JP2021052725A - モノアシルグリセロールリパーゼ変異体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置における、フェニルアラニン以外のアミノ酸残基;
配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置における、メチオニン以外のアミノ酸残基;及び
配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置における、イソロイシン以外のアミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
また本発明は、配列番号1のアミノ酸配列又はこれと少なくとも92%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニン、132位に相当する位置のメチオニン、及び145位に相当する位置のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法を提供する。
さらに本発明は、前記モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含有する形質転換体を提供する。
さらに本発明は、前記形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。
配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置における、フェニルアラニン以外のアミノ酸残基、好ましくはチロシン;
配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置における、メチオニン以外のアミノ酸残基、好ましくはロイシン;及び
配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置における、イソロイシン以外のアミノ酸残基、好ましくはアラニン、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。本発明のMGLP変異体の好ましい例としては、配列番号13のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置における、フェニルアラニン以外のアミノ酸残基;
配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置における、メチオニン以外のアミノ酸残基;及び
配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置における、イソロイシン以外のアミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。
〔2〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置にチロシンを有する、〔1〕記載のポリペプチド。
〔3〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置にロイシンを有する、〔1〕又は〔2〕記載のポリペプチド。
〔4〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置にアラニンを有する、〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載のポリペプチド。
〔5〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置にチロシンを有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置にロイシンを有する、〔1〕記載のポリペプチド。
〔6〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置にチロシンを有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置にアラニンを有する、〔1〕記載のポリペプチド。
〔7〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置にロイシンを有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置にアラニンを有する、〔1〕記載のポリペプチド。
〔8〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置にチロシンを有し、配列番号1の132位に相当する位置にロイシンを有し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置にアラニンを有する、〔1〕記載のポリペプチド。
〔9〕好ましくは、親ポリペプチドと比べてエステル化活性が向上している、〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のポリペプチド。
〔11〕〔10〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔12〕〔10〕記載のポリヌクレオチド又は〔11〕記載のベクターを含有する形質転換体。
〔13〕好ましくはバチルス属菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔12〕記載の形質転換体。
〔14〕〔12〕又は〔13〕記載の形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
〔16〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニンをチロシンに置換することを含む、〔15〕に記載の方法。
〔17〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置のメチオニンをロイシンに置換することを含む、〔15〕又は〔16〕記載の方法。
〔18〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置のイソロイシンをアラニンに置換することを含む、〔15〕〜〔17〕のいずれか1項記載の方法。
〔19〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニンをチロシンに置換し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置のメチオニンをロイシンに置換することを含む、〔15〕記載の方法。
〔20〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニンをチロシンに置換し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置のイソロイシンをアラニンに置換することを含む、〔15〕記載の方法。
〔21〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置のメチオニンをロイシンに置換し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置のイソロイシンをアラニンに置換することを含む、〔15〕記載の方法。
〔22〕好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニンをチロシンに置換し、配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置のメチオニンをロイシンに置換し、かつ配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置のイソロイシンをアラニンに置換することを含む、〔15〕記載の方法。
〔23〕好ましくは、前記変異ポリペプチドが、親ポリペプチドと比べてエステル化活性が向上している、〔15〕〜〔22〕のいずれか1項記載の方法。
(1)プラスミドpHY−EstGtA2の構築
モノアシルグリセロールリパーゼEstGtA2(配列番号1)をコードする、枯草菌用にコドン至適化した遺伝子(配列番号2)をプラスミドpUC57に挿入したプラスミド(EstGtA2−pUC57)を、GenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型とし、プライマーEstGtA2−F及びプライマーEstGtA2−R(配列番号3及び4)を用いてPCRを行った。同様に、WO2006/068148A1の実施例7に記載のプラスミドpHY−S237を鋳型とし、プライマーpHY−S237−F及びpHY−S237−R(配列番号5及び6)を使用してPCR反応を行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理を行った。得られた両断片を適量混合し、In−fusion法を用いてプラスミド(pHY−EstGtA2)を合成した。
(1)で得られたIn−Fusion反応液を用いて、ECOSTM Competent E.coli DH5α(ニッポンジーン、310−06236)を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するLBプレートに塗抹し、37℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むLB培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収し、High Pure Plasmid Isolation Kit(Roche)を使用してプラスミドpHY−EstGtA2を抽出した。
(2)で得られたpHY−EstGtA2を鋳型として、変異用プライマーEstGtA2−F29Y−F及びEstGtA2−F29Y−R(配列番号7及び8)を用いてPCRを行った。PCR産物をDpnIにて処理した。得られた断片をプロトプラスト形質転換法にてプロテアーゼ遺伝子9重欠失枯草菌株(Kao9株;プロテアーゼ遺伝子aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXが欠失した株、特開2006−174707)に導入し、F29Y変異を有するEstGtA2変異体であるEstGtA2−F29Yを発現する組換え枯草菌株を得た。
(3)と同様の手順で、変異用プライマーとして表1記載の変異用プライマーを用いて、M132L変異を有するEstGtA2変異体EstGtA2−M132L、及びI145A変異を有するEstGtA2変異体EstGtA2−I145Aを発現する組換え枯草菌株を取得した。
実施例1で得られた組換え枯草菌株を3mL/大試験管(φ18×180mm)中のLB培地で30℃、15時間、250rpmで振盪培養した。得られた培養液0.02mLを20mL/500mL容ヒダ付三角フラスコ(バイオット)の2×L−マルトース培地に接種し、30℃で96時間、210rpmで振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離(8000rpm×30分)し、得られた上清をフィルター(0.45μm、PVDF、メルクミリポア製)でろ過して菌体を除いた。ろ過上清をビバスピン20(ザルトリウス)にて濃縮後、エコノパック(登録商標)10DG脱塩カラム(バイオラッド)を用いて50mMリン酸緩衝液(pH6.0)へと置換した。得られた溶液を60℃で10分間加熱処理することで枯草菌宿主由来のリパーゼを不活化し、遠心分離(8000rpm×30分)により凝集物を除去した。遠心後の上清を分取し、これを酵素液として用いた。酵素濃度はQuick StartTM Bradford 1×Dye Ragent(Bio−Rad)を用いて測定した。アルブミンタンパク質溶液を用いて作成した検量線により酵素濃度を測定した。50mMリン酸緩衝液(pH6.0)を用いて酵素液の濃度を適宜調整した。
(エステル化反応)
実施例2で得られた酵素液を用いてMGLP変異体のエステル化活性を調べた。リップ付試験管(φ15×105mm)にグリセリン0.16g及びオレイン酸0.25gを添加し、次いで8N KOHを8μL添加した。次いで実施例2で調製したEstGtA2(親)もしくは変異体の酵素液(3.5g/Lに調整)を添加して反応液を調製した。試験管のキャップを閉めて反応槽(ケミストプラザCP−1000;柴田化学)にセットし、反応液を800rpmで撹拌しながら、50℃で3又は6時間エステル化反応させた。
エステル化反応後の反応液約10μLを試験管に分取し、クロロホルム1mL、メタノール1mL、及び脱イオン水1mLを添加して撹拌し、遠心分離(3000rpm、5分)した。有機層(下層)をねじ口試験管に回収し、窒素ガスで乾固した。得られた乾固物にTMSI−H(ジーエルサイエンス)を添加し、80℃で10分間反応させた。反応物にヘキサン1mL、飽和NaCl溶液1mLを添加して撹拌し、遠心分離(3000rpm、5分)した後、ヘキサン層(上層)を回収することで、脂肪酸グリセリドのトリメチルシリル誘導体を得た。得られたトリメチルシリル誘導体を、下記に示す条件下でガスクロマトグラフィー(GC)分析した。
<ガスクロマトグラフィー条件>
分析装置:(Agilent)
キャピラリーカラム:DB1−M 30m×200μm×0.25μm(J&W Scientific)
移動相:ヘリウム
カラム内流量:0.25mL/分
昇温プログラム:80℃(1分)→20℃/分→340℃(10分)
注入口:スプリット注入(スプリット比:50:1)
検出器温度:340℃
検出器:FID
MAG選択率(%)=MAG/(MAG+DAG+TAG)×100
エステル化率(%)=(MAG+DAG+TAG)/(FA+MAG+DAG+TAG)×100
算出したMAG選択率及びエステル化率の平均値と標準偏差を求めた(n=2)。さらにエステル化率の平均値をもとに、親酵素に対するエステル化率の相対値を求めた。結果を表2に示す。変異体では親酵素に比べて脂肪酸エステル合成が亢進していた。
Claims (15)
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも92%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ以下:
配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置における、フェニルアラニン以外のアミノ酸残基;
配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置における、メチオニン以外のアミノ酸残基;及び
配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置における、イソロイシン以外のアミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。 - 配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置にチロシンを有する、請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置にロイシンを有する、請求項1又は2記載のポリペプチド。
- 配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置にアラニンを有する、請求項1〜3のいずれか1項記載のポリペプチド。
- 親ポリペプチドと比べてエステル化活性が向上している、請求項1〜4のいずれか1項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項6記載のポリヌクレオチド又は請求項7記載のベクターを含有する形質転換体。
- バチルス属菌である、請求項8記載の形質転換体。
- 請求項8又は9記載の形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列又はこれと少なくとも92%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニン、132位に相当する位置のメチオニン、及び145位に相当する位置のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列の29位に相当する位置のフェニルアラニンをチロシンに置換することを含む、請求項11に記載の方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列の132位に相当する位置のメチオニンをロイシンに置換することを含む、請求項11又は12記載の方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列の145位に相当する位置のイソロイシンをアラニンに置換することを含む、請求項11〜13のいずれか1項記載の方法。
- 前記変異ポリペプチドが親ポリペプチドと比べてエステル化活性が向上している、請求項11〜14のいずれか1項記載の方法。
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CHARBONNEAU, DM ET AL.: "Role of Ley Salt Bridges in Thermostability of G. thermodenitrificans EstGtA2: Distinctive Patterns", PLOS ONE, vol. 8, JPN6023030624, October 2013 (2013-10-01), pages 1 - 18, ISSN: 0005118423 * |
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