CN112111561A - 一种适用于ffpe样本的建库试剂盒、建库方法及用途 - Google Patents

一种适用于ffpe样本的建库试剂盒、建库方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112111561A
CN112111561A CN201911016298.4A CN201911016298A CN112111561A CN 112111561 A CN112111561 A CN 112111561A CN 201911016298 A CN201911016298 A CN 201911016298A CN 112111561 A CN112111561 A CN 112111561A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
adaptor
ligase
double
library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201911016298.4A
Other languages
English (en)
Inventor
魏子涵
王晓娜
王艳茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Rols Biotech Co ltd
Original Assignee
Shanghai Rols Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Rols Biotech Co ltd filed Critical Shanghai Rols Biotech Co ltd
Publication of CN112111561A publication Critical patent/CN112111561A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种适用于FFPE样本的建库试剂盒，建库方法及用途，所述建库试剂盒包括去RNA与去磷酸化试剂、碱基与末端修复试剂、P7接头、P7接头连接酶、P5接头、P5接头连接酶和DNA扩增试剂。本发明的建库试剂盒对50ng起始量的FFPE样本经过去RNA与去磷酸化、连接P7接头、连接P5接头、DNA扩增后，可得到1μg以上的文库产量；本发明的建库试剂盒中的P7接头、P5接头含有双端8碱基索引(index)，方便高通量测序混库操作。

Description

一种适用于FFPE样本的建库试剂盒、建库方法及用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种适用于FFPE样本的建库试剂盒、采用该试剂盒进行文库建立的方法及在制备FFPE样本测序产品中的用途。
背景技术
疾病研究和病理分析中，通过手术、穿刺等方式获取的组织样本离开机体后，很快就会发生死亡及组织腐败，丧失正常的结构和功能。因此，离体的组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以避免细胞组织死亡，进而进行形态结构、免疫或分子分析。福尔马林固定石蜡包埋样本(FFPE样本)成为病理学、法医病理学等进行样本保存的最主要手段。对组织样本进行FFPE保存，有助于研究人员更加全面地了解病理标本中所包含的遗传机制和病理成因。目前，全球约有2-4亿FFPE样本，这些样本已经是疾病诊断和科学研究的最为宝贵的生物学资源之一。随着基因组学检测技术的快速发展，尤其新一代测序技术(NGS)的飞速发展，在细胞分子水平提供了前所未有的检测能力，研究人员可以使用这一技术手段，寻找疾病与基因关系。
然而，在FFPE样本的制备和贮存过程中，样本经福尔马林固定、石蜡包埋后很容易引起DNA的交联和降解，大量碱基发生脱氨现象，这些会降低后续建库体系中酶的活性，因此，研究人员很难获得足量的、高质量的DNA样本，这对测序技术本身提出了较高要求。
英国NEB(New England Biolabs)公司开发了一种针对FFPE样本的修复体系，包含碱基缺失修复、氧化碱基修复、脱氨碱基修复、残缺碱基连接等功能，可以提高FFPE样本在文库构建过程中的丰度，被抽提的核酸可利用的占比高，从而提高了文库构建的效率和文库质量。目前，有一些国内公司在模仿NEB公司的技术，但是仍无法保证FFPE样本能够顺利建库。
发明内容
为了解决FFPE样本在建库时产率低、失败率高的问题，本发明的目的是提供一种适用于FFPE样本的建库试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种适用于FFPE样本的建库试剂盒，包括去RNA与去磷酸化试剂、碱基与末端修复试剂、P7接头、P7接头连接酶、P5接头、P5接头连接酶和DNA扩增试剂。
优选地，所述去RNA与去磷酸化试剂用于对FFPE样本基因组DNA进行去RNA与去磷酸化处理；所述碱基与末端修复试剂用于对FFPE样本基因组DNA进行碱基与末端修复；所述P7接头用于连接到获得碱基与末端修复的FFPE样本基因组双链DNA的一端，获得一端带有接头的双链DNA；所述P7接头连接酶用于连接P7接头与FFPE样本基因组双链DNA；所述P5接头用于连接到所述一端带有接头的双链DNA的另一端，形成双端带有接头的双链DNA；所述P5接头连接酶用于连接P5接头与FFPE样本基因组双链DNA；所述DNA扩增试剂用于对所述双端带有接头的双链DNA进行扩增，获得测序文库。
优选地，所述P7接头对应的碱基序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24中的任意一个。
优选地，所述P5接头对应的碱基序列选自SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.48中的任意一个。
优选地，所述P7接头连接酶为T4连接酶。
优选地，所述P5接头连接酶选自Taq连接酶，T4 DNA聚合酶，5’端外切酶中的任意一种。
优选地，所述DNA扩增试剂包括DNA聚合酶，dNTPs，DNA聚合酶缓冲液，上游引物和下游引物，所述上游引物对应的碱基序列为SEQ ID NO.49，所述下游引物对应的碱基序列为SEQ ID NO.50。
本发明的第二方面，提供上述的建库试剂盒对FFPE样本进行文库建立的方法，包括如下步骤：
S1，采用去RNA与去磷酸化试剂对FFPE样本基因组DNA进行去RNA与去磷酸化处理；
S2，将S1获得的DNA通过P7接头连接酶与P7接头连接，获得一端带有接头的双链DNA；
S3，将S2获得的双链DNA通过P5接头连接酶与P5接头连接，形成双端带有接头的双链DNA；
S4，采用DNA扩增试剂对S3获得的双端带有接头的双链DNA进行扩增，获得测序文库。
本发明的第三方面，提供上述的建库试剂盒在制备FFPE样本测序产品中的用途。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：
(1)本发明的建库试剂盒对50ng起始量的FFPE样本经过去RNA与去磷酸化、连接P7接头、连接P5接头、DNA扩增后，可得到1μg以上的文库产量；
(2)本发明的建库试剂盒中的P7接头、P5接头含有双端8碱基索引(index)，方便高通量测序混库操作；
(3)本发明的建库试剂盒采用平端、分步接头连接，先连接P7接头以及与P7接头3’末端5-15nt碱基互补的Linker连接体，再通过酶促反应连接P5接头，具有极高的连接效率，接头利用率高于90％。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为本发明建库试剂盒处理后的FEPP样本进行灵敏度检测的结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
(一)去RNA与去磷酸化处理
1、按照表1配制处理液
表1
试剂 体积/μl
去磷酸化溶液 18
去磷酸化酶 1
RNaseA酶/Low-EDTA TE溶液 1
总体积 20
其中，去磷酸化溶液包括20mM Tris-盐酸缓冲液，50mM醋酸钾，10mM氯化镁和1mM氯化锌。
其中，去磷酸化酶为小牛肠来源碱性磷酸酶。
其中，RNaseA酶为单链RNA水解酶。
RNaseA酶对FFPE样本中的核酸DNA进行消化，确保无RNA的残留，避免RNA残留影响后续文库的构建效率。
当FFPE样本抽提核酸RNA残留浓度小于1ng/μl时，可以不加入RNaseA酶，使用Low-EDTA TE溶液(低浓度乙二胺四乙酸的Tris-盐酸溶液),Low-EDTA TE溶液中含有＜0.1mM的Tris-盐酸缓冲液。
2、取上述配制的处理液加入起始FFPE样本中，样本的用量为40μl，然后使用移液器进行往复吸吹混匀；放置于PCR仪器，采用表2中的反应条件进行反应。
表2
温度 时间
37℃ 20min
65℃ 2min
37℃ 5min
3、磁珠纯化
(1)向反应后的FFPE样本中加入84μl DNA纯化磁珠，使用移液器进行往复吸吹混匀；
(2)室温放置5min；
(3)放置于磁力架，静置2-5min；
(4)待上清澄清后，丢弃上清液；
(5)使用200μl 80％乙醇洗涤磁珠，然后丢弃上清液，重复数次。
上述的DNA纯化磁珠选用Beckman Coulter公司生产的AMPure XP磁珠、美基生物(Magen)生产的A4 XP磁珠、诺唯赞生物(Vazyme)生产的VAHTS DNA Clean Beads中的任意一种。
(二)碱基修复与末端修复
1、按照表3配制修复液
表3
试剂 体积/μl
修复溶液 46
末端修复酶 2
碱基修复酶 2
总体积 50
其中，修复溶液包括20mM Tris-盐酸缓冲液，1mM二硫苏糖醇，10mM氯化镁。
其中，末端修复酶选自Klenow大片段，T4 DNA聚合酶，T4磷酸化激酶，Taq聚合酶中的任意一种。
其中，碱基修复酶选自甲酰嘧啶糖苷酶、非限制性内切酶IV、非限制性内切酶VIII、尿嘧啶DNA糖基化酶、8氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶、T4嘧啶二聚体糖苷酶中的一种或多种的混合。
甲酰嘧啶糖苷酶、非限制性内切酶IV、非限制性内切酶VIII为具有切除碱基缺失位点功能的非限制性内切酶；尿嘧啶DNA糖基化酶为具有切除脱氨配对碱基功能的酶；8氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶为具有切除氧化配对碱基功能的酶；T4嘧啶二聚体糖苷酶为具有碱基结构修复功能的酶。
2、取表3配制的修复液加入磁珠纯化后的FFPE样本中，使用移液器进行往复吸吹混匀；放置于PCR仪器上，于20℃温度下反应20min。
3、磁珠纯化
(1)向上述修复后的FFPE样本中加入60μl PEG/NaCl溶液，使用移液器进行往复吸吹混匀；
(2)室温放置5min；
(3)放置于磁力架，静置2-5min；
(4)待上清澄清后，丢弃上清液；
(5)使用200μl 80％乙醇洗涤磁珠，然后丢弃上清液，重复数次。
(三)P7接头连接
1、按照表4配制连接反应预混液
表4
试剂 体积/μl
快速连接溶液 23
快速连接酶 2
总体积 25
其中快速连接溶液包括50mM Tris-盐酸缓冲液、10mM氯化镁、1mM三磷酸腺苷、10mM二硫苏糖醇、10-25％聚乙二醇。
其中快速连接酶为T4连接酶，用量为80-250万单位/ml。
2、取表4中的连接反应预混液加入上述纯化后的FFPE样本中，然后加入5μl P7接头连接预混液，其中接头预混液为P7接头以及与P7接头3’末端5-15nt碱基互补的Linker连接体，溶解在Low-EDTA TE缓冲液中制得，P7接头的浓度为20μM；使用移液器进行往复吸吹混匀；放置于PCR仪器，在22℃下反应15min。
3、磁珠纯化
(1)向上述P7接头连接后的FFPE样本中加入30μl PEG/NaCl溶液，使用移液器进行往复吸吹混匀；
(2)室温放置5min；
(3)放置于磁力架，静置2-5min；
(4)待上清澄清后，丢弃上清液；
(5)使用200μl 80％乙醇洗涤磁珠，然后丢弃上清液。
(四)P5接头连接
1、按照表5配制P5接头连接预混液
表5
试剂 体积/μl
连接溶液Ⅰ 35
连接溶液Ⅱ 11
连接酶 4
总体积 50
其中连接溶液Ⅰ为P5接头溶解在Low-EDTA TE缓冲液中制得，P5接头的浓度为20μM；连接溶液Ⅱ包括50mM Tris-盐酸缓冲液、10mM氯化镁、1mM三磷酸腺苷和10mM二硫苏糖醇，连接酶为Taq连接酶、T4 DNA聚合酶、5’端外切酶中的任意一种或多种的混合。
2、取表5中的P5接头连接预混液加入上述P7接头连接后的FFPE样本中，然后使用移液器进行往复吸吹混匀；放置于PCR仪器，在40℃下反应15min。
3、磁珠纯化
(1)向上述P5接头连接后的FFPE样本中加入50μl PEG/NaCl溶液，使用移液器进行往复吸吹混匀；
(2)室温放置5min；
(3)放置于磁力架，静置2-5min；
(4)待上清澄清后，丢弃上清液；
(5)使用200μl 80％乙醇洗涤磁珠，然后丢弃上清液，重复数次；
(6)使用20μl Low-EDTA TE溶液重悬磁珠，室温静置1min；
(7)再次放置于磁力架，静置2-5min；
(8)吸取20μl上清液作为DNA模板，用于后续PCR扩增反应。
P7接头、P5接头分别含有8碱基索引(index)，可选择的索引(index)如表6所示。
表6
Figure BDA0002245821180000061
Figure BDA0002245821180000071
(五)DNA扩增
1、按照表7配制PCR扩增体系
表7
试剂 体积/μl
PCR反应液 25
PCR引物对溶液 3
DNA模板 20
Low-EDTA TE溶液 2
总体积 50
其中，PCR反应液包括pfu酶(5活性单位)、25mM Tris-盐酸缓冲液、50mM氯化钾、5mM氯化镁、1mM二硫苏糖醇、200μM dNTP、Tween 20，PCR引物对溶液包括3μl上游引物和3μl下游引物，上游引物对应的碱基序列为SEQ ID NO.49，下游引物对应的碱基序列为SEQ IDNO.50。
2、根据样本情况参照表8选择PCR扩增循环数进行反应
表8
Figure BDA0002245821180000072
Figure BDA0002245821180000081
3、按照表9的反应条件进行扩增反应
表9
Figure BDA0002245821180000082
4、磁珠纯化
(1)向扩增反应后的FFPE样本中加入50μl DNA纯化磁珠，使用移液器进行往复吸吹混匀；
(2)室温放置5min；
(3)放置于磁力架，静置2-5min；
(4)待上清澄清后，丢弃上清液；
(5)使用200μl 80％乙醇洗涤磁珠，然后丢弃上清液，重复数次；
(6)使用20μl Low-EDTA TE buffer溶液重悬磁珠，室温静置1min；
(7)再次放置于磁力架，静置2-5min；
(8)吸取20μl上清液，用于后续文库鉴定。
实施例二
将实施例1处理后的FFPE样本通过安捷伦4200分析仪D1000进行灵敏度检测，检测结果如图1。
图1为构建成的FFPE样本文库生物分析峰图，投入文库原始浓度为20ng/ul，稀释10倍，横坐标表示根据核酸样品迁移率计算出的核酸分子量大小，纵坐标为相对荧光值，荧光值越大表示该片段大小的核酸量越大，在25bp处和1500bp处有检测卡夹自带的生物标记尺Marker对应的峰，从上图可以看出，文库平均大小在320bp处，由峰图积分计算的浓度为2ng/ul，表明符合上机要求的文库，采用本发明的试剂盒对FFPE样本建库成功。
序列表
<110> 上海融享生物科技有限公司
<120> 一种适用于FFPE样本的建库试剂盒、建库方法及用途
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcctgatcgt atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcactctcga atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tctgagctag atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcgagacgat atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 5
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tccttgtcga atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 6
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcttccaagg atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 7
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 7
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tccgcatgat atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 8
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 8
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacggaaca atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 9
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 9
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tccggctaat atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 10
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 10
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcatcgatcg atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 11
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 11
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcgcaagatc atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 12
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 12
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcgctatcct atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 13
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 13
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tctacgctac atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 14
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 14
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tctggactct atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 15
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 15
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcagagtagc atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 16
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 16
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcatccagag atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 17
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 17
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcgacgatct atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 18
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 18
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcaactgagc atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 19
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 19
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tccttaggac atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 20
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 20
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcgtgccata atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 21
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 21
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcgaatccga atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 22
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 22
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tctcgctgtt atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 23
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 23
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcttcgttgg atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 24
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 24
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcaagcactg atctcgtatg ccgtcttctg 60
cttg 64
<210> 25
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 25
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tatgcgcaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 26
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 26
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ggtacagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 27
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 27
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca accgttcaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 28
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 28
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact aaccggtaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 29
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 29
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg aacatcgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 30
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 30
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc cttgtagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 31
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 31
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact caggcttaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 32
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttctcgtaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 33
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 33
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gaacgagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 34
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 34
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gcttccaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 35
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ttcgactaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 36
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 36
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc acctgttaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 37
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 37
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tcacacgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 38
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 38
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gtaagaacac tctttcccta cacgacgctc 60
ttccgatct 69
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 39
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact acgccttaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 40
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 40
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gacgttaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 41
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 41
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tgcacgaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 42
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 42
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ctgattgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 43
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 43
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taggagtaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 44
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 44
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctaggagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 45
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 45
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc actagctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 46
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 46
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca cgacttgaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 47
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 47
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gtgtgtaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 48
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 48
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttgacctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 49
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 50
agatcggaag agcacacgtc 20

Claims (9)

1.一种适用于FFPE样本的建库试剂盒，其特征在于，包括去RNA与去磷酸化试剂、碱基与末端修复试剂、P7接头、P7接头连接酶、P5接头、P5接头连接酶和DNA扩增试剂。
2.如权利要求1所述的建库试剂盒，其特征在于，
所述去RNA与去磷酸化试剂用于对FFPE样本基因组DNA进行去RNA与去磷酸化处理；
所述碱基与末端修复试剂用于对FFPE样本基因组DNA进行碱基与末端修复；
所述P7接头用于连接到获得碱基与末端修复的FFPE样本基因组双链DNA的一端，获得一端带有接头的双链DNA；
所述P7接头连接酶用于连接P7接头与FFPE样本基因组双链DNA；
所述P5接头用于连接到所述一端带有接头的双链DNA的另一端，形成双端带有接头的双链DNA；
所述P5接头连接酶用于连接P5接头与FFPE样本基因组双链DNA；
所述DNA扩增试剂用于对所述双端带有接头的双链DNA进行扩增，获得测序文库。
3.如权利要求1或2所述的建库试剂盒，其特征在于，所述P7接头对应的碱基序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24中的任意一个。
4.如权利要求1或2所述的建库试剂盒，其特征在于，所述P5接头对应的碱基序列选自SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.48中的任意一个。
5.如权利要求1或2所述的建库试剂盒，其特征在于，所述P7接头连接酶为T4连接酶。
6.如权利要求1或2所述的建库试剂盒，其特征在于，所述P5接头连接酶选自Taq连接酶，T4 DNA聚合酶，5’端外切酶中的任意一种。
7.如权利要求1或2所述的建库试剂盒，其特征在于，所述DNA扩增试剂包括DNA聚合酶，dNTPs，DNA聚合酶缓冲液，上游引物和下游引物，所述上游引物对应的碱基序列为SEQ IDNO.49，所述下游引物对应的碱基序列为SEQ ID NO.50。
8.采用如权利要求1-7任一项所述的建库试剂盒对FFPE样本进行文库建立的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，采用去RNA与去磷酸化试剂对FFPE样本基因组DNA进行去RNA与去磷酸化处理；
S2，将S1获得的DNA通过P7接头连接酶与P7接头连接，获得一端带有接头的双链DNA；
S3，将S2获得的双链DNA通过P5接头连接酶与P5接头连接，形成双端带有接头的双链DNA；
S4，采用DNA扩增试剂对S3获得的双端带有接头的双链DNA进行扩增，获得测序文库。
9.如权利要求1-7任一项所述的建库试剂盒在制备FFPE样本测序产品中的用途。
CN201911016298.4A 2019-06-19 2019-10-24 一种适用于ffpe样本的建库试剂盒、建库方法及用途 Withdrawn CN112111561A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019105322396 2019-06-19
CN201910532239 2019-06-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112111561A true CN112111561A (zh) 2020-12-22

Family

ID=73796585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911016298.4A Withdrawn CN112111561A (zh) 2019-06-19 2019-10-24 一种适用于ffpe样本的建库试剂盒、建库方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112111561A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111005074A (zh) * 2019-12-19 2020-04-14 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111005074A (zh) * 2019-12-19 2020-04-14 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 一种基于illumina测序平台的DNA文库构建试剂盒、文库构建方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017299803B2 (en) Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
CN108300716B (zh) 接头元件、其应用和基于不对称多重pcr进行靶向测序文库构建的方法
EP2770090B1 (en) Method for preparing nucleic acid library, its uses and kits
EP4183886B1 (en) Method for nucleic acid amplification
CN110546272B (zh) 将衔接子附接至样品核酸的方法
US10648032B2 (en) High-throughput sequencing method for methylated CpG island in trace DNA
CN109593757B (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
CN107893260B (zh) 高效去除核糖体rna的构建转录组测序文库的方法及试剂盒
CN112359093B (zh) 血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒
EP3643789A1 (en) Pcr primer pair and application thereof
CN112941635A (zh) 一种提高文库转化率的二代测序建库试剂盒及其方法
CN116024305A (zh) 生物组织裂解液和直接pcr扩增试剂盒及其应用
CN112111561A (zh) 一种适用于ffpe样本的建库试剂盒、建库方法及用途
CN108374203B (zh) 一种用于双向测序的扩增子文库的构建方法
CN109852668A (zh) 一种简化基因组测序文库及其建库方法
CN114736951A (zh) 一种小分子rna的高通量测序文库构建方法
CN113736874A (zh) 一种沙丁胺醇代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用
CN112708939A (zh) 构建dna文库的试剂盒及方法
WO2020135650A1 (zh) 一种基因测序文库的构建方法
CN113817804B (zh) 一种测序文库自连接头消除的方法及应用
US20200140850A1 (en) Methods for isolation and quantification of short nucleic acid molecules
CN114507728B (zh) 一种捕获引物及其应用
CN113667744A (zh) 一种用于罗库溴铵代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用
CN115976014A (zh) 引物组、检测试剂盒、其用途、以及相应的检测方法
CN116426607A (zh) 一种dna建库预混液

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20201222

WW01 Invention patent application withdrawn after publication