CN109852668A

CN109852668A - 一种简化基因组测序文库及其建库方法

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Publication number: CN109852668A
Application number: CN201811643318.6A
Authority: CN
Inventors: 刘同欣; 谢正立; 陈业; 吴昕; 廖国娟
Original assignee: SUZHOU GENEWIZ BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU GENEWIZ BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109852668B

Abstract

本发明提供了一种简化基因组测序文库及其建库方法，在利用磁珠进行片段选择时，利用磁珠结合DNA特性，针对现实中存在片段选择不均匀以及回收效率较低的缺点，优化磁珠纯化大片段和小片段进行去除方法，同时增加异丙醇沉淀，调整组分配比，最终有效的提高片段回收的效率以及不同片段的回收量，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种简化基因组测序文库及其建库方法

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，涉及一种简化基因组测序文库及其建库方法。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，尤其是Illumina高通量测序平台，使得大量物种可以进行全基因组测序，从而获得该物种的遗传信息；目前因为高通量测序精确度的限制，二代测序需要对同一位点进行多次测序，对于人类基因组而言，基因组大小约为3Gb(base)，如果需要准确的获得人类基因组上的变异位点，实际测序的数据量需要对人类基因组测大约90Gb的数据才能满足相关要求，由此产生巨额的费用。相对于全基因组测序，简化基因组测序则有效的弥补了全基因组测序的不足，简化基因组测序(Reduced-RepresentationGenome Sequencing，RRGS)是指利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序获得大量遗传多态性标签序列来充分代表目标物种全基因组信息的测序策略，由于所回收的产物大多只占整个基因组的0.1～5％，因此成为简化基因组测序。目前常用的简化基因组测序的方法主要包括RAD-Seq(Restriction-site Associated DNA Sequencing)，GBS测序(Genotyping by sequencing)以及ddRAD(Double-diggest RAD)测序。

传统的RAD-seq技术构建文库的方法是先利用限制性内切酶对基因组进行酶切，并连上一端的接头，然后再利用超声打断连接产物，再连接另一端的接头，最后通过磁珠回收或者凝胶回收300～700bp的片段进行高通量测序。传统的GBS建库技术则是通过限制性内切酶进行酶切，然后连上特定的双端接头，通过控制PCR过程中的延伸时间来选择酶切产物的特定片段，一般长度在100～500bp。而ddRAD-seq综合了RAD-seq和GBS两种建库方法的优势，采用两种不同种类的酶进行酶切，通常两种酶的类型一种是稀有酶，一种是常见酶；从而从选酶角度上控制了测序片段的产出，由于采用不同种类的酶同时省去了机械打断的过程，使得片段具有一定的方向性，便于进行目的片段的选择。因此，ddRAD-seq技术是目前简化基因组中最常用的建库方式。ddRAD-seq主要实验步骤包括以下几个方面：酶切，加接头，混池，对混池后的样本进行片段筛选、PCR扩增和PCR产物回收等步骤。

片段选择是二代测序建库中必不可缺的步骤，全基因组测序文库中进行片段选择主要是集中到某个特定片段的文库，例如250bp文库，500bp文库以及800bp文库等，而简化基因组所建的文库则是筛选某个片段大小的文库，例如GBS文库筛选片段大小为100bp～500bp，ddRAD文库则筛选的是300bp～700bp区间文库；目前最常用的片段选择是利用磁珠进行分选，目前按照Ion Xpress^TM Plus gDNA Fragment Library Preparation对片段区间进行筛选，经常出现回收效率低以及片段分布不均匀的状况，而对于片段筛选的质量则直接影响了建库的质量，进而影响数据产出。常规片段筛选原则是先通过加入大体积磁珠去除大片段，然后加入小体积的磁珠去除小片段，从而完成特定区段长度的片段选择，但在实际操作中，按照Ion Xpress^TM Plus gDNA Fragment Library Preparation操作，会出现片段分布不均匀以及回收效率较低的状况，尤其是当样本数量较少时。

因此，研发一种优化的简化基因组测序文库的构建方法，提高回收率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种简化基因组测序文库及其建库方法，在利用磁珠进行片段选择时，针对现实中存在片段选择不均匀以及回收效率较低的缺点，优化磁珠纯化大片段和小片段进行去除方法，同时增加异丙醇沉淀步骤，最终有效的提高片段回收的效率以及不同片段的回收量，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种简化基因组测序文库的建库方法，所述方法包括如下步骤：

(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；

(2)根据步骤(1)所述酶切的酶设计接头序列，制备双链接头；

(3)将步骤(1)的酶切产物与步骤(2)的接头进行连接，得到连接产物；

(4)将步骤(3)的连接产物混合后得到混池，向混池中加入磁珠，进行片段筛选，得到目的片段；

(5)向步骤(4)得到的目的片段进行沉淀处理，离心弃上清，得到纯化产物；

(6)将步骤(5)得到的纯化产物进行PCR扩增和产物回收，得到所述简化基因组测序文库；

步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段；

步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；

所述第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；

所述第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。

本发明中，发明人在长期的科研实践中，发现按照Ion Xpress^TM Plus gDNAFragment Library Preparation操作，会出现片段分布不均匀以及回收效率较低的状况；针对这一缺陷，采用大量实验摸索验证，优化片段筛选和沉淀步骤，创造性地颠倒了去除片段的顺序，先去除小片段，再去除大片段，从而最大程度减少大片段的残留；同时，利用长期实验的经验总结，添加了异丙醇沉淀的步骤，优化了各组分的配比，各步骤各条件相互配合促进，极大地提高了回收产物的产率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

简化基因组是指利用限制性内切酶打断基因组DNA，对特定片段进行高通量测序，从而获得大量遗传多样性标签来充分代表目标物种全基因组信息的测序策略。此方法相对于全基因组测序而言，实验步骤简单，成本低，而且不依赖于参考基因组就能获得全基因组范围内的遗传多态性标签，因而广泛应用于生态学、进化学和基因组学等领域；GBS：Genotyping by Sequencing，测序分型技术；ddRAD：Double diggest Restriction-siteAssociated DNA Sequencing，双限制性内切酶相关的DNA测序。

常规片段筛选原则是先通过加入大体积磁珠去除大片段，然后加入小体积的磁珠去除小片段，从而完成特定区段长度的片段选择，但在实际操作中，按照Ion Xpress^TM PlusgDNA Fragment LibraryPreparation操作，会出现片段分布不均匀以及回收效率较低的状况，尤其是当样本数量较少时。

本发明与常规片段选择有两个区别，第一个区别在于去除大片段和小片段顺序上并不一致，本发明先去除小片段，再去除大片段，从而最大程度减少大片段的残留；第二个区别在于纯化过程中采用异丙醇进行沉淀，极大的提高回收产物的产率，相比常规的磁珠片段选择，本方法具有回收效率高，可操作性强，片段的保真度较高(反应在文库上分布较均匀)。

优选地，步骤(4)所述先加入的磁珠体积为混池体积的0.6～0.9倍。

优选地，步骤(4)所述再加入的磁珠体积为混池体积的0.2～0.5倍。

优选地，步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；

优选地，第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；

优选地，第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。

优选地，所述第一次沉淀的异丙醇的浓度为100％的异丙醇原液；

优选地，所述第一次沉淀的糖原的浓度为3～10mg/mL；

优选地，所述第一次沉淀的醋酸钠的浓度为0.2～0.7mol/mL。

优选地，所述第一次沉淀的条件为：-70℃～-80℃静置10～20min，11000～13000rpm，2～6℃离心10～20min弃上清。

优选地，所述第二次沉淀的乙醇为75％的冰乙醇。

优选地，所述第二次沉淀的条件为11000～13000rpm，2～6℃离心3～8min弃上清，再将乙醇挥发后用ddH₂O洗脱。

作为优选技术方案，一种简化基因组测序文库的建库方法，具体包括如下步骤：

(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；

(2)根据步骤(1)所述酶切的酶设计接头序列，接头序列如SEQ ID NO.3-28所示，制备双链接头；

(5)向步骤(4)得到的目的片段进行两次沉淀处理，第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇原液、3～10mg/mL的糖原和0.2～0.7mol/mL的醋酸钠，-70℃～-80℃静置10-20min，11000～13000rpm，2～6℃离心10-20min弃上清；第二次沉淀的沉淀试剂为75％的冰乙醇，11000～13000rpm，2～6℃离心3～8min弃上清，再将乙醇挥发后用ddH₂O洗脱，得到纯化产物；

(6)将步骤(5)得到的纯化产物进行PCR扩增和产物回收，得到所述简化基因组文库；

其中，步骤(4)所述片段筛选的片段大小为300-700bp；

步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入混池体积的0.6～0.9倍的磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入混池体积的0.2～0.5倍的磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段。

步骤(2)所述带有条形码的5’接头序列：

Bar01-PstI-01:SEQ ID NO.3

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACTTGCA

Bar01-PstI-02:SEQ ID NO.4

AGTTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar02-PstI-01:SEQ ID NO.5

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAGTGCA

Bar02-PstI-02:SEQ ID NO.6

CTGGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar03-PstI-01:SEQ ID NO.7

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGAATGCA

Bar03-PstI-02:SEQ ID NO.8

TTCAAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar04-PstI-01:SEQ ID NO.9

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTCGTGCA

Bar04-PstI-02:SEQ ID NO.10

CGACCAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar05-PstI-01:SEQ ID NO.11

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATGCATGCA

Bar05-PstI-02:SEQ ID NO.12

TGCATTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar06-PstI-01:SEQ ID NO.13

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCATGATGCA

Bar06-PstI-02:SEQ ID NO.14

TCATGGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar07-PstI-01:SEQ ID NO.15

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGACCATGCA

Bar07-PstI-02:SEQ ID NO.16

TGGTCAAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar08-PstI-01:SEQ ID NO.17

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCCACATGCA

Bar08-PstI-02:SEQ ID NO.18

TGTGGCAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar09-PstI-01:SEQ ID NO.19

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAACAATATGCA

Bar09-PstI-02:SEQ ID NO.20

TATTGTTCAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar10-PstI-01:SEQ ID NO.21

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCACCGTTGCA

Bar10-PstI-02:SEQ ID NO.22

ACGGTGGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar11-PstI-01:SEQ ID NO.23

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTTGTTACATGCA

Bar11-PstI-02:SEQ ID NO.24

TGTAACAAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar12-PstI-01:SEQ ID NO.25

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGTGGCGTTGCA

Bar12-PstI-02:SEQ ID NO.26

ACGCCACCTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

3’接头序列：

Ada-MspI-01:SEQ ID NO.27

CGGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG(5’端磷酸化)

Ada-MspI-02:SEQ ID NO.28

CGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC

具体地，本发明提供一种基于ddRAD优化的简化基因组测序文库的构建方法，尤其涉及一种建库片段筛选的方法，具体方案如下：

1)利用限制性内切酶PstI和MspI对玉米DNA进行酶切；

2)针对PstI酶设计相关的条形码及通用接头序列，并制备成双链接头；

接头通过合成的Oligo正链和负链退火而成的，其中带有条形码的负链的5’端经过了磷酸化修饰，通用接头正链的5’端经过了磷酸化修饰；退火反应体系如下：正反向100pM的引物各5μL，然后加入10μL的5×退火缓冲液缓冲液，加入30μL无菌的ddH₂O，混匀后按照下面表1的反应条件制备双链的接头产物：

表1

所述条形码是4～10bp不同的ATCG序列的组合用于区分不同的样本，使用条形码分别是：AACT，CCAG，TTGAA，GGTCG，AATGCA，CCATGA，TTGACCA，TGCCACA，TGAACAATA，ACCACCGT，CTTGTTACA，TAGGTGGCGT。

3)使用T4DNA连接酶将5’端和3’接头与酶切的DNA进行连接，获得相关的5’端条形码接头-DNA-3’端通用接头连接产物；

5’接头和3’接头浓度为1pM/μL，其中所加5’接头和3’接头的比例是1:18，所用的连接反应体系见表2；

表2

组分	加体积
		已消化的DNA	20μL
T4连接酶缓冲液	5μL
		稀释后5’端接头(1pmol/μL)	1μL
稀释后3’端接头	18μL
		T4连接酶	1μL
ddH<sub>2</sub>O	To 50μL

4)混池：将不同样本的酶切产物按照每个样本取25μL进行混合；

5)利用Beckman Ampure磁珠对文库片段进行筛选，本次筛选300～700bp之间的大小序列，根据混池后的体积，加入0.6～0.9倍体积的磁珠，此时小片段(<300bp)不结合到磁珠上，而大于300bp的片段都结合到磁珠上，纯化磁珠上的产物即得到第一步的纯化产物，这一步主要是去除小片段；

6)然后加入0.2～0.5倍第一步纯化产物体积的磁珠，室温静置5～10min，使磁珠能够充分与大于700bp核酸片段结合；

7)将微孔板放在磁力架上吸附2min，使溶液完全变澄清，此时上清液主要是300～700bp的片段，将上清液转移到另一干净的EP管中，估算上清的体积，这一步主要是去除大于700bp的大片段；

8)然后向上清液中依次加入7μL糖原，70μL醋酸钠，700-70-7-A μL的水(A为上清的体积)，再加入700μL异丙醇，混合均匀后，-80℃冰箱放置10-20min；12000rpm，4℃离心15min；

9)小心倒掉上清，加入700μL 75％冰乙醇(预先放置在-20℃进行预冷30min以上)，12000rpm，4℃离心5min，小心倒掉上清，然后放置在超净工作台吹5min，使残留酒精挥发干净；

10)加入一定体积的ddH₂O进行洗脱，得到第二步的纯化产物；

11)然后对第10步回收的DNA片段模板进行PCR扩增富集靶DNA片段；PCR反应体系为表3：

表3

ddH<sub>2</sub>O	To 50μL
		回收DNA产物	5ng
5×Pfu缓冲液	10μL
		GBS-F(10pmol/μL)	0.6μL
GBS-R(10pmol/μL)	0.6μL
		dNTP(10mM)	0.5μL
Pfu聚合酶	0.5μL

反应步骤见表4；

表4

聚合酶为高保真聚合酶；

GBS-F引物序列如SEQ ID NO.1所示：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT.

GBS-R引物序列如SEQ ID NO.2所示：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC

12)对第11步获得PCR产物进行磁珠回收，并进行Qubit2.0定量；

第二方面，本发明提供一种简化基因组文库，所述文库采用第一方面所述方法构建得到。

通过第一方面所述方法构建的文库，文库片段区段分布均匀，质量较高，特别适合尤其是针对少量样品进行的简化基因组测序。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

相比常规的磁珠片段选择，本发明提供的方法具有回收效率高，可操作性强的优点，构建的文库片段的保真度较高，文库中片段分布较均匀，质量较高，大片段残留少，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

附图说明

图1为本发明提供的方法纯化的文库的2100结果；

图2为Ion Xpress方法建立文库的2100质检结果图；

图3为本发明提供的方法构建的文库PCR扩增后2100质检结果图；

图4为采用Ion Xpress方法建立文库PCR扩增后2100质检结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例

1)采用CTAB方法对玉米的胚提取相关的DNA，最后用ddH₂O对DNA进行溶解，

2)设计条形码序列并合成带有条形码的接头序列(5’接头)以及Illumina(3’接头)通用序列，纯化方式采用HPLC的方法进行纯化，相关序列信息如下：

带有条形码的5’接头序列：

Bar01-PstI-01:SEQ ID NO.3

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACTTGCA

Bar01-PstI-02:SEQ ID NO.4

AGTTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar02-PstI-01:SEQ ID NO.5

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAGTGCA

Bar02-PstI-02:SEQ ID NO.6

CTGGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar03-PstI-01:SEQ ID NO.7

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGAATGCA

Bar03-PstI-02:SEQ ID NO.8

TTCAAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar04-PstI-01:SEQ ID NO.9

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTCGTGCA

Bar04-PstI-02:SEQ ID NO.10

CGACCAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar05-PstI-01:SEQ ID NO.11

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATGCATGCA

Bar05-PstI-02:SEQ ID NO.12

TGCATTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar06-PstI-01:SEQ ID NO.13

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCATGATGCA

Bar06-PstI-02:SEQ ID NO.14

TCATGGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar07-PstI-01:SEQ ID NO.15

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGACCATGCA

Bar07-PstI-02:SEQ ID NO.16

TGGTCAAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar08-PstI-01:SEQ ID NO.17

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCCACATGCA

Bar08-PstI-02:SEQ ID NO.18

TGTGGCAAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar09-PstI-01:SEQ ID NO.19

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAACAATATGCA

Bar09-PstI-02:SEQ ID NO.20

TATTGTTCAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar10-PstI-01:SEQ ID NO.21

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCACCGTTGCA

Bar10-PstI-02:SEQ ID NO.22

ACGGTGGTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar11-PstI-01:SEQ ID NO.23

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTTGTTACATGCA

Bar11-PstI-02:SEQ ID NO.24

TGTAACAAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

Bar12-PstI-01:SEQ ID NO.25

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGGTGGCGTTGCA

Bar12-PstI-02:SEQ ID NO.26

ACGCCACCTAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(5’端磷酸化)

3’接头序列：

Ada-MspI-01:SEQ ID NO.27

CGGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG(5’端磷酸化)

Ada-MspI-02:SEQ ID NO.28

CGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC

3)退火形成双链条形码接头和双链通用接头

将所有的Oligo序列使用12，000rpm离心30s后，根据引物的总量确定加入适量的去离子水，并将引物稀释至100pmol/μL，充分震荡混匀后再瞬时离心；

然后取配对的正链和反链引物各5μL，加入10μL 5×退火缓冲液，加入30μL无菌H₂O，混匀后按照下面表5反应程序制备双链接头产物，双链接头浓度约为10pmol/μL；

表5

4)反应结束后，分别取出2μL 5’端接头产物，加入18μL ddH₂O进行稀释备用，3’端的接头产物也需要稀释10倍后使用，因此根据用到的3’端接头产物总量，按照比例稀释至10倍后备用，剩余双链接头产物原液(10pmol/μL)置于-20℃长期保存；

5)DNA基因组酶切：

取出待检测样品，充分震荡混匀后，本次测试的样品是12个玉米的样本，利用Qubit准确定量，将DNA统一稀释成50ng/μL，根据定量结果，按照下面的反应体系进行酶切反应(20μL)，酶切条件如下：

表6

6)接头连接

等待样品反应完成后，将条形码接头和通用接头进行稀释，稀释成1pM/μL，然后分别加入1μL条形码序列和18μL的通用接头序列，其他成分按照以下表7反应体系进行加样：

表7

Samples	加体积
		已消化的DNA	20μL
T4连接酶缓冲液	5μL
		条形码接头(1pmol/μL)	1μL
通用接头	18μL
		T4连接酶	1μL
ddH<sub>2</sub>O	To 50μL

反应条件为22℃反应60min；反应结束后，进行68℃30min将T4酶进行失活处理；

7)混池并利用磁珠对文库片段进行筛选：

将所有的样本的连接产物混合在一起(每个样本取25μL)，并利用磁珠进行文库片段的筛选；本次筛选300～700bp之间的大小序列，根据混池后的体积，加入0.6～0.9倍体积的磁珠，此时小片段(<300bp)不结合到磁珠上，而大于300bp的片段都结合到磁珠上，纯化磁珠上的产物即得到第一步的纯化产物，这一步主要是去除小片段；然后加入0.2～0.5倍第一步纯化产物体积的磁珠，室温静置5～10min，使磁珠能够充分与大于700bp核酸片段结合，将微孔板放在磁力架上吸附2min，使溶液完全变澄清，此时上清液主要是300～700bp的片段，将上清液转移到另一干净的EP管中，估算上清的体积，这一步主要是去除大于700bp的大片段；然后向上清液中依次加入7μL糖原，70μL醋酸钠，(700-70-7-A)μL的水(A为上清的体积)，再加入700μL异丙醇，混合均匀后，-80℃冰箱放置10-20min；12000rpm，4℃离心15min；小心倒掉上清，加入700μL 75％冰乙醇(预先放置在-20℃进行预冷30min以上)，12000rpm，4℃离心5min，小心倒掉上清，然后放置在超净工作台吹5min，使残留酒精挥发干净；加入一定体积的ddH₂O进行洗脱，得到第二步的纯化产物；

8)PCR扩增靶序列文库

以磁珠纯化的DNA片段为模板，按照下面表8反应体系进行PCR扩增反应，

GBS-F引物序列如SEQ ID NO.1所示：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT.

GBS-R引物序列如SEQ ID NO.2所示：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC

表8

反应程序如下表9；

表9

9)PCR产物纯化：

9.1等待上述反应结束后，将所有的PCR产物合并在一起后，按照0.6倍体积的比例加入稀释好的磁珠，充分混合均匀后，室温放置5min，使磁珠能够充分与核酸片段结合；

9.2将EP管放在磁力架上吸附2min，直至溶液完全变澄清，吸走上清；

9.3向EP管中磁珠加入700μL75％乙醇，室温孵育30s后弃上清；

9.4重复步骤9.3一次，然后换用10μL移液器小心吸干净酒精；

9.5室温干燥2-3min，待残留乙醇挥发干净；

9.6加入32μL ddH₂O进行洗脱，吹匀后静置5-10min充分吸附；

9.7再将EP管放置在磁力架上，吸附5min后，再将洗脱液吸附转移至新的EP管中；

10)文库质检：

通过2100对文库进行片段大小的检测，主要是比较峰图分布的均匀性以及大片段和小片段的残留状况等。

11)结果

本实施例主要通过比较优化前以及优化后片段筛选2100结果，见图1、图2、表10和表11；图1为优化后的2100检测结果，表10是对图1的结果统计，由图1和表10可知优化的片段均匀的分布在300～700bp之间，大片段占有的比例较小，而优化前的图2则存在大量的大片段；此外通过比较表10和表11，表11为对图2的结果统计，可以看出利用优化的方法纯化的片段浓度远高于优化之前的方法。而通过比较PCR之后的2100检测结果和质检结果见图3、表12、图4和表13，表12为对图3的结果统计，表13是对图4的结果统计，则会发现优化后的方法很少有大片段，大部分片段落在300～700bp之间，而优化之前的结果则含有大量的高于700bp的片段，从以上结果可以看出，本方法可以高效的对特定片段大小的DNA进行回收。

表10

表11

表12

表13

综上所述，本发明提供的简化基因组测序文库及其构建方法，通过优化片段筛选和沉淀步骤，创造性地颠倒了去除片段的顺序，先去除小片段，再去除大片段，从而最大程度减少大片段的残留；同时，利用长期实验的经验总结，添加了异丙醇沉淀的步骤，优化了各组分的配比，各步骤各条件相互配合促进，极大地提高了回收产物的产率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州金唯智生物科技有限公司

<120> 一种简化基因组测序文库及其建库方法

<130> 2018年

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttc 43

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaacttgc a 41

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agttagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtgt 37

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccagtgc a 41

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctggagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtgt 37

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgaatg ca 42

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttcaaagatc ggaagagcgt cgtgtaggga aagagtgt 38

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggtcgtg ca 42

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgaccagatc ggaagagcgt cgtgtaggga aagagtgt 38

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaatgcat gca 43

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tgcattagat cggaagagcg tcgtgtaggg aaagagtgt 39

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccatgat gca 43

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tcatggagat cggaagagcg tcgtgtaggg aaagagtgt 39

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgacca tgca 44

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tggtcaaaga tcggaagagc gtcgtgtagg gaaagagtgt 40

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgccaca tgca 44

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tgtggcaaga tcggaagagc gtcgtgtagg gaaagagtgt 40

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgaacaat atgca 45

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

tattgttcag atcggaagag cgtcgtgtag ggaaagagtg t 41

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaccaccg ttgca 45

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

acggtggtag atcggaagag cgtcgtgtag ggaaagagtg t 41

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcttgtta catgca 46

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tgtaacaaga gatcggaaga gcgtcgtgta gggaaagagt gt 42

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaggtggc gttgca 46

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

acgccaccta gatcggaaga gcgtcgtgta gggaaagagt gt 42

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

cggatcggaa gagcacacgt ctgaactcca gtcacatcac g 41

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cgtgatgtga ctggagttca gacgtgtgct cttccgatc 39

Claims

1.一种简化基因组测序文库的建库方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；

(2)根据步骤(1)所述酶切的酶设计接头序列，制备双链接头；

(4)将步骤(3)的连接产物混合后得到混池，向混池中加入磁珠进行片段筛选，得到目的片段；

其中，步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段；

步骤(5)所述沉淀处理包括第一次沉淀和第二次沉淀；

所述第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇、糖原和醋酸钠；

所述第二次沉淀的沉淀试剂包括乙醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述先加入的磁珠体积为混池体积的0.6～0.9倍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述再加入的磁珠体积为混池体积的0.2～0.5倍。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次沉淀的异丙醇的浓度为100％的异丙醇原液。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次沉淀的糖原的浓度为3～10mg/mL；

优选地，所述第一次沉淀的醋酸钠的浓度为0.2～0.7mol/mL。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述第一次沉淀的条件为：-70℃～-80℃静置10～20min，11000～13000rpm，2～6℃离心10～20min弃上清。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次沉淀的乙醇为75％的冰乙醇。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次沉淀的条件为11000～13000rpm，2～6℃离心3～8min弃上清，再将乙醇挥发后用ddH₂O洗脱。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)对样品进行酶切，得到酶切产物；

(5)向步骤(4)得到的目的片段进行两次沉淀处理，第一次沉淀的沉淀试剂包括异丙醇原液、3～10mg/mL的糖原和0.2～0.7mol/mL的醋酸钠，-70℃～-80℃静置10-20min，11000～13000rpm，2～6℃离心10～20min弃上清；第二次沉淀的沉淀试剂为75％的冰乙醇，11000～13000rpm，2～6℃离心3～8min弃上清，再将乙醇挥发后用ddH₂O洗脱，得到纯化产物；

其中，步骤(4)所述片段筛选的片段大小为300～700bp；

步骤(4)所述片段筛选的方法为：先加入混池体积的0.6-0.9倍的磁珠结合大于300bp的片段，弃上清去除小于300bp的片段，再加入混池体积的0.2-0.5倍的磁珠结合大于700bp的片段，留上清得到所要筛选的片段。

10.一种简化基因组测序文库，其特征在于，所述文库采用权利要求1-9中任一项所述方法构建得到。