CN108130318B

CN108130318B - 突变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108130318B
Application number: CN201810169144.8A
Authority: CN
Inventors: 谭毅彬; 马柳安; 郑林; 李泓彦; 周娇娇
Original assignee: Shenzhen Aivd Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CN108130318A

Abstract

本发明公开了一种突变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用。通过将野生型Taq DNA聚合酶的第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，得到的突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。该突变型Taq DNA聚合酶仅突变一个位点，突变的位点少，容易制备。实验结果表明，该突变型Taq DNA聚合酶可用于免核酸提取的直接PCR扩增反应体系中，即使对于含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。

Description

突变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种突变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是当今分子生物学研究领域最重要的工具之一，在PCR反应中，DNA聚合酶的活性特点关系到PCR反应的特异性、高效性和保真性。Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热菌Thermus aquaticus的高度热稳定的DNA聚合酶，并以其耐高温、较高的特异性以及灵敏度等优良特性被广泛应用在PCR扩增中。然而常规的Taq DNA聚合酶受扩增模板中的抑制剂的限制，比如，土壤中的腐殖酸、小鼠血清中多种成分、动植物的组织等，由于血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规Taq DNA聚合酶将产生明显的抑制作用。这一限制使得PCR不能够更加有效而广泛的应用到多个领域，如：遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。因此，传统的方法必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于PCR扩增。显然，传统方法操作步骤多、成本高、对样品的需要量较大且易于造成交叉污染。

目前国外对于无需提取核酸直接用于扩增PCR的DNA聚合酶的进行了大量的研究。美国VitaNavi Technology公司研发的新型高耐受性DNA聚合酶为基因检测技术带来了根本性的革新。该公司生产的新一代突变的Taq和Klentaq酶可耐受反应中高浓度的抑制因子，具有内在热启动特性，不需抗体或化学修饰，从GC含量>80％的样品中成功扩增目的基因。而国内对这种酶的研究目前还处于研发阶段，应用于研究方面的主要是购自VitaNaviTechnology公司的商品化试剂盒。相对于传统的方法，虽然操作简便了很多，但是由于货源运输的成本以及运输时间距离，试剂盒的成本也提高了不少。且对高耐受性DNA聚合酶一般需要突变的位点较多，制备不易，这对于上述很多研究和检测领域都带来了不便。

综上，传统的DNA聚合酶活性低、耐受性低、制备不易。

发明内容

基于此，有必要提供一种酶活性高、耐受性高、且容易制备的突变型Taq DNA聚合酶，从而能够适应免核酸提取直接PCR扩增。

此外，还有必要提供一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法以及一种免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒和一种免核酸提取直接PCR扩增的检测方法。

一种突变型Taq DNA聚合酶，由野生型Taq DNA聚合酶的第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺后得到。

在一个实施方式中，所述突变型Taq DNA聚合酶为：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，

(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述突变型Taq DNA聚合酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一个实施方式中，所述突变型Taq DNA聚合酶为：

(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，

(b)在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述突变型Taq DNA聚合酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：

以Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，所述目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与所述野生型Taq DNA聚合酶相比，第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；

将所述目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述突变型Taq DNA聚合酶。

在一个实施方式中，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。

一种免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒，包括上述任一项所述的突变型TaqDNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP，所述处理液用于处理待检测样本，所述PCR增强剂用于增强扩增片段的PCR聚合能力以及特异性。

在一个实施方式中，所述处理液中含有40mmol/L～60mmol/L的Tris-HCl、150mmol/L～160mmol/L的(NH4)2SO4、质量分数为0.1％～0.3％的聚氧乙烯醚以及20mmol/L～25mmol/L的MgCl2。

在一个实施方式中，所述PCR增强剂为甜菜碱类化合物。

一种免核酸提取直接PCR扩增的检测方法，包括如下步骤：

将待检测样品、扩增所述待检测样品的引物、突变型Taq DNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP混合得到反应液，其中，所述突变型Taq DNA聚合酶为上述任一项所述的突变型Taq DNA聚合酶，所述处理液用于处理所述待检测的样本，所述PCR增强剂用于增强扩增片段的PCR聚合能力以及特异性；以及

将所述反应液置于PCR仪中进行PCR扩增。

在一个实施方式中，所述待检测样品选自血液样品、土壤样品和食物样品中的至少一种。

通过将野生型Taq DNA聚合酶的第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，得到的突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高。该突变型Taq DNA聚合酶仅突变一个位点，突变的位点少，容易制备。实验结果表明，由于该突变型Taq DNA聚合酶具有较高的酶活性和耐受性，可用于免核酸提取的直接PCR扩增反应体系中，即使对于含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。用该突变型Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时，能够省去对样本分离提取核酸的步骤，对样本要求低，有效减少交叉污染。

附图说明

图1为实施例1中诱导前后蛋白样品的SDS-PAGE图；

图2为实施例1中纯化过程中样品、透析后样品以及流穿液中样品的SDS-PAGE图；

图3为实施例1中纯化各个浓度的蛋白样品的SDS-PAGE图；

图4为实施例3中在不同PCR反应条件下PCR产物的琼脂糖电泳图；

图5为实施例4中用普通Taq DNA聚合酶对粗样血清扩增产物与纯化DNA模板扩增产物的凝胶电泳结果对比图；

图6为实施例4中用突变型Taq DNA聚合酶对粗样血清扩增产物与纯化DNA模板扩增产物的凝胶电泳结果对比图；

图7为实施例5中用普通Taq DNA聚合酶和突变型Taq DNA聚合酶对土壤中DNA扩增产物的凝胶电泳结果对比图；

图8为实施例6中用普通Taq DNA聚合酶和突变型Taq DNA聚合酶对食物中DNA扩增产物的凝胶电泳结果对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的突变型Taq DNA聚合酶，该突变型Taq DNA聚合酶由野生型Taq DNA聚合酶的第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺后得到。

具体地，该突变型Taq DNA聚合酶为：(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述突变型Taq DNA聚合酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

进一步地，该突变型Taq DNA聚合酶为：(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述突变型Taq DNA聚合酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为优化后的序列，该优化后的序列在宿主细胞中更容易表达以获得突变型Taq DNA聚合酶。

可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有本申请的突变型Taq DNA聚合酶活性的蛋白质，或在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有本申请的突变型TaqDNA聚合酶活性的衍生的蛋白，得到的蛋白与突变型Taq DNA聚合酶没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

经过不断探索研究，预料不到的发现将野生型Taq DNA聚合酶的第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，得到的突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高，即使对于含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。且该突变型Taq DNA聚合酶仅需要突变一个位点，突变的位点少，容易制备。

一实施方式的突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤S110～S120。

S110、以Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与野生型Taq DNA聚合酶相比，第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺。

S120、将S110中得到的目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的宿主细胞进行诱导表达，得到突变型Taq DNA聚合酶。

具体地，在NCBI上查找Taq DNA Polymerase的基因序列，并进行密码子优化，设计突变型Taq DNA聚合酶的基因编码序列。以Taq DNA Polymerase的709位的谷氨酸E突变为谷氨酰胺Q设计两条点突变的引物如下：

F-primer：CGAAAGTTCGCGCTTGGATCCAAAAAACCCTGGAAGAAGG(SEQ ID No.3所示)。

R-primer：CCTTCTTCCAGGGTTTTTTGGATCCAAGCGCGAACTTTCG(SEQ ID No.4所示)。

上述一对互补引物进行点突变PCR扩增，使得目标位置的GAA突变为CAA，得到目的基因表达序列，并将目的基因表达序列转化到宿主细胞中，宿主细胞例如可以为BL21(DE3)等，对转化后的宿主细胞进行诱导表达，纯化获得纯度为90％的大小为100KDa的蛋白，获得该突变型Taq DNA聚合酶。

当然，可以理解，在其他实施方式中，还可以设计其他的点突变的引物，将目标位置的GAA突变为CAG，同样使得第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺。

具体地，制备获得的突变型Taq DNA聚合酶的序列等特征可参见上文描述，在此不作赘述。

上述制备方法仅突变一个位点，突变的位点少，容易制备。且制备得到的突变型Taq DNA聚合酶的活性、耐受性等均有明显的提高，即使对于含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。

一实施方式的免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒，包括上述任一项的突变型Taq DNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP，其中处理液用于处理待检测样本，PCR增强剂用于增强扩增片段的PCR聚合能力以及特异性。

在一个实施方式中，处理液中含有40mmol/L～60mmol/L的Tris-HCl、150mmol/L～160mmol/L的(NH4)₂SO₄、质量分数为0.1％～0.3％的聚氧乙烯醚以及20mmol/L～25mmol/L的MgCl₂。Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄以及MgCl₂为待检测样本提供合适的盐离子环境，聚氧乙烯醚作为表面非离子活性剂，能够增强PCR扩增。上述组分的处理液能够消除血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，减少上述样本对Taq DNA聚合酶的干扰作用，从而使得含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。

在一个实施方式中，PCR增强剂为甜菜碱类化合物，以增强PCR聚合能力以及特异性。

上述免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒用于检测样本时，能够省去对样本分离提取核酸的步骤，对样本要求低，有效减少交叉污染。

一实施方式的免核酸提取直接PCR扩增的检测方法，包括如下步骤S210～S220。

S210、将待检测样品、扩增待检测样品的引物、突变型Taq DNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP混合得到反应液，其中，突变型Taq DNA聚合酶为上述的突变型Taq DNA聚合酶，处理液用于处理待检测的样本，PCR增强剂用于增强扩增片段的PCR聚合能力以及特异性。

S220、将S210中的反应液置于PCR仪中进行PCR扩增。

在一个实施方式中，处理液中含有40mmol/L～60mmol/L的Tris-HCl、150mmol/L～160mmol/L的(NH₄)₂SO₄、质量分数为0.1％～0.3％的聚氧乙烯醚以及20mmol/L～25mmol/L的MgCl₂。Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄以及MgCl₂为待检测样本提供合适的盐离子环境，聚氧乙烯醚作为表面非离子活性剂，能够增强PCR扩增。上述组分的处理液能够消除血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，减少上述样本对Taq DNA聚合酶的干扰作用，从而使得含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。

具体地，待检测样品选自血液样品、土壤样品和食物样品中的至少一种。该检测方法即使对于含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。

当然，在其他实施方式中，待检测样品还可以是纯化的核酸分子。

上述检测方法能够省去对样本分离提取核酸的步骤，对样本要求低，有效减少交叉污染。

下面为具体实施例部分。

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。

图中，Taq表示普通市售的Taq DNA聚合酶，Ri Taq表示突变型Taq DNA聚合酶。

实施例1突变型Taq DNA聚合酶的制备

在NCBI上查找Taq DNA Polymerase的基因序列(GenBank序列号为：D32013.1)，并进行密码子优化，设计目的基因表达序列。以Taq DNA Polymerase的709位的谷氨酸E突变为谷氨酰胺Q设计两条点突变的引物如下：

F-primer：CGAAAGTTCGCGCTTGGATCCAAAAAACCCTGGAAGAAGG(如SEQ ID No.3所示)

R-primer：CCTTCTTCCAGGGTTTTTTGGATCCAAGCGCGAACTTTCG(如SEQ ID No.4所示)

由上海生工生物工程有限公司合成。以本公司提取的PTaq DNA Polymerase的基因为模板，上述一对互补引物进行点突变PCR扩增，得到点突变后产物RiTaq(目的基因表达序列)，并且用限制性内切酶Dnp I去除PTaq模板，纯化产物后测序，去除序列的前端6个酶切位点序列(GGATCC)以及末端6个酶切位点序列(GAATTC)，得到的测序结果如SEQ ID No.2所示，可以看出在序列的第2125位～2127位的GAA成功突变为CAA。将其转化到BL21(DE3)中进行诱导表达、纯化获得纯度为90％的大小为100KDa的RiTaq蛋白(突变型Taq DNA聚合酶)。诱导前后、纯化过程以及纯化后的各蛋白样品的SDS-PAGE图分别如图1～3所示，可以看出经诱导BL21，突变型Taq DNA聚合酶成功表达，透析后的样品的纯度高、杂质少。

实施例2

免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒

试剂盒中包括实施例1中突变型Taq DNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP，处理液中含有50mmol/L Tris-HCI(pH 9.1)，25mmol/L MgC1₂，160mmol/L(NH₄)₂SO₄和0.25％Brij-58。PCR增强剂为甜菜碱。

实施例3

突变型Taq DNA聚合酶PCR反应条件的优化

以一个长度2.9Kb的DNA片段为(PET-28a)模板，设计以下扩增引物，在统一其他一切反应条件的情况下，梯度变化处理液中中MgC1₂，(NH₄)₂SO₄，Brij-58(聚氧乙烯醚)的浓度，及其pH值，进行多组PCR反应，以PCR产物的琼脂糖电泳图来表征RiTaq DNA Polymerase(突变型Taq DNA聚合酶)在PCR反应中的催化活性。其中，PCR产物条带越亮，就可以表示该组PCR反应的效率越高，即RiTaq DNA Polymerase的反应活性也越高，凝胶电泳图如图4。

2.9Kb片段的扩增引物:

PET-28a-F:ATCCGGATATAGTTCCTCCT(如SEQ ID No.5所示)

PET-28a-R:CAGTATACACTCCGCTATGC(如SEQ ID No.6所示)

根据各组PCR结果电泳图可知，突变型Taq DNA聚合酶活性最高时，pH最佳值为9.0～9.2，MgCl₂最佳值为20mmol/L～25mmol/L，(NH₄)₂SO₄最佳值为150mmol/L～160mmol/L，Brij-58最佳值为0.1％～0.3％。

优选地，突变型Taq DNA聚合酶PCR的处理液：50mmol/L Tris-HCI(pH9.1)，25mmol/L MgC1₂，160mmol/L(NH₄)₂SO₄和0.25％Brij-58。

以25μL为例，推荐PCR扩增体系，如下表1所示。

表1：推荐的PCR扩增体系

处理液含有：50mmol/L Tris-HCI(pH 9.1)，25mmol/L MgC1₂，160mmol/L(NH₄)₂SO₄和0.25％Brij-58。

其中，检测的模板可直接来自全血、土壤、食物以及动植物组织等，样本无需提取其核酸。试剂盒中自带的2×PCR Enhancer(PCR增强剂)，有利于扩增微量模板DNA。为了确定酶反应的最佳浓度，建议对于不用测试目标选择不同的酶浓度进行提前测试。每25μL反应的酶起始量为0.1μL，纯化的DNA模板为0.1μL，粗品含有5％或更多全血，血浆或血清的样品为0.25μL，对于大于1kb的目标可能需要更多的酶。

推荐PCR反应条件如下表2所示：

表2：PCR反应条件

注意：选择合适的循环数以及合适的退火温度，避免得不到特异性扩增条带。

实施例4

采用实施例2的试剂盒对小鼠血清的PCR扩增

分别以新鲜未经过任何处理的的小鼠血清以及纯化后的DNA进行实验，按照10倍稀释为模板，引物HBVS-F和HBVS-R，用纯化的突变型Taq DNA聚合酶与普通Taq DNAPolymerase进行PCR扩增。

HBVS-F：CCCAACCTCCAATCACTCACCAACC(SEQ ID No.7所示)

HBVS-R：GGCCCCCAATACCACATCATCCARA(SEQ ID No.8所示)

PCR反应体参见实施例3表1所示。

PCR反应条件：94℃ 5min(粗样品)，[94℃ 50sec，58℃ 50sec，72℃ 2min](35cycle),72℃ 4min。

小鼠血清中含有血红素、血色素、胶原质等PCR抑制剂，扩增结果进行1.2％的琼脂糖电泳，普通Taq DNA聚合酶对粗样血清扩增产物与纯化DNA模板扩增产物的凝胶电泳结果如图5所示，突变型Taq DNA聚合酶对粗样血清扩增产物与纯化DNA模板扩增产物的凝胶电泳结果如图6所示。可以突变型Taq DNA聚合酶对粗样血清扩增产物与纯化DNA模板扩增产物一样，都可以扩增出目的条带，大小为2Kb，而普通Taq DNA Polymerase无扩增条带。说明突变型Taq DNA聚合酶对于血清中PCR抑制剂有很强的的耐受性。实施例2的试剂盒能够免核酸提取直接PCR扩增血清样本。

实施例5

采用实施例2的试剂盒对的土壤中DNA进行PCR扩增

模拟含有不同浓度0ng、12ng、25ng、50ng、100ng、200ng的腐殖酸的未经纯化的土壤DNA为模板，细菌16SrDNA基因的通用引物为扩增引物，分别用纯化的突变型Taq DNA聚合酶以及普通Taq DNA Polymerase进行PCR扩增

16s-1525-F：AAGGAGGTGWTCCARCC(SEQ ID No.9所示)

16s-1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.10所示)

PCR反应体参见实施例3表1所示。

PCR反应条件：94℃ 5min(粗样品)，[94℃ 50sec，55℃ 50sec，72℃ 2min](35cycle)，72℃ 4min。

未经纯化的土壤DNA中含有大量的腐植酸、复杂多糖、盐类等PCR抑制剂，且DNA的片段较大(20K～30Kb)。因此，土壤中DNA进行PCR扩增时，对DNA聚合酶的质量要求较高。扩增结果进行1.2％的琼脂糖电泳，如图7所示，粗样土壤扩增，用突变型Taq DNA聚合酶的均有扩增产物且扩增出目的条带大小为380bp，与预期大小一致。而普通Taq DNA Polymerase在较低浓度下有扩增条带，高浓度下无扩增条带。说明纯化的突变型Taq DNA聚合酶对于土壤中PCR抑制剂有很强的的耐受性。实施例2的试剂盒能够免核酸提取直接PCR扩增土壤样本。

实施例6

采用实施例2的试剂盒对的食物中DNA进行PCR扩增

为进一步检测突变型Taq DNA聚合酶对于PCR抑制剂的抵抗能力，实验模拟含有50mg/mL的黑胡椒以及含有10％巧克力的食物，取不同的体积作为模板，细菌16SrDNA基因的通用引物为扩增引物，分别用纯化的突变型Taq DNA聚合酶以及普通Taq DNAPolymerase进行PCR扩增，

16s-1525-F：AAGGAGGTGWTCCARCC(SEQ ID No.9所示)

16s-1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.10所示)

PCR反应体参见实施例3表1所示。

PCR反应条件：94℃ 5min(粗样品)，[94℃ 50sec，55℃ 50sec，72℃ 2min](35cycle)，72℃ 4min。未经纯化的食物中含有黑胡椒、巧克力等食物类PCR抑制剂。琼脂糖电泳结果如图8表明，对于食物中DNA扩增，突变型Taq DNA聚合酶组均有扩增产物且扩增出目的条带大小为380bp，与预期大小一致。而普通Taq DNA Polymerase无扩增条带。说明纯化的突变型Taq DNA聚合酶对于食物中PCR抑制剂有很强的的耐受性。

以上实验例4～6的结果表明，突变型Taq DNA聚合酶对抑制剂的抵抗能力强，即使对于含有大量抑制因子的血液、食物、土壤等样本也能够实现免核酸提取的直接PCR扩增。用该突变型Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时，能够省去对样本分离提取核酸的步骤，对样本要求低，有效减少交叉污染。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市草履虫生物科技有限公司

<120> 变型Taq DNA聚合酶、免核酸提取直接PCR扩增的试剂盒及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 829

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu Val Asp Gly

1 5 10 15

His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly Leu Thr Thr

20 25 30

Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala Lys Ser Leu

35 40 45

Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val Val Phe Asp

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly Tyr Lys Ala

65 70 75 80

Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu Ala Leu Ile

85 90 95

Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu Val Pro Gly

100 105 110

Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys Ala Glu Lys

115 120 125

Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp Leu Tyr Gln

130 135 140

Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly Tyr Leu Ile

145 150 155 160

Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Gln Trp

165 170 175

Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn Leu Pro Gly

180 185 190

Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu Glu Glu Trp

195 200 205

Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu Lys Pro Ala

210 215 220

Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys Leu Ser Trp

225 230 235 240

Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val Asp Phe Ala

245 250 255

Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe Leu Glu Arg

260 265 270

Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu Glu Ser Pro

275 280 285

Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly Ala Phe Val

290 295 300

Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp Leu Leu Ala

305 310 315 320

Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro Glu Pro Tyr

325 330 335

Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu Ala Lys Asp

340 345 350

Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro Pro Gly Asp

355 360 365

Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Thr Pro

370 375 380

Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu Glu Ala Gly

385 390 395 400

Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg

405 410 415

Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg

420 425 430

Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu

435 440 445

Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile

450 455 460

Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn

465 470 475 480

Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly

485 490 495

Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser

500 505 510

Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys

515 520 525

Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp

530 535 540

Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg

545 550 555 560

Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro

565 570 575

Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg

580 585 590

Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr

595 600 605

Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn

610 615 620

Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala

625 630 635 640

Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg

645 650 655

Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala

660 665 670

His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala

675 680 685

Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile

690 695 700

Glu Lys Thr Leu Gln Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu

705 710 715 720

Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser

725 730 735

Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly

740 745 750

Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg

755 760 765

Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu

770 775 780

Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala

785 790 795 800

Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val

805 810 815

Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

820 825

<210> 2

<211> 2490

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctgccac tgtttgaacc aaaaggtcgc gttctgctgg ttgacggtca tcatctggca 60

tatcgcacgt ttcacgcact gaaaggtctg accaccagtc gcggcgaacc agttcaagca 120

gtttacggct tcgcgaaaag cctgctgaaa gcactgaaag aagacgggga cgcagttatt 180

gttgtttttg acgccaaagc gccgagcttt cgtcacgaag catacggcgg ttataaagca 240

ggtcgcgcac caaccccaga agattttcca cgtcaactgg cgctgatcaa agaactggtt 300

gatctgctgg gtctggcacg tctggaagtt ccaggttacg aagcagacga cgttctggca 360

agcctggcga aaaaagcgga gaaagaaggc tacgaagtcc gtatcctgac cgcggataaa 420

gatctgtacc agctgctgag cgatcgtatt cacgttctgc atccggaagg ctatctgatt 480

accccagctt ggctgtggga aaaatacggt ctgcgtccag atcagtgggc agattatcgc 540

gcactgaccg gcgacgaatc tgataatctg ccaggcgtta aaggcattgg cgaaaaaacc 600

gcgcgtaaac tgctggaaga gtggggtagt ctggaagcac tgctgaaaaa cctggatcgt 660

ctgaaaccgg caatccgcga aaaaatcctg gcgcatatgg acgatctgaa actgagctgg 720

gatctggcga aagttcgtac cgatctgcca ctggaagtcg attttgccaa acgtcgcgaa 780

ccagatcgcg aacgtctgcg cgcatttctg gaacgtctgg aatttggtag cctgctgcac 840

gaatttggcc tgctggaaag tccgaaagca ctggaagaag caccgtggcc accaccagaa 900

ggcgcatttg ttggctttgt tctgagtcgt aaagagccaa tgtgggcaga tctgctggca 960

ctggcagcag cacgcggcgg tcgcgttcat cgtgcaccag aaccatataa agcactgcgc 1020

gatctgaaag aagcacgcgg tctgctggca aaagatctgt ctgttctggc actgcgcgaa 1080

ggtctgggtc tgccaccagg cgacgatcca atgctgctgg catatctgct ggacccgagt 1140

aataccaccc cagaaggcgt tgcacgtcgt tacggtggtg agtggaccga agaagcaggt 1200

gaacgcgcag cactgtctga acgtctgttt gccaatctgt ggggtcgtct ggaaggcgaa 1260

gaacgtctgc tgtggctgta tcgcgaagtt gaacgtccac tgtctgctgt tctggcacat 1320

atggaagcaa ccggcgttcg tctggacgta gcatatctgc gcgcactgag tctggaagtt 1380

gcagaagaaa ttgcgcgtct ggaagcagaa gtttttcgtc tggcaggcca tccgtttaac 1440

ctgaatagtc gcgatcagct ggaacgcgtt ctgtttgacg aactgggtct gccagcaatt 1500

ggcaaaaccg agaaaaccgg taaacgtagc acctctgcag cagttctgga agcactgcgt 1560

gaagcgcatc cgattgtcga gaaaatcctg cagtaccgcg aactgaccaa actgaaaagc 1620

acctacatcg atccgctgcc agatctgatt catccacgta ccggtcgtct gcatacccgt 1680

tttaatcaga ccgcaaccgc aaccggtcgt ctgagtagta gcgatccgaa tctgcagaac 1740

attccggttc gtaccccact gggtcaacgt attcgtcgcg catttatcgc ggaagaaggt 1800

tggctgctgg tagcactgga ttatagccag atcgaactgc gcgttctggc acatctgtct 1860

ggcgacgaaa atctgattcg cgttttccag gaaggtcgcg atatccatac cgaaaccgct 1920

tcttggatgt ttggcgttcc acgcgaagct gttgatccac tgatgcgtcg cgcagcaaaa 1980

accattaact tcggcgttct gtacggcatg tctgcacatc gtctgagtca agaactggca 2040

atcccgtacg aagaagcaca ggcgtttatc gagcgctact ttcagagctt cccgaaagtt 2100

cgcgcttgga tcgaaaaaac cctgcaagaa ggtcgtcgtc gcggttacgt tgaaaccctg 2160

tttggtcgtc gtcgttacgt tccagatctg gaagcacgcg ttaaaagcgt gcgcgaagct 2220

gccgaacgta tggcctttaa catgccagtt cagggtaccg ctgctgatct gatgaaactg 2280

gcgatggtca aactgtttcc gcgtctggaa gaaatgggcg cacgtatgct gctgcaagtt 2340

catgacgaac tggttctgga agccccaaaa gaacgtgcag aagcagttgc tcgtctggct 2400

aaagaggtca tggaaggcgt ttatccgctg gcagttccgc tggaagttga agttggcatt 2460

ggcgaagatt ggctgtctgc gaaagaataa 2490

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaaagttcg cgcttggatc caaaaaaccc tggaagaagg 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttcttcca gggttttttg gatccaagcg cgaactttcg 40

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccggatat agttcctcct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagtatacac tccgctatgc 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccaacctcc aatcactcac caacc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcccccaat accacatcat ccara 25

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggaggtgw tccarcc 17

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于，由野生型Taq DNA聚合酶的第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺后得到，所述突变型Taq DNA聚合酶为由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述突变型Taq DNA聚合酶为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质。

3.一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以野生型Taq DNA聚合酶的基因表达序列为扩增模板，并加入点突变引物进行点突变PCR扩增，得到目的基因表达序列；其中，所述目的基因表达序列所编码得到的蛋白质与所述野生型Taq DNA聚合酶相比，第709位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；

将所述目的基因表达序列转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述突变型Taq DNA聚合酶，所述突变型Taq DNA聚合酶为由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述点突变引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。

5.一种免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～2中任一项所述的突变型Taq DNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP，所述处理液用于处理待检测样本，所述PCR增强剂用于增强扩增片段的PCR聚合能力以及特异性。

6.根据权利要求5所述的免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒，其特征在于，所述处理液中含有40mmol/L～60mmol/L的Tris-HCl、150mmol/L～160mmol/L的(NH₄)₂SO₄、质量分数为0.1％～0.3％的聚氧乙烯醚以及20mmol/L～25mmol/L的MgCl₂。

7.根据权利要求5所述的免核酸提取直接PCR扩增的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR增强剂为甜菜碱类化合物。

8.一种免核酸提取直接PCR扩增的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

将待检测样品、扩增所述待检测样品的引物、突变型Taq DNA聚合酶、处理液、PCR增强剂以及dNTP混合得到反应液，其中，所述突变型Taq DNA聚合酶选自权利要求1～2中任一项所述的突变型Taq DNA聚合酶，所述处理液用于处理所述待检测的样本，所述PCR增强剂用于增强扩增片段的PCR聚合能力以及特异性；以及

将所述反应液置于PCR仪中进行PCR扩增。

9.根据权利要求8所述的检测方法，所述待检测样品选自血液样品、土壤样品和食物样品中的至少一种。