CN111041069B - 一种低起始量dna样本的高通量测序文库构建方法及其应用 - Google Patents

一种低起始量dna样本的高通量测序文库构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低起始量DNA样本的高通量测序文库构建方法及其应用，所述构建方法包括经过前处理、DNA片段化、末端修复、接头连接、预文库扩增、目标区域捕获和测序文库扩增的步骤，其中，前处理步骤为加入相对于待测DNA样本N的目标位点基因型为已知的辅助DNA样本M；本方法起始样本量可低至1ng，并且还具有操作简单、结果准确等优点。本发明还公开了该高通量测序文库构建方法在检测基因突变中的应用，经过上述方法构建测序文库后测序，将测序结果进行变异分析，可同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本，其所需起始样本量低且检测准确率高。

Description

一种低起始量DNA样本的高通量测序文库构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种低起始量DNA样本的高通量测序文库构建方法及其应用。
背景技术
DNA测序作为最重要的分子生物学分析方法之一，其不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，并且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(NextGeneration Sequencing，NGS)，是通过在高密度生物芯片上实现大规模平行测序的技术，相对于传统的桑格测序(Sanger Sequencing)具有数据产量高，单位数据量成本低的特点。高通量测序技术的发展大大促进了基因组学和生命科学领域的发展。
在高通量筛选过程中，为了实现在一张高密度生物芯片上大规模平行测序，对于待检测的样本必须进行前处理即样本准备和文库构建的过程，才能使之成为适合高通量测序的DNA文库类型，进行测序反应。对于低起始量DNA样本直接进行片段化或者转座酶建库，常常由于有效片段化DNA量少，并且片段大小分布难符合预期，通常无法进行后续建库实验。目前对于待检测样本进行DNA测序文库构建的方法，均需至少20ng以上的DNA才能适用于测序文库构建，并且DNA量越少，文库质量越低，测序数据质量和结果也越低，难以达到测序分析的目的。市面上比较高效的低起始量建库试剂盒如Illumina Nextera DNA建库试剂盒等，采用的是转座酶随机插入并将基因组DNA打断，同时添加测序接头的方法，该方法需要20ng以上的DNA样本，其余基于转座酶原理的优化和改进的建库方法也需要在样本质量或者DNA质量很高的情况下，才能达到理想的建库目的。因此，本领域急需一种专门针对低起始量DNA样本的通用型高通量测序文库构建方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种低起始量DNA样本的高通量测序文库构建方法，能够使用低起始量浓度的DNA构建高通量测序文库，进而检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本。
本发明还提出了上述一种基因突变检测方法。
根据本发明的第一方面实施例的高通量测序文库构建方法，包括以下步骤：
S1、前处理：在待测DNA样本N中加入辅助DNA样本M，得到待建库DNA样本；
S2、DNA片段化：将步骤S1得到的待建库DNA样本进行片段化处理，得到DNA片段；
S3、末端修复：将步骤S2得到的DNA片段末端进行末端修复加A，得到加A产物；
S4、接头连接：将步骤S3得到的加A产物连接测序接头，得到连接产物；
S5、预文库扩增：对步骤S4得到的连接产物进行PCR扩增，得到预文库；
S6、目标区域捕获：对步骤S5得到的预文库进行目标区域捕获，得到含有目标位点的DNA的文库；
S7、测序文库扩增：对步骤S6得到的含有目标位点的DNA文库进行扩增，得到测序文库。
根据本发明第一方面实施例的高通量测序文库构建方法，至少具有如下有益效果：本发明提供的适用于高通量测序平台的低起始量DNA建库方法，可同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本，建库起始量DNA可降低至1ng，能够解决现有技术中建库起始样本量要求高及低起始量样本的建库困难等问题，该方法不仅起始样本量要求低，而且还具有操作简单、结果准确等优点。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1中辅助DNA样本M相对于待测DNA样本N的目标位点基因型为已知。
作为优选的，所述步骤S1中辅助DNA样本M相对于待测DNA样本N的目标位点基因型(胚系突变)为纯合型AA、突变型BB或杂合型AB中的任意一种。
作为优选的，所述步骤S1中辅助DNA样本M相对于待测DNA样本N的目标位点突变频率(体细胞突变)低于其检测方法检测限或者无突变；所述检测方法为文库测序的检测方法。
作为优选的，所述步骤S1中待测DNA样本N来源于福尔马林固定石蜡包埋(Formalin-fixed and Paraffin-embedded，FFPE)样本DNA、组织样本DNA、口腔样本DNA、干血斑DNA、珍贵样本DNA或游离血浆DNA中的至少一种。
作为优选的，所述步骤S1中辅助DNA样本M来源于人类基因组DNA样本。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S1中待测DNA样本N的加入量为n，n≥1ng。
作为优选的，所述步骤S1中辅助DNA样本M的加入量为m，待建库DNA样本的总量k，其中，k，m，n符合以下关系：
k＝m+n；
20ng≤k≤100ng；
令a＝n/k，则：0.01≤a＜1。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S2中片段化处理采用方法为超声波打断仪处理、片段化酶处理或转座酶法直接构建文库中的任意一种。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S4中连接的测序接头为带有分子标签的Y型接头。
作为优选的，所述Y型接头为在非互补区域中至少一条链带有index序列。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S6中目标区域捕获平台可为以下任意一种：液相杂交捕获平台如安捷伦SureSelect平台、NimbleGen平台、Illumina TruSeqEnrichment平台；或者扩增子捕获平台如TruSeq Amplicon平台、cfBEST扩增子测序平台。
根据本发明第二方面的基因突变检测方法，包括以下步骤：基于待测目标的核酸样本通过上述高通量测序文库构建方法构建测序文库，对测序文库进行测序，获得测序结果；将所述测序结果与参考基因组进行变异分析。
根据本发明第二方面实施例的应用，至少具有如下有益效果：通过加入已知目标位点基因型的辅助DNA样本M，能够同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本。提供了一种适用于高通量测序平台的低起始量DNA建库方法，该方法通过加入已知目标位点基因型的辅助DNA样本M，能够同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本，对检测的DNA起始量低至1ng，可以满足对低起始量DNA样本的检测。本方案是通过加入已知目标位点基因型的辅助DNA样本M与待测低起始量DNA样本进行分析通过得到准确的分型和突变信息结果。
根据本发明的一些实施例，所述测序使用的测序平台为pooling、illumina或MGI测序平台中的任意一种。
根据本发明的一些实施例，所述变异分析包括以下步骤：
S01、下机数据进行质控过滤；
S02、分子标签和特异性引物过滤和分子标签分类；
S03、比对和去重；
S04、突变类型和突变频率f计算；
S05、待测DNA样本N的基因型分析或目标位点突变频率分析。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S05中基因型分析过程中突变频率f与基因型的关系为：
若辅助DNA样本M基因型为AA，则当f＜0.005时，待测DNA样本N基因型为AA；当1a/4≤f≤3a/4时，待测DNA样本N基因型为AB，当3a/4＜f时，待测DNA样本N基因型为BB；
若辅助DNA样本M基因型为AB，则当f＜(0.5-1a/4)时，待测DNA样本N基因型为AA；当(0.5-1a/4)≤f＜(0.5+1a/4)时，待测DNA样本N基因型为AB，当f≥(0.5+1a/4)时，待测DNA样本N基因型为BB；
若辅助DNA样本M基因型为BB，则当f＜(1-3a/4)时，待测DNA样本N基因型为AA；当(1-3a/4)≤f＜(1-1a/4)时，待测DNA样本N基因型为AB，当f≥0.995时，待测DNA样本N基因型为BB；
其中，a＝n/k，k＝n+m，n为待测DNA样本N的加入量，m为辅助DNA样本M的加入量，n≥1ng，20ng≤k≤100ng，0.01≤a＜1。
作为优选的，上述基因型分析的突变频率f与基因型关系如表1所示：
表1.突变频率f与基因型关系
Figure BDA0002339500590000041
Figure BDA0002339500590000051
其中，AA:纯合型；AB：杂合型；BB：突变型。
根据表1，通过突变频率f、a和M基因型分析出待测DNA样本N基因型。
根据本发明的一些实施例，所述步骤S05中目标位点突变频率分析结果为：所述待测DNA样本N的突变频率为f/a；其中，a＝n/k，k＝n+m，n为待测DNA样本N的加入量，m为辅助DNA样本M的加入量，n≥1ng，20ng≤k≤100ng，0.01≤a＜1。
作为优选的，待测DNA样本N某目标位点的突变频率(体细胞突变)分析模型如表2所示：
表2.突变频率f与实际突变频率关系
M突变频率 突变频率f N突变频率
0 f f/a
根据表2，通过突变频率f和a分析出待测DNA样本N在目标位点的突变频率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中高通量测序文库构建方法及基因突变检测的流程图；
图2为本发明实施例1中低起始量样本的HBB:c.126_129delCTTT位点检测不同低起始量建库的终文库质检图；
图3为本发明实施例2中使用Horizon cfDNA肿瘤突变标准品1％Multiplex样本进行建库后的终文库质检图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1
本实施例中低起始量待测样本的检测位点为HBB:c.126_129delCTTT，依照图1所示的流程图中的方法步骤对待测DNA进行检测，具体操作步骤如下：
1.样本提取：提取待检测样本的DNA，使用仪器Qubit dsDNAHS对DNA样本定量。
2.样本前处理：将待测DNA样本N和辅助DNA样本M以表3所示的比例混合。
表3.待测DNA样本N和辅助DNA样本M混合比例
混合样本 待测DNA样本N(n) 辅助DNA样本M(m) 总量(l) 比例(a)
样本0 0 20 20 0
样本1 1 19 20 0.05
样本2 5 15 20 0.25
样本3 15 35 50 0.3
样本4 20 80 100 0.2
3.DNA片段化：对混合样本进行DNA片段化，使用超声波打断仪(型号为CovarisS220)将样品打断成主带在150-250bp范围的DNA片段。
4.末端修复：将片段化产物进行末端修复加A。配置如表4所示的反应体系：
表4.末端修复反应体系
成分 添加量
片段化DNA 50μL
10ⅹKAPA End Repair&A-Tailing Buffer 6μL
10mM dATP混合液 1μL
KAPA End Repair&A-Tailing Enzyme Mix 3μL
总反应体积 补水至60μL
混匀离心，PCR仪上进行20℃，30min；65℃，30min反应。反应结束立即进行下一步。
5.接头连接：连接测序接头，配置如下表5所示的反应体系：
表5.接头连接反应体系
成分 添加量
末端修复产物 60μL
KAPA Ligation Buffer 30μL
T4 DNA连接酶 10μL
Adapter with Barcode 10μL
总反应体积 110μL
混匀离心：PCR仪上进行20℃，15min。反应结束立即使用0.8×XP磁珠纯化，25μL洗脱液洗脱。
6.预文库扩增，配置下表6所示的反应体系：
表6.预文库扩增反应体系
成分 添加量
DNA溶液 20μL
HIFI聚合酶混合物 25μL
pre-lib-primer-F+pre-lib-primer-R 5μL
总体积 50μL
配制好的反应体系进行PCR扩增，PCR程序如下表7所示：
表7.预文库PCR扩增程序
Figure BDA0002339500590000071
反应结束，使用1.0×XP磁珠纯化，30μL洗脱液洗脱，得到预文库。
7.目标区域捕获：使用cfBEST扩增技术对上述预文库进行目标区域捕获：1)PCR1反应体系如下表8所示：
表8.PCR1反应体系
成分 添加量
HiFi Ready Mix 25μL
PCR1引物 6μL
GC enhancer 2μL
预文库 100ng
无菌去离子水 补齐至50μL
PCR程序如下表9所示：
表9.PCR1扩增程序
Figure BDA0002339500590000072
反应结束，使用1.2×XP磁珠纯化，20μL洗脱液洗脱。
2)PCR2反应体系如下表10所示：
表10.PCR1扩增程序
成分 添加量
HiFi Ready Mix 25μL
PCR2引物 6μL
GC enhancer 2μL
PCR1产物 17μL
无菌去离子水 补齐至50μL
PCR程序如下表11所示：
表11.PCR2扩增程序
Figure BDA0002339500590000081
反应结束，使用1.2×XP磁珠纯化，25μL洗脱液洗脱。
8.终文库扩增：反应体系如下表12所示：
表12.终文库扩增程序
成分 添加量
HiFi Ready Mix 25μL
终文库引物 2μL
PCR2产物 23μL
无菌去离子水 补齐至50μL
PCR程序如下表13所示：
表13.终文库扩增程序
Figure BDA0002339500590000082
反应结束，使用1.2×XP磁珠纯化，30μL洗脱液洗脱，得到终文库；所得终文库质检图如图2所示，图2中，样本0到样本4的凝胶电泳条带表明终文库的片段大小分布集中，构建的文库质量良好。
9.文库质检：qPCR检测文库浓度，pooling，illumina Nextseq CN500上机，150循环V2测序试剂，每个样本15M reads数据量。
10.数据分析：下机数据目标区间分析结果如下表14所示：
表14.数据分析结果
混合样本 TotalReads uniqRatio BarErrorRatio PrimerRatio OffTargetRatio AverDepth
样本0 14385383 25.47％ 5.52％ 91.86％ 7.76％ 1298.37
样本1 14039838 25.66％ 4.75％ 91.89％ 7.39％ 1589.47
样本2 14205378 26.00％ 5.72％ 91.93％ 7.43％ 1576.7
样本3 14186866 26.50％ 5.78％ 91.82％ 7.91％ 3515.09
样本4 14454572 26.21％ 5.91％ 91.73％ 7.82％ 7282.56
根据突变频率分析低起始量待测DNA样本N基因型结果如下表15所示：
表15.基因型结果
混合样本 Total Mutation AF(％)
样本0 1342 546 0.00％
样本1 1435 603 2.79％
样本2 1315 652 15.21％
样本3 3423 1751 13.15％
样本4 7093 1861 9.28％
不同起始量下基因型如下表16所示：
表16.不同起始量基因型检测结果
待测DNA样本N(n) 基因型
0 -
1 杂合
5 杂合
15 杂合
20 杂合
结果表明检测结果与样本实际分型一致，即使当起始量低至1ng时，本发明也能成功对待测样本成功分型。
实施例2
检测低起始量待测Horizon cfDNA肿瘤突变标准品1％Multiplex样本，基因型信息如下表17所示：
表17.基因型信息
Gene Mut-AA AF(％)
NRAS Q61K 1.3％
NRAS A59T 1.3％
KRAS G12D 1.3％
PIK3CA E545K 1.3％
EGFR ΔE746-A750 1.0％
EGFR V769_D770insASV 1.0％
EGFR T790M 1.0％
EGFR L858R 1.0％
与辅助DNA样本M参比比例如下表18所示：
表18.辅助DNA样本M参比比例
混合样本 待测DNA样本N(n) 辅助DNA样本M(m) 总量(l) 比例(a)
样本5 1 19 20 0.05
样本6 5 15 20 0.25
样本7 15 35 50 0.3
样本8 0 20 20 0
按照实施例1的方法进行建库、上机和突变频率分析，其中，所得终文库质检图如图3所示，下机数据目标区间分析结果如下表19所示：
表19.目标区间分析结果
混合样本 TotalReads uniqRatio BarErrorRatio PrimerRatio OffTargetRatio AverDepth
样本5 14832094 25.76％ 5.59％ 92.87％ 8.79％ 1224.97
样本6 15011776 25.76％ 5.61％ 92.66％ 8.84％ 1287.68
样本7 15126704 29.32％ 5.15％ 91.66％ 7.87％ 2479.43
样本8 13996237 28.78％ 5.17％ 91.82％ 7.68％ 1398.2
混合样本突变测试结果如下表20所示：
表20.突变测试结果
Gene Mut-AA AF(％) 样本4 样本5 样本6 样本7
NRAS Q61K 1.30％ 0.08％ 0.34％ 0.37％ 0
NRAS A59T 1.30％ 0.12％ 0.22％ 0.39％ 0
KRAS G12D 1.30％ 0.07％ 0.21％ 0.02％ 0
PIK3CA E545K 1.30％ 0.10％ 0.43％ 0.08％ 0
EGFR ΔE746-A750 1.00％ 0.05％ 0.30％ 0.18％ 0
EGFR V769_D770insASV 1.00％ 0.06％ 0.07％ 0.23％ 0
EGFR T790M 1.00％ 0.09％ 0.24％ 0.06％ 0
EGFR L858R 1.00％ 0.10％ 0.18％ 0.19％ 0
1％Multiplex低起始量样本建库突变检测频率结果图下表21所示：
表21.低起始量样本建库突变检测频率结果
Gene Mut-AA AF(％) 1ng 5ng 15ng 0ng
NRAS Q61K 1.30％ 1.62％ 1.36％ 1.24％ 0.00％
NRAS A59T 1.30％ 2.35％ 0.86％ 1.29％ 0.00％
KRAS G12D 1.30％ 1.31％ 0.83％ 0.08％ 0.00％
PIK3CA E545K 1.30％ 2.00％ 1.71％ 0.28％ 0.00％
EGFR ΔE746-A750 1.00％ 1.09％ 1.20％ 0.59％ 0.00％
EGFR V769_D770insASV 1.00％ 1.30％ 0.29％ 0.75％ 0.00％
EGFR T790M 1.00％ 1.78％ 0.94％ 0.19％ 0.00％
EGFR L858R 1.00％ 1.96％ 0.70％ 0.63％ 0.00％
结合实施例1与实施例2的结果表明，本发明能够成功地对低起始量DNA样本进行高通量测序，得到准确的分型和突变信息，低起始量DNA样本的使用量可以低至1ng；该方法能够有效的对低起始量DNA样本进行全基因组建库测序和目标区域捕获测序，从而确定待测DNA样本N的目标区域序列信息，包括所包含的SNV、Indel、Fusion和CNV等突变信息，并且检测低起始量DNA样本低至1ng，结果准确可靠。
综上所述，本发明提供的一种适用于高通量测序平台的低起始量DNA建库方法，可同时检测SNV、Indel、Fusion和CNV四种突变类型样本，建库起始量DNA降低至1ng，可以解决现有技术中低起始量样本的建库困难的技术问题。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种低起始量DNA样本的高通量测序文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、前处理：在待测DNA样本N中加入辅助DNA样本M，得到待建库DNA样本；
S2、DNA片段化：将所述待建库DNA样本进行片段化处理，得到DNA片段；
S3、末端修复：将所述DNA片段末端进行末端修复加A，得到加A产物；
S4、接头连接：将所述加A产物连接测序接头，得到连接产物；
S5、预文库扩增：对所述连接产物进行PCR扩增，得到预文库；
S6、目标区域捕获：对所述预文库进行目标区域捕获，得到含有目标位点的DNA文库；
S7、测序文库扩增：对所述含有目标位点的DNA文库进行扩增，得到测序文库；
所述辅助DNA样本M相对于待测DNA样本N的目标位点基因型为已知；所述基因型为纯合型AA、突变型BB或杂合型AB中的任意一种；
所述辅助DNA样本M相对于待测DNA样本N的目标位点突变频率低于其检测方法检测限；所述检测方法为文库测序的检测方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中待测DNA样本N的加入量为n，n≥1ng。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中辅助DNA样本M的加入量为m，待建库DNA样本的总量为k，其中，k，m，n符合以下关系：
k＝m+n；
20ng≤k≤100ng；
令a＝n/k，则：0.01≤a＜1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中连接的测序接头为带有分子标签的Y型接头。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Y型接头为在非互补区域至少一条链带有index序列。
6.一种基因突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：基于待测目标的核酸样本通过如权利要求1至5任一项所述的方法构建测序文库，对测序文库进行测序，获得测序结果；将所述测序结果与参考基因组进行变异分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述变异分析包括以下步骤：
S01、下机数据进行质控过滤；
S02、分子标签和特异性引物过滤和分子标签分类；
S03、比对和去重；
S04、突变类型和突变频率f计算；
S05、待测DNA样本N的基因型分析或目标位点突变频率分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S05中基因型分析过程中突变频率f与基因型的关系为：
若辅助DNA样本M基因型为AA，则当f＜0.005时，待测DNA样本N基因型为AA；当1a/4≤f≤3a/4时，待测DNA样本N基因型为AB，当3a/4＜f时，待测DNA样本N基因型为BB；
若辅助DNA样本M基因型为AB，则当f＜(0.5-1a/4)时，待测DNA样本N基因型为AA；当(0.5-1a/4)≤f＜(0.5+1a/4)时，待测DNA样本N基因型为AB，当f≥(0.5+1a/4)时，待测DNA样本N基因型为BB；
若辅助DNA样本M基因型为BB，则当f＜(1-3a/4)时，待测DNA样本N基因型为AA；当(1-3a/4)≤f＜(1-1a/4)时，待测DNA样本N基因型为AB，当f≥0.995时，待测DNA样本N基因型为BB；
其中，a＝n/k，k＝n+m，n为待测DNA样本N的加入量，m为辅助DNA样本M的加入量，n≥1ng，20ng≤k≤100ng，0.01≤a＜1。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S05中目标位点突变频率分析结果为：所述待测DNA样本N的突变频率为f/a；其中，a＝n/k，k＝n+m，n为待测DNA样本N的加入量，m为辅助DNA样本M的加入量，n≥1ng，20ng≤k≤100ng，0.01≤a＜1。
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