CN108624574B - 一种s-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核酸、表达载体及宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明采用易错PCR、shuffling的方法筛选出一种S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体，在野生型SAHH序列SEQ ID NO.1的基础上包含选自N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V任意两个以上氨基酸位点的突变。该突变体的活性提高了一倍，稳定性也有所提高，而且耐热性也比较好。本发明还公开了编码该S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体、包括所述表达载体的宿主细胞。

Description

一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法、核 酸、表达载体及宿主细胞

技术领域

本发明涉及一种酶及其应用和制法，编码该酶的核酸，包括所述核酸的表达载体，包括所述表达载体的宿主细胞，它涉及一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体及其应用和制法，编码该S-腺苷同型半胱氨酸水解酶突变体的核酸，包括所述核酸的表达载体，包括所述表达载体的宿主细胞。

背景技术

同型半胱氨酸（Hcy）为含巯基氨基酸，是体内甲硫氨酸循环过程中的一个代谢中间产物。血液中总Hcy浓度的病理性升高会导致高同型半胱氨酸血症。近年来的研究已确认，高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切关系，是心血管疾病的一个新的独立和重要的危险因素。目前国内外已经把Hcy作为心血管疾病的一个检测指标。

Hcy检测方法中最快捷、灵敏度高、适合大批量样品检测，并且可以上生化分析仪自动分析的是Hcy检测试剂盒。其中最常用的是循环酶法试剂盒，试剂盒中最核心的酶是Hcy甲基转移酶（HMT）和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl Methionine，SAM）在同型半胱氨酸甲基转移酶（HomocysteineMethyltransferase，HMT）的催化下反应，形成甲硫氨酸（Met）和S-腺苷同型半胱氨酸（S-Adenosyl Homocysteine，SAH），SAH被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解成腺苷(Ado)和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大检测信号。这些反应被用来研发同型半胱氨酸检测试剂盒。

国内外已有SAHH表达的文章和专利。徐明旭等人（高特异性活性重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的制备与高度表达及对S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改进分析，专利申请号：CN01803726.7）在大肠杆菌中表达了滴虫来源的SAHH基因。金晓霞等人（黄瓜S-腺苷L-高半胱氨酸水解酶全长cDNA的克隆及表达分析）克隆了黄瓜SAHH cDNA基因。王倩等人（大肠杆菌密度感应缺陷株中SAHH基因克隆与表达的研究）在大肠杆菌密度感应缺陷株中表达了GST-SAHH融合蛋白，产物大小为75kD。表达产物恢复了该缺陷菌株的甲基循环，表明产物具有SAHH活性。王源（青岛文昌鱼SAHH基因的鉴定表达及进化分析，山东理工大学2008年硕士论文）在大肠杆菌中表达了青岛文昌鱼SAHH，产物具备酶活性。

宁波美康邹炳德等人（基因工程菌，用其制备重组S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的方法及该酶的应用，专利申请号：CN201210027921.8）通过PCR技术从环境中筛选得到一个SAHH基因片段，该基因编码416个氨基酸，和嗜酸热硫化叶菌SAHH有98%同源性，但有13个氨基酸的差异。表达产物能催化腺苷同型半胱氨酸水解为腺苷和同型半胱氨酸，并且该SAHH对腺苷同型半胱氨酸的Km值为0.009+0.0009mM。但是耐热性不够好。

余凯茜（采用小分子捕获技术的同型半胱氨酸检测方法，申请号：CN03145972.2）采用突变过的SAHH作为试剂盒成分参与同型半胱氨酸检测，突变的SAHH对NAD和同型半胱氨酸的亲和力有所提高，但催化活性降低10%-50%。

袁崇生（同型半胱氨酸检测方法，专利号：US7192729 B2）采用突变的SAHH作为试剂盒成分参与同型半胱氨酸检测，突变的SAHH提高了对同型半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸或腺苷的亲和力，但减弱了催化活性。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的一在于提供一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，活性、稳定性提高的SAHH突变体，而且耐热性也比较好。

本发明的上述技术目的一是通过以下技术方案得以实现的：一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，所述的突变体为在野生型SAHH序列SEQ ID NO.1的基础上包含选自N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V任意两个以上氨基酸位点的突变。

通过采用上述技术方案，通过理论知识和经验，选取了在特定氨基酸位置上进行定向突变，与野生型（WT）相比，突变体的活性和稳定性都有一定的提高，而且耐热性也得到了提高。

本发明的目的二在于提供一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，编码获得的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型SAHH的活性和稳定性都得到了显著提高。

本发明的上述技术目的二是通过以下技术方案得以实现的：一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，所述核酸为编码上述方案中所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸。

通过采用上述技术方案，本发明选取了密码子经过优化的基因序列，且经过基因测序。经过优化后的基因与宿主的密码子使用频率相匹配可用来提高蛋白表达水平。

本发明的目的三在于提供一种表达载体，表达载体中含有的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型SAHH的活性和稳定性都得到了显著提高。

本发明的上述技术目的三是通过以下技术方案得以实现的：一种表达载体，包含上述方案中所述的核酸。

本发明进一步设置为：所述表达载体为pET系列的载体，带有T7启动子。

通过采用上述技术方案，优选的pET系列的载体，带有T7启动子，T7表达系统可使用强力的噬菌体T7启动子进行高水平表达。它非常适用于在大肠杆菌中表达可溶的无毒性重组蛋白质。本发明得到的pET-28a-SAHH在进行表达时得到了明显的高水平表达，平均每g离心后的菌体中蛋白的产量经过纯化可得到至少约40mg的纯度高达至少95%以上的目的蛋白。

本发明的目的四在于提供一种宿主细胞，宿主细胞中含有的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型HMT的活性和稳定性都得到了显著提高。

本发明的上述技术目的四是通过以下技术方案得以实现的：一种宿主细胞，包含上述方案中所述的表达载体。

本发明进一步设置为：所述宿主细胞为原核细胞。

本发明进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明进一步设置为：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。

通过采用上述技术方案，本发明优选BL21（DE3）细胞，其特点是T7 RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，非常适用于T7、T7Lac启动子的表达系统，如pET、pEASY等。上述本发明优选了pET- 28a系列的表达载体，配对BL21（DE3）表达细胞，是非常利于SAHH蛋白的可溶性高表达量的表达。

本发明的目的五在于提供S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的应用，催化S-腺苷同型半胱氨酸水解生成腺苷和同型半胱氨酸效率更高。

本发明的上述技术目的五是通过以下技术方案得以实现的：上述方案中S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体催化S-腺苷同型半胱氨酸水解生成腺苷和同型半胱氨酸的应用。

本发明的目的六在于提供S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的制备方法，制备方法简单高效。

本发明的上述技术目的六是通过以下技术方案得以实现的：上述方案中所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的制备方法，步骤如下：

S1 首先将编码SAHH的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成；

S2 采用易错PCR方法、DNA改组（shuffling）技术对其进行随机突变，以pET-28a(+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主E. coli BL21（DE3）中，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白；

S3 离心后细胞反复冻融5次，加入缓冲液重悬后，离心取适量上清液加入不含SAHH的HCY检测试剂中进行酶活测定；

S4将筛选得到的活性高于对照的菌株，测序获得突变体 DNA 序列信息。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

其一、本发明是将编码SAHH的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成，相对比于野生菌来源的序列，优化后的基因序列更有利于在大肠杆菌中表达，表达量高而且重组质粒稳定，重复性好且不宜丢失。

其二、本发明经过优选，选取了pET-28a(+)表达载体、选取了BL21（DE3）细胞进行表达，经过优化后的载体和细胞的组合通过试验得到了可溶性的、高水平表达的目的蛋白。

其三、本发明直接采用Hcy检测试剂盒的原理，经过组合后反过来检测SAHH的活性，使得该酶在Hcy试剂盒中活性高低变化对试剂盒的影响更为直接，这样会避免单纯的酶活性检测和酶在试剂盒中活性检测的不一致的问题，简单说，试剂盒成分复杂，简单酶活性检测说明酶活性高了是不能直接说明在试剂盒中实际运用的时候就一定能提高整个试剂盒的活性的。

具体实施方式

下文中SEQ ID NO.1为来源于大鼠的SAHH氨基酸序列，SEQ ID NO.2为本发明优化的SAHH核苷酸序列。SEQ ID NO.3-17为本发明的SAHH突变体氨基酸序列，详细序列见表3。

本发明的具体实施方法为：来源于大鼠的SAHH由432个氨基酸组成（见SEQ ID NO：1），为得到更适合于大肠杆菌表达的基因，首先将编码SAHH的核酸序列交由基因合成公司按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成。采用易错 PCR 方法、DNA 改组（shuffling）技术对其进行随机突变，以pET- 28a (+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主E. coli BL21（DE3）中，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。离心后细胞反复冻融5次，加入缓冲液重悬后，离心取适量上清液加入不含SAHH的HCY检测试剂中进行酶活测定。将筛选得到的活性高于对照的菌株，送测序公司测序，获得突变体 DNA 序列信息。详细方案见实施例2。

经过对构建的突变文库筛选获得15个活性提高的突变体，获得SAHH突变体，野生型SAHH的氨基酸序列SEQ ID NO.1采用 “原始氨基酸-突变位置-替换的氨基酸”来表示SAHH突变体中突变的氨基酸，所述SAHH突变体的突变位点分别为N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V。即第27位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸、第38位氨基酸由甲硫氨酸突变为组氨酸、第45位氨基酸由亮氨酸突变为异亮氨酸、第65位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸、第84位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸、第110位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸、第126位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸、第176位氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸、第204位氨基酸由赖氨酸突变为天冬氨酸、第256位氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸、第276位氨基酸由苏氨酸突变为丝氨酸、第316位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸、第368位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸。

序列信息见SEQ ID NO.3- SEQ ID NO.17，

SEQ ID NO.3序列中突变位点为M38H、K204D；

SEQ ID NO.4序列中突变位点为Y110F、V316A；

SEQ ID NO.5序列中突变位点为E65D、P176A；

SEQ ID NO.6序列中突变位点为T84S、T276S、V316A；

SEQ ID NO.7序列中突变位点为N27A、L45I、N126D、A368V；

SEQ ID NO.8序列中突变位点为M38H、Y110F、K204D、V316A；

SEQ ID NO.9序列中突变位点为M38H、Y110F、P176A、K204D、V316A；

SEQ ID NO.10序列中突变位点为M38H、E65D、Y110F、P176A、K204D、V316A；

SEQ ID NO.11序列中突变位点为M38H、E65D、T84S、Y110F、T276S、V316A；

SEQ ID NO.12序列中突变位点为T84S、Y110F、K204D、T276S、V316A；

SEQ ID NO.13序列中突变位点为M38H、E65D、T84S、Y110F、P176A、K204D、T276S、V316A；

SEQ ID NO.14序列中突变位点为E65D、T84S、N126D、P176A、V316A、A368V；

SEQ ID NO.15序列中突变位点为M38H、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V；

SEQ ID NO.16序列中突变位点为N27A、M38H、L45I、Y110F、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V；

SEQ ID NO.17序列中突变位点为N27A、M38H、L45I、E65D、T84S、Y110F、N126D、P176A、K204D、T276S、V316A、A368V；

将含有上述突变体的基因连入pET-28a(+)，并在宿主细胞大肠杆菌Escherichiacoli BL21（DE3）中表达，获得突变体酶蛋白。

下面结合表格和实施例，对本发明进行详细描述。

实施例1 易错 PCR(error-prone PCR) 方法构建SAHH突变文库

采用GeneMorph II random mutagenesis kit，以优化的SAHH（见SEQ ID NO.2）核苷酸序列为模板扩增SAHH基因，随机引入突变。

扩增引物

F：5’-ACACATGTCTGACAAGTTGCCATACAAG（下划线为PscI内切酶）

R：5’-CCGCTCGAGTCAGTATCTGTAGTGGTCTG（下划线为XhoI内切酶）

反应条件：94°C 预变性10 min，94°C变性30s，60°C退火60s 和72°C延伸2min，共25个循环，0.8%琼脂糖电泳，试剂盒回收目的基因片段。按照NEB公司产品说明书描述的方法，用PscI和XhoI双酶切后，与经过NcoI（PscI和NcoI为同尾酶）和XhoI酶切的pET-28a(+)载体（kana抗性）进行连接反应，反应条件为：载体和片段按摩尔比1:3的比例混合，加入0.5μL Takara T4 DNA连接酶，16°C过夜。电击法转入E.coli HST08 Premium Electro Cells，得到超过10⁵个克隆的突变体库。

实施例2 SAHH突变体库的筛选

将实施例 1 中突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株 BL21（DE3），涂布含有kana的LB平板，培养12h。 挑取单克隆于96孔板，每孔含有150μL TB 培养基（含有50μg/mL卡纳霉素，1mM IPTG），37℃，245rpm，震荡培养36h。96孔板复制器复制各单克隆于LB固体培养基平板，37℃培养12h后，4℃冰箱保存。用排枪轻轻吸出96孔板各孔中的细胞培养物，按相应位置分配于A板和B板的96孔板中，每块96孔板各孔中的培养物为70μL。4000rpm，4℃，离心10min，弃去上清，各孔中菌体细胞反复冻融5次后用30μL，50mM，pH7.6的磷酸钠缓冲液重悬。A板直接加入不含SAHH的Hcy检测试剂R1 124μL和R2 30μL，加入酶标仪混匀后，检测反应情况，筛选出酶活高于野生型对照的突变体。详细数据见表1。

表1经过高通量筛选后获得的活性提高的突变体的酶活，WT为野生型

实施例3 稳定性检测

将B板中的突变体筛选出5个在酶活和稳定性都提高的突变体，将突变体单克隆送测序公司测序，氨基酸序列见表3中的SEQ ID NO.3 - SEQ ID NO.7。

实施例4 SAHH突变体基因 DNA 改组突变库的构建和筛选

4.1以筛选到的SAHH突变体质粒为模板，扩增引物：

5’-GTGAGCGGATAACAATTCCC-3’,

5’-CCTCAAGACCCGTTTAGAGG-3’

分别扩增各突变体基因，反应条件为：94°C 预变性 4 min，94°C变性30s，60°C退火30s和72°C延伸2min，共25个循环，0.8%琼脂糖电泳，试剂盒回收纯化目的基因。 按照Stemmer的方法，DNase I 将获得的DNA目的基因片段处理适当时间，回收50~150b的小片段(Stemmer,1994 Proceedings of the National Academy of Science of the UnitedStates of America 91(22), 10747-10751)。 经过无引物PCR和有引物PCR，所用引物为

F：5’-ACACATGTCTGACAAGTTGCCATACAAG

R：5’-CCGCTCGAGTCAGTATCTGTAGTGGTCTG

得到重组后的全长目的基因。DNA改组突变文库的构建方法同实施例1，获得超过10⁵个克隆的突变体库。

4.2 DNA改组突变库的筛选

筛选正突变以易错 PCR 中获得的酶活及稳定性最高的突变体NO.5为参照，操作步骤参见实施例2。

4.3 突变体稳定性的测定

参见实施例3，详细数据见表2。

表2活性提高的阳性突变体的稳定性的测定，WT为野生型

通过上述实验分析可以发现，相比野生型SAHH，本发明的15个突变体活性有明显变化，从25%到200%变化各自不一样，其中NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7有明显提高，分别提高了1.44倍、1.28倍、2.01倍、1.37倍和1.16倍，稳定性表现也非常好，分别达到了88%、80%、93%、90%和82%（野生型稳定性达到85%）。显示出在Hcy检测试剂中降低生产成本，延长保质期的价值。

本发明是将编码SAHH的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成，相对比于野生菌来源的序列，优化后的基因序列更有利于在大肠杆菌中表达，表达量高而且重组质粒稳定，重复性好且不宜丢失。

本发明直接利用His标签进行亲和纯化，对比用离子交换和疏水层析纯化，亲和纯化步骤操作更为简单，工艺重复性好且易于控制，纯化得到的蛋白纯度更高。

一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，核酸为编码权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸。

一种表达载体，包含上述实施例中所述的核酸的表达载体，本发明优选的pET系列的载体，带有T7启动子，T7表达系统可使用强力的噬菌体T7启动子进行高水平表达。它非常适用于在大肠杆菌中表达可溶的无毒性重组蛋白质。本发明得到的pET- 28a-SAHH在进行表达时得到了明显的高水平表达，平均每g离心后的菌体中蛋白的产量经过纯化可得到至少约40mg的纯度高达至少95%以上的目的蛋白。

一种宿主细胞，宿主细胞中含有的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体相对于野生型HMT的活性和稳定性都得到了显著提高。宿主细胞为原核细胞，优选为大肠杆菌细胞，进一步优选大肠杆菌BL21（DE3）细胞，其特点是T7 RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，非常适用于T7、T7Lac启动子的表达系统，如pET、pEASY等。本发明优选了pET- 28a系列的表达载体，配对BL21（DE3）表达细胞，非常利于SAHH蛋白的可溶性高表达量的表达。

本发明直接采用Hcy检测试剂盒的原理，经过组合后反过来检测SAHH的活性，使得该酶在Hcy试剂盒中活性高低变化对试剂盒的影响更为直接，这样会避免单纯的酶活性检测和酶在试剂盒中活性检测的不一致的问题，简单说，试剂盒成分复杂，简单酶活性检测说明酶活性高了是不能直接说明在试剂盒中实际运用时候就一定能提高整个试剂盒的活性的。

表3 SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.17的序列表

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体，其特征在于，所述的突变体为在野生型SAHH序列SEQ ID NO .1的基础上包含下列任意一种氨基酸位点的突变：

M38H和K204D氨基酸位点的突变；

Y110F和V316A氨基酸位点的突变；

E65D和P176A氨基酸位点的突变；

T84S、T276S和V316A氨基酸位点的突变；

N27A、L45I、N126D和A368V氨基酸位点的突变。

2.一种编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸，其特征在于，所述核酸为编码权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的核酸。

3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列的载体，带有T7启动子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3或4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。

9.权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的突变体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1 首先将编码SAHH的核酸序列按照大肠杆菌密码子偏好进行优化并合成；

S2 采用易错PCR方法、DNA改组（shuffling）技术对其进行随机突变，以pET-28a(+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主E. coli BL21（DE3）中，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白；

S3 离心后细胞反复冻融5次，加入缓冲液重悬后，离心取适量上清液加入不含SAHH的HCY检测试剂中进行酶活测定；

S4将筛选得到的活性高于对照的菌株，测序获得突变体 DNA 序列信息；

S5 筛选获得活性提高的突变体，获得SAHH突变体。