CN109937252B

CN109937252B - 重组dna聚合酶

Info

Publication number: CN109937252B
Application number: CN201780069442.3A
Authority: CN
Inventors: 王林; 刘芬; 董宇亮; 章文蔚; 徐崇钧; 斯内扎娜·德马纳克
Original assignee: MGI Tech Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: US10883091B2; CN109937252A; EP3613851A4; WO2018126470A1; US20190330602A1; EP3613851A1

Abstract

提供一种重组DNA聚合酶，其为如下A)‑C)中任一种：A)所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408、409和485位氨基酸残基进行修饰，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；B)所示的蛋白为将A)所示蛋白的氨基酸序列C端的自末端起1‑29个氨基酸去除，保留其余氨基酸残基且具有DNA聚合酶活性的由A)衍生的蛋白质；C)所示的蛋白为将A)或B)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A)或B)衍生的蛋白质。

Description

重组DNA聚合酶

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组DNA聚合酶。

背景技术

DNA聚合酶快速而准确地复制在生物染色体中的DNA，对于维持生命体中遗传物质稳定性具有重要意义。基于与大肠杆菌聚合酶I、II和III的氨基酸序列差异，DNA聚合酶分为三个家族，分别称为A、B和C族。尽管在结构上A、B族聚合酶的核苷酸结合位点相似，但不同族聚合酶序列模体(motif)则有显著不同，并相应表现在对核苷酸及其类似物的识别机理上的差异。与其在生命体中功能紧密相关，DNA聚合酶在分子生物学技术中居于核心地位，尤其表现在分子克隆及PCR、定点突变和DNA测序方面。在这些分子生物学技术中，DNA聚合酶识别不同的核苷酸或核苷酸类似物及其与模板的互补性起到关键作用。

许多实际应用技术依赖于能够准确加入核苷酸或核苷酸类似物的DNA聚合酶。例如，在边合成边测序(SBS)中，加入经过荧光标记的核苷酸能够帮助识别模板DNA碱基，从而给出DNA序列信息。近年来，与其它测序方法相比，SBS测序方法以其通量高、价格低而获得青睐。在这一测序方法中，加入和检测人工修饰的核苷酸或核苷酸类似物，如带有荧光标记的可逆终止子(reversible terminator)的DNA聚合酶起到关键性作用。在DNA聚合反应中，已有聚合酶对人工修饰的核苷酸或核苷酸类似物的聚合能力不足经常成为限制性因素，鉴于此，增进聚合酶对人工修饰的核苷酸或核苷酸类似物的聚合效能成为这类测序方法的重要一步。

发明公开

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，是如下A)-D)中任一种：

A)所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408、409和485位氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；

B)所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408、409和485位氨基酸残基进行修饰，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；

C)所示的蛋白为将A)或B)所示蛋白的氨基酸序列C端的自末端起1-29个氨基酸去除(包括第29个氨基酸)，保留其余氨基酸残基且具有DNA聚合酶活性的由A)衍生的蛋白质；

D)所示的蛋白为将A)或B)或C)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A)或B)或C)衍生的蛋白质。

上述蛋白质中，

B)所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408、409和485位氨基酸残基进行修饰，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少2位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。

上述蛋白质中，

B)所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408、409和485位氨基酸残基进行修饰，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少3位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。

上述蛋白质中，所述修饰为氨基酸置换。

上述蛋白质中，

第408位的亮氨酸置换为异亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸；

第409位的酪氨酸置换为丙氨酸或甘氨酸；

第485位的丙氨酸置换为组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；

第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少一位的氨基酸残基置换为甲硫氨酸或苯丙氨酸或丙氨酸。

上述蛋白质中，

所述第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少一位的氨基酸残基置换为甲硫氨酸或苯丙氨酸或丙氨酸为如下：

第53位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第59位的组氨酸置换为苯丙氨酸；

第199位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第243位的精氨酸置换为甲硫氨酸；

第526位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第558位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第613位的精氨酸置换为甲硫氨酸；

第641位的精氨酸置换为甲硫氨酸；

第671位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第673位的酪氨酸置换为苯丙氨酸；

第674位的赖氨酸置换为丙氨酸；

第692位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第709位的精氨酸置换为甲硫氨酸。

上述蛋白质中，

所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列为序列1。

上述蛋白质中，

所述蛋白质的对生物芯片的吸附能力低于所述野生型KOD型DNA聚合酶。

上述蛋白质中，

所述蛋白质的对生物芯片的吸附能力低于所述野生型KOD型DNA聚合酶体现在与所述野生型KOD型DNA聚合酶相比，所述蛋白质不易吸附于生物芯片表面和/或易于从生物芯片表面洗脱。

编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围；

或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。

上述蛋白或上述DNA分子或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备DNA聚合酶中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述DNA聚合酶的对生物芯片的吸附能力低于所述野生型KOD型DNA聚合酶；

或，所述DNA聚合酶的对生物芯片的吸附能力低于所述野生型KOD型DNA聚合酶体现在与所述野生型KOD型DNA聚合酶相比，所述DNA聚合酶不易吸附于生物芯片表面和/或易于从生物芯片表面洗脱。

上述蛋白或上述DNA分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞在测序中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白或上述DNA分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞在制备用于测序的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述产品为试剂盒。

上述蛋白质中，所述蛋白作为DNA聚合酶的作用底物为核苷酸或核苷酸类似物；

上述蛋白质中，所述蛋白作为DNA聚合酶的模板为单链DNA；

上述应用中，所述DNA聚合酶的底物为核苷酸或核苷酸类似物。

上述应用中，所述DNA聚合酶的模板为单链DNA。

上述应用中，所述DNA聚合酶具有如下特征：以单链DNA为模板时聚合活性高和/或对生物芯片吸附力低。

上述应用中，所述以单链DNA为模板时聚合活性高体现在以单链DNA为模板时所述蛋白的聚合活性高于所述KOD型DNA聚合酶；

上述应用中，所述聚合反应在生物芯片上进行。

上述生物芯片为所有的本领域常用的生物芯片。

上述应用中，所述产品为试剂盒。

上述蛋白为KOD型DNA聚合酶突变体蛋白，具体为如下：

KOD型DNA聚合酶点突变体：Ue1A、Ue1B、Ue1C、Ue1D、Ue1E、Ue2A、Ue2B、Ue2C、Ue2D、Ue2E、Ue3A、Ue3B、Ue3C、Ue3D、Ue3E、Ue4A、Ue4B、Ue4C、Ue1A5、Ue1A6、Ue1B5、Ue1B6、Ue1C5、Ue1C6、Ue1D5、Ue1D6、Ue1E5、Ue1E6、Ue2A5、Ue2A6、Ue2B5、Ue2B6、Ue2C5、Ue2C6、Ue2D5、Ue2D6、Ue2E5、Ue2E6、Ue3A5、Ue3A6、Ue3B5、Ue3B6、Ue3C5、Ue3C6、Ue3D5、Ue3D6、Ue3E5、Ue3E6、Ue4A5、Ue4A6、Ue4B5、Ue4B6、Ue4C5、Ue4C6

或C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体，其为上述KOD型DNA聚合酶点突变体除去自C末端起29个氨基酸，剩余氨基酸残基组成的区段。

本发明以对自然界已有及经过人工改造的DNA聚合酶的三维结构及序列信息分别进行动力学模拟与统计推断为基础，通过半理性设计、酶变体库构建和高通量筛选达到改善聚合酶的催化及理化特性，发现突变KOD型DNA聚合酶野生型部分位点，可以实现DNA聚合酶突变体不易被吸附于芯片表面、易于从芯片表面洗脱，这些突变体为适合于在附着于芯片表面的DNA测序工作的DNA聚合酶。

附图说明

图1为对纯化后的野生型KOD型DNA聚合酶纯度检测电泳结果。

图2为对KOD型DNA聚合酶突变体Ue1E、Ue1E5、Ue1E6和野生型KOD聚合酶KOD-WT以单链DNA为底物的米氏动力学曲线图。

图3为KOD型DNA聚合酶突变体Ue1E5和野生型KOD聚合酶芯片活性测试的芯片反应亮点图。

图4为KOD型DNA聚合酶突变体Ue1E5和对照组Therminator芯片洗脱测试的芯片反应亮点图。

实施发明的最佳方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、野生型KOD型DNA聚合酶及其突变体的制备

本发明将野生型KOD型DNA聚合酶及其突变体均采用DNA 2.0的Electra^TMCloningReagents Kit试剂盒进行表达载体的构建，利用His标签进行Ni柱亲和纯化。

一、野生型KOD型DNA聚合酶的制备

野生型KOD型DNA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列1，其编码基因phaP的核苷酸序列为序列表中序列2。

1、重组表达载体pD441-WT的构建

重组表达载体pD441-WT为将融合his标签的野生型KOD型DNA聚合酶编码基因按Electra^TMCloning Reagents Kit(DNA2.0,EKT-02)试剂盒说明书操作步骤重组到载体pD441-pelB(DNA2.0,pD441-pelB)上，得到的载体，融合His标签的野生型KOD型DNA聚合酶编码基因，通过载体pD441-pelB上的信号肽引导表达。

融合His标签的野生型KOD型DNA聚合酶编码基因的核苷酸序列为在序列2的3’端连接有6个His标签密码子得到的序列。

野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白的氨基酸序列为将序列1所示的氨基酸的C端连接6个His标签得到。

2、重组菌的构建

将重组表达载体pD441-WT导入大肠杆菌BL21感受态细胞(购自全式金生物科技有限公司)中，涂抹抗性平板(含卡那50μg/ml)筛选阳性菌落。挑选3-5个阳性菌落，利用引物SQF(序列表中序列3)和引物SQR(序列表中序列4)对阳性菌落进行菌液PCR鉴定。得到与预计的理论值基本一致的2800bp大小的片段为阳性克隆，将该阳性克隆命名为BL21/pD441-WT。

3、野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白的表达和纯化

挑取BL21/pD441-WT单菌落，于50ml LB液体培养集中(含卡那50μg/ml)中，37℃，220rpm/min，过夜培养。次日按1:100稀释量，转接于1000mlLB液体培养基中(含卡那50μg/ml)，37℃，220rpm/min振荡培养至OD600为0.5-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃过夜诱导培养，收集诱导后BL21/pD441-WT菌液。同时设不加IPTG作为空白对照，收集未诱导BL21/pD441-WT菌液。

将上述诱导后BL21/pD441-WT菌液，转速为8000rpm/min离心10min，弃上清，收集沉淀菌体，重悬菌体细胞于buffer 1(50mMKPO₄，500mM NaCl，10mM imidazole，5％Glycerol，PH 7.0)中，另加入PMSF(终浓度0.5mM)、Triton X-100(终浓度0.5％)、Lysozyme(终浓度0.25％)，后室温孵育30min，12000rpm/min、4℃离心30min，冰浴，超声破碎细胞；以12000rpm/min的转速离心30min，将离心所得上清液于75℃水浴20min，期间注意定时混匀，使受热均匀；12000rpm/min，4℃离心30min，将上清液用0.22um滤膜过滤，即为融合蛋白粗提物。

将融合蛋白粗提物以适当流速上样进行Ni柱亲和层析(亲和层析预装柱HisTrapFF，5ml，17-5255-01，GE healthcare)，上样后利用buffer1平衡5CV；3％buffer 2(50mMKPO₄，1M NaCl，5％Glycerol，PH 7.0)洗脱5CV；50％buffer 2洗脱5CV，收集大于等于100mAU峰值对应的Ni柱亲和层析洗脱液。

将大于等于100mAU峰值对应的洗脱液按一定的流速上样进行离子交换层析(离子交换预装柱HiTrap Q HP，5ml，17-1154-01，GE healthcare)，上样后利用buffer2平衡5CV，0％buffer 2→60％buffer 2线性洗脱，收集大于等于100mAU峰值对应的离子交换层析洗脱液。

将大于等于100mAU峰值对应的离子交换层析洗脱液进行凝胶层析(凝胶层析预装柱HiPrep Sephacryl S-100HR，26mm，17-1194-01，GE healthcare)，先用20％乙醇洗3CV，水洗3CV，利用100％buffer 3(20mM Tris，200mMKCl，0.2mM EDTA，10％Glycerol，PH7.4)平衡3CV后上样，再用buffer 3洗脱1.5CV，收集洗脱液即为纯化后野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白。

检测纯化后野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白最终得率为40mg/L。

将纯化后野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白进行SDS-PAGE(浓缩胶为5％分离胶为12％)，结果如图1所示，1为蛋白Marker(PageRulerPrestained Protein Ladder，26616，Thermo Scientific)，2为10μl1mg/ml纯化后野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白+10μl 2x上样缓冲液，3为10μl稀释20倍后的0.05mg/ml纯化后野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白+10μl2x上样缓冲液；可以看出，泳道2和泳道3中蛋白大小约91.5KDa，与文献报道分子量一致。

对电泳后的蛋白胶利用Quantity one软件分析蛋白纯度，纯化后野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白纯度能达到95％或以上。

未诱导BL21/pD441-WT菌液未得到约91.5KDa大小的目的蛋白。

将空载体pD441-pelB导入大肠杆菌BL21中，得到BL21/pD441-pelB。采用上述方法进行表达和纯化蛋白，也未得到约91.5KDa大小的目的蛋白。

二、KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白的制备

KOD型DNA聚合酶点突变体为将KOD型DNA聚合酶的氨基酸序列(序列1)中第53、59、199、243、408、409、485、526、558、613、641、671、673、674、692和709位中至少三个氨基酸进行氨基酸置换，得到的蛋白，各突变体具体突变位置及方式如下：

Ue1A其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸；

Ue1B其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺；

Ue1C其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸；

Ue1D其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸；

Ue1E其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸；

Ue2A其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸；

Ue2B其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺；

Ue2C其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸；

Ue2D其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸；

Ue2E其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸；

Ue3A其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸；

Ue3B其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺；

Ue3C其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸；

Ue3D其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸；

Ue3E其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸

Ue4A其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丝氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸；

Ue4B其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丝氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺；

Ue4C其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变位丝氨酸，第409位酪氨酸突变位丙氨酸，第485为丙氨酸突变位赖氨酸；

Ue1A5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1A6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1B5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1B6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1C5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1C6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1D5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1D6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1E5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue1E6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2A5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2A6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2B5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2B6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2C5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2C6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2D5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2D6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2E5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue2E6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丙氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3A5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3A6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3B5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3B6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3C5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3C6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为赖氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3D5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3D6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3E5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue3E6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为缬氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue4A5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丝氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue4A6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丝氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为组氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue4B5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丝氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue4B6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为丝氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为天冬酰胺，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue4C5其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变位丝氨酸，第409位酪氨酸突变位丙氨酸，第485为丙氨酸突变位赖氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；

Ue4C6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变位丝氨酸，第409位酪氨酸突变位丙氨酸，第485为丙氨酸突变位赖氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸。

1、表达KOD型DNA聚合酶点突变体的重组载体的制备

表达不同KOD型DNA聚合酶点突变体的重组载体为将融合His标签的的不同KOD型DNA聚合酶点突变体蛋白编码基因重组到载体pD441-pelB上，得到的载体，融合His标签的不同点突变体蛋白编码基因，通过载体pD441-pelB上的信号肽引导表达。

每个KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的氨基酸序列为将序列A所示的KOD型DNA聚合酶点突变体的C端连接6个His标签得到的；序列A为序列1按的突变位置及突变方式进行相应的突变得到的序列。

融合His标签的不同KOD型DNA聚合酶点突变体蛋白编码基因的核苷酸序列为将序列B所示的不同KOD型DNA聚合酶点突变体蛋白编码基因的3‘端连接6个His标签密码子得到的；序列B为序列2按照上述各突变体的突变位置及突变方式进行相应的氨基酸密码子突变得到的序列。

如本领域人员所知，对于不同的酶，可在氨基酸序列的N端或C端加标签，以便于纯化，标签一般为表1所示的序列；加或不加标签对于酶的性能没有影响。

表1标签的序列

本发明实施例所用聚合酶突变体均为C端连接6个His标签的聚合酶突变体融合蛋白，如本领域人员所知，均可以替换为不加标签的聚合酶突变体。

2、重组菌的构建

与上述一中的2方法相同，将上述1制备的表达不同KOD型DNA聚合酶点突变体重组载体导入BL21中，得到表达不同KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的重组菌。

3、突变体的表达和纯化

与上述一野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白表达和纯化方法相同，将上述2制备的表达不同KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的重组菌进行表达纯化，得到不同的KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白。

采用上述一的2的检测不同的KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的纯度均得到能达到95％或以上。

三、C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白的制备

C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体为将上述二制备的KOD型DNA聚合酶点突变体的碳末端起29个氨基酸删除得到的突变体；具体为将点突变体Ue1A、Ue1B、Ue1C、Ue1D、Ue1E、Ue2A、Ue2B、Ue2C、Ue2D、Ue2E、Ue3A、Ue3B、Ue3C、Ue3D、Ue3E、Ue4A、Ue4B、Ue4C6碳端29个氨基酸删除得到的突变体△Ue1A、△Ue1B、△Ue1C、△Ue1D、△Ue1E、△Ue2A、△Ue2B、△Ue2C、△Ue2D、△Ue2E、△Ue3A、△Ue3B、ΔUe3C、ΔUe3D、ΔUe3E、ΔUe4A、ΔUe4B、ΔUe4C。

C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白为将C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体的C端连接6个His标签得到的。

制备方法同上述二。

实施例2、KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的性能检测

本实施例中的点突变体融合蛋白均按照上述实施例1中的方法表达纯化。

一、KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的聚合活性检测

聚合酶活性检测参照Nishioka,M.,et al.(2001.J.Biotechnol.88)文献方法进行，一个酶活单位定义为:单位酶在50μl的反应体系中于75°反应30min聚合10nmol dNTP生成酸不溶性物质所需的酶量。

反应液为：20mM Tris-HCl(pH7.5)，8mM MgCl₂，50μg/ml BSA，0.15mM each dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，[methyl-3H]-TTP(0.13mCi/nmol)，150mg/ml激活的小牛胸腺DNA,7.5mM DTT，1μL野生型KOD型DNA聚合酶(1mg/ml),总反应体积为50μl。

上述反应液于75°反应30min，后按酶活定义计算野生型KOD型DNA聚合酶的聚合活性为2U/μl。

以野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白及KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白为例，进行上述聚合反应。

KOD型DNA聚合酶点突变体为Ue1E；

KOD型DNA聚合酶点突变体Ue1E的氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，且将第409位酪氨酸突变为丙氨酸，且将第485位丙氨酸突变为谷氨酸；其编码基因核苷酸序列为将序列2第1222位核苷酸C突变为A、第1224位核苷酸G为突变为T，且将第1225为核苷酸T突变为G、第1226位核苷酸A突变为C、第1227位核苷酸T突变为A，且将第1454位核苷酸C突变为A。

融合蛋白为在各自突变体的C端加入6个his标签。

KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白Ue1E聚合酶活性结果如表2所示，可以看出，KOD型DNA聚合酶点突变体具有聚合酶活性。

表2为野生型及突变体Ue1E聚合酶活性

其他突变体的聚合活性结果类似。

二、KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白的单碱基掺入动力学

本实施例利用Cy3荧光染料标记的dATP(dATP-Cy3)和Cy5荧光染料标记的DNA模板(模板DNA-Cy5)，利用酶标仪检测KOD型DNA聚合酶突变体相对反应速率，近似描绘各突变体的米氏动力学曲线，具体实验方法如下：

将带有5’Cy5荧光标记的单链引物S1A(序列表中序列5)和S2A(序列表中序列6)与模板DNA(由金斯瑞公司合成，序列表中序列7)按1：1：1等摩尔浓度进行混合，按65℃ 1min、40℃ 1min、4℃ 10min退火，退火产物避光保存至-20℃，即得到Cy5荧光染料标记的模板DNA-Cy5。

使用BioTek酶标仪进行酶活检测，反应在384板(Corning black,clear bottom384 plates)中进行，反应液总体积50μl

反应体系为：2UKOD聚合酶突变体融合蛋白，1μM dATP-Cy3，10μMdTTP,10μM dCTP,10μM dGTP,模板DNA-Cy5按2、4、5、8、10、20、40、80nmol 8个浓度梯度进行实验，酶反应缓冲液为20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mM MgSO₄pH 8.8；反应温度为25℃。

酶反应以动力学检测模式，每分钟记录一次数据，检测条件为

反应完成后可直接导出数据表格或者酶活曲线，可近似计算其相对荧光值的反应速率。

对荧光值的反应速率的大小取决于模板DNA-Cy5的浓度，因此通过在不同浓度的模板DNA-Cy5条件下，检测KOD型DNA聚合酶突变体的活性可以近似确定其Km值即反应速率达到最大反应速率的一半时所对应的模板DNA浓度。

以野生型KOD型DNA聚合酶融合蛋白(KOD-WT)为对照。

KOD型DNA聚合酶点突变体为Ue1E、Ue1E5、Ue1E6，制备方法实施例1；

KOD型DNA聚合酶点突变体Ue1E5的氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第53位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第199位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第243位精氨酸突变位甲硫氨酸，第526位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第674位赖氨酸突变为丙氨酸，第709为精氨酸突变为甲硫氨酸；其编码基因核苷酸序列为将序列2第1222位核苷酸C突变为A、第1224位核苷酸G为突变为T，且将第1225为核苷酸T突变为G、第1226位核苷酸A突变为C、第1227位核苷酸T突变为A，且将第1454位核苷酸C突变为A，且将第158位核苷酸A突变为T、第159位核苷酸A突变为G，且将第596位核苷酸A突变T、第597位核苷酸突变为G，且将第727位核苷酸C突变为A、第728位核苷酸G突变为T、第729位核苷酸C突变为G，且将第1577位核苷酸A突变为T、第1578位核苷酸A突变为G，且将第2021位核苷酸A突变为T，且将第2125位核苷酸C突变为G、第2126位核苷酸G突变为T、第2127位核苷酸T突变为G。

KOD型DNA聚合酶点突变体Ue1E6其氨基酸序列为将序列1的第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，第59位组氨酸突变为苯丙氨酸，第558位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第613位精氨酸突变为甲硫氨酸，第641位精氨酸突变为甲硫氨酸，第671位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第673位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第692位赖氨酸突变为甲硫氨酸；其编码基因核苷酸序列为将序列2第1222位核苷酸C突变为A、第1224位核苷酸G为突变为T，且将第1225为核苷酸T突变为G、第1226位核苷酸A突变为C、第1227位核苷酸T突变为A，且将第1454位核苷酸C突变为A，且将第175位核苷酸C突变为T、第176位核苷酸A突变为T，且将第1673位核苷酸A突变为T、第1674位核苷酸A突变为G，且将第1837位核苷酸C突变为A、第1838位核苷酸G突变为T、第1839位核苷酸突变T为G，且将第1921位核苷酸C突变为A、1922位核苷酸G突变为T、1923位核苷酸T突变为G，且将第2012位核苷酸A突变为T、第2013位核苷酸A突变为G，且将第2018位核苷酸A突变为T，且将第2075位核苷酸A突变为T。

融合蛋白为在各自突变体的C端加入6个his标签。

Michaelis曲线如图2所示，可以看出，在以单链DNA为模板时，与野生型KOD聚合酶(KOD-WT)相比，突变体Ue1E、Ue1E5、Ue1E6相比表现出较好的聚合活性。

另外，本结果说明调整酶的Km值大小近似酶与DNA亲和力大小时，并未影响酶的聚合活性即催化反应效率，达到理想的突变修饰酶体的DNA结合亲和力而不影响其特定的催化性质。增大Km值有利于酶与DNA分子快速解离，从而可以在一定程度上加快反应完成，另一方面有利于酶从芯片表面的洗脱。

三、KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白Ue1E5芯片活性测试

本实验选取上述一种的KOD型DNA聚合酶突变体Ue1E5(相对于野生型氨基酸序列408、409、485、53、199、243、526、674、709位氨基酸突变为异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)进行测试实验。

将模板DNA(由金斯瑞公司合成，序列表中序列7)固定于生物芯片gencbio氨基基片(Gencbio，GCB01003)上，测试KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白Ue1E5在非水溶液中与模板DNA的反应，具体实验方法如下：

利用0.2M PH7.0的PB(0.2M NaH₂PO₄,0.2M Na₂HPO₄)缓冲液，清洗芯片，后进行模板DNA固定反应，加入适量浓度为30ng/μl模板DNA使其充满整张芯片，于室温反应15min，使带负电的模板DNA能充分固定在带正电的氨基化修饰的芯片表面,利用酶反应缓冲液(20mMTris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mM MgSO₄pH 8.8，反应温度25℃)清洗芯片，以除去多余模板DNA。再加入含2U突变体Ue1E5聚合酶、1μM dATP-Cy3、10μM dTTP,、10μM dCTP、10μMdGTP的酶反应液(酶反应缓冲液为0.2MPH7.0的PB)，使酶反应液充满整张芯片，于65℃反应15min，后以酶反应缓冲液清洗芯片两次，以除去多余未参与反应的dNTP。完成反应后，利用荧光显微镜按荧光标记物Cy3的检测条件(530nm激发波长、568nm发射波长)对芯片进行观察和拍照。对照组野生型的KOD聚合酶采用同样方法进行实验。

图中若亮点越多、越密集说明反应充分，另一方面则说明酶与固定在芯片上的模板DNA不仅发生了反应而且还表现出较好的聚合活性。

芯片反应结果如图3所示，其中A为野生型KOD聚合酶，B为突变体Ue1E5聚合酶，可以看出，图3A中芯片亮点很少，说明未经改造或突变的野生型KOD聚合酶与芯片表面的模板DNA反应时其活性较差或无活性；相反，图3B中芯片亮点多且密集，说明改造后的突变体Ue1E5与野生型相比在与芯片表面的模板DNA反应时其活性较好。

采用同样的方法检测KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白Ue1E、Ue1E6，结果与Ue1E5无显著差异，均具有较好的聚合活性。

融合蛋白为在各自突变体的C端加入6个his标签。

四、KOD型DNA聚合酶突变体Ue1E5芯片洗脱测试

在芯片反应中，上一轮反应残留物会干扰下一轮反应，且直接影响整张芯片的拍照效果，在实验中完成移除上一轮反应残留物是理想状态。

本实验以KOD型DNA聚合酶突变体Ue1E5为例进行KOD型DNA聚合酶芯片洗脱测试，同时以商业酶Therminator(TherminatorTMDNA Polymerase，NEB,M0261S)为对照进行实验。具体实验方法如下：

芯片前期处理及芯片活性反应与上述芯片活性测试实验方法相同。

完成拍照后，利用酶反应缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mM KCl、2mMMgSO₄pH 8.8@25℃)清洗芯片3-4次，后加入不含酶但包括dNTP和反应缓冲液的酶反应，于65℃反应15min，后以酶反应缓冲液清洗芯片两次，利用荧光显微镜按荧光标记物Cy3的检测条件(530nm激发波长、568nm发射波长)对芯片进行观察和拍照。

洗脱实验中，若图片亮点越多，说明有反应的发生即说明酶未洗脱干净，说明此酶不易洗脱。

实验结果如图4所示，其中A为空白对照即空白芯片，B为Therminator，C为聚合酶突变体融合蛋白Ue1E5，可以看出，图4A为空白芯片因而无反应，图片未见亮点；图4B为商业酶Therminator，其图片亮点与空白对照相比亮点较多；图4C为突变体Ue1E5，其与对照相比仍有少许亮点，但与Therminator相比明显少很多，说明本突变体洗脱效果好于Therminator，说明突变体易于洗脱，不易吸附芯片表面，不干扰后续实验。

野生型由于聚合活性差，无法进行洗脱实验，故以商业的Therminator为对照。

采用同样的方法检测KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白Ue1E6，结果与Ue1E5无显著差异，均比Therminator易于洗脱。

采用同样的方法其他KOD型DNA聚合酶突变体，也易于洗脱，不易吸附芯片表面。

实施例3、C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白的活性测试

融合蛋白为在各自突变体的C端加入6个his标签。

将实施例1的三制备的C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白△Ue1A、ΔUe1B、ΔUe1C、ΔUe1D、ΔUe1E、ΔUe2A、ΔUe2B、ΔUe2C、ΔUe2D、ΔUe2E、ΔUe3A、ΔUe3B、ΔUe3C、ΔUe3D、ΔUe3E、ΔUe4A、ΔUe4B和△Ue4C分别按照实施例2中的一检测聚合活性的方法和三中检测芯片活性的方法进行检测。

以KOD型DNA聚合酶点突变体融合蛋白Ue1A、Ue1B、Ue1C、Ue1D、Ue1E、Ue2A、Ue2B、Ue2C、Ue2D、Ue2E、Ue3A、Ue3B、Ue3C、Ue3D、Ue3E、Ue4A、Ue4B和Ue4C6为对照。

结果C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白△Ue1A、ΔUe1B、ΔUe1C、ΔUe1D、ΔUe1E、ΔUe2A、ΔUe2B、ΔUe2C、ΔUe2D、ΔUe2E、ΔUe3A、ΔUe3B、ΔUe3C、ΔUe3D、ΔUe3E、ΔUe4A、ΔUe4B和△Ue4C的结果与KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白Ue1A、Ue1B、Ue1C、Ue1D、Ue1E、Ue2A、Ue2B、Ue2C、Ue2D、Ue2E、Ue3A、Ue3B、Ue3C、Ue3D、Ue3E、Ue4A、Ue4B和Ue4C6无显著差异。

表明，C端29个氨基酸删除不影响聚合酶的活性。

采用实施例2的四的方法检测本实施例的C端截短型KOD型DNA聚合酶突变体融合蛋白，也易于洗脱，不易吸附芯片表面。

工业应用

本发明的实验证明，本发明制备的DNA聚合酶突变体，能够利用人工修饰的核苷酸或核苷酸类似物作为底物进行聚合反应，表现出较好的聚合活性及不易被吸附于芯片表面、易于从芯片表面洗脱，使之能够在每个反应循环中加入单个核苷酸或核苷酸类似物且易于洗脱而不对下一个测序循环造成干扰。

序列表

<110>深圳华大智造科技股份有限公司

<120>重组DNA聚合酶

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 774

<212> PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 1

Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile

35 40 45

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr

50 55 60

Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val

65 70 75 80

Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile

85 90 95

Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro

115 120 125

Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr

130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val

165 170 175

Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys

180 185 190

Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr

195 200 205

Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu

210 215 220

Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile

245 250 255

His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

260 265 270

Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu

275 280 285

Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn

290 295 300

Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu

340 345 350

Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala

355 360 365

Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr

370 375 380

Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile

385 390 395 400

Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His

405 410 415

Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp

420 425 430

Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe

435 440 445

Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys

450 455 460

Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp

465 470 475 480

Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr

485 490 495

Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser

500 505 510

Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile

515 520 525

Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe

530 535 540

Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala

545 550 555 560

Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu

565 570 575

Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys

580 585 590

Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu

595 600 605

Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala

610 615 620

Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val

625 630 635 640

Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro

645 650 655

Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp

660 665 670

Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala

675 680 685

Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu

690 695 700

Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe

705 710 715 720

Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln

725 730 735

Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys

740 745 750

Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp

755 760 765

Leu Lys Pro Lys Gly Thr

770

<210> 2

<211> 2322

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 2

atgattctgg acaccgatta catcaccgaa gatggcaagc cagttatccg cattttcaaa 60

aaagagaatg gtgaattcaa gatcgaatat gatcgtacct tcgagccgta cttctatgct 120

ctgctgaaag acgatagcgc gattgaggag gtcaagaaaa tcaccgcgga gcgtcacggt 180

acggttgtta ccgtgaaacg cgtggagaaa gtccagaaga aatttctggg tcgcccggtt 240

gaagtgtgga agctgtactt tacgcatccg caagatgttc cggcgattcg cgataagatt 300

cgtgagcacc cggcagtcat tgacatctac gagtatgaca ttccgttcgc caagcgttat 360

ctgatcgata agggtctggt cccgatggag ggtgacgaag aactgaagat gctggcgttc 420

gacatcgaaa ctctgtacca cgagggtgaa gagtttgccg agggtccgat cttgatgatt 480

tcctacgcgg acgaagaggg cgcacgtgtt atcacgtgga aaaatgttga tctgccgtat 540

gttgacgtcg taagcaccga gcgtgagatg atcaaacgtt ttctgcgcgt tgttaaagaa 600

aaagatcctg acgtgctgat cacctacaac ggtgacaatt tcgatttcgc gtacctgaag 660

aaacgttgcg aaaaactggg tattaacttc gcgctgggtc gcgatggctc tgaaccgaag 720

atccagcgca tgggtgatcg ttttgcggtc gaggtgaagg gtcgcattca tttcgacctg 780

tacccggtga ttcgtcgtac catcaacttg ccgacttaca ccctggaagc cgtctatgaa 840

gctgtatttg gtcaaccgaa agaaaaagtg tacgctgagg aaattacgac ggcgtgggaa 900

accggtgaga acctggagcg cgttgcacgt tattctatgg aggacgcgaa agttacctac 960

gaactgggta aagagttcct gccgatggag gcccaactgt cccgtctgat cggccaaagc 1020

ctgtgggacg ttagccgcag cagcaccggt aacttagttg aatggttctt gctgcgtaag 1080

gcatacgaac gcaatgagct ggcgccgaac aaaccggacg agaaagaatt ggcgcgtcgc 1140

cgccagagct atgagggtgg ttatgtcaaa gaaccggagc gcggcttgtg ggagaacatc 1200

gtctatttgg attttcgtag cctgtatccg agcatcatta tcacgcataa tgtgagcccg 1260

gatacgttga atcgtgaggg ctgtaaggaa tacgacgtgg cgcctcaggt tggccaccgt 1320

ttctgcaagg actttccggg ctttatcccg agcctgctgg gtgatttgct ggaggaacgt 1380

cagaaaatca agaagaagat gaaagcaacc attgatccga tcgagcgcaa attactggac 1440

taccgtcaac gtgcaatcaa gatcctggcg aattcgtatt atggttacta tggctacgcg 1500

cgtgcgcgct ggtattgcaa agagtgtgcc gagagcgtga ccgcttgggg tcgtgagtac 1560

attaccatga cgatcaaaga gattgaagag aaatacggct ttaaggttat ctatagcgac 1620

accgacggtt tctttgcaac tatccctggc gcagacgcag aaaccgttaa gaaaaaggca 1680

atggagtttc tgaagtatat caacgcgaag ttgccaggcg ccctggaact ggagtacgag 1740

ggcttctaca agcgtggctt tttcgtgacg aaaaagaaat acgctgttat tgatgaagag 1800

ggcaagatca cgacccgtgg cctggaaatt gtgcgccgtg attggagcga aattgcaaaa 1860

gaaacgcaag cgcgtgtgct ggaagcgctg ctgaaggacg gcgacgtcga aaaagctgtg 1920

cgtattgtta aagaggtcac cgagaagctg agcaaatacg aggtcccgcc agagaaattg 1980

gtgattcacg aacagattac gcgtgacctg aaagactata aggccaccgg tccgcatgtc 2040

gcagtggcga agcgcctggc ggctcgcggt gtgaagatcc gtccgggtac cgtcattagc 2100

tatatcgtgc tgaagggcag cggtcgtatc ggcgaccgtg cgattccgtt cgacgaattt 2160

gatccgacca aacacaaata tgatgcggaa tactatattg agaaccaagt gctgccagcc 2220

gttgagcgta ttctgcgcgc cttcggttac cgcaaggaag atctgcgtta ccagaaaact 2280

cgtcaggtcg gtctgtccgc atggctgaaa ccgaagggca cc 2322

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 3

aattccacaa cggtttccct c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 4

acctgaatat ggctcataac acc 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 5

aatgccgtaa caaccgct 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 6

cgcggccttc ctagaagt 18

<210> 7

<211> 309

<212> DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 7

gcgccgatct tccagtactc ggattacggc attgttggcg atgccgtgaa gatccttccg 60

gcgctgaccg cagctttagc gcgttgatcc actctggcag ggctgcattt tggtcctgcc 120

gctgacaggg agctcttatg tccgaagata tctttgacgc catcatcgtc ggtgcagggc 180

ttgccggttc ggttgccgca ctggtgctcg cccgcgaagg ggcgcaagtg ttagttatcg 240

agcgtggcaa ttccgcaggt gccaagaacg tcaccggcgg gcgtctctat gcccacagcc 300

tggaacaca 309

Claims

1.一种蛋白质，是如下A）-D）中任一种：

A）所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；

B）所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少一位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白；

C）所示的蛋白为将A）或B）所示蛋白的氨基酸序列C端的自末端起1-29个氨基酸去除，保留其余氨基酸残基且具有DNA聚合酶活性的由A）衍生的蛋白质；

D）所示的蛋白为将A）或B）或C）所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有DNA聚合酶活性的由A）或B）或C）衍生的蛋白质；

所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列为序列1。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：

B）所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少2位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：

B）所示的蛋白为将野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第408位亮氨酸突变为异亮氨酸，第409位酪氨酸突变为丙氨酸，第485位丙氨酸突变为谷氨酸，且对所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列中第53、59、199、243、526、558、613、641、671、673、674、692和709位这13位中至少3位的氨基酸残基进行修饰，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白。

4.根据权利要求1-3中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述修饰为氨基酸置换。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的蛋白质，其特征在于：

第53位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第59位的组氨酸置换为苯丙氨酸；

第199位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第243位的精氨酸置换为甲硫氨酸；

第526位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第558位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第613位的精氨酸置换为甲硫氨酸；

第641位的精氨酸置换为甲硫氨酸；

第671位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第673位的酪氨酸置换为苯丙氨酸；

第674位的赖氨酸置换为丙氨酸；

第692位的赖氨酸置换为甲硫氨酸；

第709位的精氨酸置换为甲硫氨酸。

7.根据权利要求1-6中任一所述蛋白，其特征在于：

8.根据权利要求7所述蛋白，其特征在于：

9.编码权利要求1-8中任一所述蛋白的DNA分子；

或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

10.权利要求1-8中任一所述蛋白或权利要求9所述DNA分子或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备DNA聚合酶中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述DNA聚合酶的对生物芯片的吸附能力低于所述野生型KOD型DNA聚合酶；

或，所述DNA聚合酶的对生物芯片的吸附能力低于所述野生型KOD型DNA聚合酶体现在与所述野生型KOD型DNA聚合酶相比，所述DNA聚合酶不易吸附于生物芯片表面和/或易于从生物芯片表面洗脱；

所述野生型KOD型DNA聚合酶氨基酸序列为序列1。

12.权利要求1-8中任一所述蛋白或权利要求9所述DNA分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞在测序中的应用；

或权利要求1-8中任一所述蛋白或权利要求9所述DNA分子或所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞在制备用于测序的产品中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。