CN106604991B

CN106604991B - 修饰型β-半乳糖苷酶

Info

Publication number: CN106604991B
Application number: CN201580044502.7A
Authority: CN
Inventors: 石川一彦; 石原聪; 山口庄太郎
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2035-08-13
Also published as: DK3184633T3; US20170233705A1; JP6596427B2; CN106604991A; US10190107B2; EP3184633B1; EP3184633A1; JPWO2016027747A1; EP3184633A4; WO2016027747A1

Abstract

本发明的课题在于提供提高β‑半乳糖苷酶的耐热性的技术。在基准β‑半乳糖苷酶中，将选自以下的(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸置换成脯氨酸，即，(1)与序列号4表示的氨基酸序列的166位的赖氨酸相当的氢基酸、(2)与序列号4表示的氨基酸序列的307位的甘氨酸相当的氨基酸、(3)与序列号4表示的氨基酸序列的833位的丙氨酸相当的氨基酸，上述基准β‑半乳糖苷酶由与序列号4表示的氢基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列构成。

Description

修饰型β-半乳糖苷酶

技术领域

本发明涉及β-半乳糖苷酶。详细而言，涉及来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的修饰以及修饰型酶的用途等。本申请基于2014年8月19日申请的日本专利申请第2014-166897号要求优先权，参照并引用该专利申请的全部内容。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是水解β-D-半乳糖苷键使D-半乳糖游离的酶，一般广泛存在于微生物和动植物中。β-半乳糖苷酶别名被称为乳糖酶。另外，β-半乳糖苷酶还具有使半乳糖苷键转移的能力，已知有利用该能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖残基的低聚糖)的方法。

已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxinus)、细菌环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等产生β-半乳糖苷酶。其中，来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶(专利文献1，非专利文献1)是能够用乳糖生成低聚半乳糖的酶，是工业上制造低聚半乳糖的重要的酶(例如，以“BIOLACTA”的商品名销售β-半乳糖苷酶制剂)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2010/140435号小册子

非专利文献

非专利文献1：Song，J.，Abe，K.，Imanaka，H.，Imamura，K.，Minoda，M.，Yamaguchi，S.，&Nakanishi，K.(2010).Causes of the production of multiple forms of β-galactosidase by Bacillus circulans.Bioscience，biotechnology，andbiochemistry，75(2)，268-278.

发明内容

就低聚糖的制造而言，向底物糖类(乳糖等)添加酶后，通常加热进行。在该酶反应中，为了提高底物的溶解度、防止杂菌的污染等，优选反应温度尽可能的高。已知利用酶的转糖基作用通常底物浓度越高效率越好地进行。另外，高温的情形由于底物的溶解度高，所以能够提高底物浓度。因此，工业生产中特别期望酶的耐热性的提高。另一方面，报告了利用酶工程技术等进行酶的修饰时酶的稳定性降低。虽然酶的性质被改良，但是酶的稳定性(耐热性等)受到影响，也存在不能实现实用化的情形。在这样的情形中，进一步施加修饰，如果能够提高酶的稳定性，会向实用化大大前进。

因此本发明的课题在于提供低聚糖的制造等中有用的提高β-半乳糖苷酶的耐热性的技术、其产物以及用途等。

根据目前的研究，得知环状芽孢杆菌生产的β-半乳糖苷酶由分子量不同的4种酶，即，分子量195kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-A，序列号1)、分子量160kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-B，序列号2)、分子量135kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-C，序列号3)、和分子量86kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-D，序列号4)构成。其中BgaD-D是具有酶活性的最小尺寸的β-半乳糖苷酶，转糖基活性最高。由于该特性，BgaD-D在低聚糖的制造中特别有用。关注这一点，尝试确定BgaD-D的立体结构。具体而言，采用使用0.4M柠檬酸三钠盐二水合物(sodium citrate tribasicdihydrate)、1.0M三水合醋酸钠(sodium acetate trihydrate)(pH4.0)、25％w/v聚乙二醇(Polyethylene glycol)3350作为沉淀剂的悬滴式液蒸汽扩散法，使用精制成高纯度的BgaD-D以结晶化为目标。需要约1年的时间，但是不均匀溶液的界面附近仅成功发现3个结晶。从其中选择结晶，尝试装入结晶结构解析用装置。其结果，1个结晶中，成功收集其反射数据。因此，使用本数据，利用相位决定软件进行约2周的计算。其结果，幸运地成功确定BgaD-D的立体结构。接下来，在立体结构信息的基础上确定预计对耐热化有效的氨基酸，导入突变。详细研究各突变体的特性的结果，3个突变点对耐热化有效。进一步的研究结果表明通过组合有效的突变，耐热性进一步提高。下述的发明主要基于以上的成果以及考察。

[1]一种β-半乳糖苷酶，由在基准β-半乳糖苷酶中选自以下的(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸为脯氨酸的氨基酸序列构成，基准β-半乳糖苷酶由与序列号4表示的氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列构成：

(1)与序列号4表示的氨基酸序列的166位的赖氨酸相当的氨基酸；

(2)与序列号4表示的氨基酸序列的307位的甘氨酸相当的氨基酸；

(3)与序列号4表示的氨基酸序列的833位的丙氨酸相当的氨基酸。

[2]根据[1]记载的β-半乳糖苷酶，其与基准β-半乳糖苷酶相比耐热性提高。

[3]根据[1]或[2]记载的β-半乳糖苷酶，其中，(1)和(2)、(1)和(3)、或(1)～(3)为置换对象。

[4]根据[1]～[3]中任一项记载的β-半乳糖苷酶，其中，基准β-半乳糖苷酶由序列号4表示的氨基酸序列构成。

[5]根据[1]记载的β-半乳糖苷酶，由序列号9～15中任一个氨基酸序列构成。

[6]一种β-半乳糖苷酶，由在基准β-半乳糖苷酶中选自以下的(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸为脯氨酸的氨基酸序列构成，基准β-半乳糖苷酶由与序列号1～3中任一个氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列构成。

[7]一种基因，编码[1]～[6]中任一项记载的β-半乳糖苷酶。

[8]一种重组DNA，其中，包含[7]记载的基因。

[9]一种微生物，保有[8]记载的重组DNA。

[10]一种酶剂，其中，包含[1]～[6]中任一项记载的β-半乳糖苷酶。

[11]一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使[1]～[6]中任一项记载的β-半乳糖苷酶作用于具有β-1，3键、β-1，4键和β-1，6键中的至少一个的二糖、低聚糖或多糖。

[12]一种β-半乳糖苷酶的设计方法，其中，包括以下步骤(i)和(ii)：

(i)在基准β-半乳糖苷酶的氨基酸序列中，确定选自以下的(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸的步骤，基准β-半乳糖苷酶由与序列号1～4的氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列构成：

(ii)以基准β-半乳糖苷酶的氨基酸序列为基础，构建步骤(i)中确定的氨基酸被置换成脯氨酸的氨基酸序列的步骤。

[13]根据[12]记载的设计方法，其中，基准β-半乳糖苷酶由序列号4表示的氨基酸序列构成。

[14]一种β-半乳糖苷酶的制备方法，其中，包括以下步骤(I)～(III)：

(I)准备编码序列号9～15中任一个氨基酸序列、或者利用[12]或[13]记载的设计方法构建的氨基酸序列的核酸的步骤；

(II)使上述核酸表达的步骤，以及

(III)回收表达产物的步骤。

附图说明

图1：各种突变体的酶活性。(A)40℃和60℃的活性测定值。(B)活性比(60℃的活性测定值/40℃的活性测定值)

图2：利用圆二色性光谱仪的蛋白质变性温度的解析结果(单突变体)。

图3：利用圆二色性光谱仪的蛋白质变性温度的解析结果(多重突变体)。

图4：包含野生型酶(WT)和K166P的各突变体的CD值(222nm)的温度变化。

具体实施方式

为了方便说明，以下对本发明使用的用语的一部分进行定义。

(用语)

用语“修饰型β-半乳糖苷酶”是指对特定的β-半乳糖苷酶(为了方便说明，称为“基准β-半乳糖苷酶”)进行修饰或突变而得到的酶。基准β-半乳糖苷酶是环状芽孢杆菌生产的β-半乳糖苷酶。根据目前的研究，得知环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶由分子量不同的4种酶，即，分子量195kD的β-半乳糖苷酶(以下，也称为BgaD-A)、分子量160kD的β-半乳糖苷酶(以下，也称为BgaD-B)、分子量135kD的β-半乳糖苷酶(以下，也称为BgaD-C)、以及分子量86kD的β-半乳糖苷酶(以下，也称为BgaD-D)构成。本发明中，将这4种酶中任一种作为基准β-半乳糖苷酶。因此，典型的是基准β-半乳糖苷酶具有BgaD-A的氨基酸序列(序列序列1)、BgaD-B的氨基酸序列(序列序列2)、BgaD-C的氨基酸序列(序列序列3)、BgaD-D的氨基酸序列(序列序列4)中任一种，但是也能使用具有与序列号1～4中任一个氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列的酶(限于显示β-半乳糖苷酶活性的酶)作为基准β-半乳糖苷酶。优选将具有与序列号1～4中任一个氨基酸序列的95％以上相同的氨基酸序列的酶(显示β-半乳糖苷酶活性的酶)、更优选将具有与序列号1～4中任一个氨基酸序列的98％以上相同的氨基酸序列的酶(限于显示β-半乳糖苷酶活性的酶)、最优选将具有与序列号1～4中任一个氨基酸序列的99％以上相同的氨基酸序列的酶(限于显示β-半乳糖苷酶活性的酶)作为基准β-半乳糖苷酶使用。另外，将编码BgaD-A、BgaD-B、BgaD-C以及BgaD-D的碱基序列分别表示为序列号5、6、7以及8。

上述4种酶中BgaD-D转糖基活性最高，在低聚糖的制造中特别有用。因此，本发明的最优选的实施方式之一，将由BgaD-D的氨基酸序列(序列号4)构成的β-半乳糖苷酶作为基准β-半乳糖苷酶。

本发明中，作为修饰或突变，进行“氨基酸的置换”。因此，若比较修饰型的β-半乳糖苷酶和基准β-半乳糖苷酶，则一部分氨基酸残基存在不同。应予说明，本说明书中，将修饰型的β-半乳糖苷酶也称为修饰型酶、突变β-半乳糖苷酶、突变体等。

本说明书中按照惯例，如下，用1个字母表述各氨基酸。

甲硫氨酸：M、丝氨酸：S、丙氨酸：A、苏氨酸：T、缬氨酸：V、酪氨酸：Y、亮氨酸：L、天冬酰胺：N、异亮氨酸：I、谷氨酰胺：Q、脯氨酸：P、天冬氨酸：D、苯丙氨酸：F、谷氨酸：E、色氨酸：W、赖氨酸：K、半胱氨酸：C、精氨酸：R、甘氨酸：G、组氨酸：H

另外，将突变点的氨基酸残基(成为置换的对象的氨基酸残基)用表示氨基酸的种类的上述1个字母和表示氨基酸的位点的数字的组合来表达。例如，如果166位的赖氨酸为突变点，则表达为“K166”。

(修饰型β-半乳糖苷酶)

本发明的第1方面涉及修饰型β-半乳糖苷酶(修饰型酶)。本发明的修饰型酶，在由与序列号1～4表示的氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列构成的基准β-半乳糖苷酶中，具有选自以下的(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸被置换成脯氨酸的氨基酸序列。

(1)与序列号4表示的氨基酸序列的166位的赖氨酸(K166)相当的氨基酸

(2)与序列号4表示的氨基酸序列的307位的甘氨酸(G307)相当的氨基酸

(3)与序列号4表示的氨基酸序列的833位的丙氨酸(A833)相当的氨基酸

如后述的实施例所示，成为突变点的氨基酸残基是在基于BgaD-D(序列号4)的立体结构确定的氨基酸残基内，通过详细的研究而确认对耐热性的提高有效的残基。本发明通过将这些氨基酸残基作为靶进行修饰，实现耐热性的提高。

基准β-半乳糖苷酶具有与序列号1～4中任一个氨基酸序列的90％以上(优选为95％以上，更优选为98％以上，最优选位99％以上)相同的氨基酸序列。基准β-半乳糖苷酶中，具有与序列号4的氨基酸序列相同的氨基酸序列的酶以外，通过氨基酸的插入、缺失等，置换对象的氨基酸残基的编号(该序列中的位点)有时产生偏差。考虑到这一点，本发明中，作为确定置换对象的氨基酸的表述使用“相当的氨基酸”。其中，用语“相当”是指在被比较的蛋白质(酶)间对其功能的发挥作出同等贡献。例如，相对于基准的氨基酸序列(即，序列号4的氨基酸序列)，将比较对象的氨基酸序列以考虑一级结构(氨基酸序列)的部分同源性的同时能够进行最佳的比较的方式进行排列时(此时根据需要导入间隙，可以将比对最佳化)，可以将与基准的氨基酸序列中的特定的氨基酸对应的位点的氨基酸确定为“相当的氨基酸”。通过代替一级结构彼此的比较、或者在此基础上进行立体结构(三维结构)彼此的比较，也可以确定出“相当的氨基酸”。通过利用立体结构信息，得到可靠性高的比较结果。此时，可以采用一边比较多种酶的立体结构的原子坐标，一边进行比对的技术。应予说明，将BgaD-A、BgaD-B、BgaD-C、BgaD-D作为基准β-半乳糖苷酶时的“相当的氨基酸”如下所示。

(1)与序列号4表示的氨基酸序列的K166相当的氨基酸

BgaD-A中K166

BgaD-B中K166

BgaD-C中K166

BgaD-D中K166

(2)与序列号4表示的氨基酸序列的G307相当的氨基酸

BgaD-A中G307

BgaD-B中G307

BgaD-C中G307

BgaD-D中G307

(3)与序列号4表示的氨基酸序列的A833相当的氨基酸

BgaD-A中A833

BgaD-B中A833

BgaD-C中A833

BgaD-D中A833

如后述的实施例的栏中说明所示，置换对象氨基酸(1)～(3)构成β转角。本发明中通过将该氨基酸置换为脯氨酸使酶的结构稳定化，实现耐热性的提高。脯氨酸形成亚氨基(＝NH)上的H原子与其他氨基酸的羧基进行分子间脱水(＝N-CO-)的特征性的肽键。在该肽键中N原子上没有氨，不能形成氨键。另外，由于是环状结构内部的键角度被固定，使蛋白质的立体结构稳定化。只要具有能够发挥这样的结构的稳定化的特征性作用即可，可以修饰置换后的氨基酸即脯氨酸。作为其中的修饰的例子，可以举出羟基化、乙酰羟基脯氨酸。

如后述的实施例证明所示，置换对象氨基酸(1)～(3)的并用、即，复合的修饰能够发挥更进一步的耐热性提高。因此，本发明的修饰型酶优选的实施方式中上述(1)～(3)中的两个，更优选的实施方式中上述(1)～(3)的全部被置换为脯氨酸。应予说明，由于明确与(1)的脯氨酸的置换特别有用(参照实施例)，将(1)～(3)中的两个置换为脯氨酸时，可以选择(1)和(2)、或(1)和(3)的组合。

其中，修饰型酶的氨基酸序列的例子表示为序列号9～15。这些序列是通过对BgaD-D实施1氨基酸置换、2氨基酸置换(对(1)和(2)的氨基酸、对(1)和(3)的氨基酸、或对(2)和(3)的氨基酸)、或3氨基酸置换(对(1)、(2)和(3)的氨基酸)而得到的修饰型酶的氨基酸序列。序列号和氨基酸置换的对应关系如以下所示。

氨基酸序列：氨基酸置换

A.序列号9：K166P

B.序列号10：G307P

C.序列号11：A833P

D.序列号12：K166P和G307P

E.序列号13：K166P和A833P

F.序列号14：G307P和A833P

G.序列号15：K166P、G307P和A833P

其中，通常在使某一蛋白质的氨基酸序列的一部分突变的情形中突变后的蛋白质与突变前的蛋白质具有同等的功能。即氨基酸序列的突变对蛋白质的功能没有产生实质影响，蛋白质的功能在突变前后被维持。如果考虑该技术常识，与由选自上述(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸被脯氨酸置换的氨基酸序列构成的修饰型酶比较时，虽然发现氨基酸序列的细微差别(但是，氨基酸序列的差别在实施上述氨基酸置换的位点以外的位点产生)，但是特性没有发现实质的差异的氨基酸序列，可以看做与上述修饰型酶实质相同的酶。其中的“氨基酸序列的细微差别”典型的是指通过构成氨基酸序列的1～多个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的缺失、置换、或1～多个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的附加、插入、或它们的组合而氨基酸序列产生突变(变化)。“实质相同的酶”的氨基酸序列和成为基准的上述修饰型酶的氨基酸序列的同一性(％)，例如为90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上，最优选为99％以上。应予说明，氨基酸序列的差别可以在多个位点产生。“氨基酸序列的细微差别”优选通过保守的氨基酸置换产生。

然而，来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的一个被WO2010/098561公开。对该β-半乳糖苷酶，实施与本说明书公开的氨基酸置换相当的突变，也能够取得修饰型β-半乳糖苷酶。应予说明，编码WO2010/098561公开的β-半乳糖苷酶的序列，与编码本申请中的基准β-半乳糖苷酶的之一的序列(序列号5)具有约70％的同一性。

(编码修饰型β-半乳糖苷酶的核酸等)

本发明的第2方面提供与本发明的修饰型酶相关的核酸。即，提供编码修饰型酶的基因、作为用于确定编码修饰型酶的核酸的探针能够使用的核酸、作为用于使编码修饰型酶的核酸扩增或突变等的引物能够使用的核酸。

编码修饰型酶的基因典型地被用于修饰型酶的制备。根据使用编码修饰型酶的基因的基因工程的制备方法，能够得到更均匀的状态的修饰型酶。另外，该方法在制备大量的修饰型酶时也是合适的方法。应予说明，编码修饰型酶的基因的用途不局限于修饰型酶的制备。例如，作为以修饰型酶的作用机理的解明等为目的的实验用工具，或作为用于设计或制作酶的进一步的修饰体的工具，也可以利用该核酸。

本说明书中“编码修饰型酶的基因”是指使其表达时得到该修饰型酶的核酸，具有与该修饰型酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸当然也包括对这类核酸附加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，还要考虑密码子的简并。

参考本说明书或附带的序列表公开的序列信息，通过使用标准的基因工程技术、分子生物学技术、生物化学技术等，可以将本发明的核酸制备成分离的状态。

本发明的其他方式提供与本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列比较时其编码的蛋白质的功能同等但一部分碱基序列不同的核酸(以下，也称为“同源核酸”。另外，将规定同源核酸的碱基序列也称为“同源碱基序列”)。作为同源核酸的例子，可举出由以本发明的编码修饰型酶的核酸的碱基序列为基准包含1个或多个碱基的置换、缺失、插入、附加、或倒位的碱基序列构成，编码具有修饰型酶特有的酶活性的蛋白质的DNA。碱基的置换、缺失等可以发生在多个部位。其中的“多个”根据该核酸编码的蛋白质的立体结构中的氨基酸残基的位点、种类而不同，例如为2～40个碱基，优选为2～20个碱基，更优选为2～10个碱基。

以上这类同源核酸例如通过利用限制性内切酶处理、基于核酸外切酶或DNA连接酶等的处理、定点突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)、随机突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)导入突变等而得到。另外，利用紫外线照射等其他方法也能够得到同源核酸。

本发明的其他方式涉及具有与本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的又一方式提供相对于本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％相同的碱基序列的核酸。

本发明的又一方式涉及具有在严格的条件下对于本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列或者与其相同碱基序列互补的碱基序列进行杂交的碱基序列的核酸。其中的“严格的条件”是指形成所谓的特异性杂交，不形成非特异性杂交的条件。这类严格的条件对本领域技术人员而言是公知的，例如可以参照Molecular Cloning(Third Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)、Current protocols in molecularbiology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)设定。作为严格的条件，例如可举出使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠(sodium citrate)，pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃培养，其后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃清洗的条件。作为更优选的严格的条件，例如，可举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠(sodium citrate)，pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。

本发明的又一方式提供具有本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这类核酸片段可以用于对具有本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列的核酸等进行检测、鉴定、和/或扩增等。核酸片段例如被设计成至少包括与本发明的编码修饰型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如约10～约100碱基长，优选为约20～约100碱基长，更优选为约30～约100碱基长)杂交的部分。用作探针时可以标记核酸片段。标记例如可以使用荧光物质、酶、放射性同位元素。

本发明的又一方面涉及包含本发明的基因(编码修饰型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA例如以载体的形态提供。本说明书中用语“载体”是指可以将插入其中的核酸向细胞等靶内输送的核酸性分子。

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，另外还要考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体，可以例示M13噬菌体或其修饰体、λ噬菌体或其修饰体、pBR322或其修饰体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，可以例示pYepSec1、pMFa、pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可以例示pAc、pVL等，作为哺乳类细胞为宿主的载体，可以例示pCDM8、pMT2PC等。

本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指可以将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内且在该细胞内能够表达的载体。表达载体通常包含插入的核酸的表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择性标记物的表达载体。使用上述表达载体时，可以利用选择性标记物确定有无表达载体的导入(及其程度)。

本发明的核酸向载体的插入、选择性标记物基因的插入(必要时)、启动子的插入(必要时)等可以使用标准的重组DNA技术(例如，可以参照Molecular Cloning，ThirdEdition，1.84，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，使用限制性内切酶和DNA连接酶的公知的方法)进行。

作为宿主细胞，从处理的容易性的观点出发，优选使用大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)等微生物，但只要是重组DNA能够复制且修饰型酶的基因能够表达的宿主细胞就可利用。利用T7系启动子作为大肠杆菌的例子时，可举出大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，除此情形以外，可举出大肠杆菌JM109。另外，作为酿酒酵母的例子，可举出酿酒酵母SHY2、酿酒酵母AH22或酿酒酵母INVSc1(Invitrogen公司)。

本发明的又一方面涉及保有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物可以通过使用了上述本发明的载体的转染或转化而得到。例如，可以利用氯化钙法(Journal of Molecular Biology(J.Mol.Biol.)，第53卷，第159页(1970))、哈纳汉(Hanahan)法(Journal ofMolecular Biology，第166卷，第557页(1983))、SEM法(Gene，第96卷，第23页(1990))，Chung等的方法(Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA，第86卷，第2172页(1989))、磷酸钙共沉淀法、电穿孔(Potter，H.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂质转染(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))等实施。应予说明，本发明的微生物能够用于生产本发明的修饰型酶。

(包含修饰型β-半乳糖苷酶的酶剂)

本发明的修饰型酶例如以酶剂的形态提供。酶剂含有有效成分(本发明的修饰型酶)以外，还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理食盐水等。作为赋形剂，可以使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

(修饰型β-半乳糖苷酶的用途)

本发明的又一方面提供修饰型酶或酶剂的用途。用途的例子是低聚半乳糖的制造、用于乳糖不耐受患者的药物、补充剂的制造·加工、乳制品(低乳糖牛奶等加工奶、奶粉(脱脂奶粉、婴儿奶粉等)、酸奶等)的制造·加工、医疗用食品(Medical Food)的制造·加工。

本发明的修饰型酶在制造低聚半乳糖方面特别有用。在低聚半乳糖的制造中，例如，向预先加热溶解的乳糖液(例如30％～50％的乳糖，pH 7.0)加入规定量(例如50U～1000U)的修饰型酶，在58℃左右放置1～10小时，生成低聚半乳糖。由于本发明的修饰型酶耐热性提高，因此在较高温度下能够反应，由此导致制造效率的提高。应予说明，低聚半乳糖由Gal-(Gal)n-Glc(n为0～5左右)表示(Gal：半乳糖残基，Glc：葡萄糖残基)。结合方式除β1-6、β1-3、β1-4、β1-2以外，还有α1-3、α1-6等。

修饰型酶与野生型酶特性不同。因此，通过并用修饰型酶和野生型酶，能够制造单独用野生型酶无法制造(或者不适合其制造)的低聚半乳糖。如果并用特性不同的多种修饰型酶和野生型酶，可以进一步增加制造的低聚半乳糖的种类。像这样修饰型酶(1种或2种以上)和野生型酶的并用对分别制作各种低聚半乳糖也是有效的。

应予说明，使用多种酶(多种修饰型酶的并用、或者野生型酶和1种或2种以上的修饰型酶的并用)而得到低聚半乳糖(多种低聚半乳糖的混合物)的方法大致有：将分别使用各酶制造的低聚半乳糖混合的方法；使多种酶同时作用于原料(乳糖)的方法；以及使多种酶分阶段作用于原料的方法。

(修饰型β-半乳糖苷酶的设计方法)

本发明的又一方面涉及修饰型酶的设计方法。本发明的设计方法中，实施以下的步骤(i)和(ii)。

步骤(i)：在基准β-半乳糖苷酶的氨基酸序列中，确定选自以下的(1)～(3)中的一个或二个以上的氨基酸的步骤，基准β-半乳糖苷酶由与序列号1～4中任一个氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列构成：

置换对象氨基酸(1)～(3)是作为对β-半乳糖苷酶的耐热性提高有效的氨基酸而被确定的氨基酸。本发明的设计方法中，通过将这些氨基酸置换为脯氨酸，实现β-半乳糖苷酶的耐热性提高。

本发明的设计方法中的突变的对象是β-半乳糖苷酶。突变对象酶典型的是野生型酶(在自然界被发现的酶)。但是，不妨碍将已经实施了某种突变或修饰的酶作为突变对象酶。突变对象酶具有与序列号1～4中任一个氨基酸序列的90％以上相同的氨基酸序列。其中的同一性优选为95％以上，更优选为98％以上，最优选为99％以上。

本发明中步骤(i)之后，进行以下的步骤(ii)。

步骤(ii)：以基准β-半乳糖苷酶的氨基酸序列为基础，构建将步骤(i)中被确定的氨基酸置换成脯氨酸的氨基酸序列的步骤。

(修饰型β-半乳糖苷酶的制备方法)

本发明的又一方面涉及修饰型酶的制备方法。本发明的制备方法的一个方式中，利用基因工程技术制备本发明人等成功取得的修饰型酶。该方式的情形，准备编码序列号9～15中任一个氨基酸序列的核酸(步骤(I))。其中，“编码确定的氨基酸序列的核酸”是使其表达时得到的具有该氨基酸序列的多肽的核酸，可以是由与该氨基酸序列对应的碱基序列构成的核酸，也可以在这样的核酸附加多余的序列(可以是编码氨基酸序列的序列，也可以是不编码氨基酸序列的序列)。此外还考虑密码子的简并。“编码序列号9～15中任一个氨基酸序列的核酸”，参考本说明书或附带的序列表公开的序列信息，通过使用标准的基因工程技术、分子生物学技术、生物化学技术等，可以制备成分离的状态。其中，序列号9～15的氨基酸序列均是对BgaD-D的氨基酸序列实施突变的氨基酸序列。因此，通过对编码BgaD-D的基因(序列号8)施加必要的突变，也可以得到编码序列号9～15中任一个氨基酸序列的核酸(基因)。已知多种该技术领域中用于位点特异性碱基序列置换的方法(例如，参照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)，可以从其中选择适当的方法并使用。作为位点特异性突变导入法，可以采用位点特异性氨基酸饱和诱变法。位点特异性氨基酸饱和诱变法是基于蛋白的立体结构，推定与要求的功能相关的位点，导入氨基酸饱和诱变的“Semi-rational，semi-random”技术(J.Mol.Biol.331，585-592(2003))。例如，使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司)、Quick change(Stratagene公司)等的试剂盒、Overlap extention PCR(Nucleic AcidRes.16，7351-7367(1988))可以导入位点特异性氨基酸饱和诱变。用于PCR的DNA聚合酶可以使用Taq聚合酶等。但是，优选使用KOD-PLUS-(东洋纺公司)、Pfu turbo(Stratagene公司)等精度高的DNA聚合酶。

本发明其他方式在通过本发明放热设计方法设计的氨基酸序列的基础上制备修饰型酶。该方式的情形下，步骤(I)中准备编码通过本发明的设计方法构建的氨基酸序列的核酸。例如，在通过本发明的设计方法构建的氨基酸序列的基础上，对编码修饰型酶的基因施加必要的突变(即，表达产物蛋白质中的、特定位点的氨基酸的置换)，得到编码修饰型酶的核酸(基因)。

继步骤(I)，使准备的核酸表达(步骤(II))。例如，首先准备插入上述核酸的表达载体，使用其转化宿主细胞。“表达载体”是指可以将插入其的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内且能够在该细胞内使其表达的载体。表达载体通常包含被插入的核酸的表达需要的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择性标记物的表达载体。使用上述表达载体时，利用选择性标记物可以确认有无表达载体的导入(及其程度)。

接下来，在产生表达产物修饰型酶的条件下培养转化体。转化体的培养可以按照常规方法进行。作为用于培养基的碳源，只要是可同化的碳化合物即可，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。另外，作为氮源，只要是能够利用的氮化合物即可，例如使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕碱性提取物等。其他根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。

另一方面，培养温度可以设定在30℃～40℃的范围内(优选为37℃附近)。培养时间可以考虑培养对象的转化体的生长特性、修饰型酶的产生特性等进行设定。培养基的pH在转化体生长且产生酶的范围内制备。优选将培养基的pH设定为6.0～9.0左右(进一步优选为pH7.0附近)。

接下来，回收表达产物(修饰型酶)(步骤(III))。包含培养后的菌体的培养液直接、或者经过浓缩、杂质的除去等之后也可以作为酶溶液利用，但是通常从培养液或菌体一次性回收表达产物。表达产物如果是分泌型蛋白质，可以从培养液回收，如果是除此以外的蛋白质可以从菌体内回收。从培养液回收时，例如过滤培养上清，进行离心处理除去不溶物后，通过将利用减压浓缩、膜浓缩、硫酸铵、硫酸钠的盐析、利用甲醇、乙醇或丙酮等的分别沉淀法、透析、加热处理、等电点处理、凝胶过滤、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等各种色谱(例如，利用葡聚糖(Sephadex)凝胶(GE Healthcare Bioscience)等的凝胶过滤、将DEAE琼脂糖CL-6B(GE Healthcare Bioscience)、辛基琼脂糖CL-6B(GE HealthcareBioscience)、CM琼脂糖CL-6B(GE Healthcare Bioscience))等组合并进行分离、精制，可以得到修饰型酶的精制品。另一方面，从菌体内回收时，通过将培养液进行过滤、离心处理等而采取菌体，接下来通过将菌体进行加压处理、超声波处理等机械方法或利用溶菌酶等的酶的方法进行破坏后，与上述同样通过进行分离、精制，从而可以得到修饰型酶的精制品。

也可以将如上得到的精制酶，例如通过冷冻干燥、真空干燥或者喷雾干燥等进行粉末化而提供。此时，可以预先利用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris盐酸缓冲液、GOOD缓冲液溶解精制酶。优选可以使用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，其中作为GOOD缓冲液可举出PIPES、MES或MOPS。

通常，如上述所示利用适当的宿主-载体系统进行基因的表达～表达产物(修饰型酶)的回收，但是可以利用无细胞合成系统。其中，“无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，使用来自活细胞的(或者利用基因工程技术得到的)核糖体、转录·翻译因子等，基于作为模板的核酸(DNA、mRNA)在体外合成其编码的mRNA、蛋白质。无细胞合成系统通常使用根据需要将细胞破碎液精制而得到的细胞提取液。细胞提取液通常包含蛋白质合成需要的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等的各种酶。进行蛋白质的合成时，在该细胞提取液中添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白质合成需要的其他物质。当然，蛋白质合成时，可以根据需要补充另外准备的核糖体、各种因子和/或各种酶等。

也报告了将蛋白质合成需要的各分子(因子)重建的转录/翻译系统的开发(Shimizu，Y.et al.：Nature Biotech.，19，751-755，2001)。该合成系统中，构成细菌的蛋白质合成系统的3种起始因子、3种延伸因子、与终结相关的4种因子、使各氨基酸与tRNA结合的20种氨基酰基tRNA合成酶、以及由甲硫氨酰基tRNA甲酰转移酶构成的31种因子的基因由大肠杆菌基因组扩增，使用它们在体外重建蛋白质合成系统。本发明中可以利用这类重建的合成系统。

用语“无细胞转录/翻译系统”，能够与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。在体外翻译系统中使用RNA作为模板而合成蛋白质。使用总RNA、mRNA、体外转录产物等作为模板RNA。在其他的体外转录/翻译系统中使用DNA作为模板。模板DNA应该包含核糖体结合区域，另外优选包含适当的终止子序列。应予说明，体外转录/翻译系统中，为了转录反应以及翻译反应连续进行，设定添加各反应需要的因子的条件。

实施例

1.目的

来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶(BgaD-D)用于利用转糖基作用将乳糖作为底物的低聚半乳糖的制造(非专利文献1)。乳糖如果提高温度那么溶解度增加，所以进行低聚半乳糖的制造时的反应温度越高越好。利用酶工程技术如果可以提高BgaD-D的耐热性，在更高的温度下能够进行将高浓度的乳糖作为底物的酶反应，可以期待低聚糖的生产效率提高。另外，通过在更高温下进行低聚糖的制造也能够防止杂菌的污染。另外，当用于其他目的(例如底物特异性的提高)的修饰导致酶的稳定性降低时，也可以施加带来耐热性提高的突变，则在与目前为止同样的反应条件下，能够进行高效的低聚糖的制造。因此，利用酶工程技术使BgaD-D的耐热性提高，在产业上非常有用。因此，以BgaD-D的耐热性的提高为目的，进行以下研究。

2.方法

(1)BgaD-D的立体结构的解析

为了阐明BgaD-D的立体结构，进行以下实验。首先，使用HISTrap HP 1mL(GEHealthcare公司)，使用结合缓冲液(Binding buffer)和洗脱缓冲液(Elution buffer)进行精制。本精制中使用的结合缓冲液、洗脱缓冲液的组成如以下所示。

结合缓冲液：20mM磷酸钠、0.2M NaCl、20mM咪唑(pH 7.4)。

洗脱缓冲液：10mM磷酸钠、0.1M NaCl、0.25M咪唑(pH 7.4)。

如上所示精制后，使用Amicon，Centricon YM-10(Millipore，Billerica，MA，USA)，将精制的BgaD-D酶样品相对于20mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液进行透析，进一步浓缩至10mg/ml。使用得到的浓缩样品，在各种结晶化条件下进行筛选实验。其结果，通过使用0.4M柠檬酸三钠盐二水合物(sodium citrate tribasic dihydrate)、1.0M三水合醋酸钠(sodium acetate trihydrate)(pH4.0)、25％w/v聚乙二醇(Polyethylene glycol)3350作为沉淀剂的悬滴式液蒸汽扩散法，在不均匀溶液的界面附近成功发现结晶。利用大型高辐射设施Spring8，收集得到的结晶的反射数据。通过使用BALBES(Long et al.，2008)的分子同型置换法确定相位，使用COOT(Emsley&Cowtan，2004)以及REFMAC5(Murshudov et al.，2011)成功实现最终的分子构建，得到BgaD-D的立体结构。因此，成功确定BgaD-D的立体结构。应予说明，BgaD-D的立体结构数据登录到了蛋白质结构数据库(大阪大学蛋白质研究所)(登录编号3WQ7，未公开)。

(2)耐热性突变点的设计和突变酶的制作

根据BgaD-D的立体结构信息，确定被予想为对耐热化有效果的突变导入点。具体而言，确定带来脯氨酸置换所致的β转角的加强或二硫(SS)键的导入的、总计9处的突变导入点，制作突变体。首先，为了加强立体结构的容易移动，将K166、D167、G306、G307、E720以及A833置换为脯氨酸。另一方面，根据与大肠杆菌LacZ的比较，出于加强β转角的目的，将G101、G102以及G349置换为脯氨酸。但是，将G101和G102同时置换为脯氨酸(双突变体)。此外，在立体结构上将位于接近于可以进行利用二硫键的交联的程度的位点的苏氨酸(T211和T315)置换为半胱氨酸。

制作与各突变对应的引物，利用PCR法进行突变的导入(氨基酸的置换)。具体而言，设计引物，使用KOD plus Mutagenesis kit(东洋纺公司)，利用反向PCR法进行突变导入。按照制品的实验步骤，将PCR产物进行自身连接后，进行大肠杆菌DH5alpha株的转化。从转化体回收质粒，进行测序来确认突变。另一方面，利用得到的质粒转化大肠杆菌BL21株(Takara Bio公司)或OrigamiB株(MERCK公司)，通过以下实验步骤进行蛋白质的表达。

(蛋白质表达的实验步骤)

(i)利用1.5mL LB(含有氨苄西林)培养基进行预培养(37℃，一晚)

(ii)将0.06mL的培养物添加至3mL LB(含有氨苄西林)培养基

(iii)在37℃培养4小时

(iv)将试管转移至冰上，添加0.75μL 1M IPTG

(v)在15℃培养24小时

(vi)集菌后利用磷酸缓冲液(pH7.4)清洗

(vii)悬浮于0.25mL磷酸缓冲液(pH7.4)

(viii)利用超声波处理的菌体的破碎(30秒，3次)

(ix)通过离心处理回收上清

为了进行利用圆二色性光谱仪的解析，将酶精制。使BgaD-D和其突变体表达成在N端添加HIS标签的融合蛋白质，使用镍柱进行精制。具体而言，使用HISTrap HP 1ml(GEHealthcare公司)，利用以下缓冲液进行精制。

结合用缓冲液：20mM磷酸钠，0.2M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4

洗脱用缓冲液：10mM磷酸钠，0.1M NaCl，0.25M咪唑，pH 7.4

利用结合用缓冲液使其与柱结合后，利用相同的缓冲液清洗。其后，利用洗脱用缓冲液使结合成分从柱洗脱。关于洗脱的样品，进行电泳和水解活性的测定，确认酶的精制。

(3)利用酶活性的简易评价

水解测定法参考过去的文献(WO2010/140435)进行。作为底物使用邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，在2点的温度下测定酶活性。乳糖酶与ONPG(终浓度20mM)在pH 6.0、40℃或60℃作用时，在反应初期的1分钟生成1μmol的邻硝基苯的酶量作为1个单元(U)。将大肠杆菌提取液作为样品(酶)，在40℃和60℃测定OD420，算出酶的活性值。

(4)单突变体(single mutants)的温度变性评价

将野生型以及突变体(突变导入BgaD-D)表达后，使用HISTrap HP1ml进行精制。在BgaD-D的氨基酸序列基础上计算出1.882＝1mg/ml，根据精制酶的OD280的测定结果算出蛋白浓度。另外，使用圆二色性光谱仪的热稳定性测定程序测定变性温度。应予说明，参考过去的文献(Yamashiro，K.，Yokobori，S.I.，Koikeda，S.，&Yamagishi，A.(2010).Improvement ofBacillus circulansβ-amylase activity attained using theancestral mutation method.Protein Engineering Design and Selection，23(7)，519-528.)，将圆二色性光谱仪的测定条件按照以下方式设定。

装置：圆二色性光谱仪J-820(日本分光株式会社)

样品浓度：0.1mg/ml

缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 8.0)

测定波长：222nm

温度上升：1℃/min

测定温度：45～90℃

(5)多重突变体的温度变性评价

关于野生型以及多重突变导入突变体，也利用上述同样的方法以及条件评价温度变性。

3.结果

(1)利用酶活性的简易评价

关于野生型(WT)和9种突变体，在平时的活性测定温度40℃进行酶活性的检验。其结果，发现突变体G306P整体的活性降低(图1(A))。由于不改变酶的性质，提高耐热性是目的，因此判断对水解活性有影响的突变G306P不符合目的。

接下来，在40℃和60℃测定ONPG分解活性，对酶的热稳定性进行简单比较。双突变体(G101P，G102P)和突变体G306P中基本没有发现60℃中的酶活性，认为在突变的影响下热稳定性降低(图1(A))。关于全部的突变体，60℃中的活性以将40℃中的活性作为基准的相对值(60℃中的活性测定值/40℃中的活性测定值)进行比较。其结果表明，除了双突变体(G101P，G102P)和突变体G306P以外的7种突变体中，活性比与野生型是相同程度的(图1(B))。因此，判断这7种突变体耐热性有提高的可能性，进行了利用圆二色性光谱仪的解析。

(2)单突变体(single mutants)的温度变性评价

关于野生型和上述7种突变体，使用圆二色性光谱仪测定变性温度。其结果发现突变体K166P中2.9℃的变性温度的上升，突变体G307P中0.3℃的变性温度的上升、突变体A833P中0.4℃的变性温度的上升。另一方面，除此以外的突变体的变性温度与野生型基本相同(图2)。应予说明，在相同的条件下测定5次以上，将结果累积而进行评价。

综上所述，发现3个有前景的突变点。因此，制作将该3个突变点组合的多重突变体，检验耐热性是否协同地提高。

(3)多重突变体的温度变性评价

制作野生型和3种双突变体、1种三重突变体，利用圆二色性光谱仪测定变性温度。其结果，发现双突变体(K166p，G307P)中3.3℃的变性温度的上升、双突变体(K166P，A833P)中1.8℃的变性温度的上升、双突变体(G307P，A833P)中0.9℃的变性温度的上升、三重突变体(K166P，G307P，A833P)中4.2℃的变性温度的上升(图3)。将利用圆二色性光谱仪的CD值(222nm)的变化制成图表解析变性过程。与野生型比较，可知包含突变K166P的突变体向温度高的方向迁移，K166P、G307P以及A833P的三重突变体迁移至最高的温度(图4)。根据以上结果，判明将K166置换为脯氨酸，进而将多个突变组合，对于耐热性的大幅提高是有效的。

产业上的利用可能性

本发明的修饰型酶与野生型酶相比耐热性优异。利用该特性，可期待在低聚糖的高效的制造(合成)中被利用。还可将本发明用在针对乳糖不耐受症患者的药物、补充剂的制造·加工、乳制品(低乳糖牛奶等加工奶、奶粉(脱脂奶粉、婴儿奶粉等)、酸奶等)的制造·加工、医疗用食品(Medical Food)的制造·加工等。

该发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的限制。在不脱离专利请求保护的范围的记载、本领域技术人员能够容易想到的范围内各种变形方式也属于该发明。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等内容通过援引其全部的内容而被引用。