CN113462798A - 快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的lamp引物及方法 - Google Patents

快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的lamp引物及方法 Download PDF

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张影
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Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物及方法。快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。通过引物浓度配比实验确定三重LAMP反应体系引物浓度，进而建立三重LAMP检测方法。本发明提供的LAMP引物可以实现金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速检测及高度特异性检测。本发明建立的三重LAMP检测方法可以有效解决单重LAMP反应检测通量低和假阳性的问题。

Description

快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引 物及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物及方法。
背景技术
目前，病原微生物检测领域应用比较广泛的检测方法主要有生化法、免疫学方法、分子生物学技术、代谢学技术等。其中分子生物学技术中的环介导等温扩增技术(LAMP)具有操作简单、无需大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单、比常规分子生物学方法具有更高的灵敏度和特异性等优点而受到广泛关注。LAMP仅需普通水浴锅就能快速、高效、简便地对病原微生物进行鉴定，因而具有推广性，可以作为常规的检测工具。对设施简陋、经济状况较差、无法使用昂贵的大型检测仪器的偏远地区或乡村来说，建立一种快速、准确、灵敏、操作简便的病原微生物检测技术十分关键。
LAMP是一种利用具有链置换特性的DNA聚合酶对识别的核酸序列进行催化扩增的新型技术。该技术的核心要点是能特异性识别目的基因保守片段的4条或6条引物以及具有链置换特性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)。除此之外反应体系还包括dNTPs、模板DNA、Mg2+、甜菜碱等。LAMP反应是一种等温条件下的核酸扩增反应，通过在60℃左右保持几十分钟，即可完成反应，阳性结果中，LAMP体系的DNA扩增链式循环产生大量目的基因片段，产生反应副产物焦磷酸镁白色沉淀，可根据浊度结果判定反应结果。
LAMP技术也有一些缺陷限制了其应用于实际场景中，例如假阳性结果和检测通量。单重LAMP只能检测单一基因片段，其效率已不足以满足当前的众多需求，且多种病原菌的单重LAMP检测步骤具有大量的重复性，逐个单一检测耗时耗力；LAMP方法是基于DNA扩增的一种技术手段，死菌的DNA也可能被扩增，因此LAMP假阳性结果的来源可能是目标死菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服常规技术普遍存在的操作复杂，价格昂贵，需要大型仪器，耗时长。
本发明的技术方案快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。
本发明还提供了快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的方法，包括如下步骤：
步骤1、采用叠氮溴乙锭对样本进行前处理，用磁珠法提取DNA；
步骤2、向步骤1提取好的DNA样本中加入LAMP反应体系，所述LAMP反应体系为单重反应体系或三重反应体系，所述单重反应体系包括1套nuc引物、1套invA引物或1套ipaH引物，10×LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；所述三重反应体系包括1套nuc引物、1套invA引物和1套ipaH引物，10×LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；1套nuc引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～6所示，1套invA引物核苷酸序列如SEQ ID No.19～24所示；1套ipaH引物核苷酸序列如SEQ ID No.37～42所示；
步骤3、将步骤2所得产物进行通过浊度仪进行检测。
其中，步骤2中，单重反应体系的反应温度为65℃。
具体的，步骤2中，单重反应体系中dNTPs浓度为0.6～1.4mmol/L。
优选的，步骤2中，单重反应体系中dNTPs浓度为1.0mmol/L。
具体的，步骤2中，单重反应体系中的10×LAMP buffer中Mg2+浓度为2～10mmol/L。
优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套nuc引物时，Mg2+浓度为4～6mmol/L。
优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套invA引物时，Mg2+浓度为4～8mmol/L。
优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套ipaH引物时，Mg2+浓度为4mmol/L。
其中，步骤2中，三重反应体系的反应温度为60℃。
其中，步骤2中，三重反应体系中3套引物总浓度为1～3μmol/L。
优选的，步骤2中，三重反应体系中3套引物总浓度为1.5μmol/L。
具体的，步骤2中，三重反应体系中dNTPs浓度0.6～1.4mmol/L。
优选的，步骤2中，三重反应体系中dNTPs浓度1.0mmol/L。
具体的，步骤2中，三重反应体系中的10×LAMP buffer中Mg2+浓度2～10mmol/L。
优选的，步骤2中，三重反应体系中的10×LAMP buffer中Mg2+浓度4mmol/L。
dNTPs浓度优选主要从反应开始扩增的时间、反应过程中的扩增效率、反应结束后的扩增量三个方面考虑；浓度为1.0mmol/L时较早开始扩增，且反应过程中保持较高的扩增效率，反应结束后扩增量较高，所以选取1.0mmol/L为最优浓度。Mg2+浓度优选主要从反应开始扩增的时间、反应过程中的扩增效率、反应结束后的扩增量三个方面考虑。
本发明建立的三重LAMP检测方法可以同时特异性检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种病原微生物，检测通量是单重LAMP的3倍，有效解决了单重LAMP检测通量低的缺陷；且针对死菌造成的假阳性结果，本发明通过采用EMA(叠氮溴乙锭)对样本进行前处理可以有效避免死菌对反应结果的影响，解决了单重LAMP假阳性的缺陷。
本发明前处理时用磁珠法提取DNA，在LAMP检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种病原微生物的相关研究中多用试剂盒法、热裂解法、碱法以及改良后的碱法、CTAB法、改良型SDS法等。
检测指标：浊度仪中浊度曲线随扩增反应进行是否上升，浊度曲线上升即为阳性反应，反应结束后浊度越高代表扩增效率越高。
本发明设计的单重LAMP引物及建立的三重LAMP检测方法在病原微生物检测领域的应用也属于本发明的保护范围。优选的，所述应用的方法是将需要检测的样品分别加入单重LAMP反应体系或三重LAMP反应体系，在65℃(单重)或60℃(三重)恒温下进行。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明设计的单重LAMP引物可以实现金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的高度特异性检测和快速检测；
(2)本发明建立的三重LAMP检测方法可同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌三种病原微生物，克服了传统LAMP技术的检测通量低和假阳性问题；且具有操作简单、无需大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单、比常规分子生物学方法具有更高的灵敏度和特异性等优点。
附图说明
图1是实施例1单重LAMP引物设计及反应体系优化，DNA提取结果图；1～3分别为使用市售通用细菌基因组DNA提取试剂盒对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌DNA提取结果；4～6为磁珠法提取金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌三种细菌基因组DNA结果。
图2是是实施例1单重LAMP引物设计及反应体系优化，金黄色葡萄球菌(A)、沙门氏菌(B)、志贺氏菌(C)LAMP反应温度优化图；
图3是是实施例1单重LAMP引物设计及反应体系优化，金黄色葡萄球菌(A)、沙门氏菌(B)、志贺氏菌(C)LAMP反应dNTPs浓度优化图；
图4是是实施例1单重LAMP引物设计及反应体系优化，金黄色葡萄球菌(A)、沙门氏菌(B)、志贺氏菌(C)LAMP反应Mg2+浓度优化图；
图5是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，A、B、C、D依次为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和阴性对照三重LAMP引物配比优化结果图；
图6是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，金黄色葡萄球菌LAMP反应温度优化图；
图7是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，金黄色葡萄球菌LAMP反应dNTPs浓度优化图；
图8是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，金黄色葡萄球菌LAMP反应Mg2+浓度优化图；
图9是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，模拟样品三重LAMP检测结果图；sample代表样品，数字代表样品编号；
图10是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，实际厕所样品三重LAMP检测结果图。
图11是实施例1单重LAMP引物设计及反应体系优化，3套nuc引物(A)、3套invA引物(B)、3套ipaH引物(C)LAMP反应扩增结果图；
图12是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，模拟样品可视化三重LAMP检测结果图；
图13是实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用，实际厕所样品可视化三重LAMP检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明进行进一步的说明。
实施例1单重LAMP引物设计及反应体系优化
步骤1：磁珠法提取细菌DNA：分别取过夜培养的待提取DNA细菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌)菌液各200μL，加入50μL细胞裂解液和20μL Proteinase K，振荡混匀，65℃放置10min。然后加入350μL异丙醇，混匀后加入10μL磁珠(100mg/mL)振荡混匀1min，放置3min，置于磁力架上磁分离，吸去上清液；加入500μL 5mol/L NaCl洗涤1次，置于磁力架上磁分离，吸去上清液，然后用Washing Buffer洗涤1次，置于磁力架上磁分离，吸去上清液，加入900μL 80％乙醇漂洗，磁分离后室温晾干，加入50μL ddH2O洗脱，置于65℃水浴放置10min，置于磁力架吸附30s后，将所得液体转移至一干净的EP管内，即得到DNA提取液；分别用试剂盒法和磁珠法提取DNA，两种方法DNA提取结果如附图图1所示，可知磁珠法提取的DNA电泳条带相较于试剂盒法更加清晰明亮，质量更高。
步骤2：分别根据NCBI中GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因的保守区域，利用MEGA5.0和Blast分析该基因的保守核苷酸序列，使用Primer Explorer V5.0在线引物设计软件设计3套nuc引物、3套invA引物和3套ipaH引物(表1～3)后筛选，分别以设计好的9套引物进行单重LAMP反应，LAMP反应体系：10μmol/LFIP和BIP，10μmol/L F3和B3，5μmol/L LF和LB，10×LAMP buffer(200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH 4)2SO4，1.0％Tritonx-100)，10mmol/LdNTPs，0.8mmol/L Betaine，8U Bst DNA聚合酶，2μLDNA模板，反应pH为8.8，ddH2O补足体积至25μL，反应初始温度设定为60℃，反应时间1h。9套引物扩增结果如图11所示，在3套nuc引物、3套invA引物和3套ipaH引物中，nuc1引物、invA1引物和ipaH1引物均表现出最早开始扩增、扩增反应中效率最高、扩增结束后扩增量较高的趋势，所以选择nuc1引物、invA1引物和ipaH1引物为最优的3套引物(表4)。将设计完成的LAMP序列交由相关公司进行合成。
表1金黄色葡萄球菌3套nuc基因引物序列
Figure BDA0003179443310000041
Figure BDA0003179443310000051
表2沙门氏菌3套invA基因引物序列
Figure BDA0003179443310000052
表3志贺氏菌3套ipaH基因引物序列
Figure BDA0003179443310000061
表4筛选后3套引物序列
Figure BDA0003179443310000062
Figure BDA0003179443310000071
步骤3：单重LAMP的初始反应体系：10μmol/LFIP和BIP，10μmol/L F3和B3，5μmol/LLF和LB，10×LAMP buffer(200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1.0％Tritonx-100)，10mmol/L dNTPs，0.8mmol/L Betaine，8U BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，反应pH为8.8，ddH2O补足体积至25μL。
步骤4：LAMP反应体系的优化：以步骤3设定的LAMP初始反应体系作为反应体系优化的基础值，以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌为试验对象，对LAMP反应体系中几个关键的因素：反应温度、dNTPs浓度、Mg2+浓度进行优化。各反应均以ddH2O代替DNA模板设置阴性对照。
①反应温度的优化：本LAMP反应体系优化设置的反应温度为40℃，50℃，60℃，65℃，70℃，通过实时浊度仪的最终反应结果选择较优反应温度。
②dNTPs浓度的优化：本LAMP反应体系优化设置的中的dNTPs浓度为0mmol/L，0.6mmol/L，0.8mmol/L，1.0mmol/L，1.2mmol/L，1.4mmol/L，通过实时浊度仪的最终反应结果选择最优的dNTPs浓度。
③Mg2+浓度的优化：本LAMP反应体系优化设置的Mg2+浓度分别为0，2，4，6，8，10mmol/L，通过实时浊度仪的最终反应结果选择最优的Mg2+浓度。
④优化后的反应体系Mg2+浓度4mmol/L，dNTPs浓度1.0mmol/L，反应温度65℃，优化结果如图2、图3、图4所示，反应温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度的优选主要从反应开始的扩增时间、反应过程中的扩增效率、反应结束后的扩增量三个方面考虑；在最优的Mg2+浓度、dNTPs浓度和反应温度时金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的LAMP反应均表现出，较快开始扩增，反应过程中保持较高的扩增效率且反应结束后扩增量较高的趋势。
步骤5：反应体系置于LA-320c实时浊度仪中进行LAMP反应，随着反应的进行，阳性反应会产生焦磷酸镁乳白色沉淀，可以通过浊度显示实时观测。
实施例2三重LAMP反应体系的建立、优化及应用
步骤1：磁珠法提取细菌DNA：分别取过夜培养的待提取DNA细菌(金黄色葡萄球菌)菌液各200μL，加入50μL细胞裂解液和20μLProteinase K，振荡混匀，65℃放置10min。然后加入350μL异丙醇，混匀后加入10μL磁珠(100mg/mL)振荡混匀1min，放置3min，置于磁力架上磁分离，吸去上清液；加入500μL5mol/L NaCl洗涤1次，置于磁力架上磁分离，吸去上清液，然后用Washing Buffer洗涤1次，置于磁力架上磁分离，吸去上清液，加入900μL80％乙醇漂洗，磁分离后室温晾干，加入50μL ddH2O洗脱，置于65℃水浴放置10min，置于磁力架吸附30s后，将所得液体转移至一干净的EP管内，即得到DNA提取液。
步骤2：分别根据NCBI中GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌invA基因、志贺氏菌ipaH基因的保守区域，利用MEGA5.0和Blast分析该基因的保守核苷酸序列，使用Primer Explorer V5.0在线引物设计软件设计3套nuc引物、3套invA引物和3套ipaH引物，分别以设计好的9套引物进行LAMP反应，在3套nuc引物、3套invA引物和3套ipaH引物中各自选取1套反应时间、扩增量、扩增效率三个方面综合最好的nuc引物、invA引物和ipaH引物。将设计完成的LAMP序列交由相关公司进行合成。
步骤3：选取三种致病菌各自较优的一组引物加入同一反应体系作为三重LAMP检测的引物。本发明设置了三种引物的配比方式，分别为：(1)引物nuc、引物invA、引物ipaH的浓度为其原浓度(3μmol/L)；(2)引物nuc、引物invA、引物ipaH的浓度为其原浓度的1/2(1.5μmol/L)；(3)引物nuc、引物invA、引物ipaH的浓度为其原浓度的1/3(1μmol/L)，三重LAMP引物配比优化结果如图5所示，在引物浓度为初始浓度(3μmol/L)时，阴性对照产生了阳性反应，所以选取引物nuc、引物invA、引物ipaH最优总浓度为1.5μmol/L。
步骤4：三重LAMP的初始反应体系：引物nuc、引物invA、引物ipaH总浓度为1.5μmol/L，10×LAMP buffer(200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH 4)2SO4，1.0％Tritonx-100)，10mmol/L dNTPs，0.8mmol/L Betaine，8U BstDNA聚合酶，2μL DNA模板，反应pH为8.8，ddH2O补足体积至25μL。
步骤5：LAMP反应体系的优化：以步骤4设定的三重LAMP初始反应体系作为反应体系优化的基础值，通过单重LAMP反应中反应体系的优化，可以得知金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌在反应条件优选范围内筛选出的最优条件基本相同且各反应条件下LAMP反应扩增趋势相似，因此，本次三重LAMP反应体系反应条件的优化以金黄色葡萄球菌为代表菌进行，对LAMP反应体系中几个关键的因素：反应温度、dNTPs浓度、Mg2+浓度进行优化。各反应均以ddH2O代替DNA模板设置阴性对照。
①反应温度的优化：本LAMP反应体系优化设置的反应温度为40℃，50℃，60℃，65℃，70℃，通过实时浊度仪的最终反应结果选择较优反应温度。
②dNTPs浓度的优化：本LAMP反应体系优化设置的dNTPs浓度为0mmol/L，0.6mmol/L，0.8mmol/L，1.0mmol/L，1.2mmol/L，1.4mmol/L，通过实时浊度仪的最终反应结果选择最优的dNTPs浓度。
③Mg2+浓度的优化：本LAMP反应体系优化设置的Mg2+浓度分别为0，2，4，6，8，10mmol/L，通过实时浊度仪的最终反应结果选择最优的Mg2+浓度。
④优化后的反应体系为：反应温度60℃，dNTPs浓度1.0mmol/L，Mg2+浓度4mmol/L，优化结果如附图图6～8所示。反应温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度的优选主要从反应开始的扩增时间、反应过程中的扩增效率、反应结束后的扩增量三个方面考虑；在最优的Mg2+浓度、dNTPs浓度和反应温度时金黄色葡萄球菌LAMP反应均表现出，较快开始扩增，反应过程中保持较高的扩增效率且反应结束后扩增量较高的趋势。
步骤6：反应体系置于LA-320c实时浊度仪中进行LAMP反应，随着反应的进行，阳性反应会产生焦磷酸镁乳白色沉淀，可以通过浊度显示实时观测。
步骤7：自制了模拟厕所样本，在经过灭菌的灰水中分别加入金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌，各细菌的添加量均为104CFU/mL。对配制好的模拟样本首先使用EMA进行前处理，加入EMA至终浓度为1μg/mL，混匀后室温内静置5min，于LED灯下曝光处理10min。将EMA处理过后的细菌悬液使用磁珠法提取DNA，对提取的DNA进行三重LAMP反应。实验结果以实时浊度仪判定，如图9和表5所示除阴性对照(模拟样品1)外，添加了三种目标病原菌的模拟样本均实现了扩增，模拟样品检出率为100％。且通过在反应体系中加入染料SYBR GreenI使三重LAMP检测的结果可视化，证明本反应过程无假阳性反应，实验结果如附图12所示，样品1为阴性对照(无细菌)且未检出证明无假阳性反应，样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8为阳性反应。
表5模拟厕所样本
菌株 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 志贺氏菌
模拟样品1 - - -
模拟样品2 + - -
模拟样品3 - + -
模拟样品4 - - +
模拟样品5 + + -
模拟样品6 - + +
模拟样品7 + - +
模拟样品8 + + +
步骤8：分别实际现场采集4个厕所的污水样本。每个厕所采集2个样本，共8个。对采集的实际样品首先使用EMA进行前处理，加入EMA至终浓度为1μg/mL，混匀后室温内静置5min，于LED灯下曝光处理10min。将EMA处理过后的细菌悬液使用磁珠法提取DNA，对提取的DNA进行三重LAMP反应。实验结果以实时浊度仪判定，如图10所示实际厕所的8个样本阳性检出率为50％，且通过在反应体系中加入染料SYBR Green I使三重LAMP检测的结果可视化，证明本反应过程无假阳性反应，实验结果如图13所示，样品1、样品2、样品7、样品8为阴性反应未检出，样品3、样品4、样品5、样品6为阳性反应检出。
以上所述仅是本发明较佳的实施例，并不用来限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之类。

Claims (9)

1.快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的LAMP引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1~6、SEQ ID No.19～24或/和SEQ ID No.37～42所示。
2.快速检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或/和志贺氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、采用叠氮溴乙锭对样本进行前处理，用磁珠法提取DNA；
步骤2、向步骤1提取好的DNA样本中加入LAMP反应体系，所述LAMP反应体系为单重反应体系或三重反应体系，所述单重反应体系包括1套nuc 引物、1套 invA引物或1套ipaH 引物，10×LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶， DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；所述三重反应体系包括1套nuc 引物、1套 invA引物和1套ipaH 引物，10×LAMP buffer，dNTPs，Betaine，8U Bst DNA聚合酶，DNA模板，ddH2O，反应pH为8.8；1套nuc 引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1~6所示，1套 invA引物核苷酸序列如SEQ ID No. 19～24所示；1套ipaH引物核苷酸序列如SEQ ID No. 37～42所示；
步骤3、将步骤2所得产物进行通过浊度仪进行检测。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，单重反应体系的反应温度为65℃。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，单重反应体系中dNTPs 浓度为0.6～1.4mmol/L；
优选的，步骤2中，单重反应体系中dNTPs 浓度为1.0mmol/L。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，单重反应体系中的10×LAMP buffer中Mg2+浓度为2～10mmol/L；
优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套nuc 引物时，Mg2+浓度为4～6mmol/L；
优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套invA 引物时，Mg2+浓度为4～8mmol/L；
优选的，步骤2中，单重反应体系的引物为1套ipaH 引物时，Mg2+浓度为4mmol/L。
6.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，三重反应体系的反应温度为60℃。
7.如权利要求2所述方法，其特征在于，具体的，步骤2中，三重反应体系中的10×LAMPbuffer中Mg2+浓度2～10mmol/L；
优选的，步骤2中，三重反应体系中的10×LAMP buffer中Mg2+浓度4mmol/L。
8.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，三重反应体系中3套引物总浓度为1～3μmol/L；
优选的，步骤2中，三重反应体系中3套引物总浓度为1.5μmol/L。
9.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2中，三重反应体系中dNTPs 浓度0.6～1.4mmol/L；
优选的，步骤2中，三重反应体系中dNTPs 浓度1.0mmol/L。
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