CN112626174B - 一种细胞裂解液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞裂解液及其应用。该细胞裂解液由A组分和B组分组成；其中，A组分由3～600mmol/L碱溶液和0.1mmol/L～7mmol/L SDS组成；B组分由3～600mmol/L Tris、8～1100mmol/L氯化盐和0.5～110mmol/L EDTA组成，pH为7～10；使用时A组分与B组分的体积比为(3～50)：1。该细胞裂解液不包含氯仿等有毒试剂，由常见的试剂组成，成本低，并且操作步骤简单，可快速将细胞中的核酸释放出来，大大节省核酸提取时间；并且可从微量的细胞(细胞个数小于等于2x104个)中提取出足够量的核酸用于PCR鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞裂解液及其应用。
背景技术
基因编辑技术是对细胞中的DNA序列进行精准操作从而改变细胞命运和生物体特征的技术，该技术为提高人类对于遗传学的理解以及遗传疾病的治疗提供了重要的工具。尤其是CRISPR-Cas9基因编辑技术的发明，为基因编辑技术的发展带来了革命性的变化。CRISPR-Cas9技术使得基因编辑操作变得简单快捷，但在筛选基因编辑突变体方面，尤其是细胞基因编辑突变体环节，仍旧费时费力。为了获得纯合的基因编辑细胞株，需要对基因编辑细胞进行单克隆筛选，将单个细胞接种到96孔微孔板中培养，经过48孔板，24孔板，12孔板，6孔板逐步扩增，再取其一部分进行核酸提取，做基因型鉴定。
细胞核酸的提取以离心柱法和磁珠法居多，酚氯仿抽提因其试剂有毒性较少使用，且这些方法都无法从微量的细胞中提取出足够量的DNA用于做PCR基因型鉴定，需要细胞扩增到6孔以上的量方可进行抽提，等待细胞扩增的时间较长且步骤繁琐。专利文献CN108841729A公开了一种用于真菌和细菌的细胞裂解液，所述细胞裂解液由NaOH、十二烷基硫酸钠(SDS)和蒸馏水组成，其中，NaOH浓度为4mmol/L，SDS重量百分比含量为2％；专利文献CN107574166A公开了一种用于提取大豆种子基因组DNA的细胞裂解液，其中，所述细胞裂解液为含有0.015～0.025g/mL的SDS，0.04～0.06mol/L的Tris-HCl，0.04～0.06mol/L的EDTA，以及0.14～0.16mol/L的NaCl的纯水溶液；所述细胞裂解液的pH值为8；但是上述细胞裂解液均无法从微量的细胞中提取出足够量的DNA用于做PCR基因型鉴定。
发明内容
为了克服现有细胞裂解液无法从微量的细胞中提取出足够量的DNA用于PCR基因型鉴定的不足，本发明第一个方面的目的，在于提供一种细胞裂解液。
本发明的第二方面的目的，在于提供上述细胞裂解液在提取核酸中的应用。
本发明的第三方面的目的，在于提供一种提取核酸的方法。
本发明的第四方面的目的，在于提供一种包含上述细胞裂解液的试剂盒。
本发明的第五方面的目的，在于提供第一方面的细胞裂解液或第四方面的试剂盒在PCR鉴定中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种细胞裂解液，由A组分和B组分组成；
其中，A组分由3～600mmol/L碱溶液和0.1mmol/L～7mmol/L SDS(十二烷基硫酸钠)组成；
B组分由3～600mmol/L Tris、8～1100mmol/L氯化盐和0.5～110mmol/L EDTA组成，pH为7～10。
优选的，一种细胞裂解液，由A组分和B组分组成；
其中，A组分由5～200mmol/L碱溶液和0.2mmol/L～3.5mmol/L SDS(十二烷基硫酸钠)组成；
B组分由5～500mmol/L Tris、10～1000mmol/L氯化盐和1～100mmol/L EDTA组成，pH为7～9。
进一步优选的，一种细胞裂解液，由A组分和B组分组成；
其中，A组分由100mmol/L碱溶液和2.5mmol/L～3.5mmol/L SDS(十二烷基硫酸钠)组成；
B组分由200mmol/L Tris、150mmol/L氯化盐和20mmol/L EDTA组成，pH为8。
优选的，所述碱为NaOH。
优选的，所述氯化盐为NaCl或KCl。
优选的，使用时A组分与B组分的体积比为(3～50)：1；进一步优选的，使用时A组分与B组分的体积比为(4～50)：1。
本发明的第二方面，提供上述细胞裂解液在提取核酸中的应用。
本发明的第三方面，提供一种提取核酸的方法，包括如下步骤：1)将待提取样品与上述细胞裂解液的A组分混合，得到混合液A；2)将混合液A置于80℃～100℃孵育5～20min；3)将孵育后的混合液A与上述细胞裂解液的B组分混合。
本发明的第四方面，提供一种包含第一方面的细胞裂解液的试剂盒。
一种试剂盒，包含上述细胞裂解液。
所述试剂盒还包含2x Taq Mix、无菌水(ddH2O)。
所述2x Taq Mix包含Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs。
本发明的第五方面，提供第一方面的细胞裂解液或第四方面的试剂盒在PCR鉴定中的应用。
优选的，所述PCR鉴定为单克隆细胞PCR鉴定；单克隆细胞即由1个细胞增殖获得的细胞团。
本发明的有益效果是：
本发明提供的细胞裂解液不包含氯仿等有毒试剂，由常见的试剂组成，成本低，并且操作步骤简单，可快速将细胞中的核酸释放出来，大大节省核酸提取时间；并且可从微量的细胞(细胞个数小于等于2x 104个)中提取出足够量的核酸用于PCR鉴定。
附图说明
图1是效果实施例1中A组分与B组分不同的添加方式处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是实施例4～7的裂解液处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是实施例3的细胞裂解液、对比例1的细胞裂解液及10倍稀释后的对比例1的细胞裂解液处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图：其中，A为对比例1的细胞裂解液处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图；B为10倍稀释后的对比例1的细胞裂解液处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图；C为实施例3的细胞裂解液处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是实施例3的细胞裂解液、对比例1的细胞裂解液及10倍稀释后的对比例1的细胞裂解液处理后PCR成功率图。
图5是实施例3、对比例2、对比例3的细胞裂解液处理后PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
实施例1一种细胞裂解液
一种细胞裂解液，由A组分和B组分组成，A组分和B组分的原料组成如下：
A组分：5mmol/L NaOH、0.2mmol/L十二烷基硫酸钠；
B组分：5mmol/L Tris、10mmol/L KCl、1mmol/L EDTA，pH7.0；
使用时A组分与B组分的体积比为3:1。
实施例2一种细胞裂解液
一种细胞裂解液，由A组分和B组分组成，A组分和B组分的原料组成如下：
A组分：100mmol/L NaOH、2.5mmol/L十二烷基硫酸钠；
B组分：200mmol/L Trisl、150mmol/L KCl、20mmol/L EDTA，pH8.0；
使用时A组分与B组分的体积比为3:1。
实施例3一种细胞裂解液
一种细胞裂解液，由A组分和B组分组成，A组分和B组分的原料组成如下：
A组分：200mmol/L NaOH、3.5mmol/L十二烷基硫酸钠；
B组分：500mmol/L Tris、1000mmol/L KCl、100mmol/L EDTA，pH9.0；
使用时A组分与B组分的体积比为3:1。
实施例4一种细胞裂解液
本实施例的细胞裂解液与实施例2的相同，区别仅在于：使用时A组分与B组分的体积比为1:1。
实施例5一种细胞裂解液
本实施例的细胞裂解液与实施例2的相同，区别仅在于：使用时A组分与B组分的体积比为4:1。
实施例6一种细胞裂解液
本实施例的细胞裂解液与实施例2的相同，区别仅在于：使用时A组分与B组分的体积比为20:1。
实施例7一种细胞裂解液
本实施例的细胞裂解液与实施例2的相同，区别仅在于：使用时A组分与B组分的体积比为50:1。
对比例1M5超光速mix(购于北京聚合美生物科技有限公司)中的细胞裂解液。
对比例2专利文献CN108841729A提供的细胞裂解液。
对比例3专利文献CN107574166A中实施例1提供的细胞裂解液。
效果实施例1A组分与B组分的添加方式对DNA提取的影响
(1)A组分与B组分分步处理样品
1)在96孔细胞培养板中取6孔每孔接种相同量的293T细胞，第二天等细胞贴壁长满(细胞个数为1x104～2x104)，从培养箱中取出；
2)用移液器将培养板中的培养基吸走，每孔加入80μL A组分，然后用移液器吹打；
3)将液体转移到96孔PCR板中，放入PCR仪内，95℃孵育5分钟；
4)将96孔PCR板从PCR仪中取出，每孔加入20μL B组分，用移液器吹打混匀，得到裂解产物。
(2)A组分与B组分同时添加至样品
1)在96孔细胞培养板中取6孔每孔接种相同量的293T细胞，第二天等细胞贴壁长满(细胞个数为1x104～2x104)，从培养箱中取出；
2)用移液器将培养板中的培养基吸走，每孔加入80μL A组分及20μL B组分，然后用移液器吹打；
3)将液体转移到96孔PCR板中，放入PCR仪内，95℃孵育5分钟；
4)将96孔PCR板从PCR仪中取出，得到裂解产物。
(3)PCR鉴定裂解效果
分别取3uL裂解产物作为模板，进行PCR反应(PCR反应体系如表1所示：引物F：CTTATTTTGATTTTACAAAGACAGTTAAG(SEQ ID NO.1)；引物R：CACAGTTCCTTTTTCT TTTGAATATAAC(SEQ ID NO.2)，反应程序如表2所示)，然后取10uLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示：Mraker左边为A组分与B组分分步处理样品后的结果，有六条条带，PCR成功率为100％；Mraker右边为A组分与B组分同时添加至样品后的结果，有四条条带，PCR成功率为66.7％，并且Mraker左边的条带的亮度比Mraker右边的条带强；表明A组分与B组分分步处理样品效果更好。
表1PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 裂解产物 | 3μL |
| 2x Taq Mix | 25μL |
| 引物F(10μM) | 1μL |
| 引物R(10μM) | 1μL |
| 无菌水 | To 50μL |
表2PCR反应程序
效果实施例2A组分与B组分的体积比对裂解效果的影响
分别取实施例4～7的裂解液处理293T细胞(具体步骤参考效果实施例1中第(1)部分)，然后分别取3uL裂解产物作为模板，进行PCR反应(PCR反应体系如表1所示，反应程序如表2所示)，然后取10uLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示：从左到右，第1～4孔为实施例4的裂解液处理后的结果，第5、18孔为Mraker，第6～9孔为实施例7的裂解液处理后的结果，第10～13孔为实施例6的裂解液处理后的结果，第14～17孔为实施例5的裂解液处理后的结果，可见实施例4(A组分与B组分的体积比为1:1)的效果最差，实施例5(A组分与B组分的体积比为4:1)的效果最好。
效果实施例3本发明提供的细胞裂解液与市售细胞裂解液的效果对比
分别取实施例3的细胞裂解液(具体步骤参考效果实施例1中第(1)部分)、M5超光速mix中的细胞裂解液(对比例1提供的细胞裂解液)以及10倍稀释的M5超光速mix中的细胞裂解液(具体步骤参考效果实施例1中第(2)部分)处理293T细胞，然后分别取3uL裂解产物作为模板，进行PCR反应(PCR反应体系如表1所示，反应程序如表2所示)，然后取10uLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3中A～C、4所示：C为实施例3的细胞裂解液处理后的结果，有24条条带，PCR成功率为100％；A为M5超光速mix中的细胞裂解液处理后的结果，有9条条带，PCR成功率为37.5％；B为M5超光速mix中的细胞裂解液10倍稀释后处理的结果，有4条条带，PCR成功率为16.7％；表明本发明提供的细胞裂解液的效果显著好于市售产品。
效果实施例3本发明提供的细胞裂解液与专利文献CN108841729A、CN107574166A中细胞裂解液的效果对比
分别取实施例3的细胞裂解液(具体步骤参考效果实施例1中第(1)部分)、对比例2(具体步骤参考效果实施例1中第(2)部分)、对比例3的细胞裂解液(具体步骤参考效果实施例1中第(2)部分)处理293T细胞，然后分别取3uL裂解产物作为模板，进行PCR反应(PCR反应体系如表1所示，反应程序如表2所示)，然后取10uLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示：从左向右，第1～6孔为对比例2的细胞裂解液处理后的结果，PCR反应失败，没有扩增出目的条带，还有很多杂带；第7、14孔为Mraker；第8～13孔为对比例3的细胞裂解液处理后的结果，PCR反应失败，没有扩增出目的条带，还有很多杂带；第15～20孔为实施例3的细胞裂解液处理后的结果，PCR成功率为100％，且条带特异单一；表明本发明提供的细胞裂解液的效果优于对比例2、3。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州源井生物科技有限公司
<120> 一种细胞裂解液及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttattttga ttttacaaag acagttaag 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacagttcct ttttcttttg aatataac 28
Claims (1)
1.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将待提取样品与细胞裂解液的A组分混合，得到混合液A；
2)将混合液A置于80℃～100℃孵育5～20min；
3)将孵育后的混合液A与细胞裂解液的B组分混合；
其中，所述细胞裂解液由A组分和B组分组成，所述A组分由100～200mmol/LNaOH溶液和2.5～3.5mmol/L SDS组成；
所述B组分由200～500mmol/L Tris、150～1000mmol/L氯化盐和20～100mmol/LEDTA组成，pH为8～10，所述氯化盐为NaCl或KCl；
使用时所述A组分与所述B组分的体积比为3：1；
所述待提取样品为293T细胞。
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