CN112055751A - 修饰型酯酶和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供可以期待高反应效率、能够适用于各种用途的修饰型酯酶。本发明提供一种修饰型酯酶，其具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1个或2个以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。

Description

修饰型酯酶和其用途

技术领域

本发明涉及修饰型酯酶。具体而言，提供提高特性的修饰型酯酶和其用途。本申请要求基于2018年5月2日在日本提出的专利申请特愿No.2018-088943号的优先权，参照并援引该专利申请的全部内容。

背景技术

酯酶是水解酯的酶，许多酯酶从各种生物中被分离出来。具有独特且广泛的底物特异性的来自于乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的酯酶在工业上的有用性高，例如药品、精细化学品领域等中使用的有机化合物的合成；直至食品中的有害化合物的分解，能够用于涉及多方面的用途(例如参照非专利文献1)。

【现有技术文献】

【非专利文献】

【非专利文献1】应用微生物学与生物技术(Appl Microbial Biotechnol)(2002)60：288-292

发明内容

【发明要解决的课题】

但是，既然酯酶也是由氨基酸构成的蛋白质，由于使用条件(强酸强碱、高温、高浓度有机溶剂等)致蛋白质变性而不能发挥催化剂功能，因此存在适用范围受限制的情况。例如，对于酶而言，医药中间体的合成反应多在严苛条件下(例如：高温下的反应、有机溶剂中的反应、酸性pH区域的反应)进行，稳定性尤其成问题。因此，根据反应条件，不能得到充分的酶活性，反应效率(收率)降低。

于是，本发明的课题在于：通过改善来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶的特性，能够在各种使用条件下最大限度地发挥广泛的底物特异性，由此，提高该酯酶的有用性或利用价值。现有的用途中，特性的改善能够带来反应效率等的改善，另一方面能够创造出新用途(即用途的扩大)。

解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人尝试改变来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶。经过反复试验，成功确定对其特性(比活性、高温稳定性、高温反应性、pH稳定性)的改善有效的突变点(氨基酸残基)，得到有用性高的突变体(修饰型酯酶)。在提供用于设计、获得可以达到特性的改善这样的目的的突变体的信息、手段方面，该成果也是重要的。

于是，常经历通过组合有效果的2个突变从而产生相加效果或协同效果的可能性高的情况。此外，对于同种酶，结构(一级结构、立体结构)的类似性高，同样的突变产生同样的效果的可能性高，鉴于这样的技术常识，如果将在具有序列号1的氨基酸序列的来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶中发现的有用的突变适用于与该酯酶之间在结构上的类似性高的其他酯酶，则发挥同等的效果的可能性高，此外，本领域技术人员能够认识到这样的适用是有效的。

以下的发明基于以上的成果和考察。

[1]一种修饰型酯酶，其具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1种或2种以上的氨基酸取代的氨基酸序列、或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。

[2]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为S235T，比活性提高。

[3]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为K7P、F13Y、L222M或V229I，高温稳定性提高。

[4]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为V229I或S235T，高温反应性提高。

[5]根据[1]所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T，pH稳定性提高。

[6]一种修饰型酯酶，其为序列号2～7中的任一个氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列(其中，在同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况时，在第7位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况时，在第13位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号4的氨基酸序列的情况时，在第107位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号5的氨基酸序列的情况时，在第222位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号6的氨基酸序列的情况时，在第229位异亮氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号7的氨基酸序列的情况时，在第235位苏氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同)，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。

[7]一种基因，其编码[1]～[6]中任一项所述的修饰型酯酶。

[8]根据[7]所述的基因，其中，所述基因包含序列号8～13中任一个碱基序列。

[9]一种重组DNA，其包含[7]或[8]所述的基因。

[10]一种微生物，其保有[9]所述的重组DNA。

[11]根据[10]所述的微生物，其宿主为：大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus chosinensis)。

[12]一种酶制剂，其包含[1]～[6]中任一项所述的修饰型酯酶。

[13]一种修饰型酯酶的制备方法，其包括以下的步骤(I)～(III)：

(I)准备编码序列号2～7中的任一个氨基酸序列的核酸的步骤；

(II)使上述核酸表达的步骤，和

(III)回收表达产物的步骤。

附图说明

【图1】突变体的比活性。将突变体的比活性与野生型酶相比较。

【图2】突变体的高温下的稳定性。将在80℃下处理30分钟后的活性残存率与野生型酶相比较。

【图3】突变体的高温下的反应性。将相对活性(60℃下的酶活性相对于30℃下的酶活性之比率)与野生型酶相比较。

【图4】突变体的pH稳定性。将pH4.0条件下处理30分钟后的活性残存率与野生型酶相比较。

具体实施方式

为了便于说明，对于一部分与本发明相关而使用的术语作以下定义。

(术语)

术语“修饰型酯酶”是指将作为基准的酯酶(以下称为“基准酯酶”)修饰或突变而得到的酶。典型而言，基准酯酶是具有序列号1的氨基酸序列的来自于乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的酯酶。

术语“来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶”是指其起源于乙酸钙不动杆菌的酯酶，包括乙酸钙不动杆菌产生的酯酶或使用该酯酶的遗传信息而由其他微生物等表达的酯酶等。

本发明中，作为修饰或突变，进行“氨基酸的取代”。因此，如果比较修饰型酯酶和基准酯酶，则发现部分氨基酸残基存在不同。此外，在本说明书中，将修饰型酯酶也称为修饰型酶或突变体。

本说明书中根据惯例，如以下所示，用1个字母表述各氨基酸。

蛋氨酸：M，丝氨酸：S，丙氨酸：A，苏氨酸：T，缬氨酸：V，酪氨酸：Y，亮氨酸：L，天冬酰胺：N，异亮氨酸：I，谷氨酰胺：Q，脯氨酸：P，天冬氨酸：D，苯丙氨酸：F，谷氨酸：E，色氨酸：W，赖氨酸：K，半胱氨酸：C，精氨酸：R，甘氨酸：G，组氨酸：H

本说明书中，将N末端的氨基酸残基作为第1位，从N末端朝向C末端通过附带的编号确定突变点的位置。

根据惯例，用表示氨基酸种类的1个字母和表示氨基酸位置的数字的组合表达实施氨基酸取代的氨基酸残基，即“突变点”。此外，氨基酸取代引起的“突变”，通过在表示突变点的显示的右侧追加取代后的氨基酸种类的1个字母从而表示。因此，例如，第7位的赖氨酸为突变点时，表示为“K7”，若是第7位的赖氨酸被取代为脯氨酸的突变时，表示为“K7P”。

1.修饰型酯酶

本发明的第1方面涉及修饰型酯酶(修饰型酶)。典型而言，本发明的修饰型酶具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1个或2个以上的氨基酸取代的氨基酸序列。根据该特征，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，比活性、高温稳定性、高温反应性或pH稳定性或者它们中的2个以上特性提高。此外，序列号1的氨基酸序列为来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶的序列。

为了使修饰型酶的高温稳定性和高温反应性的理解、判断/判定变容易，高温稳定性中的高温取“75℃～85℃”，高温反应性中的高温取“55℃～65℃”。此外，pH稳定性是指酸性pH区域下的稳定性。为了使pH稳定性的理解、判断/判定变容易，此处的酸性pH区域定为3～5。

例如，可以基于用后述的实施例所示的测定法算出的活性评价比活性。比活性提高的修饰型酶中，其比活性比基准酯酶(即，由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶)高。修饰型酶的比活性，例如是基准酯酶的比活性的1.1倍～1.3倍。

例如，可以基于在80℃下处理30分钟后的残存活性评价高温稳定性。高温稳定性提高的修饰型酶中，其活性残存率比基准酯酶(即，由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶)还增高。修饰型酶的活性残存率，例如为基准酯酶的活性残存率的2倍～10倍。优选为3倍～10倍。此外，如下所示地计算活性残存率。

活性残存率＝(热处理后的酶活性/热处理前的酶活性)×100(％)

例如，可以基于60℃下的酶活性相对于30℃下的酶活性之比率(以30℃下的活性为基准的60℃下的相对活性)评价高温反应性。在高温反应性提高的修饰型酶中，其相对活性比基准酯酶(即，由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶)还增高。修饰型酶的相对活性，例如，为基准酯酶的相对活性的1.2倍～2倍。优选为1.5倍～2倍。此外，如下所示地计算相对活性。

相对活性＝(60℃下的酶活性/30℃下的酶活性)×100(％)

例如，可以基于在pH4的条件下处理30分钟后的残存活性评价pH稳定性。在pH稳定性提高的修饰型酶中，其活性残存率比基准酯酶(即，由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶)还增高。修饰型酶的活性残存率，例如，为基准酯酶的活性残存率的1.08倍～1.3倍。优选为1.15倍～3倍。此外，如下所示地计算活性残存率。

活性残存率＝(处理后的酶活性/处理前的酶活性)×100(％)

本说明书中，“包含氨基酸取代”是指，突变点(即，产生特定的氨基酸取代的氨基酸残基的位置)变为取代后的氨基酸。因此，将包含氨基酸取代的氨基酸序列(突变氨基酸序列)与不包含氨基酸取代的序列号1的氨基酸序列(基准氨基酸序列)相比较时，在该氨基酸取代的位置中，可以确认氨基酸残基的不同。

K7P表示序列号1的氨基酸序列中的第7位氨基酸(赖氨酸)被取代为脯氨酸的突变。F13Y表示序列号1的氨基酸序列中的第13位氨基酸(苯丙氨酸)被取代为酪氨酸的突变。V107M表示序列号1的氨基酸序列中的第107位氨基酸(缬氨酸)被取代为蛋氨酸的突变。L222M表示序列号1的氨基酸序列中的第222位氨基酸(亮氨酸)被取代为蛋氨酸的突变。V229I表示序列号1的氨基酸序列中的第229位氨基酸(缬氨酸)被取代为异亮氨酸的突变。S235T表示序列号1的氨基酸序列中的第235位氨基酸(丝氨酸)被取代为苏氨酸的突变。

作为本发明的修饰型酶的具体例子，可举出由序列号2～7中的任一个氨基酸序列构成的酯酶(依次对应突变体1(K7P)、突变体2(F13Y)、突变体3(V107M)、突变体4(L222M)、突变体5(V229I)、突变体6(S235T))。如后述的实施例所示，可确认到：由序列号2的氨基酸序列构成的酯酶(突变体1(K7P))的高温稳定性提高；由序列号3的氨基酸序列构成的酯酶(突变体2(F13Y))的高温稳定性和pH稳定性提高；由序列号4的氨基酸序列构成的酯酶(突变体3(V107M))的pH稳定性提高；由序列号5的氨基酸序列构成的酯酶(突变体4(L222M))的高温稳定性和pH稳定性提高；由序列号6的氨基酸序列构成的酯酶(突变体5(V229I))的高温稳定性、高温反应性和pH稳定性提高；由序列号7的氨基酸序列构成的酯酶(突变体6(S235T))的比活性、高温反应性和pH稳定性提高。

通常，使某个蛋白质的氨基酸序列的一部分突变时，有时突变后的蛋白质具有与突变前的蛋白质同等的功能。即氨基酸序列的突变不给蛋白质的功能带来实质性的影响，在突变前后均维持蛋白质的功能。另一方面，2个蛋白质的氨基酸序列的同源性高时，两者显示同等特性的可能性高。如果考虑这些技术常识，则具有虽然与上述修饰型酶的氨基酸序列即“序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、E132P、S155P、L222M、V229I和S235T中的1个或2个以上的氨基酸取代的氨基酸序列(该氨基酸序列的具体例子为序列号2～7的氨基酸序列)”并不是完全相同(即100％的同源性)但显示高同源性的氨基酸序列，且如果所望的特性提高，可以看成是与上述修饰型酶实质性地相同的酶(实质相同的酯酶)。这里的同源性优选90％以上，更优选91％以上，更加优选92％以上，进一步优选93％以上，更进一步优选95％以上，更加进一步优选98％以上，最优选99％以上。如果将上述修饰型酶与实质相同的酯酶相比较，则可见氨基酸序列的稍微不同。其中，设定氨基酸序列的不同在实施了上述氨基酸取代的位置以外的位置产生。因此，同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况时，在第7位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况时，在第13位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；同源性的基准为序列号4的氨基酸序列的情况时，在第107位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；同源性的基准为序列号5的氨基酸序列的情况时，在第222位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；同源性的基准为序列号6的氨基酸序列的情况时，在第229位异亮氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；同源性的基准为序列号7的氨基酸序列的情况时，在第235位苏氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同。换言之，在与序列号2的氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列中，第7位氨基酸为脯氨酸。同样地，在与序列号3的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列中，第13位氨基酸为酪氨酸，在与序列号4的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列中，第107位氨基酸为蛋氨酸，在与序列号5的氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列中，第222位氨基酸为蛋氨酸，在与序列号6的氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列中，第229位氨基酸为异亮氨酸，在与序列号7的氨基酸序列显示90％以上的同源性的氨基酸序列中，第235位氨基酸为苏氨酸。

此处的“氨基酸序列的稍微不同”，通过氨基酸的缺失、取代、附加、插入或它们的组合而产生。典型而言，是指通过构成氨基酸序列的1～数个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的缺失、取代或者1～数个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的附加、插入或它们的组合从而在氨基酸序列上产生突变(变化)。“氨基酸序列的稍微不同”，优选通过保守性氨基酸取代而产生。此处的“保守性氨基酸取代”是指将某个氨基酸残基取代为具有相同性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链被分类为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这样的几个家族。保守性氨基酸取代优选为同源家族内的氨基酸残基间的取代。此外，已知构成来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶(序列号1)的活性中心的氨基酸残基为第97位丝氨酸、第226位天冬氨酸和第256位组氨酸，因此，可以在实施突变时不对这些氨基酸残基产生影响为好。作为氨基酸序列的稍微不同未对蛋白质的功能产生实质上的影响、在突变前后维持蛋白质的功能的例子，可列举：序列号1的氨基酸序列中的第132位氨基酸(谷氨酸)为脯氨酸的氨基酸序列；序列号1的氨基酸序列中的第192位氨基酸(甘氨酸)为丝氨酸的氨基酸序列或序列号1的氨基酸序列中的第244位氨基酸(亮氨酸)为脯氨酸的氨基酸序列。关于具有这些氨基酸序列的酯酶，比较比活性和高温稳定性的结果，与序列号1同等。

然而，2个氨基酸序列或2个碱基序列(以下，作为包含它们的术语使用“2个序列”)的同源性(％)例如可以按照以下的顺序确定。首先，排列两个序列以能够进行最佳比较(例如，可以在第一序列中引入空位而使其与第二序列的比对最适化。)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中的对应位置的分子相同时，可以说该位置的分子相同。2个序列的同源性是该2个序列中共通的相同位置的个数的函数(即，同源性(％)＝相同位置的个数/位置的总数×100)，优选还考虑比对的最适化所需要的空位的数量和尺寸。

可以用数学算法实现2个序列的比较和同源性的确定。作为可以利用于序列的比较中的数学算法的具体例，有记载于Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-68且在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中被改变的算法，但是并不限定于此。这样的算法被编入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序(2.0版)中。为了得到等效的核苷酸序列，例如，只要用NBLAST程序设为score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。为了得到等效的氨基酸序列，例如，只要用XBLAST程序设为score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的空位比对，可以利用Altschul等人(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389-3402记载的GappedBLAST。利用BLAST和Gapped BLAST时，可以使用对应的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。详细情况请参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。作为能够利用于序列比较的其他数学算法的例子，有Myers和Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这样的算法例如被编入在GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中能够利用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比较中利用ALIGN程序时，例如可以使用PAM120残基质量表，设为空位长度罚分＝12，空位罚分＝4。

可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，设为空位权重＝12、10、8、6或4，空位长度权重＝2、3或4，来确定两个氨基酸序列的同源性。此外，可以使用GCG软件包(可以通过http：//www.gcg.com利用)的GAP程序，设为空位权重＝50、空位长度权重＝3，来确定两个碱基序列的同源性。

典型而言，通过由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶，即来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶突变(上述K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1个或2个以上的组合)，而成为本发明的修饰型酶。对于上述实质相同的酯酶，可通过以下方式获得：对由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶突变(上述K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1个或2个以上的组合导致)后的酶进一步施加突变；对于来自于与产生由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶的乙酸钙不动杆菌株为同种同属的酯酶等由与序列号1的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列构成的酯酶，施加同等的突变，或对通过该突变得到的酯酶进一步施加突变。这里的“同等的突变”中，在与序列号1的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列中，与本发明中的突变点(序列号1的氨基酸序列的第7位、第13位、第107位、第222位、第229位或第235位)的氨基酸残基相当的氨基酸残基被取代。此外，作为由与序列号1的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列构成的酯酶的例子，可举出：来自于吉洛氏不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)且具有序列号15的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性98％)；来自于鲍曼不动杆菌ABNIH3(Acinetobacter baumannii ABNIH3)且具有序列号16的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性97％)；来自于塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)且具有序列号17的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性90％)；来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)且具有序列号18的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)；来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)且具有序列号19的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)；来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)且具有序列号20的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)；来自于乌汶伯克氏(Burkholderia ubonensis)且具有序列号21的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)；来自于铁矿副伯克氏菌(Paraburkholderia ferrariae)且具有序列号22的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)；来自于假多噬伯克氏菌(Burkholderia pseudomultivorans)且具有序列号23的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)；来自于不动杆菌属sp.NBRC 110496(Acinetobacter sp.NBRC 110496)且具有序列号24的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性81％)；来自于塞氏不动杆菌(Acinetobacter seifertii)且具有序列号25的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性90％)；来自于不动杆菌属sp.NIPH809(Acinetobactersp.NIPH809)且具有序列号26的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)；来自于荧光假单胞菌A506(A506Pseudomonas fluorescens A506)且具有序列号27的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)；来自于假单胞菌属sp.ABAC61(Pseudomonas sp.ABAC61)且具有序列号28的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性79％)；来自于恶臭假单胞菌IFO12996(Pseudomonas putida IFO12996)且具有序列号29的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性76％)；来自于恶臭假单胞菌MR2068(Pseudomonas putida MR2068)且具有序列号30的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性76％)；来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)且具有序列号31的氨基酸序列的酯酶(氨基酸序列的同源性80％)。

本说明书中，针对氨基酸残基使用时的术语“相当”是指，在被比较的蛋白质(酶)之间对于其功能的发挥带来同等的贡献。例如，以考虑一级结构(氨基酸序列)的部分相同性的同时能够进行最适的比较的方式，将比较对象的氨基酸序列相对于基准酯酶的氨基酸序列(序列号1的氨基酸序列)进行排列时(此时，可以根据需要引入空位使比对最最适化)，可以将与基准氨基酸序列中的特定氨基酸对应的位置的氨基酸特定为“相当的氨基酸”。也可以代替一级结构之间的比较，或在此基础上通过立体结构(三维结构)之间的比较来特定“相当的氨基酸”。通过使用立体结构信息，从而可以得到可靠性高的比较结果。该情况下，可以采用比较多个酶的立体结构的原子坐标同时进行比对的方法。突变对象酶的立体结构信息例如可以通过Protein Data Bank(http：//www.pdbj.org/index_j.html)获得。

以下示出使用X射线晶体结构解析的蛋白质立体结构的确定方法的一个例子。

(1)使蛋白质结晶化。结晶化对确定立体结构是不可缺少的，除此之外，作为蛋白质的高纯度的纯化法、高密度且稳定的保存法也具有产业上的有用性。此时，可以使结合有底物或其类似化合物作为配体的蛋白质结晶化。

(2)对制成的晶体照射X射线收集衍射数据。另外，蛋白质结晶受到X射线照射而损伤导致衍射能力劣化的情形较多。该情况下，最近普及了将晶体急剧地冷却至-173℃左右，在该状态下收集衍射数据的低温测定技术。另外，最终，为了收集用于结构确定的高分辨率数据，利用高亮度的同步辐射光源。

(3)要进行晶体结构解析，除了衍射数据，还需要相位信息。对于目标蛋白质，近缘蛋白质的晶体结构为未知的情况时，不可能使用分子置换法来确定结构，必须要通过重原子同晶置换法来解决相位问题。重原子同晶置换法是将汞、铂等原子序号大的金属原子引入晶体，利用金属原子大的X射线散射能力对于X射线衍射数据的贡献来获得相位信息的方法。被确定的相位能够通过使晶体中的溶剂区域的电子密度平滑化而改善。由于溶剂区域的水分子波动大，所以几乎观察不到电子密度，因此通过使该区域的电子密度近似为0，能够接近真正的电子密度，甚至相位得到改善。此外，非对称单元中含有多个分子时，通过使这些分子的电子密度平均化从而能够更大幅改善相位。在使用由此得到改善的相位计算的电子密度图中将蛋白质模型拟合。该过程是在计算机绘图上，使用MSI公司(美国)的QUANTA等程序进行。之后，使用MSI公司的X-PLOR等程序，进行结构精密化，完成结构解析。对于目标蛋白质，在近缘蛋白质的晶体结构为已知的情况时，可以使用已知蛋白质的原子坐标通过分子取代法能够确定。分子取代和结构精密化可以使用程序CNS_SOLVE ver.11等进行。

2.编码修饰型酯酶的核酸等

本发明的第2方面提供与本发明的修饰型酶相关的核酸。即，可以提供编码修饰型酶的基因、能够用作鉴定编码修饰型酶的核酸的探针的核酸、可以用作使编码修饰型酶的核酸扩增或突变等的引物的核酸。

编码修饰型酶的基因典型而言被用于修饰型酶的制备。根据使用了编码修饰型酶的基因的基因工程学制备方法，能够得到更为均质状态的修饰型酶。此外，在制备大量的修饰型酶的情况时该方法也可称为优选的方法。此外，编码修饰型酶的基因的用途不限于修饰型酶的制备。例如，作为以阐明修饰型酶的作用机理等为目的的实验用工具，或作为用于设计或制作酶的进一步的修饰体的工具，也能够利用该核酸。

本说明书中，“编码修饰型酶的基因”是指，使其表达时得到该修饰型酶的核酸，当然包括具有与该修饰型酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸，当然还包括在这样的核酸中附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。此外，也考虑了密码子的简并。

编码修饰型酶的基因的序列(碱基序列)的例子示于序列号8～13。这些序列如下编码后述实施例所示的突变体。

序列号8：突变体1(K7P)

序列号9：突变体2(F13Y)

序列号10：突变体3(V107M)

序列号11：突变体4(L222M)

序列号12：突变体5(V229I)

序列号13：突变体6(S235T)

本发明的酶不具有信号序列，因此通常不分泌到菌体外，但是，在不分泌到菌体外时，可以用在上述序列(序列号8～13中的任一个)的5'末端侧附加有编码信号肽的序列(信号序列)的基因构建体将其导入到宿主。可以根据宿主选择信号序列。只要是能够表达目标突变体的信号序列，就可以用于本发明。作为可以使用的信号序列，可例示：编码α-因子的信号肽的序列(Protein Engineering,1996,vol9,p.1055-1061)；编码α-因子受体的信号肽的序列；编码SUC2蛋白质的信号肽的序列；编码PHO5蛋白质的信号肽的序列；编码BGL2蛋白质的信号肽的序列；编码AGA2蛋白质的信号肽的序列；编码TorA(三甲胺-N-氧化物还原酶)的信号肽的序列；编码来自于枯草芽孢杆菌的PhoD(磷酸酯酶)的信号肽的序列；编码来自于枯草芽孢杆菌的LipA(酯酶)的信号肽的序列；编码来自于米曲霉菌(Aspergillusoryzae)的高峰淀粉酶的信号肽的序列(日本特开2009-60804号公报)；编码来自于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶的信号肽的序列(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)155,577-581(1986))；编码来自于枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的信号肽的序列(应用与环境微生物学(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY),Apr.1995,p.1610-1613Vol.61,No.4)；编码来自于Bacillus属细菌的纤维素酶的信号肽的序列(日本特开2007-130012号公报)。

本发明的核酸，可以参考本说明书或所附的序列表公开的序列信息，通过使用标准的基因工程学的方法、分子生物学的方法、生物化学的方法、化学合成等，从而制备成分离状态。

本发明的另一个方式中，提供与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列相比较时其编码的蛋白质的功能同等但是一部分中碱基序列不同的核酸(以下，也称为“相同核酸”。此外，也将规定相同核酸的碱基序列称为“相同碱基序列”)。作为相同核酸的例子，可举出：以编码本发明的修饰型酶的核酸的碱基序列作为基准的由包含1个或者多个碱基的取代、缺失、插入、附加或倒位的碱基序列构成，并且编码修饰型酶中具有特征性的酶活性(即酯酶活性)的蛋白质的DNA。可以在多个部位产生碱基的取代、缺失等。此处的所谓“多个”，根据编码该核酸的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选2～20个碱基，更优选2～10个碱基。

相对于作为基准的碱基序列，相同核酸具有例如为60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、更进一步优选85％以上、还优选约90％以上、更加进一步优选95％以上、最优选99％以上的同源性。

例如，通过使用限制性内切酶处理、通过核酸外切酶、DNA连接酶等处理、使用位置指定突变引入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)、随机突变引入法(Molecular Cloning,Third Edition,Chapter 13,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)的突变的引入等而得到以上这样的相同核酸。此外，也可以通过紫外線照射等其他方法得到相同核酸。

本发明的另一个方式涉及具有与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的再一个方式提供，相对于与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或者与之互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％同源的碱基序列的核酸。

本发明的再一个方式涉及，具有：对与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或该相同碱基序列互补的碱基序列，在严格条件下杂交的碱基序列的核酸。此处的“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交不形成非特异性杂交的条件。这样的严格的条件是本领域技术人员所公知的，例如可以参照分子克隆(Molecular Cloning)(第三版,冷泉港实验室冷泉港实验室出版社,纽约)、现代分子生物学实验指南(Current protocols inmolecular biology)(F.M.奥斯伯等著,1987)而设定。作为严格的条件，例如可举出下述条件：使用杂交液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))，在约42℃～约50℃下培育，之后，使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下进行清洗。作为更加优选的严格条件，例如可举出，作为杂交液，使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

本发明的另一个方式，提供具有编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或者与之互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段可以用于对具有编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定和/或扩增等。核酸片段设计为例如，至少含有与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10个～约100个碱基长度，优选约20个～约100个碱基长度，更加优选约30个～约100个碱基长度)杂交的部分。用作探针时，可以将核酸片段标记化。标记化例如可使用荧光物质、酶、放射性同位元素。

本发明的又一个其他方面涉及含有本发明的基因(编码修饰型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如可以以载体的形态提供。本说明书中，术语“载体”是指能够将插入其中的核酸运输到细胞等靶内的核酸性分子。

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，还考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可例示M13噬菌体或其修饰体、λ噬菌体或或其修饰体、pBR322或或其修饰体(pB325、pAT153、pUC8等)、pET21等，作为以酵母为宿主的载体，可例示pYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示pAc、pVL等，作为以哺乳类动物细胞为宿主的载体，可例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指可以将插入其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内，且能够使其在该细胞内表达的载体。表达载体通常包含所插入的核酸的表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记物的表达载体。在使用所述表达载体的情况时，可以利用选择标记物来确认表达载体的导入的有无(及其程度)。

本发明的核酸对载体的插入、选择标记物基因的插入(需要时)、启动子的插入(需要时)等可以使用标准的重组DNA技术(例如可以参照Molecular Cloning,Third Edition,1.84,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York的、使用了限制性内切酶和DNA连接酶的公知的方法)来进行。

作为宿主细胞，从容易处理的观点出发，可使用曲霉菌(例如米曲霉菌)、芽孢杆菌属细菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌)、短芽孢杆菌属细菌(例如桥石短芽孢杆菌)、大肠杆菌(Escherichia coli)、出芽酵母菌(酿酒酵母)等微生物，但若是重组DNA可复制且修饰型酶的基因能够表达的宿主细胞，则能够利用。优选可使用大肠杆菌(Escherichia Koli)、出芽酵母菌(酿酒酵母)。也可以以不动杆菌属微生物(例如乙酸钙不动杆菌)为宿主。此外，作为大肠杆菌的例子，在利用T7系启动子时，可举出大肠杆菌BL21(DE3)，在不利用T7系启动子时，可举出大肠杆菌JM109。此外，作为出芽酵母的例子，可举出出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22或者出芽酵母INVSc1(Invitrogen公司)。

本发明的另一方面涉及保有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物可以通过使用了上述本发明的载体的转染或转化而得到。例如可以利用氯化钙法(分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)(J.Mol.Biol.)，第53卷，第159页(1970))、Hanahan法(分子生物学杂志，第166卷，第557页(1983))、SEM法(Gene，第96卷，第23页(1990))、Chung等的方法(美国国家科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademyof Sciences of the USA)，第86卷，第2172页(1989))、磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter,H.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,7161-7165(1984))、脂转染(Felgner,P.L.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,7413-7417(1984))等而实施。此外，本发明的微生物可以用于生产本发明的修饰型酶。

3.包含修饰型酯酶的酶制剂

本发明的修饰型酶例如可以以酶制剂的形态提供。酶制剂除了含有有效成分(本发明的修饰型酶)之外，还可以含有赋型剂、缓冲剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋型剂，可使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

4.修饰型酯酶的用途

本发明的另一个方面涉及修饰型酶和酶制剂的用途，可以提供使用了本发明的修饰型酶或酶制剂的各种反应、使用它们的各种化合物的生产/制造方法等。具体而言，本发明的修饰型酶或酶制剂可以利用于(1)利用于药品等的有机化合物的制造；(2)考虑到精细化学品领域中的使用的酯化合物的制造；(3)内酯化合物的水解；等。作为(1)的例子，可举出作为血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)之一的卡托普利、阿拉西普利的医药中间体的DAT(D-β-乙酰硫代异丁酸(D-β-Acetylthioisobutyric acid))的DL-MATI(DL-β-乙酰硫基异丁酸酯(DL-β-acetylthioisobutyrate))的利用对映选择性水解的生成(参照Jounal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic 38(2006)163-170)。另一方面，作为(2)的例子，可列举侧链上具有各种取代基的直链的酯化合物((R)3-溴-2-甲基丙酸甲酯(Methyl(R)-3-bromo-2-methylpropionate)、盐酸西曲酸酯(Methyl cetraxate hydrochloride)等)的制造(参照Appl Microbiol Biotechnol(2002)60：288-292)。此外，作为(3)的例子，可列举：醛内酯(D-半乳糖-γ-内酯、L-甘露糖-γ-内酯等)、芳香族内酯(3,4-二氢香豆素、高龙胆酸γ-内酯等)的分解(参照Eur.J.Biochem.267,3-10(2000))。

5.修饰型酯酶的制备方法

本发明的又一方面涉及修饰型酶的制备方法。在本发明的制备方法的一个实施方式中，利用基因工程学的方法制备本发明人等获得成功的修饰型酶。为该方式的情况时，准备编码序列号2～7中任一个氨基酸序列的核酸(步骤(I))。这里，“编码特定的氨基酸序列的核酸”是指使其表达时得到具有该氨基酸序列的多肽的核酸，由与该氨基酸序列对应的碱基序列构成的核酸当然可以，也可以在这样的核酸上附加多余的序列(可以是编码氨基酸序列的序列，也可以是不编码氨基酸序列的序列)。另外，也考虑了密码子的简并。“编码序列号2～7中的任一个氨基酸序列的核酸”可以参考本说明书或附加的序列表公开的序列信息，通过使用标准的基因工程学的方法、分子生物学的方法、生物化学的方法等而制备成分离的状态。这里，序列号2～7的氨基酸序列均是对来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶的氨基酸序列实施了突变的序列。因此，即使通过对编码来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶的基因施加必要的突变，也能够得到编码序列号2～7中的任一个氨基酸序列的核酸(基因)。用于位置特异性碱基序列取代的许多方法在该技术领域中是已知的(例如参照Molecular Cloning,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)，其中可以选择适当的方法而使用。作为位置特异性突变引入法，可采用位置特异性氨基酸饱和突变法。位置特异性氨基酸饱和突变法是以蛋白质的立体结构为基础，推定与所求的功能相关的位置，引入氨基酸饱和突变“Semi-rational,semi-random：半理性半随机”的方法(J.Mol.Biol.331,585-592(2003))。例如能够使用Quick change(Stratagene公司)等的试剂盒、重叠延伸(over lap extention)PCR(Nucleic AcidRes.16,7351-7367(1988))而引入位置特异性氨基酸饱和突变。用于PCR的DNA聚合酶可以使用Taq聚合酶等。其中，优选使用KOD-PLUS-(东洋纺株式会社)、Pfu turbo(Stratagene公司)等精度高的DNA聚合酶。

接着步骤(I)，使准备的核酸表达(步骤(II))。例如，首先准备插入了上述核酸的表达载体，使用其将宿主细胞转化。

接下来，在产生作为表达产物的修饰型酶的条件下培养转化体。转化体的培养只要依照常用方法即可。作为用于培养基的碳源，只要是能够同化的碳化合物即可，例如可使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。另外，作为氮源，只要是能够利用的氮化合物即可，例如可使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物等。另外，根据需要可使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类；特定的氨基酸；特定的维生素等。

另一方面，培养温度可以在30℃～40℃的范围内(优选33～37℃附近)设定。可以考虑培养对象的转化体的生长特性、修饰型酶的产生特性等设定培养时间。在转化体生长且产生酶的范围内调节培养基的pH。优选为将培养基的pH调节为6.0～9.0左右(优选为pH7.0附近)。

接着，回收表达产物(修饰型酶)(步骤(III))。虽然也能够将包含培养后的菌体的培养液直接或在经过浓缩、除去杂质等后用作酶溶液，但一般而言暂时从培养液或菌体回收表达产物。如果表达产物为分泌型蛋白质则可以从培养液回收，如果是除此以外的情况可以从菌体内回收。在从培养液回收时，例如在过滤培养上清液进行离心处理而除去不溶物后，通过组合减压浓缩；膜浓缩；使用了硫酸铵、硫酸钠的盐析；使用了甲醇、乙醇或丙酮等的分级沉淀法；透析；加热处理；等电点处理；凝胶过滤，使用了吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种色谱法(例如利用葡聚糖(Sephadex)凝胶(GE Healthcare Bio-sciences)等的凝胶过滤、DEAE琼脂糖凝胶CL-6B(GE Healthcare Bio-sciences)、辛基琼脂糖凝胶CL-6B(GE Healthcare Bio-sciences)、CM琼脂糖凝胶CL-6B(GE HealthcareBio-sciences))等而进行分离、纯化，能够得到修饰型酶的纯化品。另一方面，从菌体内回收的情况时，通过对培养液进行过滤、离心处理等来获取菌体，接着利用加压处理、超声波处理、物理粉碎处理等机械方法或基于溶菌酶等的酶方法对菌体进行破坏后，通过与上述同样地进行分离、纯化而能够得到修饰型酶的纯化品。

还能够例如利用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等对如上述那样得到的纯化酶进行粉末化来提供。此时，可以使纯化酶预先溶解于磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-HCl缓冲液、GOOD的缓冲液。优选为可以使用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。此外，这里作为GOOD的缓冲液，可举出PIPES、MES或MOPS。

通常，如上所述利用适当的宿主-载体系进行基因的表达～表达产物(修饰型酶)的回收，但也可以使用无细胞合成体系。这里，“无细胞合成体系(无细胞转录体系，无细胞转录/翻译体系)”是指不使用活细胞而是使用来自于活细胞的(或利用基因工程学的方法得到的)核糖体；转录、翻译因子等，在体外由作为模板的核酸(DNA、mRNA)合成其编码的mRNA、蛋白质。在无细胞合成体系中通常使用根据需要使细胞粉碎液纯化而得到的细胞提取液。细胞提取液中通常包含蛋白质合成所需的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白质的合成所需的其它物质。当然，也可以在合成蛋白质时根据需要补充另外准备的核糖体、各种因子和/或各种酶等。

有文献还报道了重构蛋白质合成所需的各分子(因子)的转录/翻译体系的开发(Shimizu,Y.et al.：Nature Biotech.,19,751-755,2001)。该合成体系中，从大肠杆菌基因组扩增由构成细菌的蛋白质合成体系的3种起始因子、3种延伸因子、与终结相关的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨酰-tRNA合成酶以及甲硫氨酰tRNA甲酰基转移酶组成的31种因子的基因，使用它们并在体外重构蛋白质合成体系。本发明中也可以利用这样的重构的合成体系。

术语“无细胞转录/翻译体系”能够与无细胞蛋白质合成体系、体外翻译体系或体外转录/翻译体系交换使用。在体外翻译体系中，RNA被用作模板而合成蛋白质。作为模板RNA，可使用总RNA、mRNA、体外转录产物等。在另一体外转录/翻译体系，DNA被作为模板使用。模板DNA优选应包含核糖体结合区域且包含适当的终止序列。此外，在体外转录/翻译体系中，以转录反应和翻译反应连续进行的方式设定添加各反应所需的因子的条件。

【实施例】

<对特性的提高有效的突变点的探索>

目标在于提高来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶(序列号1)的特性，从氢键的强化、疏水性的强化、高密度化(堆积(packing)性的提高)和环的强化的观点选择突变点(取代的氨基酸残基)，设计15种突变体(修饰型酯酶)。用以下的方法制作设计的各突变体，评价其特性。此外，序列号1的氨基酸序列为来自于乙酸钙不动杆菌的酯酶的成熟体(不含信号肽)。

1.突变体(修饰型酯酶)的获取

(1)突变的引入和转化

为了向各突变引入点引入随机突变，以插入有酯酶基因的质粒(pET21(Esterase))为模板，使用随机引物进行PCR(PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(Takara Bio株式会社))。PCR后，进行使用Dpn I(Takara Bio株式会社)的模板质粒的处理(37℃，3小时)和使用了T4激酶(东洋纺株式会社)、高效连接试剂(Ligation High)(东洋纺株式会社)的连接反应(16℃，一夜)，之后，转化至E.coli BL21(DE3)，从而获得向各突变引入点引入随机突变的随机突变株。

<PCR条件>

反应液的组成：5μl的5×PrimeSTAR GXL缓冲液、2μl的dNTP混合物(各2.5mM)、0.5μl的正向引物、0.5μl的反向引物、0.25μl的模板、1μl的PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(Takara Bio株式会社)(用灭菌蒸馏水调节至总量为25μl)

反应条件：在98℃下10秒、在60℃下15秒、在68℃下2分钟进行15次循环

(2)转化体的培养和酶液(菌体提取液)的获取

使用构建的各酯酶基因重组E.coli表达菌株(宿主：E.coli BL21(DE3))尝试获取培养液(培养菌体)。各酯酶基因重组E.coli表达菌株的培养液(培养菌体)的获取以2个阶段的培养进行。首先，将各酯酶基因重组E.coli表达菌株接种于5mL的L Broth(Invitrogen公司)(Amp：100μg/mL)，用振荡培养机培养(150rpm，37℃)16小时后，将0.5mL的菌株接种于50mL的Teriffic Broth(Invitrogen公司)(Amp：100μg/mL)。之后，在200rpm、33℃的条件培养48小时，从培养开始至24小时的时刻将0.1mM的IPTG添加于培养液中，从而诱导酶的表达。将50mL培养液进行离心分离(7,000g×10分，4℃)后，通过除去离心上清液从而回收培养菌体。

将获得的各培养菌体悬浮于25mL的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)之后，添加10g珠子(0.1mm)(安井机器)，使用珠式破碎仪(2,500rpm，on：60秒，off：30秒，10次循环，4℃)(安井机器)进行物理破碎。将物理破碎液离心分离(7,000g×10分钟，4℃)之后，回收离心上清液，作为菌体提取液。

(3)纯化酶的获得

用过滤器过滤菌体提取液，将液量补足至20mL。接着，按照以下步骤进行硫酸铵沉淀(回收40～80％部分)。首先，添加硫酸铵以达到40％饱和。离心分离，回收上清液后，添加硫酸铵以达到80％饱和。再次离心分离，回收离心沉淀。将回收的沉淀悬浮在10mL的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。

通过超滤对硫安沉淀后的酶溶液进行脱盐浓缩，将电导率降低至约2mS/cm以下。随后，用以下的2阶段的色谱法(DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法、苯基-琼脂糖凝胶柱色谱法)纯化。此外，用DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法回收的部分中添加NaCl以达到浓度2M并调节电导率后，将其供于苯基-琼脂糖凝胶柱色谱法。

(i)DEAE-琼脂糖凝胶柱色谱法

使用的色谱柱：Deae-琼脂糖凝胶FF 1mL(GE Healthcare)

缓冲液：10mM磷酸缓冲液(pH7.0)

洗脱：通过NaCl的线性梯度(0→0.3M)洗脱目标酶

进样量：5mL(脱盐浓缩样品总量)

流速：1mL/分钟

(ii)苯基-琼脂糖凝胶柱色谱

使用的色谱柱：Phenyl-HP 1mL(GE Healthcare)

缓冲液：10mM磷酸缓冲液(pH7.0)

洗脱：通过NaCl的线性梯度(2M→0M)洗脱目标酶

进样量：10mL(DEAE纯化部分总量)

流速：1mL/分钟

回收苯基-琼脂糖凝胶柱色谱的洗脱部分，作为纯化酶样品。

2.突变体的特性评价

<活性测定法>

混合2.1mL的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)、0.3mL的5mM 3,4-二氢香豆素(东京化成(TCI))溶液(50mM磷酸缓冲液(pH7.0)(含40％乙醇))、0.6mL的酶溶液，使它们反应。本测定法中，对通过反应而生成的产物(3-(2-羟基丙基)丙酸)的吸光值变化进行动力学测定(绝对值270nm，30℃5分钟)，从而将1分钟内生成1nmol的产物(3-(2-羟基丙基)丙酸)的酶量定义为1单位(U)。此外，本测定中获得准确测定值的ΔOD在ΔOD＝0.01～0.05/2分钟(绝对值270nm)的范围，根据需要，将酶溶液用pH7.0的50mM磷酸缓冲液稀释。

(1)比活性的评价

使用纯化酶样品评价比活性。用上述活性测定法测定各突变体的纯化酶的酶活性，计算比活性。用波长280nm的吸光度测定蛋白质浓度，设A280nm的吸光度为1.0时的蛋白质浓度为1mg/ml而计算。各突变体的比活性如图1所示。可以确认到突变体6(S235T)的比活性的提高。

(2)高温稳定性的评价

使用纯化酶样品评价高温稳定性。首先，对各突变体的纯化酶进行热处理(80℃，30分钟)。用稀释液(50mM磷酸缓冲液(pH7.0))将热处理后的样品和热处理前(未处理)的样品稀释至适当的浓度后，用上述活性测定法测定酶活性。如下，根据测定值(酶活性)计算残存活性，评价高温稳定性。

活性残存率＝(热处理后的酶活性/热处理前的酶活性)×100(％)

评价结果如图2所示。在4种突变体(突变体1(K7P)、突变体2(F13Y)、突变体4(L222M)、突变体5(V229I))确认到高温稳定性的提高。尤其是，突变体1(K7P)、突变体4(L222M)、突变体5(V229I)的高温稳定性高。

(3)高温反应性的评价

使用纯化酶样品评价高温反应性。首先，用稀释液(50mM磷酸缓冲液(pH7.0))将各突变体的纯化酶稀释至适当的浓度后，测定各温度(30℃，60℃)下的酶活性。使用用以下的计算式计算得到的相对活性(高温(60℃)下的酶活性相对于30℃下的酶活性的比率)对高温反应性进行评价。

相对活性＝(高温(60℃)下的酶活性/30℃下的酶活性)×100(％)

评价结果如图3所示。在2种突变体(突变体5(V229I)、突变体6(S235T))确认到高温反应性的提高。尤其是突变体5(V229I)的高温反应性高。

(4)pH稳定性的评价

使用纯化酶样品评价pH稳定性。首先，对各突变体的纯化酶进行低pH处理(pH4.0，30分钟)。用稀释液(50mM磷酸缓冲液(pH7.0))将处理后的样品和处理前(未处理)的样品稀释至适当的浓度后，用上述活性测定法测定酶活性。如下，根据测定值(酶活性)计算残存活性，评价高温稳定性。

活性残存率＝(低pH处理后的酶活性/处理前的酶活性)×100(％)

评价结果如图4所示。在7种突变体(突变体2(F13Y)、突变体3(V107M)、突变体4(L222M)、突变体5(V229I)、突变体6(S235T))确认到pH稳定性的提高。尤其是突变体2(F13Y)、突变体3(V107M)、突变体4(L222M)、突变体5(V229I)的pH稳定性高。

如上，成功获得了特性提高的8种突变体。各突变体的氨基酸序列如下所示。

突变体1(K7P)：序列号2

突变体2(F13Y)：序列号3

突变体3(V107M)：序列号4

突变体4(L222M)：序列号5

突变体5(V229I)：序列号6

突变体6(S235T)：序列号7

【产业上的可使用性】

本发明的修饰型酯酶的特性(比活性、高温反应性、高温稳定性、pH稳定性)提高。因此，其用途或其适用范围广，此外，可以期待反应效率的提高。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。在不脱离权利要求书的记载的情况下，在本领域技术人员能够容易地想到的范围内各种变形方式也包含于本发明。本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等内容通过援引将其全部的内容引用于此。

序列表

<110> 天野酶制品株式会社（AMANO ENZYME INC.）

<120> 修饰型酯酶和其用途

<130> AE17001P

<150> JP P2018-088943

<151> 2018-05-02

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 276

<212> PRT

<213> 乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）

<400> 1

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Tyr Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala Tyr Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Ala Leu Lys Lys Ile Glu Val Pro Val Leu Ile Leu His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Val Val Pro Phe Glu Ile Ser Gly Lys Lys Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Lys Asn Gly Lys Leu Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 2

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 1(K7P)

<400> 2

Met Gly Tyr Val Thr Thr Pro Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Tyr Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala Tyr Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

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Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

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Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 3

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 3

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275

<210> 4

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 3(V107M)

<400> 4

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65 70 75 80

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275

<210> 5

<211> 276

<212> PRT

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<220>

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<400> 5

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<210> 6

<211> 276

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<400> 6

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275

<210> 7

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 6(S235T)

<400> 7

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65 70 75 80

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85 90 95

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Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

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195 200 205

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275

<210> 8

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 1(K7P)

<400> 8

atgggatatg tcacaacacc agacggcgta gatatttttt ataaagattg gggccctcgc 60

gatgctcctg taattttctt ccaccatggt tggccgctca gttcagatga ctgggatgcg 120

cagatgcttt ttttccttaa agaaggtttt cgtgtagttg ctcatgaccg ccgtggtcat 180

ggtcgttcaa ctcaagtctg ggatggtcat gatatggacc attatgcaga tgacgttgct 240

gctgttgttg agtatttagg tgtacaaggc gcggtacatg tggggcattc aacaggtggt 300

ggtgaagtag cgtattatgt tgctcgttat cctaatgacc ctgtagctaa agctgtttta 360

attagtgccg ttcctccact catggtaaaa actgaaagta atccagatgg tttaccaaaa 420

gaagtttttg atgaccttca aaatcaactt tttaaaaatc gttcacagtt ttatcacgat 480

gtaccagcag gtccatttta tggatttaat cgcccaggag cgaaagtatc agagcctgtg 540

gtgttgaatt ggtggcgtca gggcatgatg ggtggagcaa aagctcatta cgacggaatt 600

gttgccttct ctcaaacaga ttttactgaa gccctcaaaa agatcgaagt tccagttctc 660

atcttacatg gtgaagatga tcaggtggtt ccttttgaaa tttctggtaa aaaatctgca 720

gaactcgtta aaaacggtaa attaattagt tacccaggat tccctcacgg aatgccaact 780

acagaagcag aaacaattaa taaagatctt ttagcattta ttagaagtta a 831

<210> 9

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 2(F13Y)

<400> 9

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acagaagcag aaacaattaa taaagatctt ttagcattta ttagaagtta a 831

<210> 10

<211> 831

<212> DNA

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<220>

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<400> 10

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<211> 831

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<223> 突变酶（Mutant enzyme） 4(L222M)

<400> 11

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<211> 831

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<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 5(V229I)

<400> 12

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acagaagcag aaacaattaa taaagatctt ttagcattta ttagaagtta a 831

<210> 13

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 突变酶（Mutant enzyme） 6(S235T)

<400> 13

atgggatatg tcacaacaaa agacggcgta gatatttttt ataaagattg gggccctcgc 60

gatgctcctg taattttctt ccaccatggt tggccgctca gttcagatga ctgggatgcg 120

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ggtgaagtag cgtattatgt tgctcgttat cctaatgacc ctgtagctaa agctgtttta 360

attagtgccg ttcctccact catggtaaaa actgaaagta atccagatgg tttaccaaaa 420

gaagtttttg atgaccttca aaatcaactt tttaaaaatc gttcacagtt ttatcacgat 480

gtaccagcag gtccatttta tggatttaat cgcccaggag cgaaagtatc agagcctgtg 540

gtgttgaatt ggtggcgtca gggcatgatg ggtggagcaa aagctcatta cgacggaatt 600

gttgccttct ctcaaacaga ttttactgaa gccctcaaaa agatcgaagt tccagttctc 660

atcttacatg gtgaagatga tcaggtggtt ccttttgaaa ttacaggtaa aaaatctgca 720

gaactcgtta aaaacggtaa attaattagt tacccaggat tccctcacgg aatgccaact 780

acagaagcag aaacaattaa taaagatctt ttagcattta ttagaagtta a 831

<210> 14

<211> 831

<212> DNA

<213> 乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）

<400> 14

atgggatatg tcacaacaaa agacggcgta gatatttttt ataaagattg gggccctcgc 60

gatgctcctg taattttctt ccaccatggt tggccgctca gttcagatga ctgggatgcg 120

cagatgcttt ttttccttaa agaaggtttt cgtgtagttg ctcatgaccg ccgtggtcat 180

ggtcgttcaa ctcaagtctg ggatggtcat gatatggacc attatgcaga tgacgttgct 240

gctgttgttg agtatttagg tgtacaaggc gcggtacatg tggggcattc aacaggtggt 300

ggtgaagtag cgtattatgt tgctcgttat cctaatgacc ctgtagctaa agctgtttta 360

attagtgccg ttcctccact catggtaaaa actgaaagta atccagatgg tttaccaaaa 420

gaagtttttg atgaccttca aaatcaactt tttaaaaatc gttcacagtt ttatcacgat 480

gtaccagcag gtccatttta tggatttaat cgcccaggag cgaaagtatc agagcctgtg 540

gtgttgaatt ggtggcgtca gggcatgatg ggtggagcaa aagctcatta cgacggaatt 600

gttgccttct ctcaaacaga ttttactgaa gccctcaaaa agatcgaagt tccagttctc 660

atcttacatg gtgaagatga tcaggtggtt ccttttgaaa tttctggtaa aaaatctgca 720

gaactcgtta aaaacggtaa attaattagt tacccaggat tccctcacgg aatgccaact 780

acagaagcag aaacaattaa taaagatctt ttagcattta ttagaagtta a 831

<210> 15

<211> 276

<212> PRT

<213> 吉洛氏不动杆菌（Acinetobacter guillouiae）

<400> 15

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Lys Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Ile Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala Tyr Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Ala Leu Lys Lys Ile Glu Val Pro Val Leu Ile Leu His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Val Val Pro Phe Glu Ile Ser Gly Lys Lys Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 16

<211> 276

<212> PRT

<213> 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii） ABNIH3

<400> 16

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Val Val Val Glu His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Val Ala Arg Tyr Pro Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Val Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Glu Ile Pro Val Leu Ile Leu His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Val Val Pro Phe Glu Ile Ser Gly Lys Lys Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 17

<211> 276

<212> PRT

<213> 塞氏不动杆菌（Acinetobacter seifertii）

<400> 17

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Asn Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Lys Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Ser Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asp His Leu Gly Val His Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Val Ala Asn Tyr Gln Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Asn Asn Pro Asn Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Lys Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Ile Val Pro Ile Glu Ile Ser Gly Lys Leu Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Gln Asn Gly Lys Leu Ile Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Glu

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 18

<211> 276

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 18

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Cys Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Arg Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 19

<211> 276

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 19

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Leu Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Tyr Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Arg Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Thr Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Gln Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Val Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Asp Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 20

<211> 276

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 20

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Leu Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Tyr Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe His Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu Tyr Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Gln Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Val Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Ile Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Asp Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Ile Tyr Pro Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 21

<211> 276

<212> PRT

<213> 乌汶伯克氏（Burkholderia ubonensis ）

<400> 21

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Val Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Ile Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asn His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Ala Ser Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Ile Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Arg Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Val Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Glu Ala Ile Ser Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Ala Asp Ser Gly Pro Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Ser Asn Ala Glu Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 22

<211> 276

<212> PRT

<213> 铁矿副伯克氏菌（Paraburkholderia ferrariae）

<400> 22

Met Gly Phe Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Thr

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asn His Leu Gly Val Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Val Ala Lys Gly Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Leu Lys Thr Glu Ala Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Glu Ala Gly Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Arg Ile Ser Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Ala Asp Ser Gly Pro Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Lys Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Ala Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

<210> 23

<211> 276

<212> PRT

<213> 假多噬伯克氏菌（Burkholderia pseudomultivorans）

<400> 23

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Gln

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Gln His Leu Gly Val Gln Gln Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ile His Tyr Val Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Val Ser Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Ser Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Gln Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Asp Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Gln Gly Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Arg Ala Thr Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asp Ser Gly Leu Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Ser Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 24

<211> 276

<212> PRT

<213> 不动杆菌属sp. （Acinetobacter sp. ）NBRC 110496

<400> 24

Met Ala Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Leu Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Asn Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Gln His Leu Gly Ile Lys Asn Ala Val His Ile Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Val Ser Lys Ala Val Leu Val Ser Ala Val Pro Pro Ile Met

115 120 125

Val Lys Thr Ala Ser Asn Pro Asn Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Leu Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Asn Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Ser Val Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Val Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Lys Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Lys Gly Phe Ser His

245 250 255

Gly Met Leu Thr Val Asn Ala Asp Val Ile Asn Pro Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ala

275

<210> 25

<211> 276

<212> PRT

<213> 塞氏不动杆菌（Acinetobacter seifertii）

<400> 25

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Asn Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Lys Asp Ala Pro Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Lys Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Ser Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Asp His Leu Gly Val His Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Val Ala Asn Tyr Gln Asn

100 105 110

Asp Pro Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Asn Asn Pro Asn Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Gln Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Val

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Lys Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Glu Asp Asp Gln Ile Val Pro Ile Glu Ile Ser Gly Lys Leu Ser Ala

225 230 235 240

Glu Leu Val Gln Asn Gly Lys Leu Ile Thr Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Glu Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp Leu Leu Glu

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 26

<211> 276

<212> PRT

<213> 不动杆菌属sp. （Acinetobacter sp. ）NIPH809

<400> 26

Met Ala Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Leu Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Asn Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Gln His Leu Gly Ile Lys Ser Ala Ile His Ile Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Ala His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Ala Asn Val Ala Lys Ala Val Leu Val Ser Ala Val Pro Pro Ile Met

115 120 125

Val Lys Thr Ala Asn Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Glu Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Asn Gln Leu Phe Lys Asn Arg Ser Lys Phe Tyr Tyr Asp

145 150 155 160

Leu Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Phe Asn Arg Pro Asp Ala Asn Ala

165 170 175

Ser Glu Pro Val Ile Trp Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Lys Ile Ser Val Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Val Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Gln Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Lys Gly Phe Ser His

245 250 255

Gly Met Leu Thr Val Asn Ala Asp Val Ile Asn Pro Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ala

275

<210> 27

<211> 276

<212> PRT

<213> 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens） A506

<400> 27

Met Gly Tyr Val Thr Thr Arg Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Phe Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Gly Glu

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Gln Thr Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg His Gly Glu

100 105 110

Asp Arg Val Ser Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Gln Thr Pro Ser Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Lys Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr His Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Thr Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Cys

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Arg Ile Gln Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro His Glu Asn Ala Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Lys Asn Ser Thr Leu Lys Ile Tyr Pro Gly Phe Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr His Ala Asp Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 28

<211> 276

<212> PRT

<213> 假单胞菌属sp.（Pseudomonas sp. ）ABAC61

<400> 28

Met Gly Tyr Val Thr Thr Gln Asp Gly Val Asp Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ile Ile Tyr Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ser Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Lys Gln

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Lys His Leu Gly Val Glu Lys Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Glu

100 105 110

Asp Ser Val Pro Lys Ala Val Leu Ile Ser Ser Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Asp Lys Asn Pro Asp Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Val Gln Leu Glu Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Gln Gly Ile Ile Leu Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Glu Asn Leu Ala Ser Ile Lys Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Val Ala Asn Gly Thr Leu Lys Leu Tyr Pro Gly Phe Ser His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Ile Asn Ala Asp Thr Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Val Arg Ser

275

<210> 29

<211> 276

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） IFO12996

<400> 29

Met Ser Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Gln Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile His Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Leu Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Ala His Leu Gly Ile Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Met Ala Arg His Pro Glu

100 105 110

Asp Lys Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ala Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Gln Thr Pro Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Gly Phe Gln Ala Gln Val Ala Ser Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Arg Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Val Glu Ala

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Gly Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Ile Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Gly Ile Gln Gln Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Pro Asn Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Lys Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr His Ala Asp Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 30

<211> 276

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） MR2068

<400> 30

Met Ser Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Gln Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Pro Val Ile His Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala His

35 40 45

Gly Tyr Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Ala His Leu Gly Ile Gln Gly Ala Val His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val Arg Tyr Met Ala Arg His Pro Ala

100 105 110

Asp Lys Val Ala Lys Ala Val Leu Ile Ala Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Gln Thr Pro Asp Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Gly Phe Gln Ala Gln Val Ala Ser Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Arg Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Val Asp Ala

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Gly Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Ile Gly Ser

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Asp Leu Lys Gly Ile Thr Gln Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Leu Leu Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Pro Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Gln Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr His Ala Asp Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Ser

275

<210> 31

<211> 276

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

<400> 31

Met Gly Tyr Val Thr Thr Lys Asp Gly Val Glu Ile Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Trp Gly Pro Arg Asp Ala Gln Val Ile Cys Phe His His Gly Trp Pro

20 25 30

Leu Ser Ala Asp Asp Trp Asp Ala Gln Met Leu Phe Phe Leu Ala Glu

35 40 45

Gly Phe Arg Val Val Ala His Asp Arg Arg Gly His Gly Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Val Trp Asp Gly His Asp Met Asp His Tyr Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 80

Ala Val Val Glu His Leu Gly Val Arg Gly Ala Ile His Val Gly His

85 90 95

Ser Thr Gly Gly Gly Glu Val Val His Tyr Ile Ala Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Asp Pro Val Pro Lys Ala Ala Ile Ile Ser Ala Val Pro Pro Leu Met

115 120 125

Val Lys Thr Glu Gly Asn Pro Gly Gly Leu Pro Lys Ser Val Phe Asp

130 135 140

Asp Leu Gln Ala Gln Leu Ala Ala Asn Arg Ala Gln Phe Tyr Gln Asp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Gly Pro Phe Tyr Gly Tyr Asn Arg Pro Gly Ala Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Gly Ile Ile Arg Asn Trp Trp Arg Gln Gly Met Met Gly Gly

180 185 190

Ala Lys Ala His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Phe Ser Gln Thr Asp Phe

195 200 205

Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ile Asp Ile Pro Val Leu Val Met His Gly

210 215 220

Asp Asp Asp Gln Ile Val Pro Tyr Glu Asn Ser Gly Val Arg Ser Ala

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Asn Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Pro Gly Tyr Pro His

245 250 255

Gly Met Pro Thr Thr Gln Ala Glu Val Ile Asn Ala Asp Leu Leu Ala

260 265 270

Phe Ile Arg Gly

275

Claims (13)

1.一种修饰型酯酶，具有在序列号1的氨基酸序列中包含选自K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T中的1种或2种以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。

2.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为S235T，比活性提高。

3.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为K7P、F13Y、L222M或V229I，高温稳定性提高。

4.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为V229I或S235T，高温反应性提高。

5.根据权利要求1所述的修饰型酯酶，其中，修饰型酯酶的氨基酸序列所包含的氨基酸取代为F13Y、V107M、L222M、V229I和S235T，pH稳定性提高。

6.一种修饰型酯酶，其为序列号2～7中的任一个氨基酸序列或与该氨基酸序列显示91％以上的同源性的氨基酸序列，

其中，在同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况时，在第7位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况时，在第13位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号4的氨基酸序列的情况时，在第107位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号5的氨基酸序列的情况时，在第222位蛋氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号6的氨基酸序列的情况时，在第229位异亮氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同；在同源性的基准为序列号7的氨基酸序列的情况时，在第235位苏氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，

与由序列号1的氨基酸序列构成的酯酶相比较，所述修饰型酯酶的选自比活性、高温稳定性、高温反应性和pH稳定性中的1种以上的特性提高。

7.一种基因，其编码权利要求1～6中任一项所述的修饰型酯酶。

8.根据权利要求7所述的基因，其中，所述基因包含序列号8～13中任一个碱基序列。

9.一种重组DNA，其包含权利要求7或8所述的基因。

10.一种微生物，其保有权利要求9所述的重组DNA。

11.根据权利要求10所述的微生物，其宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、桥石短芽孢杆菌。

12.一种酶制剂，其包含权利要求1～6中任一项所述的修饰型酯酶。

13.一种修饰型酯酶的制备方法，其包括以下的步骤(I)～(III)：

(I)准备编码序列号2～7中的任一个氨基酸序列的核酸的步骤；

(II)使所述核酸表达的步骤，和

(III)回收表达产物的步骤。

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