CN111172129A - 一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用 - Google Patents

一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29DNA聚合酶突变体及其应用，突变体由SEQ ID NO.1所示的Phi29DNA聚合酶中氨基酸突变形成，具体氨基酸突变方式为：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I和K512V。本发明的Phi29DNA聚合酶突变体具有9个突变位点，可长期存放于室温条件，与野生型相比，该突变体在DNA扩增反应中具有弱偏好性和更高的反应速率。本发明的Phi29DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用，可以催化多重置换扩增，催化滚环复制反应；制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。

Description

一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶 突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体，及其在DNA扩增中的应用。
背景技术
Phi29 DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌噬菌体phi29(Φ29)的执行基因组复制功能的DNA聚合酶，属于真核DNA聚合酶家族B。这种聚合酶具有特殊的链置换能力、出色的持续合成特性和保真性，因此被广泛应用于滚环复制和全基因组的多重置换扩增。然而，该酶的最适温度在30℃，热稳定性较差，限制了酶的存储期限和在有高温需求的扩增反应中的应用。此外，由于G/C在低温下会影响复制速率，在高温下进行基因组的多重置换扩增通常可以提高DNA产率和扩增均一性。目前已有多个公开报道针对该酶稳定性的工作，主要通过定向进化和构建嵌合体蛋白的手段；所以开发一种新型的稳定性高的、扩增性能好的Phi29DNA聚合酶突变体十分重要。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种全新的Phi29 DNA聚合酶突变体，该新型全新的Phi29 DNA聚合酶突变体，解决了现有Phi29 DNA聚合酶热稳定性较差，提高酶的存储期限和在有高温需求的扩增反应中的应用；此外，克服了由于G/C在低温下会影响复制速率，在高温下进行基因组的多重置换扩增通常可以提高DNA产率和扩增均一性；是一种热稳定高、扩增均一性好和扩增效率高的Phi29 DNA聚合酶。
本发明还提供了Phi29 DNA聚合酶突变体的制备过程和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体，所述突变体由SEQ ID NO.1所示的Phi29 DNA聚合酶中氨基酸突变形成，具体氨基酸突变方式为：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I和K512V。
其中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的Phi29 DNA聚合酶突变体热定性、扩增均一性、扩增效率高于野生型Phi29DNA聚合酶突变体。
本发明所述的Phi29 DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
SEQ ID NO.1
MKHMPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIK
SEQ ID NO.2
MKHMPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRDGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKAFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKLVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISFLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGLVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTLMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFIRAKYLRQKTYIQIIYMKEVDGVLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIK
注：斜体的为突变的氨基酸
SEQ ID NO.3
ATGAAACACATGCCTCGCAAAATGTATAGCTGCGATTTTGAAACCACCACCAAAGTTGAAGATTGTCGTGTTTGGGCATATGGCTATATGAACATTGAAGATCACAGCGAGTATAAGATTGGCAATAGCCTGGATGAATTTATGGCATGGGTTCTGAAAGTTCAGGCCGATCTGTATTTTCACAACCTGAAATTTGATGGTGCCTTCATTATTAACTGGCTGGAACGTAATGGCTTTAAATGGTCAGCAGATGGTCTGCCGAATACCTATAACACCATTATTAGCCGTGATGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGCCTGGGTTATAAAGGCAAACGCAAAATTCATACCGTGATCTATGACAGCCTGAAAAAACTGCCGTTTCCGGTGAAAAAAATCGCCAAAGATTTCAAACTGACCGTGCTGAAAGGCGATATCGATTATCACAAAGAACGTCCGGTTGGCTACAAAATTACACCGGAAGAATATGCCTACATCAAGAACGATATTCAGATTATTGCAGAAGCCCTGCTGATCCAGTTCAAACAAGGTCTGGATCGTATGACCGCAGGTAGCGATAGCCTGAAAGCATTTAAAGATATCATCACCACCAAGAAATTCAAAAAGGTGTTTCCGACACTGAGCCTGGGTTTAGATAAACTGGTTCGTTATGCATATCGCGGTGGTTTTACCTGGCTGAATGATCGCTTTAAAGAAAAAGAAATTGGCGAAGGCATGGTGTTTGATGTGAATAGCCTGTATCCGGCACAGATGTATAGCCGTCTGCTGCCGTATGGTGAACCGATTGTTTTTGAAGGTAAATACGTGTGGGATGAAGATTATCCGCTGCATATTCAGCATATTCGTTGCGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATCAAACGTAGCCGCTTCTATAAAGGTAACGAGTATCTGAAAAGCAGCGGTGGTGAAATTGCAGATCTGTGGCTGAGCAATGTTGATCTGGAACTGATGAAAGAACACTACGATCTGTACAACGTGGAATATATCAGCTTCCTGAAGTTTAAAGCAACCACCGGTCTGTTTAAAGACTTCATTGATAAATGGACCTATATCAAGACCACCAGTGAAGGTGCAATTAAACAGCTGGCAAAACTGATGCTGAATTCCCTGTATGGTAAATTTGCAAGCAATCCGGATGTTACCGGTCTGGTTCCTTATCTGAAAGAAAATGGTGCACTGGGTTTTCGTCTGGGTGAAGAAGAAACCAAAGATCCGGTTTATACCCTGATGGGTGTGTTTATTACCGCATGGGCACGTTATACCACCATTACCGCAGCACAGGCATGTTATGACCGTATTATCTATTGTGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAATTCCGGATGTGATCAAAGATATTGTGGACCCGAAAAAACTTGGCTATTGGGCACATGAAAGCACCTTTATTCGTGCAAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATCCAGATCATCTATATGAAAGAGGTTGACGGCGTTCTGGTTGAAGGTAGTCCGGATGATTACACCGATATCAAATTTAGCGTTAAATGTGCCGGTATGACCGATAAGATCAAAAAAGAAGTGACCTTCGAGAACTTCAAAGTGGGTTTTAGCCGTAAAATGAAACCGAAACCGGTTCAGGTTCCTGGTGGTGTTGTTCTGGTGGATGATACATTTACCATTAAA
一种包含本发明所述的核苷酸序列的重组载体。
本发明所述提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
通过全序列合成方法合成如SEQ ID NO.2所示的Phi29 DNA聚合酶突变体的氨基酸序列相应DNA序列(如SEQ ID NO.3)，具体为下述的9个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I和K512V；利用合成的DNA片段构建重组大肠杆菌制备蛋白并纯化。
本发明所述的提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体在DNA扩增中的应用。
本发明所述的提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体在制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒中的应用。
本发明所述的Phi29 DNA聚合酶突变体、或权利要求4所述的核苷酸序列、或者权利要求5所述的重组载体在生物技术领域中的应用。
进一步地，所述应用为在PCR领域中的应用。
本发明对野生型Phi29 DNA聚合酶预测分析潜在的影响热稳定性的氨基酸突变位点，并与NCBI中嗜热菌来源的同家族酶的热突变数据集比对，获得了17个位点的热稳定定向突变预测，最终在实验测试中获得了一种包含9个突变位点的提高了热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体。
本发明提供的Phi29 DNA聚合酶突变体具体包含：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I和K512V。本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体的核酸序列通过合成获得，蛋白质通过重组大肠杆菌发酵制备，并通过金属亲和层析和离子交换层析纯化。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体具有出色的热稳定性。在4℃放置在第5周酶活保留率为91.4％，在室温下第2.5周酶活保留率为90.2％。在50℃反应条件下，该蛋白在5小时后仍可以保持90％以上的活力。
本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体的扩增均一性具体为：在单细胞全基因组的多重链置换反应中，该酶的在0.6X测序量条件下扩增全基因组覆盖率为60％-75％，同时野生型为55-65％。在非整倍体检测中可将精度提高至0.8M，同时野生型为4M。
本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体的高扩增效率具体为：在相同底物的条件下，该突变体蛋白在45℃下2h扩增产量是野生型酶在30℃下扩增产量的2.4-5.2倍。
本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体具有9个突变位点，可长期存放于室温条件，与野生型相比，该突变体在DNA扩增反应中具更均一的扩增性质和更高的反应速率。本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用，可以催化多重置换扩增，催化滚环复制反应；制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。
附图说明
图1为本发明突变体SDS-PAGE的蛋白电泳图；
图2为本发明突变体的储存性能示意图；
图3为本发明突变体在不同温度下的稳定性示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明实施例中的原料和试剂均市售可得，序列由上海生工合成。
其中pET28a载体购于Invitrogen、限制性内切酶购于上海生工、宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)购于Invitrogen。
实施例1
Phi29 DNA聚合酶突变体的制备
1)根据Phi29 DNA聚合酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.2和大肠杆菌密码子偏好性合成突变体核酸序列SEQ ID NO.3，插入pET28a载体的NcoⅠ和SalⅠ位点之间，保留C端Histag，得到重组质粒。
2)将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)(Thermo)，得到重组工程菌。
3)按体积比2％的接种量将过夜活化的重组工程菌发酵液分别转接到3瓶40mL LB液体培养基中，37℃摇床180rpm培养2h，此时OD600在0.5左右，超净台加入IPTG 100μL/瓶，摇床30℃，180rpm培养24h。
4)离心收获菌体，超声破碎。
5)使用Ni-NTA纯化柱纯化；使用30mM咪唑溶液洗脱。
6)使用强阴离子交换柱纯化，去除可扩增的DNA杂质；纯化后得到Phi29DNA聚合酶。将获得的Phi29 DNA聚合酶突变体使用SDS-PAGE验证分子量，与理论值(66.7kD)一致，如图1所示，证明收获蛋白质为目的蛋白质分子。
实施例2
Phi29 DNA聚合酶突变体的热稳定性测试
1)根据Phi29 DNA聚合酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.2和大肠杆菌密码子偏好性合成突变体核酸序列SEQ ID NO.3，插入pET28a载体的NcoⅠ和SalⅠ位点之间，保留C端Histag，得到重组质粒。
2)将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)(Thermo)，得到重组工程菌。
3)按体积比2％的接种量将过夜活化的重组工程菌发酵液分别转接到3瓶40mL LB液体培养基中，37℃摇床180rpm培养2h，此时OD600在0.5左右，超净台加入IPTG 100μL/瓶，摇床30℃，180rpm培养24h。
4)离心收获菌体，超声破碎。
5)使用Ni-NTA纯化柱纯化；使用30mM咪唑溶液洗脱。
6)使用强阴离子交换株纯化，去除可扩增的DNA杂质。
7)使用超滤管超滤，将溶液置换为50mM Tris-HCl(pH7.5)；100mM KCl；1mM DTT；50％(g/mL)Glycerol.稀释至1μgPhi29 DNA聚合酶突变体/mL，得到酶制剂。
8)将7)中酶制剂分别置于4℃、室温、40℃、45℃、50℃；每12h从4℃、室温存放的酶制剂取样；每1h从40℃、45℃、50℃存放的酶制剂取样。
9)取8)中获得的酶制剂样品用于活性测试，步骤如下：
a、将40μL反应体系(预变性的人类体细胞系单细胞DNA模板约10pg，2μL从(8)中获得的酶液，终浓度为50μM 6N随机引物，20μL 2X buffer：95mM Tris-HCl(pH7.5)；20mMMgCl2·6H2O；190mM KCl；2mM DTT)使用PCR仪运行如下程序：30℃2h，热盖温度设置为65℃。
b、使用Qubit Fluorometer 4.0检测反应啊a中产物中DNB(DNA Nano ball)浓度；如图2和图3。酶活保留率＝测试样本DNB/0h样本DNB。结果表明本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体具有出色的热稳定性。在4℃放置在第5周酶活保留率为91.4％，在室温下第2.5周酶活保留率为90.2％。在50℃反应条件下，该蛋白在5小时后仍可以保持90％以上的活力。
实施例3
运用Phi29 DNA聚合酶突变体进行单细胞非整倍体检测
1)根据Phi29 DNA聚合酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.2和大肠杆菌密码子偏好性合成突变体核酸序列SEQ ID NO.3，插入pET28a载体的NcoⅠ和SalⅠ位点之间，保留C端Histag，得到重组质粒。
2)将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)(Thermo)，得到重组工程菌。
3)按体积比2％的接种量将过夜活化的重组工程菌发酵液分别转接到3瓶40mL液体培养基中，37℃摇床180rpm培养2h，此时OD600在0.5左右，超净台加入IPTG 100μL/瓶，摇床30℃，180rpm培养24h。
4)离心收获菌体，超声破碎。
5)使用Ni-NTA纯化柱纯化；使用30mM咪唑溶液洗脱。
6)使用强阴离子交换株纯化，去除可扩增的DNA杂质。
7)使用超滤管超滤，将溶液置换为50mM Tris-HCl(pH7.5)；100mM KCl；1mM DTT；50％(g/mL)Glycerol.稀释至1μgPhi29 DNA聚合酶突变体/mL，得到酶制剂。
8)将40μL反应体系(预变性的人类体细胞系单细胞DNA模板(已知9号染色体片段缺失)约10pg，2μL从(7)中获得的酶液，终浓度为50μM 6N随机引物，20μL 2X buffer：95mMTris-HCl(pH7.5)；20mM MgCl2·6H2O；190mM KCl；2mM DTT)使用PCR仪运行如下程序：40℃2h，热盖温度设置为65℃。
9)使用V*公司相应产品试剂盒N603作为野生型Phi29 DNA聚合酶对照，反应体系50μL(预变性的单细胞DNA模板(已知9号染色体片段缺失)约10pg；8μL H2O；30μLBuffer，2μL Mix)使用PCR仪运行如下程序：30℃2h，热盖温度设置为65℃。
10)将8)和9)反应产物分别使用Vazyme#TD502建库，使用Illumina HiSeq X10进行PE250测序。获得2Gb clean data，使用BWA将测序数据于参考序列比对，分析非整倍体和覆盖率、离散度(扩增均一性)。如表3。结果表明相较于野生型，发明的Phi29 DNA聚合酶突变体具有更高的DNA产率和扩增均一性，可以提高片段缺失定位精度。
表3 突变体与野生型Phi29 DNA聚合酶在单细胞非整倍体检测中的应用
Figure BDA0002300617560000071
实施例4
运用Phi29 DNA聚合酶突变体进行单细胞BRCA1基因单碱基突变的检测
1)根据Phi29 DNA聚合酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.2和大肠杆菌密码子偏好性合成突变体核酸序列SEQ ID NO.3，插入pET28a载体的NcoⅠ和SalⅠ位点之间，保留C端Histag，得到重组质粒。
2)将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)(Thermo)，得到重组工程菌。
3)按体积比2％的接种量将过夜活化的重组工程菌发酵液分别转接到3瓶40mL液体培养基中，37℃摇床180rpm培养2h，此时OD600在0.5左右，超净台加入IPTG 100μL/瓶，摇床30℃，180rpm培养24h。
4)离心收获菌体，超声破碎。
5)使用Ni-NTA纯化柱纯化；使用30mM咪唑溶液洗脱。
6)使用强阴离子交换株纯化，去除可扩增的DNA杂质。
7)使用超滤管超滤，将溶液置换为50mM Tris-HCl(pH7.5)；100mM KCl；1mM DTT；50％(g/mL)Glycerol.稀释至1μgPhi29 DNA聚合酶突变体/mL，得到酶制剂。
8)将40μL反应体系(预变性的人类体细胞系单细胞DNA模板(13号携带致病G32915312T)约10pg，2μL从(7)中获得的酶液，终浓度为50μM 6N随机引物，20μL 2Xbuffer：95mM Tris-HCl(pH7.5)；20mM MgCl2·6H2O；190mM KCl；2mM DTT)使用PCR仪运行如下程序：40℃2h，热盖温度设置为65℃。
9)将8)反应产物使用Vazyme#TD502建库，使用Illumina HiSeq X10进行PE250测序。获得200M clean data，使用BWA与参考基因组hg19比对，使用GATK进行SNP calling；确证扩增产物包含突变G32915312T。结果表明本发明的Phi29 DNA聚合酶突变体具有诊断单细胞SNP的能力，用于诊断肿瘤和胚胎发生单碱基突变造成的疾病。
序列表
<110> 顶检医学检验（南京）有限公司
<120> 一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys
565 570 575
<210> 2
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Asp Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Asp Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Ala Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Leu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Phe Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Leu Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Leu Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Ile Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Ile Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Val
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys
565 570 575
<210> 3
<211> 1725
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaacaca tgcctcgcaa aatgtatagc tgcgattttg aaaccaccac caaagttgaa 60
gattgtcgtg tttgggcata tggctatatg aacattgaag atcacagcga gtataagatt 120
ggcaatagcc tggatgaatt tatggcatgg gttctgaaag ttcaggccga tctgtatttt 180
cacaacctga aatttgatgg tgccttcatt attaactggc tggaacgtaa tggctttaaa 240
tggtcagcag atggtctgcc gaatacctat aacaccatta ttagccgtga tggccagtgg 300
tatatgattg atatttgcct gggttataaa ggcaaacgca aaattcatac cgtgatctat 360
gacagcctga aaaaactgcc gtttccggtg aaaaaaatcg ccaaagattt caaactgacc 420
gtgctgaaag gcgatatcga ttatcacaaa gaacgtccgg ttggctacaa aattacaccg 480
gaagaatatg cctacatcaa gaacgatatt cagattattg cagaagccct gctgatccag 540
ttcaaacaag gtctggatcg tatgaccgca ggtagcgata gcctgaaagc atttaaagat 600
atcatcacca ccaagaaatt caaaaaggtg tttccgacac tgagcctggg tttagataaa 660
ctggttcgtt atgcatatcg cggtggtttt acctggctga atgatcgctt taaagaaaaa 720
gaaattggcg aaggcatggt gtttgatgtg aatagcctgt atccggcaca gatgtatagc 780
cgtctgctgc cgtatggtga accgattgtt tttgaaggta aatacgtgtg ggatgaagat 840
tatccgctgc atattcagca tattcgttgc gaatttgaac tgaaagaagg ctatattccg 900
accattcaga tcaaacgtag ccgcttctat aaaggtaacg agtatctgaa aagcagcggt 960
ggtgaaattg cagatctgtg gctgagcaat gttgatctgg aactgatgaa agaacactac 1020
gatctgtaca acgtggaata tatcagcttc ctgaagttta aagcaaccac cggtctgttt 1080
aaagacttca ttgataaatg gacctatatc aagaccacca gtgaaggtgc aattaaacag 1140
ctggcaaaac tgatgctgaa ttccctgtat ggtaaatttg caagcaatcc ggatgttacc 1200
ggtctggttc cttatctgaa agaaaatggt gcactgggtt ttcgtctggg tgaagaagaa 1260
accaaagatc cggtttatac cctgatgggt gtgtttatta ccgcatgggc acgttatacc 1320
accattaccg cagcacaggc atgttatgac cgtattatct attgtgatac cgatagcatt 1380
catctgaccg gcaccgaaat tccggatgtg atcaaagata ttgtggaccc gaaaaaactt 1440
ggctattggg cacatgaaag cacctttatt cgtgcaaaat atctgcgcca gaaaacctat 1500
atccagatca tctatatgaa agaggttgac ggcgttctgg ttgaaggtag tccggatgat 1560
tacaccgata tcaaatttag cgttaaatgt gccggtatga ccgataagat caaaaaagaa 1620
gtgaccttcg agaacttcaa agtgggtttt agccgtaaaa tgaaaccgaa accggttcag 1680
gttcctggtg gtgttgttct ggtggatgat acatttacca ttaaa 1725

Claims (10)

1.一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述突变体由SEQ ID NO.1所示的Phi29 DNA聚合酶中氨基酸突变形成，具体氨基酸突变方式为：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I和K512V。
2.根据权利要求1所述的Phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的Phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Phi29 DNA聚合酶突变体热定性、扩增均一性、扩增效率高于野生型Phi29 DNA聚合酶突变体。
4.一种编码权利要求1-2任一所述的Phi29 DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。
5.一种包含权利要求3所述的核苷酸序列的重组载体。
6.一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
通过全序列合成方法合成如SEQ ID NO.2所示的Phi29 DNA聚合酶突变体的氨基酸序列相应DNA序列SEQ ID NO.3，具体为下述的9个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I，K512V；利用合成的DNA片段构建重组大肠杆菌制备蛋白并纯化。
7.一种权利要求1所述的提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体在DNA扩增中的应用。
8.一种权利要求1所述的提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体在制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒中的应用。
9.一种权利要求1所述的Phi29 DNA聚合酶突变体、或权利要求4所述的核苷酸序列、或者权利要求5所述的重组载体在生物技术领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在PCR领域中的应用。
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