CN117165551A - 一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体及其应用 - Google Patents
一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体及其应用。本申请提供一种甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体，所述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的氨基酸序列相对于野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列，其第94位、第124位、第140位、第172位和第225位中的一位或多位氨基酸发生突变，突变后的氨基酸选自缬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸或甲硫氨酸；所述野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的序列。本申请提供的甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体可以有效地提高大肠杆菌中甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程和酶工程领域，具体涉及一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体及其应用。
背景技术
甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)是一种以L-甲硫氨酸和ATP为底物生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酶，产物S-腺苷甲硫氨酸是一种多功能的生物分子，参与了许多细胞代谢过程，如转甲基、转硫、谷胱甘肽合成等。因此，甲硫氨酸腺苷转移酶在细胞的生长发育发挥着关键作用。
S-腺苷甲硫氨酸是一种重要的药物前体和营养补充剂，具有抗抑郁、抗氧化、抗炎等多种药理作用。目前，S-腺苷甲硫氨酸的工业生产主要依赖于化学合成或微生物发酵。然而，这些方法存在一些缺点，如低效率、高成本、高污染等。因此，利用甲硫氨酸腺苷转移酶作为一种高效、环保、可控的生物催化剂来合成S-腺苷甲硫氨酸是一种有吸引力的替代方案。以甲硫氨酸腺苷转移酶作为生物催化剂来合成S-腺苷甲硫氨酸的一个前提是具有良好的稳定性，目前利用重组大肠杆菌或酵母表达的甲硫氨酸腺苷转移酶稳定性不能完全达到要求，需要进行改进，提高其稳定性。
同型半胱氨酸(HCY)是一种与S-腺苷甲硫氨酸代谢相关的氨基酸，其含量与心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等疾病相关。同型半胱氨酸的水平是冠状动脉粥样硬化和心肌梗死的一个重要指标，它的含量的高低与这些疾病的严重程度成正比，也是诱发心血管疾病的一个因素，通过检测血液中同型半胱氨酸的水平，可以对这些疾病进行早期诊断或者监测。甲硫氨酸腺苷转移酶是临床用于检测同型半胱氨酸体系中的一个不可缺少的酶，与甲硫氨酸腺苷转移酶在S-腺苷甲硫氨酸的生产中存在同样的问题，稳定性不能完全达到要求，也需要对该酶进行稳定性的改造来适应检测同型半胱氨酸的需要。
甲硫氨酸腺苷转移酶是一种具有重要生理功能和应用潜力的酶。但是亟需解决其稳定性差的缺点，才能更好在S-腺苷甲硫氨酸的生产以及同型半胱氨酸的临床检测等实际应用中发挥作用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，为解决现有技术中甲硫氨酸腺苷转移酶稳定性较差的技术问题，本发明的目的在于提供一种甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列，其第94位、第124位、第140位、第172位和第225位中的一位或多位氨基酸发生突变，突变后的氨基酸选自缬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸或甲硫氨酸；野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列包括如SEQ IDNO：1所示的序列。
在本申请的一些实施方式中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体与野生型甲硫氨酸腺苷转移酶相比，能够提高甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性，优选为能够提高大肠杆菌生产的甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性。
在本申请的一些实施方式中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸序列，选自以下任一种：
1)第94位的丝氨酸突变为缬氨酸、苯丙氨酸、或甘氨酸；
2)第124位的苯丙氨酸突变为赖氨酸或丙氨酸；
3)第140位的苏氨酸突变为亮氨酸、精氨酸、或天冬酰胺；
4)第172位的谷氨酰胺突变为缬氨酸或组氨酸；
5)第225位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸或缬氨酸。
在本申请的一些实施方式中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列包括如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13所示的序列。优选地，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12所示。
本申请第二方面提供一种分离的多核苷酸，编码前述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体。
本申请第三方面提供一种构建体，含有前述的多核苷酸。
本申请第四方面提供一种宿主细胞，含有前述的构建体或基因组中整合有前述的多核苷酸。
本申请第五方面提供了一种甲硫氨酸腺苷转移酶的生产方法，包括适于上述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体表达的条件下，培养宿主细胞获得所述甲硫氨酸腺苷转移酶。
本申请第六方面提供了前述的甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体、前述的核苷酸、前述的构建体、或前述的宿主细胞在制备检测产品和/或S-腺苷甲硫氨酸中的应用。
在本申请的一些实施方式中，检测产品为同型半胱氨酸检测产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
通过对甲硫氨酸腺苷转移酶随机突变和饱和突变的方法获得了12种稳定性显著提高的突变体，其中3种稳定性提高超过50％，其余介于20％-50％之间。这些稳定性提高的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体有助于解决其实际应用过程中不稳定的问题
附图说明
图1显示为甲硫氨酸腺苷转移酶突变体表达纯化结果示意图。其中，泳道1为MAT-F124A-上清，泳道2为MAT-F124A-沉淀，泳道3为MAT-F124A-洗脱，泳道4为MAT-Q172V-上清，泳道5为MAT-Q172V-沉淀，泳道6为MAT-Q172V-洗脱，泳道7为MAT-I225M-上清，泳道8为MAT-I225M-沉淀，泳道9为MAT-I225M-洗脱；Marker从上到下分别是：97KD、66KD、43KD、31KD、20KD、14KD。
图2显示为甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的稳定性结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本申请的发明人经过大量探索研究，意外发现了一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，上述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体与野生型甲硫氨酸腺苷转移酶相比，甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性显著提高，从而可以被应用于工业SAM的生产以及临床检测HCY在血液中的含量，在此基础上完成了本发明。
本申请提供一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸序列相对于野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列，其第94位、第124位、第140位、第172位和第225位中的一位或多位氨基酸发生突变，突变后的氨基酸选自缬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸或甲硫氨酸。野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，具体序列如下：
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GAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAAT
GGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCC
CAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGG
CGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCA
GCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTG
TGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAA
CTTTCGGTACCGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTC
GACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGA
AACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA(SEQ ID NO：14)。
本申请提供的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体中，选自如下情况之一：
1)第94位的丝氨酸突变为缬氨酸、苯丙氨酸、或甘氨酸；
2)第124位的苯丙氨酸突变为赖氨酸或丙氨酸；
3)第140位的苏氨酸突变为亮氨酸、精氨酸、或天冬酰胺；
4)第172位的谷氨酰胺突变为缬氨酸或组氨酸；
5)第225位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸或缬氨酸。
在具体实施例中，当第94位的丝氨酸突变为缬氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：
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在具体实施例中，当第94位的丝氨酸突变为苯丙氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：
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在具体实施例中，当第94位的丝氨酸突变为甘氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：
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在具体实施例中，当第124位的苯丙氨酸突变为赖氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：
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在具体实施例中，当第124位的苯丙氨酸突变为丙氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：
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在具体实施例中，当第140位的苏氨酸突变为亮氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：
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在具体实施例中，当第140位的苏氨酸突变为精氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：8所示，具体为：
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在具体实施例中，当第140位的苏氨酸突变为天冬酰胺时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：
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在具体实施例中，当第172位的谷氨酰胺突变为缬氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFVYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK(SEQ ID NO：10)。
在具体实施例中，当第172位的谷氨酰胺突变为组氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：11所示，具体为：
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在具体实施例中，当第225位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：12所示，具体为：
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在具体实施例中，当第225位的异亮氨酸突变为缬氨酸时，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：13所示，具体为：
MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFVNPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDLLHPIYKETAAYGHFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK(SEQ ID NO：13)。
本申请经过随机突变初筛和定点饱和突变初筛，获得了12种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体能够明显的增强其稳定性，其中3种稳定性提高超过50％，优选地，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12所示。
本申请提供的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体与野生型甲硫氨酸腺苷转移酶相比，能够提高甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性。
本申请的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体与野生型甲硫氨酸腺苷转移酶相比，甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性提高；优选为大肠杆菌生产得到的甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性提高。甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性是指在37℃连续处理3周，得到剩余酶活相比于初始酶活的百分比，作为衡量酶稳定性的标准。
具体的，甲硫氨酸腺苷转移酶活性测定方法：
a)配置反应体系：100mM KCl、25mM MgCl2、2.5mM ATP、10mM甲硫氨酸和pH8.0的Tris-HCl；b)加入10μl的一定浓度的甲硫氨酸腺苷转移酶(注：浓度一般在0.2～10mg/ml)到反应体系中，37℃反应10min，然后加入100μL的高氯酸进行终止反应；
c)HPLC分析反应体系中生成的SAM浓度，该步骤需要用SAM的标准品做对照。
酶活的定义：在上述条件下，每分钟催化产生1μmol SAM所需酶量为一个酶活力单位(1U)。具体的，所述酶活的计算公式为：酶活(U)＝Molsam×V/t；
比活＝U×df/V×C；
Molsam：SAM的摩尔浓度；
V：反应体积；
t：反应时间；
U：酶活；
df：稀释倍数；
C:蛋白浓度(mg/ml)
具体的，剩余酶活的计算公式为：剩余酶活(％)＝37℃处理3周的酶活/初始酶活×100％。
本申请还提供了一种分离的核苷酸，编码前述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体。本申请的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。在本申请一具体实施例中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶野生型编码基因DNA序列如：SEQ ID NO：14所示。其余突变体的编码基因，可以根据氨基酸与密码子的对应关系进行推导，不进行一一列举。
本申请还提供了一种构建体，构建体进一步包含另外的表达调节元件，表达调节元件配置为可操作地连接到所述可选的核苷酸序列。构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可以选择合适的载体。例如，载体可以是表达载体，也可以是克隆载体。再例如，载体的类型可以是质粒、噬菌体、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒等。优选的，为pET39b。
本申请还提供了一种宿主细胞，含有前述的构建体或者基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。通过本领域常规的方法将构建体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。宿主包括微生物、细胞或病毒。具体的，可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选宿主为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。优选的，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Top 10。上述大肠杆菌需要能够表达上述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体，从而可以提供甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体存在的条件。合适的构建上述大肠杆菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。
本申请还提供了甲硫氨酸腺苷转移酶的生产方法，包括如下步骤：在前述的甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体存在的条件下，诱导宿主表达甲硫氨酸腺苷转移酶。合适的诱导表达方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以在合适的条件下诱导前述的宿主细胞，以提供甲硫氨酸腺苷转移酶。再例如，接种大肠杆菌单克隆在LB液体培养基中37℃培养8～12小时，然后按照2～5％的接种量转接到2xYT培养基中37℃培养，实时监测其生长状态，在对数生长期的合适区段加入IPTG进行诱导表达3～12h，具体地，可以为3～6小时、6～8小时、或8～12小时等。
本申请还提供了前述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体、前述的核苷酸、前述的构建体、或前述的宿主细胞在制备检测产品和/或S-腺苷甲硫氨酸中的应用。在一些实施方式中，检测产品为同型半胱氨酸检测产品。本申请的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体可用于工业S-腺苷甲硫氨酸生产，以及用于临床检测体内同型半胱氨酸的水平，从而监测心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等相关疾病的发展状况。
本申请的甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体可以有效提高甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性。实验数据表明，将甲硫氨酸腺苷转移酶的第124位的苯丙氨酸突变成丙氨酸，172位的谷氨酰胺突变为缬氨酸和第225位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸，这三种突变体与野生型甲硫氨酸腺苷转移酶相比，稳定性提高均超50％，有助于解决甲硫氨酸腺苷转移酶在应用过程中的失活问题，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
除非另外说明，本发明所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1
甲硫氨酸腺苷转移酶基因的随机突变并构建分泌型表达载体
设计甲硫氨酸腺苷转移酶基因的扩增引物：MAT-22b-F/R(表1)，以大肠杆菌基因组为模板，扩增MAT基因，PCR产物用NcoI和HindIII进行双酶切，用酶切连接的方法构建到分泌型载体pET22b并测序进行鉴定。然后设计引物MAT-pelB-F/R(表1)，利用QuickMutationTM基因随机突变试剂盒(碧云天，货号：D0219S)扩增出带分泌信号肽pelB的MAT，进行随机突变，方法参考试剂盒说明书。然后直接通过TA克隆的方法连接到pBADTOPOTMTA(Thermo Fisher，货号：K430001)，完成构建，并命名为：pBAD TOPOTMTA-pelB-MAT-randomMut。
表1
实施例2
甲硫氨酸腺苷转移酶基因的随机突变体的大量初筛
从实施例1中构建好的pBAD TOPOTMTA-pelB-MAT-randomMut的平板上，随机挑选单克隆到2ml EB管含500μl终浓度0.1％的阿拉伯糖的LB培养基中，培养过夜。离心之后，初筛稳定性，检测突变对甲硫氨酸腺苷转移酶稳定性的影响。
大量初筛甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体时，把带有分泌信号肽pelB的MAT构建到可以在Top10中表达的载体pBAD TOPOTMTA，这样在完成构建的同时还可以直接进行表达筛选。
大量初筛选时活性检测方法如下：
1、反应体系：100mM KCl、25mM MgCl2、2.5mM ATP、10mM甲硫氨酸和pH8.0的Tris-HCl，96孔板每个孔加入30μl。
2、加入10μl含有甲硫氨酸腺苷转移酶的培养液上清，37℃反应10min，然后加入75μl的显色液(25μl 1％钼酸铵，50μl 2％还原型维C)，室温5min进行显色。
3、加入100μl的终止液(2％醋酸，2％柠檬酸钠)室温反应10min之后，可以在酶标仪读取结果，波长设置成655nm。
初筛的稳定性检测方法如下：
1、准备一块96孔PCR板，加入20μl的甲硫氨酸腺苷转移酶的培养液上清，然后用PCR仪控温，45℃处理3h，剩余的培养液上清放在室温。
2、准备两块普通的96孔平底板，标为A板和B板；两块板按照上述的测活方法加入反应体系，然后在A板中加入10μl放在室温的甲硫氨酸腺苷转移酶的培养液上清，B板中加入10μl的45℃处理后的培养液上清，A板和B板对应位置的孔是同一来源的甲硫氨酸腺苷转移酶的培养液上清。按照测活方法完成测活之后，就可以计算出剩余酶活百分比，用来衡量稳定性，公式如下：
剩余酶活(％)＝B板读数/A板读数×100％
将稳定性提高的突变体送测序，以确定其突变位置。筛选大量突变体后发现：E43、S94、F124、T140、T170、Q172、I225、T243、S310、L345这10种氨基酸位置的突变对稳定性有所提高。
实施例3
甲硫氨酸腺苷转移酶基因10个对稳定性有提高的氨基酸位置饱和突变
以实施例1中的引物：MAT-pelB-F/R，用正常的Taq酶扩增带分泌信号肽pelB的MAT，然后构建到pBAD TOPOTMTA，测序鉴定成功之后命名为：pBAD TOPOTMTA-pelB-MAT。以此载体为基础，设计饱和突变引物(表2)，利用点突变试剂盒(全式金生物，货号：FM111-01)进行饱和突变，同样按照上述实施例2提供的初筛稳定性检测的方法，检测突变对甲硫氨酸腺苷转移酶稳定性的影响，把稳定性提高20％以上的突变体送测序，以确定突变位置。发现：S94V、S94F、S94G、F124K、T140L、T140R、T140N、Q172H和225V共9种甲硫氨酸腺苷转移酶突变稳定性提高20％-50％；另外F124A、Q172V和I225M这3种突变体稳定性提高超过50％。
表2
实施例4
构建12种稳定性提高的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体到胞内表达载体
设计引物MAT-F/R(表3)，以实施例3筛选出的12种突变体载体为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃3min；36循环(95℃20s，60℃20s，72℃3min)；72℃10min。经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的MAT突变体PCR产物。将上述纯化的MAT突变体PCR产物与pET39b质粒分别用NdeI和XhoI酶进行双酶切，将酶切产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌Top10中，中，涂布于含有的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，并测序鉴定。
表3
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列表序号 |
| MAT-F | GGGTTTCATATGATGGCAAAACACCTTTTTACGTC | SEQ ID NO：39 |
| MAT-R | CCGCTCGAGCTTCAGACCGGCAGCATCGC | SEQ ID NO：40 |
实施例5
甲硫氨酸腺苷转移酶突变体表达菌株的构建及验证
将实施例4中构建成功的载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)。挑选单克隆转化子到含有卡那霉素(50mg/ml)的LB培养基，37℃培养过夜，然后转接到新鲜的LB培养基，按2％进行接种，培养至OD600为0.8～0.1时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达过夜。然后破胞取上清测粗酶活，验证表达。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，pH＝7.0。
实施例6
纯化甲硫氨酸腺苷转移酶突变体以及活性测定
按照实施例5中所述的方法，收集诱导表达后的菌体，破胞离心得到上清，利用甲硫氨酸腺苷转移酶的C端带有His-tag可以和镍柱结合进行纯化，纯化用的缓冲液为：缓冲液A:25mM Tris-HCL、150mM NaCl，pH＝7.5；缓冲液B:25mM Tris-HCL、150mM NaCl、500mM咪唑。A液和B液配合进行梯度洗脱纯化，得到分子量为42kD的蛋白纯样品，结果用3株稳定性超过50％的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体进行说明，如图1所示。
甲硫氨酸腺苷转移酶活性测定方法：
a)配置反应体系：100mM KCl、25mM MgCl2、2.5mM ATP、10mM甲硫氨酸和pH8.0的Tris-HCl；
b)加入10μl的一定浓度的甲硫氨酸腺苷转移酶(注：浓度一般用10mg/ml)到反应体系中，37℃反应10min，然后加入100μL的高氯酸进行终止反应；
c)HPLC分析反应体系中生成的SAM浓度。
酶活的定义：在上述条件下，每分钟催化产生1μmol SAM所需酶量为一个酶活力单位(1U)。具体的，所述酶活的计算公式为：酶活(U)＝Molsam×V/t；比活＝U×df/V×C；Molsam：SAM的摩尔浓度；V：反应体积；t：反应时间；U：酶活；df：稀释倍数；C:蛋白浓度(mg/ml)。
实施例7
甲硫氨酸腺苷转移酶突变体稳定性的精细检测
甲硫氨酸腺苷转移酶突变体稳定性的精细检测，方法是：纯化甲硫氨酸腺苷转移酶突变体之后马上检测其初始酶活，然后取一部分置于37℃连续处理3周再次测定酶活，计算出剩余酶活百分比，作为衡量酶稳定性的标准，剩余酶活的计算公式为：剩余酶活(％)＝37℃处理3周的酶活/初始酶活×100％。这样就可以得到剩余酶活的百分比来反应表示酶的稳定性。剩余酶活百分比越高即稳定性越好。结果如图2所示。
实施例8
甲硫氨酸腺苷转移酶的发酵生产
将实施例4构建好的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体载体转到大肠杆菌表达菌株BL21，挑取单克隆到LB培养基，在37℃，200r/min摇床中培养8h，然后按2％接种到2xYT培养基中，用发酵罐进行培养至OD600为0.8～1之间时，加入IPTG终浓度为1mM，30℃诱导培养4～6h。
2xYT培养基：胰蛋白胨：16g/L、酵母提取物：10g/L、NaCl 5g/L，pH＝7.0。
综上，本发明应用随机突变和定点饱和突变的方法对甲硫氨酸腺苷转移酶进行突变，发现了3种突变体稳定性提高超过50％，使其能更好的用于S-腺苷甲硫氨酸的生产以及同型半胱氨酸临床检测的需要，具有广阔的市场前景。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所覆盖。
Claims (10)
1.一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述甲硫氨酸腺苷转移酶突变体的氨基酸序列相对于野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列，其第94位、第124位、第140位、第172位和第225位中的一位或多位氨基酸发生突变，突变后的氨基酸选自缬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸或甲硫氨酸；
所述野生型甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的序列。
2.如权利要求1所述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体与野生型甲硫氨酸腺苷转移酶相比，能够提高甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性，优选为能够提高大肠杆菌生产的甲硫氨酸腺苷转移酶的稳定性。
3.如权利要求1所述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸序列，选自以下任一种：
1)第94位的丝氨酸突变为缬氨酸、苯丙氨酸、或甘氨酸；
2)第124位的苯丙氨酸突变为赖氨酸或丙氨酸；
3)第140位的苏氨酸突变为亮氨酸、精氨酸、或天冬酰胺；
4)第172位的谷氨酰胺突变为缬氨酸或组氨酸；
5)第225位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸或缬氨酸。
4.如权利要求3所述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体，其特征在于，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列包括如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13所示的序列；优选地，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的突变体的氨基酸的序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、或SEQID NO：12所示。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1～4任一项所述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体。
6.一种构建体，其特征在于，含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求6所述的构建体或基因组中整合有如权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种甲硫氨酸腺苷转移酶的生产方法，包括在适于权利要求1～4任一权利要求所述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞获得所述甲硫氨酸腺苷转移酶。
9.如权利要求1～4任一所述的甲硫氨酸腺苷转移酶突变体、如权利要求5所述的核苷酸、权利要求6所述的构建体、或权利要求7所述的宿主细胞在制备检测产品和/或S-腺苷甲硫氨酸中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测产品为同型半胱氨酸检测产品。
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