此外，利用二级结构预测程序详细地对这些突变位置进行了分析，发现这些突变位置也有存在于“酶蛋白的α螺旋部分”的情况。此外发现，作为活性型突变酶的表达具有“存在于酶蛋白的α螺旋内的疏水性区域中的亲水性氨基酸、或存在于亲水性区域的疏水性氨基酸发生突变”这一共同点。此外，使用Edmondson wheel blot法将利用二级结构预测获得的α螺旋部分两分成亲水性区域和疏水性区域，进一步详细地进行分析，发现有通过将存在于疏水性区域的亲水性氨基酸替换成疏水性氨基酸、或将存在于亲水性区域的疏水性氨基酸替换成亲水性氨基酸而获得显示活性的突变酶的情况，发现氨基酸(基因)的突变部位与活性型的突变酶的表达具有恒定的关系。
上述方法是仅关注目标蛋白的氨基酸序列使活性型的突变酶基因表达的方法，与其不同，当与目标蛋白相类似的氨基酸序列是清楚的时，通过关注这些类似氨基酸序列序列同源性的保守性，将保守性低的氨基酸替换成保守性更高的氨基酸，从而所得突变蛋白为活性型的概率更高、可以有效地制备活性型突变酶。
此外还发现，上述方法是利用类似的氨基酸序列在序列同源性的保守性的方法，该方法通过进一步应用存在于酶蛋白的α螺旋部分中的突变候补的氨基酸，可以更有效地制备活性型突变酶。
此外还发现，上述方法不仅适于活性型突变酶的制备，还可适于在异源表达系统中使天然型时作为不溶性蛋白表达的蛋白变为可溶性化突变蛋白。
本发明如下所述。
[1]一种活性型突变酶的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、选择具有与在天然型中得到的活性同种的酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：将天然型时为显示酶活性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度或疏水度比该氨基酸高的氨基酸)、和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸)。
[2]上述[1]所述的制造方法，其包含以下工序：
(1)对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)进行特定的工序；
(2a)对所述(1)工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分进行特定，对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的工序；
(3a)制备具有对下述氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序，所述氨基酸序列是如下而成的：将所述失活型酶的氨基酸序列内、存在于所述α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸)；
(4a)在异源表达系统中使具有所述(3a)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)的工序。
[3]一种可溶性化突变蛋白的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、选择经可溶性化的蛋白(以下称作可溶性化突变蛋白)，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为可溶性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时在表达系统内变为不溶性的蛋白(以下称作不溶性型蛋白)的氨基酸序列内、存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸)。
[4]上述[3]所述的方法，其包含以下工序：
(1)对天然型时为可溶性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白(以下称作不溶性型蛋白)进行特定的工序；
(2a)对所述(1)工序中特定了的不溶性型蛋白的α螺旋结构部分进行特定，对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的工序；
(3a)制备具有对下述氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序，所述氨基酸序列如下而成：对所述不溶性型蛋白的氨基酸序列内、存在于所述α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)，和/或将存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸)；
(4a)在异源表达系统中使具有所述(3a)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择经可溶性化的蛋白(以下称作可溶性化突变蛋白)的工序。
[5]上述[3]或[4]所述的制造方法，其中，根据异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量判断是否为可溶性化突变蛋白。
[6]上述[5]所述的制造方法，其中，将异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量比天然型蛋白的异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量更大的突变蛋白定义为可溶性化突变蛋白。
[7]上述[2]或[4]所述的制造方法，其中，所述工序(2a)中亲水性区域和/或疏水性区域的特定如下进行：使用二级结构预测法对α螺旋结构部分的螺旋轮(helical wheel)进行作图，将螺旋轮上的氨基酸按照1位、5位、2位、6位、3位、7位、4位的顺序排列形成一列，重复该操作至少形成2列每列由7个氨基酸构成的氨基酸序列(其中，第2列的氨基酸数量为5以上即可)，
在至少排列了2列的氨基酸序列区域中，将各行氨基酸的总亲水指数为0以上的行定义为疏水性行、将小于0的行定义为亲水性行，
将3个或4个疏水性行连续而成的束定义为疏水性区域，将4个或3个亲水性行连续而成的束定义为亲水性区域(其中，疏水性区域中的4个疏水性行内侧的任一行的总亲水指数可以小于0、亲水性区域中的4个亲水性行内侧的任一行的总亲水指数可以为0以上)。
[8]上述[2]、[4]或[7]所述的制造方法，其中，所述工序(2a)中，将存在于亲水性区域的氨基酸内的亲水指数为0以上的氨基酸特定为疏水性氨基酸，将存在于疏水性区域的氨基酸内亲水指数小于0的氨基酸特定为亲水性氨基酸。
[9]上述[2]、[4]、[7]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中，将存在于亲水性区域的疏水性氨基酸替换成亲水指数比替换对象的氨基酸小的氨基酸，将存在于疏水性区域的亲水性氨基酸替换成亲水指数比替换对象的氨基酸大的氨基酸。
[10]上述[2]、[4]或[7]所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中，将存在于亲水性区域的疏水性氨基酸替换成亲水指数比替换对象的氨基酸更小且亲水指数的值小于0的氨基酸，将存在于疏水性区域的亲水性氨基酸替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸更大且亲水指数的值为0以上的氨基酸。
[11]上述[2]、[4]、[7]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中的氨基酸的替换为替换成与替换对象的氨基酸相比，序列同源性的保守性更高的氨基酸。
[12]上述[2]、[4]、[7]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，所述工序(3a)中的氨基酸的替换对多个氨基酸中的任一个进行，在所述工序(4a)中，从替换了任一个氨基酸的多个蛋白中选择活性型突变酶或可溶性化突变蛋白。
[13]一种活性型突变酶的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、获得具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)的氨基酸序列中的保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸进行替换。
[14]上述[13]所述的制造方法，其包含以下工序：
(1)对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)进行特定的工序；
(2b)对所述(1)工序中特定的失活型酶的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；
(3b)制备具有将所述保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序；
(4b)在异源表达系统中使具有所述(3b)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)的工序。
[15]一种可溶性化突变蛋白的制造方法，其包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、获得经可溶性化的蛋白(以下称作可溶性化突变蛋白)，其中，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为可溶性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时在表达系统内变为不溶性的蛋白(以下称作不溶性型蛋白)的氨基酸序列中的保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸进行替换。
[16]上述[15]所述的制造方法，其包含以下工序：
(1)对天然型时为可溶性的蛋白，但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时在表达系统内变为不溶性的蛋白(以下称作不溶性型蛋白)进行特定的工序；
(2b)对所述(1)工序中特定了的不溶性型蛋白的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；
(3b)制备具有将所述保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序；
(4b)在异源表达系统中使具有所述(3b)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择可溶性化突变蛋白的工序。
[17]上述[15]或[16]所述的方法，其中，根据异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量判断是否为可溶性化突变蛋白。
[18]上述[17]所述的制造方法，其中，将异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量比天然型蛋白的异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量大的突变蛋白定义为可溶性化突变蛋白。
[19]上述[14]或[16]所述的制造方法，其中，在所述(2b)工序中计算序列同源性的保守性的氨基酸序列选自所述(1)工序中特定的失活型酶或不溶性型蛋白的α螺旋结构部分的氨基酸序列。
[20]上述[14]、[16]或[19]所述的制造方法，其中，替换后的氨基酸是序列同源性的保守性最高的3个氨基酸中的任一个。
[21]上述[14]、[16]、[19]～[20]中任一项所述的制造方法，所述工序(3b)中的氨基酸替换对多个氨基酸进行，在所述工序(4b)中从替换了多个氨基酸的蛋白中选择活性型突变酶或可溶性化突变蛋白。
[22]上述[1]～[21]中任一项所述的制造方法，其中，所述异源表达系统为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、短小芽孢杆菌(Brevibacillus)表达系统、棒状杆菌(Corynebacterium)表达系统、曲霉(Aspergillus)表达系统、昆虫细胞表达系统、放线菌表达系统、植物细胞表达系统、动物细胞表达系统或无细胞蛋白合成系统。
[23]上述[1]～[22]中任一项所述的制造方法，其中，所述活性型突变酶与所述失活型酶相比，酶活性值为2倍以上且无限大的范围。
[24]一种活性型突变扁桃腈氧化酶(mandelonitrile oxidase)，其具有序列号2所示的氨基酸序列中的第444位的缬氨酸被替换成苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸、和/或第455位的缬氨酸被替换成谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列。
[25]一种活性型突变精氨酸脱羧酶，其具有序列号3所示的氨基酸序列中的第261位的缬氨酸被替换成苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸、和/或第430位的精氨酸被替换成缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸、第435位的亮氨酸被替换成组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、或赖氨酸的氨基酸序列。
[26]一种活性型突变鸟氨酸脱羧酶，其具有序列号7所示的氨基酸序列中的第117位的赖氨酸被替换成亮氨酸、和/或第176位的亮氨酸被替换成谷氨酸的氨基酸序列。
[27]一种活性型突变荧光素酶，其具有序列号5所示的氨基酸序列中的第80位的异亮氨酸被替换成赖氨酸、和/或第177位的丙氨酸被替换成天冬氨酸的氨基酸序列。
[28]一种活性型突变谷氨酸脱氢酶，其具有序列号9所示的氨基酸序列中的第174位的缬氨酸被替换成天冬氨酸、第257位的赖氨酸被替换成酪氨酸、和/或第261位的亮氨酸被替换成谷氨酸的氨基酸序列。
[29]一种活性型突变酶的制造方法，其包含在大肠杆菌表达系统中使编码[24]～[28]中任一项所述的氨基酸序列的基因表达，获得蛋白。
[30]上述[29]所述的制造方法，其中，活性型突变酶为活性型突变扁桃腈氧化酶、活性型突变精氨酸脱羧酶、活性型突变鸟氨酸脱羧酶、活性型突变荧光素酶或活性型突变谷氨酸脱氢酶。
[31]上述[3]～[22]中任一项所述的制造方法，其中，不溶性型蛋白为选自酶、细胞因子、血红蛋白、肌红蛋白中的1种蛋白。
[32]上述[3]～[22]中任一项所述的制造方法，其中，不溶性型蛋白为选自IFN-γ、IL-2、IFNβ及人生长激素中的1种蛋白。
发明效果
通过本发明，对于在异源表达系统中为失活型酶的各种酶而言，在异源表达系统中可以将对酶蛋白的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸替换成了更为亲水性的氨基酸的突变蛋白、或者存在于该部分的疏水性区域的亲水性的氨基酸替换成了更为疏水性的氨基酸的突变蛋白作为活性型突变酶进行表达。
此外，通过本发明，通过关注类似氨基酸序列的序列同源性的保守性，能够在异源表达系统中将保守性低的氨基酸替换成了保守性高的氨基酸的突变蛋白作为活性型突变酶进行表达。
通过本发明，对于在异源表达系统中为失活型酶的各种蛋白而言，在异源表达系统中可以将对蛋白的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸替换成了更为亲水性的氨基酸的突变蛋白、或者对存在于该部分的疏水性区域的亲水性的氨基酸替换成了更为疏水性的氨基酸的突变蛋白作为可溶性化突变蛋白进行表达。
此外，通过本发明，通过关注类似氨基酸序列的序列同源性的保守性，能够在异源表达系统中将保守性低的氨基酸替换成了保守性高的氨基酸的突变蛋白作为可溶性化突变蛋白进行表达。
附图说明
图1示出了扁桃腈氧化酶的二级结构预测图(A)及含有突变位置第455位的缬氨酸的α螺旋(RVDIDTMVRGVHVALNFG)的螺旋轮图(B)和亲水性及疏水性区域、突变位置第455位的缬氨酸。
图2示出了螺旋轮投影图(左图)，在螺旋轮投影图上顺时针地排列氨基酸序列的氨基酸1～1时的排列(A)，每7个残基换行的螺旋上的氨基酸序列及其亲水性-疏水性区域(B)。螺旋轮认为是3.6残基的周期性，第8个残基返回至接近1残基的位置，之后的残基描画出类似的轨迹。空心圆表示亲水性氨基酸、黑色圆表示疏水性氨基酸。如左图所示可知，将含有亲水性氨基酸2、5、6、12、13、16的区域作为亲水性区域、含有疏水性氨基酸1、3、4、7、8、10、14、15、17、18的区域作为疏水性区域，亲水性区域内的疏水性氨基酸9或疏水性区域内的亲水性氨基酸11为突变导入对象。
图3为关于具有能够表达活性型突变酶的残基的特定方法(本发明第一方式的制造方法及第二方式的制造方法)的说明图。
图4示出了将扁桃腈氧化酶的第455位的缬氨酸替换成了其他19种氨基酸的酶的氧化酶活性(U/ml)和各个氨基酸的序列保守率(％)。用条形图表示氧化酶活性、用白色圆表示氨基酸序列保守率。A：丙氨酸、C：半胱氨酸、D：天冬氨酸、E：谷氨酸、F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H：组氨酸、I：异亮氨酸、K：赖氨酸、L：亮氨酸、M：蛋氨酸、N：天冬酰胺、P：脯氨酸、Q：谷氨酰胺、R：精氨酸、S：丝氨酸、T：苏氨酸、V：缬氨酸、W：色氨酸、Y：酪氨酸。
图5示出了将扁桃腈氧化酶的第444位的缬氨酸替换成了其他19种氨基酸的酶的氧化酶活性(U/ml)和各个氨基酸的序列保守率(％)。用条形图表示氧化酶活性、用白色圆表示氨基酸序列保守率。A：丙氨酸、C：半胱氨酸、D：天冬氨酸、E：谷氨酸、F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H：组氨酸、I：异亮氨酸、K：赖氨酸、L：亮氨酸、M：蛋氨酸、N：天冬酰胺、P：脯氨酸、Q：谷氨酰胺、R：精氨酸、S：丝氨酸、T：苏氨酸、V：缬氨酸、W：色氨酸、Y：酪氨酸。
图6-1：图6A示出了使用扁桃腈氧化酶的R443～G460，利用图2的作图方法(二级结构预测法)描绘的螺旋轮图。图6B为线状显示图6A的螺旋轮的螺旋轮。
图6-2：图6C表示线状显示的螺旋轮中，进一步的各氨基酸的亲水指数及各行的总数。
图7-1：图7A示出了精氨酸脱羧酶的二级结构预测图、图7B示出了从N末端开始第8个、第13个α螺旋的螺旋轮图和亲水性及疏水性区域、突变位置。
图7-2：图7C表示线状显示的螺旋轮中，进一步的各氨基酸的亲水指数及各行的总和。
图8表示将精氨酸脱羧酶的第261位的缬氨酸替换成了其他19种氨基酸的酶的氧化酶活性(U/ml)和各个氨基酸的序列保守率(％)。用条形图表示氧化酶活性、用白色圆表示氨基酸序列保守率。A：丙氨酸、C：半胱氨酸、D：天冬氨酸、E：谷氨酸、F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H：组氨酸、I：异亮氨酸、K：赖氨酸、L：亮氨酸、M：蛋氨酸、N：天冬酰胺、P：脯氨酸、Q：谷氨酰胺、R：精氨酸、S：丝氨酸、T：苏氨酸、V：缬氨酸、W：色氨酸、Y：酪氨酸。
图9示出了将精氨酸脱羧酶的第430个精氨酸替换成了其他19种氨基酸的酶的氧化酶活性(U/ml)和各个氨基酸的序列保守率(％)。用条形图表示氧化酶活性、用白色圆表示氨基酸序列保守率。A：丙氨酸、C：半胱氨酸、D：天冬氨酸、E：谷氨酸、F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H：组氨酸、I：异亮氨酸、K：赖氨酸、L：亮氨酸、M：蛋氨酸、N：天冬酰胺、P：脯氨酸、Q：谷氨酰胺、R：精氨酸、S：丝氨酸、T：苏氨酸、V：缬氨酸、W：色氨酸、Y：酪氨酸。
图10示出了将精氨酸脱羧酶的第435位的亮氨酸替换成了其他19种氨基酸的酶的氧化酶活性(U/ml)和各个氨基酸的序列保守率(％)。用条形图表示氧化酶活性、用白色圆表示氨基酸序列保守率。A：丙氨酸、C：半胱氨酸、D：天冬氨酸、E：谷氨酸、F：苯丙氨酸、G：甘氨酸、H：组氨酸、I：异亮氨酸、K：赖氨酸、L：亮氨酸、M：蛋氨酸、N：天冬酰胺、P：脯氨酸、Q：谷氨酰胺、R：精氨酸、S：丝氨酸、T：苏氨酸、V：缬氨酸、W：色氨酸、Y：酪氨酸。
图11示出了使用荧光素酶的氨基酸序列推测的二级结构(A)和α螺旋(1)的螺旋轮图(B上)和亲水性及疏水性区域、突变位置(B下)。
图12示出了将荧光素酶的野生型酶和第80位的异亮氨酸替换成了赖氨酸的突变型酶及将第177位的丙氨酸替换成了天冬氨酸的突变型酶的粗酶液的荧光素酶反应的发光值。
图13示出了将荧光素酶的第80位的异亮氨酸替换成了赖氨酸的突变型酶及将第177位的丙氨酸替换成了天冬氨酸的利用突变型酶镍吸附色谱获得的精酶的SDS-PAGE电泳图。
图14示出了鸟氨酸脱羧酶的二级结构预测图。
图15示出了谷氨酰胺脱氢酶的二级结构预测图。
图16表示扁桃腈氧化酶的表达量的试验结果。可溶性ChMOX为上清(可溶性级分)、可溶性+不溶性ChMOX为全体的表达量(上清(可溶性级分)+颗粒(不溶性级分))
图17表示使用了hGH ELISA的hGH突变型蛋白的可溶性表达量的试验结果。
图18表示精制后的SDS-PAGE。
图19表示hGH的氨基酸序列(序列号11)。
具体实施方式
＜活性型突变酶的制造方法(第一方式的制造方法)＞
本发明的活性型突变酶的制造方法(第一方式的制造方法)包含在异源表达系统中使具有编码下述氨基酸序列的碱基序列的基因表达、选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)，其中，所述氨基酸序列如下而成：对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当使该蛋白的基因在异源表达系统中表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)、和/或对存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸)。
上述活性型突变酶的制造方法具体地包含以下工序。
(1)对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)进行特定的工序；
(2a)对所述(1)工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分进行特定，对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的工序；
(3a)制备具有对所述失活型酶的氨基酸序列内的存在于所述α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)、和/或对存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度高或亲水度低的氨基酸)而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序；
(4a)在异源表达系统中使具有所述(3a)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)的工序。
工序(1)
工序(1)中，对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白进行特定。将这种蛋白称作失活型酶。在某种异源表达系统中使其表达时显示活性、但在其他异源表达系统中为失活的酶在本发明中也包含在失活型酶中。成为失活型酶的酶的起源或酶的种类并无特别限定。
成为本发明对象的天然型时显示酶活性的蛋白(以下有时称作目标蛋白)并无特别限定，例如可举出微生物来源的蛋白、动物来源的蛋白及植物来源的蛋白等。另外，失活型酶的种类并无限定，例如作为失活型酶，可举出氧化还原酶、转移酶、水解酶、异构酶、裂解酶、连接酶等。
异源表达系统是在生成目标蛋白的蛋白生产体为生物体时，使用了与生成目标蛋白的生物体不同的宿主的表达系统或者无细胞蛋白合成系统，使用了不同宿主的表达系统及无细胞蛋白合成系的种类并无特别限定。另外，在生成目标蛋白的蛋白生产体为无细胞蛋白合成系统时，异源表达系统是指使用全部宿主的表达系统为异源表达系统或者与生成目标蛋白的无细胞蛋白合成系统为不同种类的无细胞蛋白合成系统。作为使用宿主的表达系统，可以没有限制地使用在遗传工学中通用的系统，例如可举出大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、短小芽孢杆菌(Brevibacillus)表达系统、棒状杆菌(Corynebacterium)表达系统、曲霉(Aspergillus)表达系统、昆虫细胞表达系统、放线菌表达系统、植物细胞表达系统及动物细胞表达系统。另外，作为无细胞蛋白合成系统，例如可以使用人培养细胞、兔网织红细胞、昆虫培养细胞、小麦胚芽、嗜热栖热菌Thermus thermophilus或极端嗜热古生菌Thermococcus kodakarensis、使用了大肠杆菌的提取液的无细胞蛋白合成系统或再构成无细胞蛋白合成系统PURE system等。
异源表达系统中的失活型酶的特定可以如下进行：将编码天然型时表现酶活性的蛋白的基因导入到异源表达系统中，在异源表达系统中使蛋白表达，所得蛋白是否具有天然型中所表现的酶活性、有酶活性时为何种程度。异源表达系统中的表达可以对各异源表达系统使用常规方法进行。详细情况在后叙述。
异源表达系统中表达的蛋白不显示活性是指在作为对象的酶的活性测定体系中，显示检测限以下的结果的情况。另外，仅显示微弱的活性是指在作为对象的酶的活性测定体系中，为天然型时该蛋白所显示的酶活性的10％以下、优选为5％以下、更优选为1％以下的情况。
工序(2a)
工序(2a)是对(1)工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分进行特定(步骤1)，对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定(步骤2)，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定(步骤3)的工序。工序(2a)包含3个步骤。
步骤1中，例如使用二级结构预测法对(1)的工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分进行特定。(1)的工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分的使用二级结构预测法的特定例如可通过使用基因信息处理软件GENETYX等基因解析软件或PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)等二级结构预测程序推测二级结构来实施(图1A)。图1A中，氨基酸S15～N22、L49～F50、G52～Q53、S91～V100、F107～A112、P125～K129、V159～E170、S264～L270、P276～L279、D324～D332、N389～Y395、R443～G460、K463～K467、D488～H497、N551～W569为α螺旋区域。
成为α螺旋的骨架的氨基酸的所有氨基与间隔4个残基的羧基形成氢键。构成α螺旋区域的氨基酸的数量并无限定，但从在下述步骤2中易于发现疏水性区域和亲水性区域的观点出发，优选为7个残基以上、更优选为12个残基以上。
步骤2是对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定的步骤。亲水性区域和/或疏水性区域的特定可以通过对α螺旋结构部分的螺旋轮作图来进行。螺旋轮可以使用pepwheel(http：//emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel)等来制作(图1B)。如图1B那样描绘的螺旋轮示出了α螺旋所含的氨基酸的种类和位置。但是，本发明中螺旋轮优选使用如图2A所示以用7个残基形成一周的形式进行作图、进而从图2A所示的螺旋轮开始以1→5→2→6→3→7→4的顺序排列属于螺旋内的氨基酸、第8个残基时换行、选择之前的1、以相同的顺序描绘的线状显示的螺旋轮(图2B)，对α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定。
更具体而言，亲水性区域和/或疏水性区域的特定的优选方式如下所述。
(a)使用二级结构预测法对α螺旋结构部分的螺旋轮进行作图，将螺旋轮上的氨基酸按照1位、5位、2位、6位、3位、7位、4位的顺序排列形成一列，重复该操作至少形成2列每列由7个氨基酸构成的氨基酸序列。但第2列的氨基酸的数目为5以上即可。即，第2列的氨基酸数目至少为5个时，可以对亲水性区域和/或疏水性区域进行特定(制作线状显示的螺旋轮的图)。
(b)在排列了至少2列的氨基酸序列区域中，将各行氨基酸的总亲水指数为0以上的行定义为疏水性行、将小于0的行定义为亲水性行。
(c)将3个或4个疏水性行连续而成的束定义为疏水性区域，将4个或3个亲水性行连续而成的束定义为亲水性区域。将疏水性区域定义为3个疏水性行连续而成的束，将亲水性区域定义为4个亲水性行连续而成的束。将疏水性区域定义为4个疏水性行连续而成的束时，将亲水性区域定义为3个亲水性行连续而成的束。但是，疏水性区域中的4个疏水性行的内侧的任一行的总亲水指数也可以小于0、亲水性区域中的4个亲水性行的内侧的任一行的总亲水指数也可以为0以上。
其中，(c)中的“疏水性区域中的4个疏水性行内侧的任一行”是指未与亲水性区域直接接触的2个行中的任一个，“亲水性区域中4个亲水性行内侧的任一行”是指未与疏水性区域直接接触的2个行中的任一个。
亲水指数(非专利文献6)是表示氨基酸的亲水性及疏水性的指标。本发明中，将亲水指数小于0的氨基酸作为亲水性氨基酸、将亲水指数为0以上的氨基酸作为疏水性氨基酸。
表1
亲水指数
以下以实施例的蛋白为例详细地说明该方法中亲水性区域和/或疏水性区域的特定。
根据图6A～C说明实施例1的马陆(Chamberlinius hualienensis)来源扁桃腈氧化酶的例子。图6A为使用(a)的二级结构预测法作图而成的α螺旋结构部分的螺旋轮。图6B为对图6A的螺旋轮进行线状显示而成的螺旋轮。各圆形记号表示氨基酸，空心圆表示亲水性氨基酸，黑色圆表示疏水性氨基酸，分别表示各氨基酸的位置序号。图6C进一步表示在进行了线状显示的螺旋轮中各氨基酸的亲水指数。例如，右上所示的氨基酸R(精氨酸)的亲水指数为-4.5。此外，图的左侧示出了各行氨基酸的总亲水指数，从上开始按顺序为(I)3.5、(II)-6.7、(III)-3.8、(IV)3.5、(V)-1.1、(VI)3.7、(VII)8.3。(b)中，至少排列了2列的氨基酸序列区域(本例中为3列排列)中，将各行氨基酸的总亲水指数为0以上的行定义为疏水性行、将小于0的行定义为亲水性行，因此(I)3.5的行为疏水性行、(II)-6.7的行为亲水性行、(III)-3.8的行为亲水性行、(IV)3.5的行为疏水性行、(V)-1.1的行为亲水性行、(VI)3.7的行为疏水性行、(VII)8.3的行为疏水性行。(c)中，将3个或4个疏水性行连续而成的束定义为疏水性区域、将4个或3个亲水性行连续而成的束定义为亲水性区域，进而将疏水性区域定义为3个疏水性行连续而成的束时、亲水性区域定义为4个亲水性行连续而成的束，进而将疏水性区域定义为4个疏水性行连续而成的束时、亲水性区域定义为3个亲水性行连续而成的束。基于该规定，可以将(II)、(III)、(IV)、(V)这4个行连续而成的束作为疏水性区域，将(VI)、(VII)及(I)的3个行连续而成的束作为亲水性区域。但是，亲水性区域中的(IV)3.5行为疏水性行，但该行由于是4个亲水性行的内侧的行(即，不与疏水性区域直接接触的行)，因此该例外相当于文中规定的、亲水性区域中4个亲水性行内侧的任一行的总亲水指数可以为0以上。
如此，该例中可以将(II)、(III)、(IV)、(V)这4个行连续而成的束作为疏水性区域，将(VI)、(VII)及(I)这3个行连续而成的束作为亲水性区域。
步骤3为对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的步骤。存在于亲水性区域的疏水性氨基酸的特定及存在于疏水性区域的亲水性氨基酸的特定使用亲水指数进行。本发明中，将存在于亲水性区域的氨基酸内的亲水指数为0以上的氨基酸特定为疏水性氨基酸、将存在于疏水性区域的氨基酸内的亲水指数小于0的氨基酸特定为亲水性氨基酸。
亲水性氨基酸为苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)及甘氨酸(G)，疏水性氨基酸为异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)及丙氨酸(A)(参照表1)。但色氨酸(W)和脯氨酸(P)由于亲水指数小于0，因此被分类于亲水性氨基酸。但是，在侧链的性质上，被分类为疏水性氨基酸。因此，色氨酸和脯氨酸均不属于亲水性及疏水性的任一个氨基酸区域，在计算所述各行氨基酸的总亲水指数时，色氨酸和脯氨酸的亲水指数均为0(零)。但色氨酸(W)和脯氨酸(P)在工序(3a)的氨基酸的替换中，可以作为亲水性氨基酸包含在替换后的氨基酸的例子中。
例如，在所述图6C所示的例子中，存在于亲水性区域的疏水性氨基酸为2个V(缬氨酸)、G(甘氨酸)及F(苯丙氨酸)，另外存在于疏水性区域的亲水性氨基酸为R(精氨酸)。
工序(3a)
制备具有编码以下氨基酸序列的核酸序列的基因，所述氨基酸序列是将失活型酶的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个替换而成的氨基酸序列。此时，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高的或疏水度比该氨基酸低的氨基酸。或者，制备具有编码以下氨基酸序列的核酸序列的基因，所述氨基酸序列是将失活型酶的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个替换而成的氨基酸序列。此时，将待替换的氨基酸替换成疏水度高的或亲水度低的氨基酸。亲水度的高低、疏水度的高低可以使用上文所述的亲水指数确定。氨基酸序列清楚的基因的制备可以利用常规方法实施，使用突变导入技术、成为对象的氨基酸残基的突变导入也可利用常规方法实施。本发明中，例如可以使用QuikChange(注册商标)LightningSite-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司制)等，在特定的残基中导入突变。
存在于亲水性区域的疏水性氨基酸的替换在使用亲水指数时，替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸小的氨基酸。即便是亲水指数的值比替换对象的氨基酸小的氨基酸，也依然有是疏水性氨基酸的情况。此外，存在于亲水性区域的疏水性氨基酸的替换也可以替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸小、且亲水指数的值小于0的亲水性氨基酸。通常，通过存在于亲水性区域的疏水性氨基酸的替换通过替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸小、且亲水指数的值小于0的亲水性氨基酸，具有能够更为确实地获得活性型突变酶的倾向。
同样，关于存在于疏水性区域的亲水性氨基酸的替换，替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸大的氨基酸。此外，存在于疏水性区域的亲水性氨基酸的替换还可以替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸大、且亲水指数的值为0以上的氨基酸。通常，存在于疏水性区域的亲水性氨基酸的替换通过替换成亲水指数的值比替换对象的氨基酸大、且亲水指数的值为0以上的氨基酸，具有能够更为确实地获得活性型突变酶的倾向。
例如，在所述图6C所示的例子中，存在于亲水性区域的疏水性氨基酸为2个V(缬氨酸)、G(甘氨酸)及F(苯丙氨酸)，另外存在于疏水性区域的亲水性氨基酸为R(精氨酸)。实施例中，将2个V(缬氨酸)(444及455)替换成亲水性比V更高、或疏水性更低的氨基酸。将其结果记载于图4(V455)及图5(V444)中，图4(V455)中约半数的突变蛋白可见酶活性，在图5(V444)中大多数的突变蛋白可见酶活性，可知获得了活性型突变酶。
工序(4a)
在所述异源表达系统或与前述不同的异源表达系统中使具有(3a)的工序中制备的核酸序列的基因表达，获得突变导入蛋白。该异源表达系统中的突变导入蛋白的表达可以通过常规方法进行。
以下详细地说明(3a)及(4a)的工序。
(启动子)
本发明的方法中，首先准备保持有对在目标蛋白的氨基酸序列的规定位置上导入有规定突变的蛋白进行编码的基因的大肠杆菌等异源表达宿主。例如保持了对在目标蛋白中导入有突变的蛋白(突变导入目标蛋白)进行编码的基因的大肠杆菌等异源表达宿主可以如下制备：准备在诱导型启动子的控制下配置有对突变导入目标蛋白进行编码的基因的载体，将该载体导入至大肠杆菌中。作为这种诱导型启动子并无特别限定，可以使用公知品。例如，可以使用在异丙基-1-硫-β-D-半乳糖苷(IPTG)的存在下显示转录活性的诱导型启动子。作为这种启动子的例子，可举出Trp启动子、Lac启动子、Trc启动子、Tac启动子、T7启动子等。另外，作为诱导型启动子还可以使用在除IPTG以外的诱导物质存在下显示转录活性的其他启动子或者根据培养基成分及温度(例如低温)等培养条件显示转录活性的其他启动子。
(载体)
作为载体只要在大肠杆菌等异源表达宿主内能够复制则无特别限定，可以是质粒载体、噬菌体载体等的任一种。作为具体的载体，可以举出pCDF系列、pRSF系列、pET系列等。例如，当表达载体为pET(具有T7启动子)系时，可以使用大肠杆菌BL21(DE3)及JM109(DE3)。作为将上述载体导入大肠杆菌的手法，一般来说可以使用作为遗传转化方法已知的各种手法。作为具体的手法，例如可以适用磷酸钙法、电穿孔法、脂质体转染法等。另外，遗传转化可以是一过性的也可以是稳定的。
另外，作为大肠杆菌还可以使用保持有质粒pLysS的大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS：Invitrogen公司制)。质粒pLysS以低水平表达T7核酶。T7核酶由于阻碍T7 RNA聚合酶，因此可以抑制利用IPTG进行表达诱导前的突变导入目标蛋白的表达。此外，在大肠杆菌等异源表达宿主中，为了支援突变导入目标蛋白的正确折叠(折叠)，还可以使伴侣等共表达。
(培养条件)
为大肠杆菌时，保持对突变导入目标蛋白序列进行编码的基因的大肠杆菌的培养可以是间歇培养及连续培养等中的任一种。另外，还可以是静置培养或振荡培养中的任一种，优选振荡培养。培养基可以使用LB培养基(Yeast extract 5.0g/L、NaCl 10.0g/L、Tryptone 10.0g/L)等。作为培养方法，例如可举出在37℃下培养至菌体浊度0.5左右，添加IPTG之后，在温度16～37℃下培养16～24小时等，但只要是重组大肠杆菌能够繁殖，则无特别限定。为大肠杆菌以外的异源表达宿主时，可以使用在任何宿主中使用的公知的培养方法。
(蛋白的提取)
主培养后可以将异源表达宿主破碎，制备含有突变导入目标蛋白的粗酶液。在以往的方法中，利用重组DNA的手法使异源基因在细菌等中大量地表达时，形成所生成的蛋白作为不溶性物质蓄积在细胞内的结构体即包涵体。本发明中，对大肠杆菌等宿主进行集菌，利用超声波破碎机将细胞破坏，利用离心分离分离成上清和含包涵体的沉淀，将所得上清(可溶性级分)作为粗酶液使用。本方法中获得的突变导入目标蛋白由于通常是可溶性的，因此在该粗蛋白悬浮液中含有具有规定活性或功能的突变导入目标蛋白。因而，可以将所得粗蛋白悬浮液作为突变导入目标蛋白含有液直接使用。另外，还可以从所得粗蛋白悬浮液中将突变导入目标蛋白分离纯化后使用。此时，突变导入蛋白的分离纯化可以单独或适当组合使用通常的生物化学方法(例如硫酸铵沉淀、色谱法、离子交换色谱法、亲和层析法等)。经分离纯化的突变导入目标蛋白例如可以以悬浮在规定pH的缓冲液等中的状态等进行利用。
从在异源表达系统中表达的突变导入蛋白中选择具有与天然型中所获活性为同种酶活性的蛋白(活性型突变酶)。活性型突变酶的选择可以如下实施。各蛋白在能够测定天然型中所具有的酶活性的体系中，可以通过测定酶活性进行实施。关于酶活性的测定体系，可以对各酶适当利用已知的方法。
例如为扁桃腈氧化酶时，可以随底物扁桃腈一起通过与4-氨基安替比林和TOOS、过氧化物酶反应的比色法测定扁桃腈氧化酶的酶活性。另外，为精氨酸或鸟氨酸脱羧酶时，可以与底物精氨酸或鸟氨酸一起通过使作用于该氧化反应的产物的胺氧化酶、4-氨基安替比林和TOOS、过氧化物酶反应的比色法测定酶活性。为荧光素酶时，使其与成为底物的腔肠素反应，测定所产生的发光，由此可以测定酶活性。谷氨酸脱氢酶可以与作为底物的谷氨酸一起、添加NAD+，通过吸光度340nm的变化量表示所生成的NADH的增加量来测定酶活性。
根据酶活性的测定结果，可以了解是否获得了活性型突变酶、以及获得了活性型突变酶的突变。活性型突变酶例如可以是与失活型酶相比，酶活性值为2倍以上、无限大的范围。当失活型酶完全不显示活性时(测定结果小于检测限时)，酶活性值的增加率无限大，失活型酶显示微弱的活性时，与微弱的活性相比，酶活性值为2倍以上、优选为10倍以上。
＜活性型突变酶的制造方法(第二方式的制造方法)＞
本发明的活性型突变酶的制造方法(第二方式的制造方法)包含以下工序。
(1)对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者仅显示微弱的酶活性的蛋白(以下称作失活型酶)进行特定的工序；
(2b)对于所述(1)工序中特定的失活型酶的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；
(3b)制备具有对将所述保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序；
(4b)在异源表达系统中使具有所述(3b)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(以下称作活性型突变酶)的工序。
上述工序(1)与本发明的活性型突变酶的制造方法(第一方式制造方法)中的工序(1)相同，可以参照所述第一方式的制造方法中的说明。
工序(2b)
工序(2b)是对(1)工序中特定的失活型酶的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；
本工序中，使用与(1)工序中特定的失活型酶的氨基酸序列同源性高的其他蛋白，利用BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE＿TYPE＝BlastSearch&LINK＿LOC＝blasthome)检索同源性，使用INTMSAlign(非专利文献7)计算各自的序列保守性。氨基酸序列与失活型酶的同源性高的其他蛋白例如如下选择。在上述BLAST位点的“Sequence”栏插入失活型酶的序列，使下部的“Algorithm parameters”内的“General Parameters”的“Max target sequences”数值为5000，将“Expect threshold”的数值变为1.0E-3，开始BLAST，由此可以选择同源性高的其他蛋白。以FASTA形式将所得同源性高的蛋白序列全部下载，插入在INTMSAlign中，由此可以计算序列保守性。
序列保守性的计算对象序列可以是失活型酶的全部氨基酸序列，也可以是部分的氨基酸序列。为部分的氨基酸序列时，序列保守性的计算对象序列还可以是酶蛋白的、例如α螺旋序列，但并不是为了限定于α螺旋序列。除了α螺旋序列以外，例如还可以是β结构、环等。但并不是为了限定于这些序列。
工序(3b)
工序(3b)是制备具有对将工序(2)中特定的保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序。工序(3b)除了利用工序(2b)的方法进行替换对象的氨基酸的选定之外，具有编码突变氨基酸序列的碱基序列的基因的制备可以参照本发明活性型突变酶的第一方式的制造方法中的工序(3a)的记载进行实施。
工序(4b)
工序(4b)是在异源表达系统中使具有(3b)工序中制备的碱基序列的基因进行表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(活性型突变酶)的工序。工序(4b)可以参照本发明的活性型突变酶的第一方式制造方法中的工序(4a)的记载进行实施。
后述实施例3(作为Metridia pacifica来源的荧光素酶的活性型突变酶的表达)及实施例4(黑腹果蝇来源的氨基酸分解酶的α螺旋和作为着重于氨基酸残基的保守性的活性型突变酶的表达)是第二方式制造方法的实施例。
实施例3中，计算L76～A89(参照表4)及S176～I201(参照表5)的2个氨基酸序列区域中的各氨基酸的保守性，可知I80及A177是保守性低的氨基酸，进而对I80制备氨基酸替换成保守性高的A的突变导入目标蛋白，对A177制备氨基酸替换成保守性高的D的突变导入目标蛋白。其结果，获得了虽天然型时为失活型酶，但显示活性的活性型突变酶(参照图12)。
实施例4中，通过计算黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)来源的鸟氨酸脱羧酶(DmODC)的S111～E118及A171～S180(参照表6)的2个氨基酸序列区域中的各氨基酸的保守性，可知K117及L176为保守性低的氨基酸，进而对K117制备氨基酸替换成保守性高的L的突变导入目标蛋白，对L176制备氨基酸替换成保守性高的E的突变导入目标蛋白。其结果，获得了虽天然型时为失活型酶，但显示活性的活性型突变酶。同样地通过计算谷氨酸脱氢酶(DmGluDH)的V174～L189及G252～F262(参照表7)这2个氨基酸序列区域中的各氨基酸的保守性，可知V174、K257及L261是保守性低的氨基酸，进而对V174制备氨基酸替换成保守性高的D的突变导入目标蛋白，对K257制备氨基酸替换成保守性高的Y的突变导入目标蛋白，对L261制备氨基酸替换成保守性高的E的突变导入目标蛋白。结果获得了虽天然型时为失活型酶，但分别显示活性的活性型突变酶。
＜本发明的活性型突变酶的制造方法的第一方式的制造方法和第二方式的制造方法的组合＞
构成酶的蛋白在立体结构内部中相面对的残基为亲水性氨基酸时，螺旋上的氨基酸也为亲水性氨基酸，底物口袋内对酶反应有影响的残基也有为亲水性氨基酸的可能性，在即便是氨基酸残基、序列保守性也高时，特别要考虑这些可能性。对照地，当序列保守性低时，考虑到仅在该酶中存在的可能性，推测是否可以通过将它们除去来提高蛋白的酶活性。利用这点是本发明第二方式的制造方法，通过提取序列保守性低的氨基酸并替换成序列保守性高的氨基酸来提高酶活性。由此，认为能够进行用于获得活性型突变酶的更合理的突变导入。
将它们的关系概念图示于图3中。构成蛋白的氨基酸(整体的圆)内，有构成α螺旋序列的氨基酸的圆(左侧)和序列保守性低的氨基酸的圆(右侧)。在构成α螺旋序列的氨基酸的圆(左侧)中，有在本发明第一方式的制造方法中进行特定的亲水性区域中的疏水性氨基酸或疏水性区域中的亲水性氨基酸的圆(左侧的圆)。本发明第二方式的制造方法中进行特定的序列保守性低的氨基酸的圆(右侧)也有与构成α螺旋序列的氨基酸的圆(左侧)及亲水性区域中的疏水性氨基酸或疏水性区域中的亲水性氨基酸的圆(左侧的圆)相重复的情况。也有根据蛋白不同、不会重复的情况。
具有所述重复时，对于工序(1)中特定的失活型酶，利用本发明的活性型突变酶的第一方式的制造方法的工序(2a)对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定，同时利用本发明的活性型突变酶的第二方式的制造方法的工序(2b)，对保守性相对低的氨基酸进行特定，根据两者的信息来实施工序(3a)及(4a)(工序(3b)及(4b))，由此可以在异源表达系统中使其表达、获得蛋白，从所得的蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白(活性型突变酶)。实施例2(作为拟南芥来源的精氨酸脱羧酶的活性型突变酶的表达)中，组合实施本发明的活性型突变酶的制造方法的第一方式的制造方法和第二方式的制造方法。
＜活性型突变酶＞
本发明包含通过上述本发明的方法选择的活性型突变酶。
本发明的活性型突变扁桃腈氧化酶在序列号2所示的氨基酸序列中，具有第444位的缬氨酸被替换成苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸、和/或第455位的缬氨酸被替换成谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸的氨基酸序列。本发明的活性型突变扁桃腈氧化酶包含具有与天然型的酶活性同等或其以上的活性。
具体而言，将第455位的缬氨酸替换成其他氨基酸的本发明的活性型突变扁桃腈氧化酶如图4所示，虽然天然型的酶活性实质上为0、但分别显示扁桃腈氧化酶活性。将第444位的缬氨酸替换成其他氨基酸的本发明的活性型突变扁桃腈氧化酶也如图5所示，虽然天然型的酶活性实质上为0、但分别显示扁桃腈氧化酶活性。
本发明的活性型突变精氨酸脱羧酶在序列号3所示的氨基酸序列中，具有第261位的缬氨酸被替换成苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸或精氨酸、和/或第430位的精氨酸被替换成缬氨酸、亮氨酸或丙氨酸、第435位的亮氨酸被替换成组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、或赖氨酸的氨基酸序列。本发明的活性型突变精氨酸脱羧酶包含为活性型突变酶且具有与天然型的酶活性同等或其以上的活性者。
将第261位的缬氨酸替换成其他氨基酸的本发明的活性型突变精氨酸脱羧酶如图8所示，虽然天然型的酶活性实质上为0，但分别显示精氨酸脱羧酶活性。
将第430位的精氨酸替换成其他氨基酸的本发明的活性型突变精氨酸脱羧酶如图9所示，虽然天然型的酶活性实质上为0，但分别显示精氨酸脱羧酶活性。
将第435位的亮氨酸替换成其他氨基酸的本发明的活性型突变精氨酸脱羧酶如图10所示，虽然天然型的酶活性实质上为0，但分别显示精氨酸脱羧酶活性。
本发明的活性型突变鸟氨酸脱羧酶在序列号7所示的氨基酸序列中，具有第117位的赖氨酸被替换成亮氨酸、和/或第176位的亮氨酸被替换成谷氨酸的氨基酸序列。本发明的活性型突变鸟氨酸脱羧酶包含为活性型突变酶且具有与天然型的酶活性同等或其以上的活性者。
具体而言，虽然无法确认天然型的酶活性，但将鸟氨酸脱羧酶(DmODC)的第117位的赖氨酸替换成亮氨酸、将176位的亮氨酸替换成谷氨酸的本发明活性型突变鸟氨酸脱羧酶的活性分别为0.45U/mL及0.04U/mL。
本发明的活性型突变荧光素酶在序列号5所示的氨基酸序列中，具有第80位的异亮氨酸被替换成赖氨酸、和/或第177位的丙氨酸被替换成天冬氨酸的氨基酸序列。本发明的活性型突变荧光素酶包含为活性型突变酶且具有与天然型的酶活性同等或其以上的活性者。
具体而言，将第80位的异亮氨酸替换成赖氨酸的本发明的活性型突变荧光素酶及将第177位的丙氨酸替换成天冬氨酸的本发明的活性型突变荧光素酶(MpLUC)如图12所示，虽然天然型的酶活性实质上为0，但分别显示荧光素酶酶活性。
本发明的活性型突变谷氨酸脱氢酶在序列号9所示的氨基酸序列中，具有第174位的缬氨酸被替换成天冬氨酸、第257位的赖氨酸被替换成酪氨酸、和/或第261位的亮氨酸被替换成谷氨酸的氨基酸序列。本发明的活性型突变谷氨酸脱氢酶包含为活性型突变酶且具有与天然型的酶活性同等或其以上的活性者。
具体而言，将谷氨酸脱氢酶(DmGluDH)的第174位的缬氨酸替换成天冬氨酸及将第257位的亮氨酸替换成酪氨酸、将第261位的亮氨酸替换成谷氨酸的本发明的活性型突变谷氨酸脱氢酶的活性分别为0.14U/mL、0.91U/mL、0.05U/mL。
本发明包含一种活性型突变酶的制造方法，其包含在大肠杆菌表达系统中使编码上述本发明活性型突变酶的氨基酸序列的基因表达、获得蛋白。
活性型突变酶例如为活性型突变扁桃腈氧化酶、活性型突变精氨酸脱羧酶、活性型突变鸟氨酸脱羧酶、活性型突变荧光素酶或活性型突变谷氨酸脱氢酶。
＜可溶性化突变蛋白的制造方法(第三方式的制造方法)＞
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第三方式的制造方法)为一种可溶性化突变蛋白的制造方法，其包含：在异源表达系统中使具有编码以下氨基酸序列的碱基序列的基因表达，选择经可溶性化的蛋白(可溶化性突变蛋白)，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为可溶性蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白(不溶性型蛋白)的氨基酸序列内的存在于α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)，和/或对存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度更高或亲水度更低的氨基酸)。
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第三方式的制造方法)具体而言包含以下工序。
(1)对天然型时为可溶性蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白(不溶性型蛋白)进行特定的工序；
(2a)对所述(1)工序中特定的不溶性型蛋白的α螺旋结构部分进行特定、对所特定的α螺旋结构部分的亲水性区域和/或疏水性区域进行特定，对存在于亲水性区域的疏水性氨基酸和/或存在于疏水性区域的亲水性氨基酸进行特定的工序；
(3a)制备具有编码以下氨基酸序列的碱基序列的基因的工序：所述氨基酸序列是如下而成的：对所述不溶性型蛋白的氨基酸序列内的存在于所述α螺旋结构部分的亲水性区域的疏水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成亲水度比该氨基酸高或疏水度比该氨基酸低的氨基酸)、和/或对存在于所述α螺旋结构部分的疏水性区域的亲水性氨基酸的至少1个进行替换(其中，将待替换的氨基酸替换成疏水度更高或亲水度更低的氨基酸)；
(4a)在异源表达系统中使具有所述(3a)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择经可溶性化的蛋白(可溶性化突变蛋白)的工序。
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第三方式的制造方法)可以通过将本发明的活性型突变酶制造方法(第一方式的制造方法)中的失活型酶读成不溶性型蛋白、将活性型突变酶读成可溶性化突变蛋白进行实施。
＜可溶性化突变蛋白的制造方法(第四方式的制造方法)＞
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第四方式的制造方法)为一种可溶性化突变蛋白的制造方法，其包含：在异源表达系统中使具有编码以下氨基酸序列的碱基序列的基因表达，获得经可溶性化的蛋白(可溶性化突变蛋白)，所述氨基酸序列是如下而成的：对天然型时为可溶性蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白(不溶性型蛋白)的氨基酸序列中保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸进行替换。
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第四方式的制造方法)具体而言包含以下的工序。
(1)对天然型时为可溶性蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白(不溶性型蛋白)进行特定的工序；
(2b)对所述(1)工序中特定的不溶性型蛋白的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；
(3b)制备具有编码将所述保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列的基因的工序；
(4b)在异源表达系统中使具有所述(3b)工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择可溶性化突变蛋白的工序。
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第四方式的制造方法)可以通过将本发明活性型突变酶的制造方法(第二方式的制造方法)中的失活型酶读作不溶性型蛋白、将活性型突变酶读作可溶性化突变蛋白来实施。
此外，与本发明的活性型突变酶的制造方法的第一方式的制造方法和第二方式的制造方法的组合相同，也可以是本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第三方式的制造方法)与本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第四方式的制造方法)的组合。
本发明的可溶性化突变蛋白的制造方法(第三及第四方式的制造方法)中，例如可以通过异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量来判断是否为可溶性化突变蛋白。此外，还可以将异源表达后的提取液中的该可溶性蛋白量大于天然型蛋白的异源表达后的提取液中的该可溶性蛋白量的突变蛋白定义为可溶性化突变蛋白。另外，该可溶性蛋白量是指除了提取液中存在的该可溶性蛋白以外的该可溶性蛋白的量。异源表达后的提取液作为溶液可以使用不含表面活性剂的缓冲水溶液，且提取可以通过在所述缓冲水溶液的存在下对异源表达中所用的宿主(菌体)进行物理或机械地破坏(例如超声波破碎、磨碎、弗氏压碎等)进行。提取液中除了可溶性化突变蛋白之外，有时还含有不溶性蛋白，此时可以对提取液进行离心分离，使上清液中的蛋白成为可溶性化突变蛋白。上清液中的蛋白的可溶性化突变蛋白的定量可以使用公知的蛋白定量方法，例如可以使用电泳法、ELISA法、westernblotting法等方法。
本发明的不溶性型蛋白是天然型时为可溶性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则在表达系统内变为不溶性的蛋白。异源表达系统的例子可以参照本发明的活性型突变酶的制造方法(第一方式的制造方法)的说明。作为这种不溶性型蛋白的例子，例如可以举出选自酶、细胞因子、血红蛋白、肌红蛋白中的1种蛋白。细胞因子、血红蛋白及肌红蛋白全部不是本发明中的不溶性型蛋白，但部分有本发明的不溶性型蛋白。本发明的不溶性型蛋白更具体地可举出选自IFN-γ、IL-2、IFNβ及人生长激素中的1种蛋白。几种蛋白为本发明的不溶性型蛋白可以参照以下的文献。
人生长激素(Fibroblast growth factor 15)：PLoS ONE,6,e20307(2011),interleukin-6(IL-6)：J.Vet.Med.Sci.,66,pp.1053-1057,(2004)
以下根据实施例更为详细地说明本发明。但实施例为本发明的示例，本发明并不受实施例所限定。
实施例1
马陆来源的扁桃腈氧化酶(ChMOX)作为活性型突变酶的表达
(1)在扁桃腈氧化酶基因中的突变的导入
将马陆(Chamberlinius hualienensis)来源的扁桃腈氧化酶基因(序列号1)导入至大肠杆菌表达载体pET22b中，制备“pET22b-ChMOX”。利用热休克法将pColdI-ChMOX的水溶液5μL导入至大肠杆菌XL-1Red(Agilent Technologies公司制)中，进行遗传转化。在含有100μg/mL的氨比西林的LB培养基中培养48小时，使用细菌涂布棒将繁殖的集落悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(pH为7.0)中，将菌体回收。对质粒载体进行提取，制成突变型酶文库。
(2)从突变型扁桃腈氧化酶文库中选择活性型突变酶表达质粒载体
利用与上述(1)相同条件的热休克法将上述(1)中获得的突变型酶文库分别导入至大肠杆菌BL21(DE3)中，进行遗传转化。在各孔中分别注有含100μg/mL氨比西林的LB培养基300μL的96孔板中，在37℃下对在含100μg/mL氨比西林的LB琼脂培养基中繁殖了的集落进行培养，在菌体浊度为0.5左右添加0.5μg/mL的IPTG，在30℃下培养6小时。通过离心分离(2000×g、15分钟、4℃)进行集菌后，添加50μL的菌体溶解试剂BugBuster(Novagen公司制)，在室温下振荡约15分钟左右。接着，添加150μL的10mM磷酸钾缓冲液(pH为7.0)，将通过离心分离(2000×g、15分钟、4℃)获得的上清作为粗酶液。扁桃腈氧化酶活性以专利文献10为参考，测定粗酶液的活性。此外，使用DNA测序仪对显示活性的突变型酶的序列解读DNA序列。其结果，第455位的缬氨酸被替换成丙氨酸。
(3)扁桃腈氧化酶的第455位的氨基酸的饱和突变
构建在第455位的缬氨酸中替换成其他19种氨基酸的突变型扁桃腈氧化酶表达质粒。然后，在与上述(1)相同的条件下分别对它们进行培养，测定扁桃腈氧化酶活性。其结果如图4所示，替换成比缬氨酸的亲水指数低、即亲水度更高的氨基酸时的活性更高，特别是亲水性氨基酸(E、Q、D、N、K、R)时显示更高的扁桃腈氧化酶活性。
(4)二级结构预测和使用螺旋轮的解析
使用扁桃腈氧化酶的氨基酸序列(序列号2)、使用二级结构预测程序PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)进行推测，其结果可知，突变位置的第455位的缬氨酸存在于α螺旋结构的氨基酸序列(RVDIDTMVRGVHVALNFG)中(图1A)。另外，利用pepwheel(http：//emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel)描绘螺旋轮的结果为，如图1B所示，第455位的缬氨酸是存在于亲水性区域的疏水性氨基酸。因此，第455位的缬氨酸向丙氨酸的替换是在α螺旋内的突变的导入，是向存在于亲水性区域的亲水指数低(即亲水度高)的氨基酸的突变。
(5)向第444位的缬氨酸的饱和突变导入
与第455位的缬氨酸同样的位于α螺旋内的V444、G452、F459由于也是“存在于亲水性区域的疏水性氨基酸”，因此按照替换成其他19种氨基酸的方式，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司制)将突变导入至V444、G452、F459中。将所得突变导入质粒分别遗传转化至大肠杆菌JM109(DE3)中，接种至加有氨比西林的LB板上，在37℃下培养16小时。对所得集落具有的质粒的序列进行解读，构建在V444、G452、F459中替换成其他19种氨基酸的突变型扁桃腈氧化酶表达质粒。此外，分别在与上述(1)相同的条件下进行培养，测定扁桃腈氧化酶活性。可知V444中，向亲水指数低(即亲水度高)的氨基酸的突变与作为活性型酶的表达有关。G452或F459中，其他19种氨基酸替换并未显示活性。从利用图2的作图方法再次重新描绘螺旋轮的图6所示的结果可知，如图6C所示，该两个残基存在于亲水性与疏水性区域的交界，认为图2的作图方法适于该区域的二分。
(6)V444、G452、V455、F459的序列保守性
使用BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE＿TYPE＝BlastSearch&LINK＿LOC＝blasthome)检索同源性，利用INTMSAlign(非专利文献7)计算所述α螺旋序列的序列保守性。序列保守性的计算在以下条件下进行。在BLAST位点的“Sequence”栏中插入失活型酶的序列，将下部的“Algorithm parameters”内的“General Parameters”的“Max target sequences”数值变为5000、将“Expect threshold”的数值变为1.0E-3，开始BLAST，由此选择同源性高的其他蛋白。将所得同源性高的蛋白序列全部以FASTAZ形式下载，插入到INTMSAlign中，由此计算序列保守性。
将确认了V444、G452、V455、F459的保守性的结果示于表2中。可知V444或V455中，不仅是疏水性氨基酸、而且亲水性的氨基酸较多地保存，但G452或F459中，亲水指数为同等程度的氨基酸保存。
由此启示，在亲水性区域的疏水性氨基酸中，特别是亲水性氨基酸保存时，通过将它们替换成亲水性氨基酸，作为活性型突变酶的表达变得容易。
表2
V444、G452、V455、F459中各氨基酸的保守率
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
V444 1.4 0.7 3.1 1.7 0.0 0.6 4.3 0.5 2.9 0.2 1.8 4.2 0.1 2.3 8.8 4.5 6.9 0.8 2.3 5.8 47.0
G452 0.2 0.5 0.2 0.1 18.3 0.5 17.1 57.2 0.5 0.0 4.0 0.2 0.0 0.1 0.0 0.1 0.0 0.0 0.3 0.1 0.6
V455 17.8 3.3 41.5 7.0 0.3 6.4 5.2 0.0 2.4 0.9 0.4 1.4 0.1 1.1 1.9 2.5 0.1 0.1 4.6 2.6 0.2
F459 64.4 7.5 21.8 0.7 0.0 3.2 0.4 0.0 0.2 0.1 0.1 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0
实施例2
拟南芥来源的精氨酸脱羧酶(AtADC)作为活性型突变酶的表达
(1)利用二级结构预测程序进行的α螺旋的推测和螺旋轮的作图
与上述同样地使用二级结构预测程序PSIPRED对拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的精氨酸脱羧酶的氨基酸序列(序列号3)进行解析，结果推测该酶具有20个α螺旋(图7A)。因此，使用全部α螺旋的序列，与上述同样地描绘螺旋轮，其结果可知，从N末端开始的第8个(TVQILRVVRKLSQ)和第13个(RESCLLYVDQLKQRCVE)的α螺旋所含的第261位的缬氨酸、第264位的亮氨酸及第430位的精氨酸、第435位的亮氨酸、第441位的赖氨酸如图7B、C所示，是“存在于亲水性区域的疏水性氨基酸”或“存在于疏水性区域的亲水性氨基酸”。
(2)精氨酸脱羧酶在V261、L264、R430、L435、K441中的突变导入
将拟南芥来源的精氨酸脱羧酶基因(序列号4)导入到pET11a中，制备“pET11a-AtArgDC”。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies公司制)在上述(1)的各个残基中导入突变，使其替换为其他氨基酸。将所得突变导入质粒分别遗传转化到大肠杆菌JM109(DE3)中，接种于加有氨比西林的LB板上，在37℃下培养16小时。对所得集落具有的质粒的序列进行解读，构建在V261、L264、R430、L435、K441中替换成其他19种氨基酸的突变型精氨酸脱羧酶表达质粒。然后，在与上述相同的条件下分别进行培养，测定精氨酸脱羧酶活性。V261(图8)或L435(图9)中，向亲水指数低(即亲水度高)的氨基酸的突变与作为活性型突变酶的表达有关，在R430(图10)中，向亲水指数高(即疏水度高)的氨基酸的突变与作为活性型突变酶的表达有关。另外，通过重复这些的突变导入，可见活性的增加，因此可见由突变导入的蓄积所带来的活性型突变酶的产量的增加。但是，在L264、K441中，其他19种氨基酸替换未见活性。
(3)V261、L264、R430、L435、K441的配列保守性
使用BLAST检测同源性，利用INTMSAlign(非专利文献7)计算所述α螺旋序列的序列保守性。序列保守性的计算在以下条件进行。在BLAST位点的“Sequence”栏中插入失活型酶的序列，将下部的“Algorithm parameters”内的“General Parameters”的“Max targetsequences”数值变为5000、将“Expect threshold”的数值变为1.0E-3，开始BLAST，由此选择同源性高的其他蛋白。将所得同源性高的蛋白序列全部以FASTAZ形式下载，插入到INTMSAlign中，由此计算序列保守性。
将确认了V261、L264、R430、L435、K441的保守性的结果示于表3中。V261、L435中，不仅是疏水性氨基酸、而且亲水性的氨基酸较多地保存，R430中，不仅是亲水性氨基酸，而且疏水性的氨基酸较多地保存。但是可知，L264、K441中，亲水指数为同等程度的氨基酸保存。
由此启示，在亲水性区域中的疏水性氨基酸或者疏水性区域中的亲水性氨基酸中，特别是具有与该区域同样性质的氨基酸保存时，通过将它们替换，作为活性型突变酶进行表达变得容易。
表3
V261、L264、R430、L435、K441的各氨基酸的保守率
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
V261 4.4 0.3 2.4 1.7 0.0 0.8 13.3 1.3 21.6 0.5 16.4 0.9 5.4 0.9 5.6 0.7 5.8 3.8 6.7 3.4 4.0
L264 8.2 10.1 49.9 0.6 0.0 2.8 12.9 1.5 0.3 0.0 0.5 1.0 1.1 0.1 1.7 1.1 0.7 1.0 0.3 0.6 5.5
R430 2.5 5.0 23.8 1.5 0.5 3.8 9.2 1.1 0.6 0.7 1.2 6.8 1.8 1.3 1.5 1.7 0.9 1.0 0.9 1.2 33.1
L435 1.4 1.4 4.5 0.7 0.3 1.3 1.1 0.6 1.2 3.4 1.0 2.0 0.9 30.7 1.7 2.9 1.8 9.3 0.6 0.9 32.3
K441 2.9 2.6 21.0 1.8 0.5 5.1 1.5 1.4 3.4 0.4 1.0 0.5 0.8 3.3 0.9 1.2 1.0 0.8 10.8 8.1 31.1
实施例3
Metridia pacifica来源的荧光素酶(MpLUC)作为活性型突变酶的表达
(1)利用二级结构预测程序进行的α螺旋的推测
由与上述相同的程序对海洋性浮游生物Metridia pacifica来源的荧光素酶(MpLUC)1-1的氨基酸序列(序列号5)预测二级结构(图11)，其结果如图11A所示，MpLUC1-1具有6个α螺旋结构，(1)所示的α螺旋序列在制成螺旋轮之后，可以分离为亲水性区域和疏水性区域(图11B)。但是，(2)的α螺旋序列在制作螺旋轮之后，无法分离为亲水性区域和疏水性区域。另外，对于(1)及(2)的α螺旋序列而言，使用BLAST检索同源性，利用INTMSAlign(非专利文献7)计算所述α螺旋序列的序列保守性。序列保守性的计算在以下条件下进行。在BLAST位点的“Sequence”栏中插入失活型酶的序列，将下部的“Algorithm parameters”内的“General Parameters”的“Max target sequences”数值变为5000、将“Expectthreshold”的数值变为1.0E-3，开始BLAST，由此选择同源性高的其他蛋白。将所得同源性高的蛋白序列全部以FASTAZ形式下载，插入到INTMSAlign中，由此计算序列保守性。
其结果可知，作为保守率低的氨基酸，发现了第80位的异亮氨酸和第177位的丙氨酸，前者以高的比率保存为赖氨酸、后者以高的比率保存为天冬氨酸。
表4
MpLUC的L76至A89的序列保守性
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
L76 5.4 2.7 59.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 22.1 0.0 2.3
E77 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 27.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 62.0 0.0 8.3 0.0 0.0 0.0 2.2
V78 2.7 86.5 8.6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
L79 2.7 0.0 92.7 0.0 0.0 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
I80 14.6 5.3 3.1 0.0 0.0 5.1 11.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.1 0.0 50.2 2.2 2.1
E81 12.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 84.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
M82 0.0 0.0 2.2 0.0 0.0 95.6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
E83 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8.6 89.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.1
A84 0.0 0.0 0.0 0.0 6.1 0.0 91.7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
N85 8.6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 89.3 0.0 0.0 2.1
A86 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 97.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
R87 0.0 11.3 0.0 10.6 0.0 0.0 3.1 0.0 0.0 0.0 5.8 0.0 0.0 0.0 0.0 5.5 0.0 0.0 20.0 41.4 2.3
K88 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.4 0.0 0.0 8.6 51.5 35.4 2.1
A89 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 89.0 0.0 0.0 0.0 8.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.2
表5
MpLUC的S176至I201的序列保守性
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
S176 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 84.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 15.1 0.0 0.0 0.0
A177 0.0 0.0 0.0 0.0 6.1 0.0 23.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.0 0.0 54.2 0.0 5.3 0.0 0.0
L178 0.0 0.0 77.4 0.0 0.0 0.0 11.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 5.3 0.0 0.0 6.1 0.0 0.0
L179 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 00 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
K180 0.0 0.0 0.0 5.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 88.7 0.0 0.0
K181 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8.6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 5.3 0.0 86.2 0.0 0.0
W182 0.0 2.7 0.0 0.0 0.0 0.0 13.8 0.0 0.0 83.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
L183 0.0 0.0 97.6 0.0 0.0 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
P184 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
9185 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.7 2.4 11.6 0.0 14.2 0.0 0.0 0.0 0.0 35.8 27.4 0.0 5.8 0.0 0.0
R186 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0
C187 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
A188 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 49.8 0.0 22.7 0.0 8.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 16.6 2.8 0.0
S189 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 19.0 41.5 0.0 28.6 0.0 0.0 0.0 0.0 8.1 0.0 2.8 0.0 0.0 0.0
F190 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
A191 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 86.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 6.1 0.0 0.0 2.7 5.3 0.0
D192 0.0 2.8 2.7 0.0 0.0 0.0 6.1 0.0 19.9 0.0 32.9 3.1 0.0 0.0 0.0 0.0 27.0 5.5 0.0 0.0 0.0
K193 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8.0 0.0 8.6 83.5 0.0 0.0
I194 94.2 0.0 0.0 0.0 0.0 5.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
0195 0.0 0.0 2.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 91.5 0.0 0.0 6.1 0.0 0.0
S196 0.0 00 0.0 0.0 0.0 0.0 2.7 27.3 0.0 0.0 34.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 4.8 28.5 2.7 0.0
E197 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 58.3 36.5 0.0 0.0 0.0 2.2 0.0
V198 2.8 84.6 0.0 0.0 0.0 3.1 6.1 3.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
D199 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.4 2.7 0.0 0.0 3.1 0.0 0.0 24.3 3.0 0.0 63.8 0.0 0.0 0.0 1.7
N200 0.0 1.7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 28.3 0.0 10.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 28.5 29.8 0.0 1.5
I201 87.6 6.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.7 3. 0.0 0.0 1.5
(2)“存在于α螺旋结构的亲水性区域的疏水性氨基酸或存在于该部分的疏水性区域的亲水性氨基酸”向保守性高的残基的替换
按照将上述各个氨基酸替换成其他氨基酸的方式，利用与上述实施例2(2)相同的方法导入突变。将所得突变导入质粒分别遗传转化至大肠杆菌JM109(DE3)中，接种在加有氨比西林的LB板上，在37℃下培养16小时。在加有IPTG的LB液体培养基5mL中对所得集落进行培养，在浊度约0.5左右添加0.5μg/mL IPTG，在16℃下培养12小时。通过离心分离(10000×g、2分钟、4℃)进行集菌后，用20mM磷酸钾缓冲液(pH为7.0)250μL再次悬浮，通过超声波破碎-离心分离制备粗酶液。在所得粗酶液中添加腔肠素，使用光度计检测发光度，结果在导入了突变的酶组中，如图12所示确认到发光。另外，通过在I80K突变型酶中导入A177D的突变，确认到发光度的增加。此外，使用His GraviTrap(GEHealthcare Japan公司制)，如图13所示那样单一地对进行了突变导入的酶进行纯化，确认是活性型突变酶。由以上结果可知，通过将存在于α螺旋上的亲水性区域的疏水性氨基酸或存在于该部分的疏水性区域的亲水性氨基酸替换成保守性高的氨基酸，可以作为活性型突变酶进行表达。
实施例4
黑腹果蝇来源的氨基酸分解酶的α螺旋和作为着重于氨基酸残基保守性的活性型突变酶的表达
(1)利用二级结构预测程序进行的α螺旋的推测、螺旋轮的作图和保守性氨基酸残基的检索
对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)来源的鸟氨酸脱羧酶(DmODC)的氨基酸序列(序列号7)及谷氨酸脱氢酶(DmGluDH)的氨基酸序列(序列号9)的二级结构进行预测，对α螺旋序列进行特定(图14、15)。此外，着眼于α螺旋序列的序列保守性进行分析，其结果如表6、7所示，可知DmODC中第117位的赖氨酸以亮氨酸、第176位的亮氨酸以谷氨酸保存的概率高，并且在DmGluDH中第174位的缬氨酸以天冬氨酸、第257位的赖氨酸以酪氨酸、第261位的亮氨酸以谷氨酸保存的概率高。
表6
DmODC的S111至E118及A171至S180的序列保守性
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
S111 0.5 1.1 0.5 4.3 0.2 0.1 17.5 1.3 1.5 0.8 28.2 0.5 1.0 1.6 8.3 1.6 7.5 1.5 7.0 13.2 1.9
H112 3.7 0.2 0.6 3.2 0.4 0.2 3.1 1.1 0.3 0.1 2.8 4.2 0.1 8.4 34.6 10.7 23.4 0.8 0.1 0.1 1.9
L113 59.3 7.0 14.5 0.4 0.1 10.4 1.3 0.0 0.5 0.0 0.4 1.4 0.0 0.1 0.5 0.4 0.2 0.0 0.6 1.0 1.9
E114 2.0 1.7 2.3 0.1 0.1 0.2 18.7 0.9 1.2 0.2 1.1 0.3 0.1 0.7 12.2 3.0 6.7 1.0 18.3 27.4 1.9
Y115 0.4 1.0 6.0 11.3 0.4 1.3 9.6 0.2 1.5 0.7 0.6 31.6 0.1 5.2 7.7 6.8 1.3 0.5 0.8 11.3 1.9
A116 0.4 3.2 0.9 6.1 1.0 0.0 79.6 2.4 0.2 0.1 0.6 2.6 0.1 0.0 0.4 0.0 0.2 0.0 0.1 0.1 2.0
K117 3.2 4.0 30.5 5.3 0.6 0.8 22.5 0.4 0.3 0.5 2.6 13.3 0.1 6.0 1.3 0.8 0.2 0.5 2.1 3.2 1.9
E118 0.1 0.6 1.0 0.6 0.1 0.2 13.9 1.8 2.7 0.1 9.1 0.2 0.0 1.1 23.3 7.0 7.6 4.5 18.8 5.5 2.1
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
A171 3.4 11.8 9.0 1.1 9.1 1.6 24.9 1.3 3.3 1.0 5.0 0.6 3.9 0.5 4.5 0.7 0.9 0.8 2.4 11.8 2.4
A172 1.7 8.1 4.1 0.3 0.2 3.9 10.3 2.6 2.1 0.1 2.7 1.1 6.0 1.3 17.4 3.3 8.0 1.3 4.3 16.5 4.7
A173 4.1 15.6 14.1 0.9 0.4 6.7 5.8 2.7 2.0 0.1 2.6 0.4 3.4 10.3 7.6 1.9 12.0 1.1 1.5 3.9 3.0
L174 4.9 9.0 50.8 6.7 0.2 1.3 1.8 0.7 0.2 0.0 0.1 20.4 0.1 0.0 1.7 0.1 0.4 0.1 0.2 0.3 1.3
M175 5.0 3.1 55.4 0.6 0.5 2.7 12.3 0.2 0.8 0.0 0.7 0.5 0.5 0.6 2.9 2.6 1.3 0.6 3.3 5.0 1.1
L176 5.7 4.2 8.5 0.8 0.2 1.1 6.2 1.0 2.0 4.1 1.9 2.7 0.8 4.3 21.8 7.0 3.3 0.9 6.1 15.9 1.4
L177 3.6 5.4 14.5 1.1 4.2 1.9 34.5 0.2 4.5 0.2 1.6 3.2 0.1 3.9 2.0 1.9 0.6 2.2 3.2 9.8 1.6
A178 1.2 2.5 1.9 0.1 0.6 0.6 68.2 0.9 1.0 0.0 2.0 0.3 0.1 1.7 0.9 1.2 0.6 0.7 10.0 4.4 1.1
K179 0.5 1.6 0.9 0.4 0.2 0.2 9.1 1.6 3.6 0.0 5.3 0.4 0.1 5.7 4.5 6.1 3.1 3.5 33.9 17.4 2.2
S180 0.3 0.7 19.5 0.4 0.3 2.4 8.2 1.5 2.8 0.3 9.3 0.6 0.1 1.6 19.9 5.9 9.5 1.7 5.5 7.0 2.4
表7
DmGluDH的V174至L189及G252至L261的序列保守性
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
V174 4.6 2.1 3.0 6.9 0.1 22 3.1 0.4 3.2 0.0 2.9 0.1 5.1 0.8 15.8 5.0 24.3 3.9 8.7 6.1 1.8
D175 0.1 0.2 1.4 0.5 0.1 1.5 14.8 20.2 2.3 1.0 9.5 0.8 0.7 6.1 1.9 23 2.7 10.7 2.9 18.6 1.8
E176 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.0 0.2 0.0 0.1 0.0 0.0 0.1 95.3 0.8 0.7 0.3 0.0 0.1 1.8
L177 12.0 14.2 63.5 0.0 0.1 1.7 0.1 0.1 0.8 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 0.0 0.9 0.0 0.1 3.5 0.9 1.8
Q178 0.1 0.1 0.3 0.1 0.1 18.5 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 75.7 1.2 0.0 0.5 0.1 1.2 1.8
T179 0.1 0.2 2.1 0.0 0.0 0.2 4.3 1.1 0.0 0.0 1.2 0.0 0.0 0.5 0.9 30 0.3 1.5 12.0 71.7 1.8
1180 22.2 5.6 49.0 18.6 0.0 2.3 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.0 0.0 0.2 0.0 0.0 0.1 0.1 0.0 1.7
T181 0.7 1.6 0.1 0.2 17.8 0.8 2.9 0.0 52.4 0.0 21.7 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.1 1.7
R182 0.0 0.0 0.3 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.2 0.1 18.3 0.0 0.0 1.1 78.0 1.7
R183 0.0 4.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.0 18.1 0.5 0.0 15.9 0.0 0.0 0.5 0.3 0.5 0.0 0.8 2.8 43.2 2.2
Y184 0.3 0.1 0.9 48.8 0.0 0.2 0.1 0.0 0.0 0.8 0.1 46.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 2.2
r185 7.6 15.6 0.1 0.9 0.1 20.0 14.7 0.3 38.0 0.0 0.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 1.8
M186 2.2 1.7 4.5 1.0 0.3 3.7 4.3 0.1 16.5 0.1 20.5 4.4 0.1 1.3 5.5 10.4 2.5 0.8 1.8 16.4 1.9
E187 0.2 0.3 0.8 0.0 0.1 0.5 21.9 2.7 0.2 0.1 1.1 0.4 0.0 0.2 60.5 1.4 0.2 0.4 5.1 1.8 2.2
L188 44.0 2.8 43.8 2.9 0.1 3.1 0.2 0.0 0.2 0.1 0.2 0.1 0.0 0.0 0.0 0.3 0.0 0.1 0.0 0.3 2.0
L189 6.7 2.2 0.2 1.5 2.7 0.8 20.0 132 0.7 2.0 19.7 9.2 0.1 5.4 1.1 4.1 0.1 2.0 0.6 6.1 1.8
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
G252 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 14.8 81.3 0.0 0.0 2.8 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0
R253 0.1 0.1 8.5 5.0 0.1 0.6 0.4 0.0 1.0 0.3 0.3 20.4 0.0 0.4 0.3 2.9 0.1 0.0 6.8 51.7 1.0
G254 0.0 0.2 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 92.1 0.0 0.0 6.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 1.2
V255 1.7 63.9 12.1 0.0 3.8 0.1 6.8 2.6 3.6 0.0 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 0.3 2.8 0.0 0.0 1.6
W256 3.4 20.7 8.1 26.8 2.3 5.4 11.4 0.6 7.5 0.0 1.6 4.6 0.0 0.1 0.1 4.8 0.0 1.3 0.1 0.1 1.5
K257 19.6 16.2 7.1 9.3 0.1 0.4 0.3 0.0 2.3 0.0 0.2 32.6 0.0 9.9 0.2 0.4 0.1 0.3 0.0 0.1 1.5
A258 5.0 14.7 4.0 12.2 8.4 2.0 15.7 11.2 15.6 0.1 5.0 4.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.4 0.0 0.1 1.5
G259 24.1 9.9 14.3 0.3 0.8 1.5 17.8 12.5 16.3 0.0 0.6 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.1 1.5
D260 0.6 2.2 6.2 0.3 2.8 2.0 2.4 0.5 1.0 0.1 3.5 0.3 0.0 1.1 24.5 9.7 3.1 3.0 7.7 27.2 2.0
L261 0.5 1.4 1.6 1.0 0.4 0.1 10.7 0.1 0.9 0.1 2.8 0.9 0.0 2.4 55.1 5.1 0.7 10.6 1.2 1.9 2.7
F262 3.0 8.6 12.3 11.8 0.6 14.0 40.4 0.4 1.1 1.9 0.4 2.2 0.1 0.1 0.1 0.2 0.0 0.0 0.1 0.0 2.5
(2)在使用本发明方法选择的残基中的突变导入和活性测定
按照替换成其他氨基酸的方式，利用与实施例2(2)同样的方法向各个残基中进行突变导入之后，对所得集落进行培养，制备粗酶液。其结果，突变前的酶由于未作为可溶性蛋白表达，因此无法确认酶活性，但在将DmODC的第117位的赖氨酸替换为亮氨酸、将第176号的亮氨酸替换为谷氨酸的突变型酶中，鸟氨酸脱羧酶活性分别为0.45U/mL及0.04U/mL。另外，将DmGluDH的第174位的缬氨酸替换成天冬氨酸、及将第257位的亮氨酸替换成酪氨酸、第261位的亮氨酸替换成谷氨酸而成的突变型酶的谷氨酸脱氢酶活性分别为0.14U/mL、0.91U/mL、0.05U/mL。由以上的结果可知，与实施例3同样，其他的酶中，通过将存在于α螺旋上的亲水性区域的疏水性氨基酸或存在于该部分的疏水性区域的亲水性氨基酸替换成保守性高的氨基酸，可以作为活性型突变酶进行表达。
实施例5
反复进行实施例1的(1)～(3)，研究野生型酶(WT)和突变型酶(V455D、V455Q)在大肠杆菌中的不溶性蛋白表达量及可溶性蛋白表达量。对粗酶液进行离心分离，将上清作为可溶性级分(可溶性蛋白)、将颗粒(沉淀)作为不溶性级分(不溶性蛋白)。
为了研究马陆(Chamberlinius hualienensis)来源的扁桃腈氧化酶的野生型酶(WT)和突变型酶(V455D、V455Q)在大肠杆菌中的表达量，利用使用了抗体的western blotting进行定量。分别在相同条件下进行诱导，在制备粗酶液(缓冲液：10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0))之后，用SDS-PAGE对上清(可溶性级分)、上清(可溶性级分)+颗粒(不溶性级分)进行电泳，转印至PVDF膜中，使用抗附加在蛋白上的组氨酸标签的抗体anti-His tag mAb HRP DirectT(MBL Co.，Ltd.，Nagoya，Japan)对各个级分中的酶量进行定量。结果可知，整体的表达量为同等程度，但突变型酶(V455D、V455Q)中，可溶性级分的表达量与野生型酶(WT)不同(图16)。
实施例6
人生长激素作为可溶性蛋白的表达
已知人生长激素(hGH)在大肠杆菌中进行不溶性表达。立体结构(PDB ID：3HHR)已被公开，其具有7个α螺旋结构。因此，为了使该蛋白在大肠杆菌中可溶性地表达，利用INTMSAlign(非专利文献7)对该α螺旋序列的序列保守性进行计算。序列保守性的计算在以下条件下进行。在BLAST位点的“Sequence”栏中插入野生型蛋白的序列，将下部的“Algorithm parameters”内的“General Parameters”的“Max target sequences”数值变为5000、将“Expect threshold”的数值变为1.0E-3，开始BLAST，由此选择同源性高的其他蛋白。将所得同源性高的蛋白序列全部以FASTAZ形式下载，插入到INTMSAlign中，由此计算序列保守性。
其结果可知，作为保守率低的氨基酸，发现了第46位的亮氨酸、第55位的苯丙氨酸、第82位的亮氨酸、第88位的亮氨酸、第95位的精氨酸、第97位的缬氨酸、第114位的异亮氨酸，以高的比率分别保存为赖氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸。
表8
hGH的L46、F55、L82、L88、R95、V97、I114的序列保守性
残基 I V L F C M A G T W S Y P H E Q D N K R 无
L46 3.7 2.1 8.3 10.7 0.2 2.0 3.5 0.4 1.1 0.2 6.5 2.3 0.6 0.6 0.9 9.6 0.2 7.3 12.2 1.8 25.9
F55 2.3 0.3 1.0 20.2 0.2 0.4 0.6 0.1 0.5 0.1 0.7 11.6 1.3 30.6 0.2 0.3 0.0 14.9 0.1 0.2 14.5
L82 2.5 10.0 23.8 0.2 0.2 4.2 2.3 6.8 1.7 0.0 12.1 0.2 0.0 0.7 0.3 0.3 0.2 2.5 3.7 19.8 8.4
L88 3.8 0.9 33.2 1.1 0.0 0.8 0.6 0.4 0.9 0.1 3.2 0.6 0.4 0.5 19.2 1.4 2.5 16.0 4.8 1.1 8.4
R95 2.1 16.9 1.2 0.0 0.1 0.2 5.1 2.8 1.3 0.3 41.1 0.6 0.4 1.3 0.5 3.9 0.3 3.1 0.3 9.4 9.2
V97 5.4 28.3 1.8 0.2 0.2 5.0 4.6 4.8 9.6 0.0 4.7 0.7 0.8 2.6 16.2 0.5 0.4 0.7 0.4 0.6 12.4
L114 0.8 0.4 9.2 0.3 0.0 3.4 1.0 1.2 0.4 0.6 0.4 2.9 0.0 2.9 7.2 9.3 1.3 0.9 41.4 3.5 12.9
“存在于α螺旋结构的亲水性区域的疏水性氨基酸或存在于该部分的疏水性区域的亲水性氨基酸”向保守性高的残基的替换
上述各个氨基酸按照替换成其他氨基酸的方式，利用与实施例2(2)同样的方法导入突变。将所得突变导入质粒分别遗传转化到大肠杆菌BL21(DE3)，接种于加有氨比西林的LB板中，在37℃下培养16小时。在加有IPTG的LB液体培养基5mL中对所得集落进行培养，在浊度约0.5左右添加0.5pg/mL IPTG，在16℃下培养12小时。通过离心分离(10000×g、2分钟、4℃)进行集菌后，用20mM磷酸钾缓冲液(pH为7.0)250μL再次悬浮，通过超声波破碎-离心分离制备粗提取液。使用hGH ELISA对所得粗提取液分析表达量，结果在导入了突变的蛋白组中，如图17所示确认到表达。此外，使用His GraviTrap(GEHealthcare Japan公司制)，如图18所示那样单一地对进行了突变导入的蛋白进行纯化，确认是可溶性蛋白。由以上结果可知，通过将存在于α螺旋上的亲水性区域的疏水性氨基酸或存在于该部分的疏水性区域的亲水性氨基酸替换成保守性高的氨基酸，可以增加蛋白的可溶性表达量。
产业上的可利用性
本发明在与酶蛋白的制备有关的领域中是有用的。
序列表白由文本
序列号1：马陆(Chamberlinius hualienensis)来源的扁桃腈氧化酶的基因
序列号2：马陆(Chamberlinius hualienensis)来源的扁桃腈氧化酶的氨基酸序列
序列号3：拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的精氨酸脱羧酶的氨基酸序列
序列号4：拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的精氨酸脱羧酶的基因
序列号5：Metridia pacifica来源的荧光素酶(MpLUC)1-1的氨基酸序列
序列号6：Metridia pacifica来源的荧光素酶(MpLUC)1-1的基因
序列号7：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)来源的鸟氨酸脱羧酶(DmODC)的氨基酸序列
序列号8：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)来源的鸟氨酸脱羧酶(DmODC)的基因
序列号9：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)来源的谷氨酸脱氢酶(DmGluDH)的氨基酸序列
序列号10：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)来源的谷氨酸脱氢酶(DmGluDH)的基因
序列号11：hGH的氨基酸序列
序 列 表
<110> 公立大学法人 富山县立大学
<120> 活性型突变酶及可溶性化突变蛋白的制造方法
<130> 161296H
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> 马陆（Chamberlinius hualienensis）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1755)
<223>
<400> 1
caaccaaagg aaacttatga ctttatcgtt gtgggagctg gttctgctgg atcagtagta 60
gctaatcgtt tgagtgaact cccaaatata aaagttttgc tgttggaagc cggtggaaat 120
gagactgaaa ccagcgaagt gccactattt gcaggacaat tacaactttc tcctctcgat 180
tggaacttta catcgacacc acagaagaac tcctgtttgg ctttttggaa tcaaacttgt 240
ctctggccac aaggcaaagt tttgggtgga tcaagtgttc tcaattacat gatctttgtt 300
agaggaaaca aaaaagattt tgacgattgg gcagcattgg gtaatgtggg ttgggactac 360
aacagtgttt tgccatactt tatcaagatg gaaaacttca ctggacctag tactgatgct 420
gcaatccgtg gaaagactgg tcctcttaca gtcggttttg tgccatatca caccgtttta 480
gctgatactt tcgtctcggc tggaaatgaa aatggataca atacagttga ttacaatgga 540
cacactcaaa caggtgtaca acgaattcaa gcaactactc gtgatggtca acgatgcagt 600
acaaacaaag cttatttatg gccaattgtg cacacgagac caaactttgt attgaaaact 660
cacgccactg tcttgaaggt tttacttaac gataaaaaag ccgctattgg agttaagtat 720
gccatcaatg gcgaagaaca taccgcatta gcatctaaag aagttattct ttctgctgga 780
gcactcaact ctccacaatt acttatgctc tcaggcattg gtgatcctac agatttgcaa 840
ccattcggaa ttaaagtttt agtcgagaat aagggtgttg gaaagaactt ccaagatcac 900
gttgcctgcg gaggtgttga atggcttatt gatcaaccag tctcactagt cacaagtcga 960
gttgtaaatg accaaacgat aaaggaatgg aaagatcatg gaactggtcc tttgactatt 1020
ccaagtgacg tggaagccac tgcatttgtt cacactacaa ccgaatacgc tgctgaagat 1080
ttccctgata ttcaactctt ctatttcagt ggtactccag catctgatgg tggaactggt 1140
gccagataca caactggatt taccaacgct tcatggaatg gatactataa agaaatcgaa 1200
aacaaagacg ctttctctat ctatccagtg ttacttcgac caaaaagcag aggatatatc 1260
ggtcttagaa gtgctaatcc ttatgatgct ccagtcattg agccagctta cttcaccgac 1320
cctggaagag ttgacattga tacgatggtt cgaggcgtac acgttgctct taactttgga 1380
aactcaaagg cattttctaa atttggagct aaattgcaca atgccacatt ccctggatgc 1440
gaaccatatc ccttacacag cgatgcttat tgggaatgtt tagctagaca ttttatcagc 1500
atcaacttcc atccatccag ctcttgtact atgggagata gaaccaagac tccattagct 1560
gtggttgaca accgattacg agtctatggt gtaaaaaatc ttcgcgttat tgatgctgca 1620
attatacctt tgtctccatc tggaaacacc aatggtccaa ccatcatgat tggagagaaa 1680
ggctccgatt tgattaagga agattggaaa cttaaaaccc catctggact cgagcaccac 1740
caccaccacc actga 1755
<210> 2
<211> 584
<212> PRT
<213> 马陆（Chamberlinius hualienensis）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(584)
<223>
<400> 2
Gln Pro Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Ile Val Val Gly Ala Gly Ser Ala
1 5 10 15
Gly Ser Val Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu Leu Pro Asn Ile Lys Val
20 25 30
Leu Leu Leu Glu Ala Gly Gly Asn Glu Thr Glu Thr Ser Glu Val Pro
35 40 45
Leu Phe Ala Gly Gln Leu Gln Leu Ser Pro Leu Asp Trp Asn Phe Thr
50 55 60
Ser Thr Pro Gln Lys Asn Ser Cys Leu Ala Phe Trp Asn Gln Thr Cys
65 70 75 80
Leu Trp Pro Gln Gly Lys Val Leu Gly Gly Ser Ser Val Leu Asn Tyr
85 90 95
Met Ile Phe Val Arg Gly Asn Lys Lys Asp Phe Asp Asp Trp Ala Ala
100 105 110
Leu Gly Asn Val Gly Trp Asp Tyr Asn Ser Val Leu Pro Tyr Phe Ile
115 120 125
Lys Met Glu Asn Phe Thr Gly Pro Ser Thr Asp Ala Ala Ile Arg Gly
130 135 140
Lys Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Phe Val Pro Tyr His Thr Val Leu
145 150 155 160
Ala Asp Thr Phe Val Ser Ala Gly Asn Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Val
165 170 175
Asp Tyr Asn Gly His Thr Gln Thr Gly Val Gln Arg Ile Gln Ala Thr
180 185 190
Thr Arg Asp Gly Gln Arg Cys Ser Thr Asn Lys Ala Tyr Leu Trp Pro
195 200 205
Ile Val His Thr Arg Pro Asn Phe Val Leu Lys Thr His Ala Thr Val
210 215 220
Leu Lys Val Leu Leu Asn Asp Lys Lys Ala Ala Ile Gly Val Lys Tyr
225 230 235 240
Ala Ile Asn Gly Glu Glu His Thr Ala Leu Ala Ser Lys Glu Val Ile
245 250 255
Leu Ser Ala Gly Ala Leu Asn Ser Pro Gln Leu Leu Met Leu Ser Gly
260 265 270
Ile Gly Asp Pro Thr Asp Leu Gln Pro Phe Gly Ile Lys Val Leu Val
275 280 285
Glu Asn Lys Gly Val Gly Lys Asn Phe Gln Asp His Val Ala Cys Gly
290 295 300
Gly Val Glu Trp Leu Ile Asp Gln Pro Val Ser Leu Val Thr Ser Arg
305 310 315 320
Val Val Asn Asp Gln Thr Ile Lys Glu Trp Lys Asp His Gly Thr Gly
325 330 335
Pro Leu Thr Ile Pro Ser Asp Val Glu Ala Thr Ala Phe Val His Thr
340 345 350
Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Glu Asp Phe Pro Asp Ile Gln Leu Phe Tyr
355 360 365
Phe Ser Gly Thr Pro Ala Ser Asp Gly Gly Thr Gly Ala Arg Tyr Thr
370 375 380
Thr Gly Phe Thr Asn Ala Ser Trp Asn Gly Tyr Tyr Lys Glu Ile Glu
385 390 395 400
Asn Lys Asp Ala Phe Ser Ile Tyr Pro Val Leu Leu Arg Pro Lys Ser
405 410 415
Arg Gly Tyr Ile Gly Leu Arg Ser Ala Asn Pro Tyr Asp Ala Pro Val
420 425 430
Ile Glu Pro Ala Tyr Phe Thr Asp Pro Gly Arg Val Asp Ile Asp Thr
435 440 445
Met Val Arg Gly Val His Val Ala Leu Asn Phe Gly Asn Ser Lys Ala
450 455 460
Phe Ser Lys Phe Gly Ala Lys Leu His Asn Ala Thr Phe Pro Gly Cys
465 470 475 480
Glu Pro Tyr Pro Leu His Ser Asp Ala Tyr Trp Glu Cys Leu Ala Arg
485 490 495
His Phe Ile Ser Ile Asn Phe His Pro Ser Ser Ser Cys Thr Met Gly
500 505 510
Asp Arg Thr Lys Thr Pro Leu Ala Val Val Asp Asn Arg Leu Arg Val
515 520 525
Tyr Gly Val Lys Asn Leu Arg Val Ile Asp Ala Ala Ile Ile Pro Leu
530 535 540
Ser Pro Ser Gly Asn Thr Asn Gly Pro Thr Ile Met Ile Gly Glu Lys
545 550 555 560
Gly Ser Asp Leu Ile Lys Glu Asp Trp Lys Leu Lys Thr Pro Ser Gly
565 570 575
Leu Glu His His His His His His
580
<210> 3
<211> 702
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<223>
<400> 3
Met Pro Ala Leu Ala Phe Val Asp Thr Pro Ile Asp Thr Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ile Phe Thr Pro Ser Ser Val Ser Thr Ala Val Val Asp Gly Ser Cys
20 25 30
His Trp Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser Leu Tyr Arg Ile Asp Gly Trp
35 40 45
Gly Ala Pro Tyr Phe Ala Ala Asn Ser Ser Gly Asn Ile Ser Val Arg
50 55 60
Pro His Gly Ser Asn Thr Leu Pro His Gln Asp Ile Asp Leu Met Lys
65 70 75 80
Val Val Lys Lys Val Thr Asp Pro Ser Gly Leu Gly Leu Gln Leu Pro
85 90 95
Leu Ile Val Arg Phe Pro Asp Val Leu Lys Asn Arg Leu Glu Cys Leu
100 105 110
Gln Ser Ala Phe Asp Tyr Ala Ile Gln Ser Gln Gly Tyr Asp Ser His
115 120 125
Tyr Gln Gly Val Tyr Pro Val Lys Cys Asn Gln Asp Arg Phe Ile Ile
130 135 140
Glu Asp Ile Val Glu Phe Gly Ser Gly Phe Arg Phe Gly Leu Glu Ala
145 150 155 160
Gly Ser Lys Pro Glu Ile Leu Leu Ala Met Ser Cys Leu Cys Lys Gly
165 170 175
Asn Pro Glu Ala Phe Leu Val Cys Asn Gly Phe Lys Asp Ser Glu Tyr
180 185 190
Ile Ser Leu Ala Leu Phe Gly Arg Lys Leu Glu Leu Asn Thr Val Ile
195 200 205
Val Leu Glu Gln Glu Glu Glu Leu Asp Leu Val Ile Asp Leu Ser Gln
210 215 220
Lys Met Asn Val Arg Pro Val Ile Gly Leu Arg Ala Lys Leu Arg Thr
225 230 235 240
Lys His Ser Gly His Phe Gly Ser Thr Ser Gly Glu Lys Gly Lys Phe
245 250 255
Gly Leu Thr Thr Val Gln Ile Leu Arg Val Val Arg Lys Leu Ser Gln
260 265 270
Val Gly Met Leu Asp Cys Leu Gln Leu Leu His Phe His Ile Gly Ser
275 280 285
Gln Ile Pro Ser Thr Ala Leu Leu Ser Asp Gly Val Ala Glu Ala Ala
290 295 300
Gln Leu Tyr Cys Glu Leu Val Arg Leu Gly Ala His Met Lys Val Ile
305 310 315 320
Asp Ile Gly Gly Gly Leu Gly Ile Asp Tyr Asp Gly Ser Lys Ser Gly
325 330 335
Glu Ser Asp Leu Ser Val Ala Tyr Ser Leu Glu Glu Tyr Ala Ala Ala
340 345 350
Val Val Ala Ser Val Arg Phe Val Cys Asp Gln Lys Ser Val Lys His
355 360 365
Pro Val Ile Cys Ser Glu Ser Gly Arg Ala Ile Val Ser His His Ser
370 375 380
Val Leu Ile Phe Glu Ala Val Ser Ala Gly Gln Gln His Glu Thr Pro
385 390 395 400
Thr Asp His Gln Phe Met Leu Glu Gly Tyr Ser Glu Glu Val Arg Gly
405 410 415
Asp Tyr Glu Asn Leu Tyr Gly Ala Ala Met Arg Gly Asp Arg Glu Ser
420 425 430
Cys Leu Leu Tyr Val Asp Gln Leu Lys Gln Arg Cys Val Glu Gly Phe
435 440 445
Lys Glu Gly Ser Leu Gly Ile Glu Gln Leu Ala Gly Val Asp Gly Leu
450 455 460
Cys Glu Trp Val Ile Lys Ala Ile Gly Ala Ser Asp Pro Val Leu Thr
465 470 475 480
Tyr His Val Asn Leu Ser Val Phe Thr Ser Ile Pro Asp Phe Trp Gly
485 490 495
Ile Asp Gln Leu Phe Pro Ile Val Pro Ile His Lys Leu Asp Gln Arg
500 505 510
Pro Ala Ala Arg Gly Ile Leu Ser Asp Leu Thr Cys Asp Ser Asp Gly
515 520 525
Lys Ile Asn Lys Phe Ile Gly Gly Glu Ser Ser Leu Pro Leu His Glu
530 535 540
Met Asp Asn Asn Gly Cys Ser Gly Gly Arg Tyr Tyr Leu Gly Met Phe
545 550 555 560
Leu Gly Gly Ala Tyr Glu Glu Ala Leu Gly Gly Val His Asn Leu Phe
565 570 575
Gly Gly Pro Ser Val Val Arg Val Leu Gln Ser Asp Gly Pro His Gly
580 585 590
Phe Ala Val Thr Arg Ala Val Met Gly Gln Ser Ser Ala Asp Val Leu
595 600 605
Arg Ala Met Gln His Glu Pro Glu Leu Met Phe Gln Thr Leu Lys His
610 615 620
Arg Ala Glu Glu Pro Arg Asn Asn Asn Asn Lys Ala Cys Gly Asp Lys
625 630 635 640
Gly Asn Asp Lys Leu Val Val Ala Ser Cys Leu Ala Lys Ser Phe Asn
645 650 655
Asn Met Pro Tyr Leu Ser Met Glu Thr Ser Thr Asn Ala Leu Thr Ala
660 665 670
Ala Val Asn Asn Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Asp Glu Ala Ala Ala Gly
675 680 685
Gly Gly Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Trp Ser Tyr Phe Gly
690 695 700
<210> 4
<211> 2109
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2109)
<223>
<400> 4
atgcctgctc tagcttttgt tgatactccc atcgatacct tttccagtat ctttacaccg 60
tcgtctgttt ccaccgccgt tgttgacggt tcctgccatt ggtctccgtc cctctcctcc 120
tctctttacc gtatcgacgg atggggagct ccgtatttcg cagcgaattc ctccgggaac 180
atctctgttc gtcctcatgg ctcaaacact ttacctcacc aagacatcga tctgatgaaa 240
gttgtgaaga aagttacaga tccgagtggt ttaggattac agcttccgct tattgttcgt 300
ttccctgatg ttctgaagaa tcgtcttgag tgtcttcaat ccgcgtttga ttacgcgatt 360
cagagtcaag gatatgattc tcattaccaa ggtgtgtatc ctgtgaaatg taatcaagat 420
cggtttatca tcgaagatat tgtcgaattc ggatccggtt ttcgattcgg tttagaagct 480
ggttccaagc ctgagattct tcttgctatg agttgtttgt gtaaaggtaa tcctgaagct 540
tttcttgtgt gtaatggttt taaagactct gagtatatct cattggcttt gtttgggagg 600
aaacttgaat tgaatactgt tattgttctt gagcaagaag aagagcttga tttggttatt 660
gatttgagcc agaagatgaa tgttaggcct gttattgggt taagagctaa gcttagaact 720
aaacattctg gtcattttgg ttctacttct ggtgagaagg ggaagtttgg tttgactacg 780
gttcagattc ttcgtgtggt gaggaagctg agtcaagttg gtatgcttga ttgtctccag 840
cttctgcatt ttcacattgg ttcacagatt ccgtccacgg ctttgctttc cgacggtgtg 900
gctgaggctg cgcagcttta ctgtgagctt gtccgtcttg gtgctcatat gaaggtgatt 960
gatattggtg gtgggttggg gattgattac gacgggtcta aatcggggga gtcggatctc 1020
tctgttgctt atagtctcga ggagtatgct gcagctgttg tggcttcggt taggtttgtt 1080
tgtgatcaga agtctgtgaa gcatccggtg atttgcagcg agagcggtcg agccattgtg 1140
tctcatcact cggtgttgat ctttgaagct gtctcagctg gtcaacaaca tgagacccct 1200
actgatcatc agtttatgct tgaagggtac tctgaggaag ttcgaggtga ttacgagaat 1260
ctttatggtg ctgctatgcg tggtgatcgt gaaagctgct tgctttatgt tgatcagctg 1320
aagcagagat gtgttgaagg gttcaaagaa ggttccttgg gcattgaaca gttagctggt 1380
gttgatggat tatgcgagtg ggtgattaag gcgattggtg catcggatcc ggttcttact 1440
taccatgtca atctatcggt tttcacttcg attcctgatt tctgggggat tgatcagctg 1500
tttcctattg ttccaatcca taaacttgac caaaggcctg ccgcgagagg gatcttatcg 1560
gatttgacgt gtgacagcga cggaaagatc aacaagttca taggcggaga atcgagcttg 1620
ccattgcacg agatggacaa caatggctgc agcggtgggc ggtactattt gggaatgttc 1680
ctaggtggag cttatgagga agctctcggt ggagtccaca atctgttcgg tggaccaagc 1740
gtggttcgcg tattgcagag cgatggacct cacggattcg cagtgacccg tgctgtgatg 1800
ggccaatcct ctgcagatgt cctcagagca atgcagcatg agcctgagct catgtttcag 1860
actcttaaac accgagccga ggagccgagg aacaacaaca acaaagcttg tggtgataag 1920
gggaacgaca aactagtagt cgcatcgtgt cttgctaagt cattcaacaa catgccttat 1980
ctttccatgg aaacgtcaac aaacgctctc accgcagcgg tcaataacct tggcgtttac 2040
tactgcgatg aagctgcagc tggtggcggc ggcaagggca aagatgagaa ttggtcttat 2100
ttcggttga 2109
<210> 5
<211> 208
<212> PRT
<213> Metridia pacifica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(208)
<223>
<400> 5
Met Met Glu Ile Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Phe Ala Leu Val
1 5 10 15
Gln Ala Asn Pro Thr Glu Asn Lys Asp Asp Ile Val Gly Val Glu Gly
20 25 30
Lys Phe Gly Thr Thr Asp Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile Val Glu
35 40 45
Asp Met Asn Val Ile Ser Arg Asp Thr Asn Leu Val Asn Ser Asp Ala
50 55 60
Asp Arg Gly Lys Met Pro Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile
65 70 75 80
Glu Met Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu
85 90 95
Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys Cys Thr Ala Lys Met Lys Val Tyr Ile
100 105 110
Pro Gly Arg Cys His Asp Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala
115 120 125
Gly Ile Val Gly Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly Phe Lys
130 135 140
Glu Leu Gly Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Ala
145 150 155 160
Asp Cys Thr Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser
165 170 175
Ala Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe Ala Asp
180 185 190
Lys Ile Gln Ser Glu Val Asp Asn Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg
195 200 205
<210> 6
<211> 627
<212> DNA
<213> Metridia pacifica
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(627)
<223>
<400> 6
atgatggaaa tcaaagttct gtttgccctg atttgttttg cactggttca ggcaaatccg 60
accgaaaaca aagatgatat tgttggtgtg gaaggcaaat ttggcaccac cgatctggaa 120
accgacctgt ttaccattgt tgaagatatg aatgtgatca gccgtgatac caatctggtt 180
aatagtgatg cagatcgtgg taaaatgcct ggtaaaaaac tgccgctgga agttctgatt 240
gaaatggaag caaatgcacg taaagcaggt tgtacccgtg gttgtctgat ttgtctgagc 300
aaaatcaaat gtaccgccaa aatgaaagtg tatattccgg gtcgttgtca tgattatggt 360
ggtgacaaaa aaaccggtca ggcaggtatt gtgggtgcaa ttgttgatat tccggaaatt 420
agcggcttta aagaactggg tccgatggaa cagtttattg cacaggttga tctgtgtgca 480
gattgtacca ccggttgcct gaaaggtctg gcaaatgtta aatgtagcgc actgctgaaa 540
aaatggctgc cggatcgttg tgccagcttt gcagataaaa ttcagagcga agtggataac 600
attaaaggcc tggcaggcga tcgttaa 627
<210> 7
<211> 394
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(394)
<223>
<400> 7
Met Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ile Gln Phe Tyr Glu Arg Glu Leu Asn
1 5 10 15
Ile Arg Arg Val Ile Glu Glu Cys Asp Leu Gln Arg Leu Asp Gln Ala
20 25 30
Leu Asn Ile Cys Asp Leu Ser Ser Val Glu Arg Lys Leu Arg Leu Trp
35 40 45
Gln Lys Leu Leu Pro Arg Ile Lys Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys Asn
50 55 60
Asp Asp Pro Met Val Val Arg Leu Leu Ala Gln Leu Gly Ala Gly Phe
65 70 75 80
Asp Cys Ala Ser Lys Asn Glu Val Lys Leu Val Leu Gly Phe Asp Val
85 90 95
Ser Pro Glu Arg Ile Ile Phe Ala Asn Pro Cys Arg Pro Val Ser His
100 105 110
Leu Glu Tyr Ala Lys Glu His Gln Val Ser Asn Gly Thr Val Asp Asn
115 120 125
Glu Phe Glu Val Tyr Lys Leu His Thr His Tyr Pro Asn Ser Asn Leu
130 135 140
Ile Val Arg Phe Lys Ser Glu Ala Lys Glu Ala Gln Cys Pro Leu Gly
145 150 155 160
Asp Lys Phe Gly Cys Asp Ala Asp Val Asp Ala Ala Ala Leu Met Leu
165 170 175
Leu Ala Lys Ser Leu Glu Leu Lys Val Thr Gly Thr Ser Phe His Val
180 185 190
Gly Ser Gly Cys Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Asp Arg Ala Ile Lys Lys
195 200 205
Ala Lys Asn Leu Phe Lys Phe Gly Ala Leu Leu Gly Tyr Asp Met Asp
210 215 220
Phe Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Pro Gly Ser Asp Asp Val Lys Phe
225 230 235 240
Glu Lys Ile Ala Glu Ser Val Asn Thr Ser Val Gln Arg His Phe Pro
245 250 255
Asp Glu Arg Val His Ile Ile Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe Val Ala
260 265 270
Ala Ala Cys Thr Leu Val Cys Lys Ile His Ala Lys Arg Glu Ile Arg
275 280 285
Asn Glu Ala Gly Lys Leu Asp Thr Val Met Tyr Tyr Leu Asn Asp Gly
290 295 300
Val Tyr Gly Ser Phe Asn Cys Ile Leu Tyr Asp His Gln Val Val Ile
305 310 315 320
Ala Glu His Tyr Leu Asp Asn Ala Glu Ser Leu Pro His Leu Lys Ser
325 330 335
Leu Ile Trp Gly Pro Ser Cys Asp Ala Leu Asp Lys Ile Ser Glu Asp
340 345 350
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Arg Gly Asp Leu Leu Gly Phe Arg Asn
355 360 365
Met Gly Ala Tyr Thr Met Pro Ile Ala Ser Ala Phe Asn Gly Phe Glu
370 375 380
Val Pro Lys Thr Leu Tyr Phe Gln Ala Ile
385 390
<210> 8
<211> 1185
<212> DNA
<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1185)
<223>
<400> 8
atggcggccg ctacccctga aatccagttc tacgaacgcg agctcaacat ccgccgggtg 60
atcgaggagt gcgacctgca gcgcctggac caggccctca acatctgcga cctgtctagc 120
gtggagcgta agctgcgcct ctggcagaag ctcctgccca ggatcaagcc cttctacgcc 180
gtcaagtgca atgacgatcc aatggtggtc aggctgctgg cccagctggg agccggattc 240
gactgcgcct ccaaaaacga agtcaagctg gtcttgggct tcgatgtctc gccggagcgt 300
atcatcttcg ccaatccctg ccgccctgtc agccatctgg agtacgccaa ggagcaccag 360
gtgtccaacg gaacggtgga caatgagttc gaggtataca agctgcacac gcactatccc 420
aactccaacc tgatcgtgag attcaagagc gaggccaagg aggcacagtg cccactgggc 480
gacaaatttg gctgtgatgc ggatgtggat gcagcggccc taatgctgct ggccaaatcc 540
ttggagctga aggtgaccgg caccagtttc cacgtcggct ccggatgcag cgagctgcag 600
gcctacgatc gggccatcaa gaaggccaag aacctcttca agttcggcgc actactgggc 660
tatgacatgg actttctgga cattggcggt gggttccctg gcagcgatga cgtaaagttt 720
gagaagatag ccgaaagtgt gaatacctcg gtgcagcgtc attttcccga cgaacgcgtt 780
cacataatcg ccgaaccagg acgcttcttt gtggcggcag cctgcacctt ggtttgcaag 840
atccacgcca agcgggagat caggaacgaa gctggcaaac tggacaccgt aatgtactat 900
ctgaatgacg gcgtctatgg gtccttcaac tgcattctgt acgaccatca agtggtgatt 960
gcagagcatt atctggacaa tgcagaatct ttgccacacc taaagtcctt gatttggggg 1020
ccaagttgtg acgccctaga taagatttcg gaggacctgc acttgcccaa cctaaaccga 1080
ggcgatcttt tgggattccg aaacatgggc gcctacacca tgcccattgc cagtgcattc 1140
aatggattcg aagtccccaa gaccctgtac ttccaagcta tatga 1185
<210> 9
<211> 535
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(535)
<223>
<400> 9
Met Leu Arg Tyr Thr Ala Arg Ile Leu Asn Gly Ile Tyr Pro Leu Met
1 5 10 15
Pro Arg Gln Val Leu Lys Arg Ser Ala His Gln Val Pro Glu Lys Leu
20 25 30
Lys Lys Val Glu Thr Asp Lys Asp Pro Glu Phe Ser Glu Met Val Leu
35 40 45
Tyr Tyr Tyr His Lys Ala Ala Gln Thr Met Glu Pro Ala Leu Leu Lys
50 55 60
Glu Met Glu Lys Tyr Pro His Met Lys Pro Glu Glu Arg Gln Ala Arg
65 70 75 80
Val Thr Ala Ile Leu Asn Leu Leu Gly Ser Val Ser Thr Ser Val Glu
85 90 95
Val Asn Phe Pro Ile Val Arg Lys Asn Gly Thr Tyr Glu Ile Ile Ser
100 105 110
Gly Tyr Arg Ser His His Val Arg His Arg Leu Pro Leu Lys Gly Gly
115 120 125
Ile Arg Tyr Ala Leu Asp Val Asn Glu Ser Glu Val Lys Ala Leu Ala
130 135 140
Ala Ile Met Thr Phe Lys Cys Ala Cys Val Asn Val Pro Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Cys Ile Asp Pro Lys Lys Tyr Thr Val Asp Glu
165 170 175
Leu Gln Thr Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Met Glu Leu Leu Lys Arg Asn
180 185 190
Met Ile Gly Pro Gly Ile Asp Val Pro Ala Pro Asp Val Asn Thr Gly
195 200 205
Pro Arg Glu Met Ser Trp Ile Val Asp Gln Tyr Gln Lys Thr Phe Gly
210 215 220
Tyr Lys Asp Ile Asn Ser Ser Ala Ile Val Thr Gly Lys Pro Val His
225 230 235 240
Asn Gly Gly Ile Asn Gly Arg His Ser Ala Thr Gly Arg Gly Val Trp
245 250 255
Lys Ala Gly Asp Leu Phe Leu Lys Asp Lys Glu Trp Met Asp Leu Leu
260 265 270
Lys Trp Lys Thr Gly Trp Lys Asp Lys Thr Val Ile Val Gln Gly Phe
275 280 285
Gly Asn Val Gly Ser Phe Ala Ala Lys Tyr Val His Glu Ala Gly Ala
290 295 300
Lys Val Ile Gly Ile Lys Glu Phe Asp Val Ser Leu Val Asn Lys Asp
305 310 315 320
Gly Ile Asp Ile Asn Asp Leu Phe Glu Tyr Thr Glu Glu Lys Lys Thr
325 330 335
Ile Lys Gly Tyr Pro Lys Ala Gln Glu Ser Lys Glu Asp Leu Leu Val
340 345 350
Ala Glu Thr Asp Ile Leu Met Pro Cys Ala Thr Gln Lys Val Ile Thr
355 360 365
Thr Asp Asn Ala Lys Asp Ile Lys Ala Lys Leu Ile Leu Glu Gly Ala
370 375 380
Asn Gly Pro Thr Thr Pro Ser Gly Glu Lys Ile Leu Leu Asp Lys Gly
385 390 395 400
Val Leu Leu Val Pro Asp Leu Tyr Cys Asn Ala Gly Gly Val Thr Val
405 410 415
Ser Tyr Phe Glu Tyr Leu Lys Asn Ile Asn His Val Ser Tyr Gly Lys
420 425 430
Met Asn Ser Lys Ser Thr Ser Glu Leu Ile Ile Glu Leu Met Asn Ser
435 440 445
Ile Asn Glu Ser Leu His Glu Cys Pro Asp Ser Gln Leu Pro Asn Ile
450 455 460
Cys Pro Asn Lys Lys Leu Lys Arg Ile Gln Gln Cys Thr Thr Glu Ala
465 470 475 480
Asp Ile Val Asp Ser Ala Leu Gln Thr Val Met Glu Ser Ala Ala Arg
485 490 495
Gly Ile Lys Glu Met Ala His Lys Phe Glu Leu Cys Asn Asp Leu Arg
500 505 510
Arg Ala Ala Tyr Val Trp Ser Ser Phe Lys Ile Phe Gln Ala Met Glu
515 520 525
Ser Ser Gly Ile Ser Gln Gln
530 535
<210> 10
<211> 1608
<212> DNA
<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1608)
<223>
<400> 10
atgcttcgtt atacggcacg gattttgaat gggatttacc cacttatgcc aaggcaagta 60
ttaaaacgtt ccgcacacca ggtgcccgag aagctgaaaa aagttgagac ggacaaggac 120
ccggaattct cggaaatggt tctttattat tatcacaagg ccgcgcagac tatggagcct 180
gcattgctca aggaaatgga aaagtatccg catatgaagc cggaggagcg tcaggctcgt 240
gtcaccgcta tactgaatct gcttgggagc gtctccacct cggtggaggt taattttccc 300
attgtccgca aaaacggcac ctacgagatc atcagcggtt atcgttcgca tcatgtacgc 360
catcgattgc ctctcaaggg cggaatccga tacgctctgg acgtgaacga gagcgaagtt 420
aaagcccttg ccgccattat gacgttcaag tgcgcttgcg tgaatgtacc ttatggtgga 480
tctaagggcg gcatttgtat cgatcccaag aagtatacag tggatgagct gcagacgatc 540
acacggcgat acacgatgga gttgctcaag cgtaatatga ttggtcccgg catcgatgta 600
ccggcgcccg atgtgaacac tggtccgcgt gagatgagct ggattgttga tcagtaccag 660
aagacatttg gctacaagga tatcaattca tcggctattg tcaccgggaa gcccgtacac 720
aacggcggca ttaatggtcg acattcggcc acgggcagag gcgtttggaa ggcgggcgat 780
ctctttctga aggataagga atggatggat ctgctcaagt ggaagacggg atggaaggac 840
aagacggtca tagtgcaggg atttggcaat gtgggctcct ttgccgctaa gtatgtgcac 900
gaggcgggcg ccaaagtcat cggaataaaa gagtttgatg tttctctggt taataaggac 960
ggcatagata ttaatgatct ttttgaatac actgaggaaa agaagactat taaaggatat 1020
ccaaaagctc aggagtctaa ggaggacttg ttggtagccg aaaccgatat ccttatgccg 1080
tgtgccaccc aaaaagtgat aaccaccgac aatgccaaag acatcaaggc caagctgatc 1140
ctggaaggcg ccaacgggcc gaccacacca tctggcgaga aaatcctatt ggataagggt 1200
gtcctcctag ttcccgatct ctattgcaat gcgggcggcg taacagtatc ctactttgag 1260
tacctcaaaa acattaacca cgtgtcatat ggcaaaatga actctaaatc tacatccgag 1320
cttattatcg aactgatgaa ctccatcaat gagtctttgc atgaatgccc cgatagtcaa 1380
ctaccgaaca tatgtcccaa taagaaactt aagaggatac aacaatgcac cacagaggcg 1440
gatatcgtgg actcggctct ccaaacagtt atggaatctg cagcacgtgg catcaaggag 1500
atggcccaca aatttgaatt gtgtaacgat ctgcggaggg ccgcctacgt ttggtcttca 1560
ttcaaaattt tccaagccat ggaaagctcc ggaatttccc aacagtag 1608
<210> 11
<211> 192
<212> PRT
<213> 人生长激素（hGH）
<400> 11
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190

Claims (10)

1.一种活性型突变酶的制造方法，其包含以下工序：（1）对天然型时为显示酶活性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时则不显示所述酶活性或者所显示的酶活性为天然型时所显示的酶活性的10%以下的蛋白即失活型酶进行特定的工序；（2b）对所述（1）工序中特定的失活型酶的α螺旋结构部分的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；（3b）制备具有将所述保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序，其中，替换后的氨基酸是序列同源性的保守性最高的3个氨基酸中的任一个；（4b）在异源表达系统中使具有所述（3b）工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择具有与天然型中获得的活性为同种酶活性的蛋白即活性型突变酶的工序。
2.一种可溶性化突变蛋白的制造方法，其包含以下工序：（1）对天然型时为可溶性的蛋白、但当在异源表达系统中使该蛋白的基因表达时在表达系统内变为不溶性的蛋白即不溶性型蛋白进行特定的工序；（2b）对所述（1）工序中特定的不溶性型蛋白的α螺旋结构部分的氨基酸序列中的至少一部分氨基酸计算序列同源性的保守性、且对保守性相对低的氨基酸进行特定的工序；（3b）制备具有将所述保守性相对低的氨基酸的至少1个用保守性比该氨基酸高的氨基酸替换而成的氨基酸序列进行编码的碱基序列的基因的工序，其中，替换后的氨基酸是序列同源性的保守性最高的3个氨基酸中的任一个；（4b）在异源表达系统中使具有所述（3b）工序中制备的碱基序列的基因表达，获得蛋白，从所得蛋白中选择可溶性化突变蛋白的工序。
3.根据权利要求2所述的制造方法，其中，根据异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量判断是否为可溶性化突变蛋白。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，将异源表达后的提取液中的可溶性蛋白量比天然型蛋白的异源表达后的提取液中的该可溶性蛋白量大的突变蛋白定义为可溶性化突变蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述工序（3b）中的氨基酸替换对多个氨基酸进行，在所述工序（4b）中，从替换了多个氨基酸的蛋白中选择活性型突变酶或可溶性化突变蛋白。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的制造方法，其中，所述异源表达系统为大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、短小芽孢杆菌（Brevibacillus）表达系统、棒状杆菌（Corynebacterium）表达系统、曲霉（Aspergillus）表达系统、放线菌表达系统、植物细胞表达系统、动物细胞表达系统或无细胞蛋白合成系统。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，所述动物细胞表达系统为昆虫细胞表达系统。
8.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述活性型突变酶与所述失活型酶相比，酶活性值为2倍以上。
9.根据权利要求2~4中任一项所述的制造方法，其中，不溶性型蛋白为选自酶、细胞因子、血红蛋白、肌红蛋白中的1种蛋白。
10.根据权利要求2~4中任一项所述的制造方法，其中，不溶性型蛋白为选自IFN-γ、IL-2、IFNβ及人生长激素中的1种蛋白。
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