CN110358811B - 一种优化环介导等温扩增反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化环介导等温扩增反应的方法，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为将石墨烯量子点加入到环介导等温扩增反应体系当中进行核酸扩增。本方法可有效提高环介导等温扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高的检测效率。该方法可以被应用食品安全检测等领域，具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种优化环介导等温扩增反应的方法。
背景技术
环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，缩写为LAMP）是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术，可以广泛应用于食品安全检测等领域。该技术灵敏度高，在等温条件下扩增15min-1h即可产生109～1010倍的扩增子，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何优化环介导等温扩增反应，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，一直是该技术领域急需解决的技术难题。
石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots)一般是横向尺寸在100nm以下，纵向尺寸在几个纳米以下，具有一层、两层或者几层的石墨烯结构，具有生物低毒性、优异的水溶性、化学惰性、稳定的光致发光、良好的表面修饰等特性，在生物、医学、材料、新型半导体器件等领域具有重要潜在应用。张井岩和朱美栋（CN103773757B）公开了一种利用石墨烯量子点优化聚合酶链式反应的方法。作为与聚合酶链式反应作用原理不同的另一种核酸扩增技术——环介导等温扩增反应的优化方面，尚未见有石墨烯量子点应用的报道。
发明内容
针对现有环介导等温扩增检测技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明目的在于：提供一种优化环介导等温扩增反应的方法。采用本发明检测，可以提高检测灵敏度和特异性。
本发明目的提供以下方案实现：一种优化环介导等温扩增反应的方法，其特征在于，通过向环介导等温扩增反应体系中添加石墨烯量子点材料来实现对环介导等温扩增的优化，具体如下：
（1）扩增反应体系优化：将石墨烯量子点加入到环介导等温扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；
（2）核酸扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测。
其中，石墨烯量子点制备：石墨烯量子点试剂利用现有技术制备。
本发明通过向环介导等温扩增反应体系中添加石墨烯量子点材料来实现优化效果，提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法。
本发明提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法，能够进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，可以很好的解决在环介导等温扩增检测方面遇到的技术难题。
所述的环介导等温扩增反应体系优化，其中用量为：在25µL的核酸扩增反应体系中加入石墨烯量子点的终浓度为0.01-0.30 μg/L。
本发明方法中，在一具体实施方案中，所述核酸扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，1×聚合酶缓冲液，Mg2+ 2-9 mmol/L，dNTP1.0-1.6 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，石墨烯量子点0.01-0.30 μg/ L。例如，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含Tris-HCl(pH 8.8) 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 10 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO4 2mmol/L。1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理。本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
本发明方法中，扩增结果检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测（包括肉眼直接观察或借助仪器进行扩增曲线判断）等。
本发明为生物技术领域提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法。本发明有益效果包括：采用本发明检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点。与目前常用的环介导等温扩增检测方法相比，本发明通过向环介导等温扩增反应体系中添加石墨烯量子点材料来实现对环介导等温扩增的优化，操作简单，效果极佳，非常适于分子检测等领域推广使用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。
附图说明
附图1表明本发明实施例1石墨烯量子点提高金黄色葡萄球菌LAMP扩增反应体系的特异性；
附图2表明本发明实施例2石墨烯量子点提高沙门氏菌LAMP扩增反应体系的灵敏度。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
一种优化环介导等温扩增反应的方法，通过向金黄色葡萄球菌环介导等温扩增反应体系中添加石墨烯量子点材料来实现优化，按如下步骤：
（1）扩增反应体系优化：将石墨烯量子点加入到金黄色葡萄球菌环介导等温扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；
制备核酸扩增反应体系（除石墨烯量子点外），组成如下表：
其中引物FIP、BIP、F3和B3为金黄色葡萄球菌特异性核酸扩增引物，模板为金黄色葡萄球菌DNA（来源于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC 1.2465，菌株经培养后使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA），模板量为0（阴性对照）或1 ng。
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料石墨烯量子点，每25 µL的体系中加入1.0 µL的石墨烯量子点溶液（终浓度为0.05 µg/L），同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在63℃条件下进行核酸反应60 min。80℃终止反应5 min。
（3）将扩增产物加入Sybr Green I进行显色检测。
扩增结果如图1所示，样品1-2反应体系中没有添加优化材料石墨烯量子点，3-4添加了优化材料量子点，其中1和3模板量为1ng，2和4模板量为0（即阴性对照）。可以看出在没有添加石墨烯量子点的处理中，模板量为1 ng和0的反应体系均显色为亮绿色，表明存在非特异性扩增（即假阳性）；而在添加石墨烯量子点的处理中，模板量为1 ng的反应体系显色为亮绿色，判断为阳性，而模板为0的反应体系（即阴性对照）显色为橙色，判断为阴性。该核酸扩增结果显示，本发明可以消除非特异性扩增，避免假阳性，优化效果显著。
实施例2
一种优化环介导等温扩增反应的方法，通过向沙门氏菌环介导等温扩增反应体系中添加石墨烯量子点材料来实现优化，按如下步骤：
（1）扩增反应体系优化：将石墨烯量子点加入到沙门氏菌环介导等温扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；
制备核酸反应体系，组成见实施例1，不同之处在于引物FIP、BIP、F3和B3为沙门氏菌特异性环介导等温扩增引物，模板为沙门氏菌DNA，并做了系列稀释，分别为0-1000 fg。石墨烯量子点加样量为1.0 µL（终浓度为0.2 μg/ L）。
（2）向以上体系中加入处理过的优化材料石墨烯量子点，每个25µL的体系中加入1.0 µL的石墨烯量子点溶液（终浓度为0.2 µg/L），同时做不加优化材料的相应对照实验。然后在63℃条件下进行核酸反应60 min。80℃终止反应5 min。
（3）对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图2所示。图中样品从左至右反应体系中加入的沙门氏菌模板的量分别为0（即阴性对照）、1000fg、100fg、10fg和5fg，第一组不加入本发明优化材料石墨烯量子点，第二组加入本发明优化材料石墨烯量子点。从图中可以看出，未加入优化材料石墨烯量子点的体系在模板量为1000fg和100fg的样品管显色为亮绿色，判断为阳性，而模板量为0、10fg和5fg的样品管显色为橙色，判断为阴性，表明不添加优化材料石墨烯量子点的反应体系最低可检测到100 fg的模板（相当于20个细菌）；而加入优化材料石墨烯量子点的体系模板量为1000fg、100fg和10fg的样品管显色为亮绿色，判断为阳性，而模板量为0和5fg的样品管显色为橙色，判断为阴性，表明添加优化材料石墨烯量子点的反应体系最低可检测到10 fg的模板（相当于2个细菌）。该核酸扩增结果显示，本发明可以提高反应灵敏度，优化效果显著。
Claims (2)
1.一种优化环介导等温扩增反应的方法，其特征在于，通过向环介导等温扩增反应体系中添加石墨烯量子点材料来实现优化，包括如下步骤：
（1）扩增反应体系优化：将石墨烯量子点加入到环介导等温扩增反应体系当中，然后进行核酸扩增；
（2）核酸扩增产物检测：可通过电泳检测、浊度检测或显色检测；其中，
在25 µL的核酸扩增反应体系中加入石墨烯量子点的终浓度为0.05-0.2μg/L。
2.根据权利要求1所述的一种优化环介导等温扩增反应的方法，其特征在于，核酸扩增反应体系包括外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，1×聚合酶缓冲液，Mg2+ 2-9 mmol/L，dNTP1.0-1.6 mmol/L，甜菜碱0-1.5 mol/L，石墨烯量子点0.05-0.2μg/L L；其中，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液选用1×Thermopol反应缓冲液，包含pH 8.8的Tris-HCl 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 10 mmol/L，0.1%Triton X-100，MgSO4 2 mmol/L；1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO4和酶反应体系中的镁离子Mg2+做合并处理；恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。
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