CN110396534A

CN110396534A - 基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN110396534A
Application number: CN201910740908.9A
Authority: CN
Inventors: 宋炎; 张娜; 蔡宇航; 孟培; 刘玉朋; 邵林; 林木飞; 夏敏; 朱长斌; 于竞; 石太平
Original assignee: Tianjin Huada Medical Laboratory Co Ltd; Huada Biotechnology (wuhan) Co Ltd; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Tianjin Huada Medical Laboratory Co Ltd; Huada Biotechnology (wuhan) Co Ltd; BGI Shenzhen Co Ltd; BGI Genomics Co Ltd
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2019-11-01

Abstract

本发明涉及一种基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒。该基因文库的构建方法包括基于待测核酸样本，进行末端修复，加A，获得经修复的末端加A的核酸样本；然后和组合标签接头进行连接，以便获得连接有组合标签接头的核酸样本；扩增以便获得所述测序文库；所述组合标签接头含有组合标签和接头序列，所述组合标签包括至少两组标签，所述至少两组标签的每一组含有至少两个标签序列，其中每一组内任意标签序列间的汉明距离大于等于2，每一组间任意标签序列间的汉明距离大于等于1。由此构建的文库进行测序，可以提高测序质量以及降低样本间的污染，可以应用于肿瘤多基因的突变检测，从而在临床上用于肿瘤的预防和诊断。

Description

基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，根据最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。随着对肿瘤研究的不断深入，治疗癌症的方法手段也在不断更新。近几年来，除传统的放化疗治疗手段外，靶向治疗、免疫治疗，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗等新方法不断涌现，实现了对肿瘤更精准有效、毒副作用更小的个体化治疗。但这些治疗离不开对肿瘤基因组变异信息的深入解读，在此基础上才能制定个体化治疗方案。

目前，高通量测序技术已广泛应用到医学研究和临床诊断领域，为致癌位点的检测提供了新的检测手段。高通量测序技术因其结果覆盖范围的全面性，以及不断下降的测序成本，在医学研究和临床应用中表现出越来越高的性价比。有限的样本量和检测报告输出的时效性对该技术提出了更高的要求。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法，缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率、防止样本间的相互污染成为高通量测序技术拓展应用领域的关键点。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒。

本发明的发明人在研究过程中发现：

高通量文库构建步骤包括：(1)基因组打断(包括物理打断法和酶打断法，如covaris超声打断、 fragmentase酶切打断)；(2)双链DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)末端修复；(3)3’末端加‘A’(用于TA克隆)；(4)加与测序平台匹配的接头；(5)PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增。整个流程需要大概8-9个小时才能完成。为简化流程，一些生物公司推出了新的建库技术，如Illumina公司提出了基于转座酶的打断与加接头一步完成的快速建库方法，华大基因及Qiagen 公司等一些单位也相继推出了基于酶切打断的文库构建方法，能有效的简化流程，由于酶的特性，酶切方法基本导致碱基偏向性问题。同时为了避免样本DNA在文库构建过程中损失，很多试剂盒推荐使用成本较高的低吸附管和吸头作为常规实验耗材。

在文库构建接头连接环节，现有技术基本上连接的是一端含有标签序列的接头，通过引入的标签序列进行样本间的区分，以便同时可以混合多个样本一同上机测序，节约测序成本。但接头在合成制备的过程中，以及PCR或测序过程中，可能会存在错误碱基的引入，从而可能造成交叉污染，影响低频突变检出的准确性。目前解决该问题常用的策略是UMI(Unique Molecular Identifier)和双标签(Dual Index)。

如上所述，经典的高通量文库构建方法是目前接受度最广、数据表现最稳定、数据偏向性最少的建库方法，但其建库过程耗时较长，对样本起始量要求较高，日益无法满足快速发展的市场对低起始量微量建库和快速报告周期的需求，这一点在高通量测序技术在临床方面的应用中表现的更为突出。而转座酶建库技术，虽然能够满足低起始量和快速建库的要求，但其数据偏向性又在一定程度上限制了该方法的大范围推广。另外，商品化建库试剂盒往往只针对一种来源的DNA样本，且成本较高。所以如果能对经典的高通量建库方法进行改良，在保持其现有优势的基础上降低其所需的样本起始量并缩短建库时间同时可兼容多种来源样本，将极大的推进高通量测序方法在市场上特别是医学研究和临床方向的应用，为相关领域研究和临床应用提供更有利的方法和技术。

在NGS测序过程中往往会多个样本混合在同一个通道中测序。为了区分出各个样本，文库构建过程会为每个样本带上固定的标签序列(index)以进行区分。目前的标签序列方式主要包括以下三种：(1) 单index模式，在接头连接或PCR扩增的环节将固定序列引入到样本中，该模式容易引起样本串扰污染； (2)双index模式，在接头及PCR引物中均含有相同的标签序列，能有效降低样本间的污染，解决串扰问题，但在测序过程中，可能出现拆分率低、样本下机数据量少的现象。(3)UMI+双index模式，在接头中带有一段随机的UMI(Unique Molecular Identifier)序列，PCR引物含有index序列并在PCR环节为样本带上独特的标签，在分析过程采用UMI去重复的方法可有效提高测序深度。UMI标签为一段随机性序列，在PCR及测序过程中容易发生变异，引入背景噪音，需要通过提高测序量来去除背景噪音，从而导致测序成本过高而难以转化为实际应用。

本发明通过优化双index以及UMI两种功能元件，开发出了新型的组合标签设计方式。可以在减少 UMI数量并同时增强其特异性，结合组合标签纠错方法，有效降低成本，同时增加测序深度并防控样本交叉污染。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种基因文库的构建方法，包括：基于待测核酸样本，进行末端修复，加A，以便获得经修复的末端加A的核酸样本；将所述经修复的末端加A的核酸样本和组合标签接头进行连接，以便获得连接有组合标签接头的核酸样本；基于所述连接有组合标签接头的核酸样本，扩增，以便获得所述测序文库；其中，所述组合标签接头含有组合标签和接头序列，所述组合标签包括至少两组标签，所述至少两组标签的每一组含有至少两个标签序列，所述至少两组标签的每一组内任意标签序列间的汉明距离大于等于2，优选大于等于3，所述至少两组标签的每一组间任意标签序列间的汉明距离大于等于1，优选大于等于2。

在构建基因文库的过程中，利用组合标签接头与经过末端加A的核酸样本进行连接，所构建获得的测序文库在后续测序的过程中，能够有效的增加测序深度，降低测序成本；而且能够减少样本间的污染。表现为：组合标签接头含有组合标签和接头序列，组合标签中的标签序列有一定的要求。其组内标签序列间的汉明距离大于等于2，优选大于等于3，组间的任意标签序列的汉明距离大于等于1，优选大于等于2。而汉明距离代表两个核酸序列相似程度，满足上述汉明距离的标签序列在应用时，可以减少样本间的污染。

根据本发明的实施例，以上所述基因文库的构建方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述标签序列为4～10个碱基，优选为4～6个碱基。考虑到组合标签在测序过程中会占用一定的测序长度，因此标签序列不宜过长，同时为了保证标签序列间的汉明距离，标签序列也不宜肽段。因此，4～10个碱基长度的标签序列即可以保证测序长度，还能够保证测序质量。例如4～6个碱基长度的标签序列测序效果较优。

在本发明的一些实施例中，所述标签序列的GC含量为20％～80％，例如为50％。由此能够保证标签序列较好的退火。

在本发明的一些实施例中，所述标签序列上任意位置处碱基A、T、C、G占比分别为25％。从而可以进一步提升测序质量。

在本发明的一些实施例中，所述标签序列不含有连续3个相同的碱基。从而进一步提升测序质量。

在本发明的一些实施例中，所述至少两组标签的每一组标签用于标记同一个样本。

在本发明的一些实施例中，所述组合标签接头选自下列中的至少一组：SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:4； SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12；SEQ IDNO:13～SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24；SEQID NO:25～SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32。

在本发明的一些实施例中，所述待测核酸样本的长度为200～300bp，所述待测核酸样本为福尔马林固定石蜡包埋样本或外周血循环肿瘤DNA。

在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：在对所述待测核酸样本进行末端修复之后，加A 之前，或者将所述经修复的末端加A的核酸和组合标签接头进行连接之后，利用磁珠进行纯化，采用含有非离子表面活性剂的DNA溶解液对所述纯化产物进行洗脱。

在本发明的一些实施例中，所述非离子表面活性剂为tween20。

在本发明的一些实施例中，利用DNA末端修复酶混合液进行所述末端修复，所述DNA末端修复酶混合液包括：聚合酶和多聚核苷酸激酶，所述聚合酶包括T4DNA聚合酶和Klenow大片段，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶。

在本发明的一些实施例中，利用引物进行所述第一扩增，所述引物的部分序列能够与所述组合标签接头的部分序列进行互补配对，所述引物上含有分子标签序列。采用组合标签接头，同时实现双index 的防样本污染功能，又起到UMI标签的剔除重复度、降低背景信号，提高检测性能。例如，每一组接头序列3’端含有一段已知的6bpUMI功能序列，相比传统未知序列UMI能有效的控制合成过程、质量、数量；在接头连接步骤，该序列与样本DNA片段结合，每个样本的连接产物均含有一段特定的已知序列(UMI功能)；在PCR过程中，通过PCR引物为每个样本带上特定的另一段标签序列。在数据分析过程中，通过PCR引物上带有分子标签序列，可以拆分出每个样本的数据，通过接头引入的标签序列起到UMI标签功能，以此进行数据去重复，提高有效测序深度。采用上述模式，可以快速发现样本间的串扰情况。另外实验过程中的接头污染、引物污染等也能够通过组合信息被发现并被过滤掉，降低背景信号，提高检测性能。

在本发明的一些实施例，利用寡核苷酸对所述组合标签接头进行封闭，所述寡核苷酸能够与所述组合标签接头的至少部分组合标签序列进行互补配对。由于组合标签接头相比较于传统的接头多出一段标签序列，采用常规的blocking oligos对其进行封闭时，性能稍差，测序数据量会稍有增加，因此使得捕获效率偏低，从而造成数据的浪费。为了解决常规blocking oligos对组合标签接头封闭不完全的问题，可以设计能够与组合标签接头的至少部分组合标签序列互补配对的寡核苷酸进行封闭，能够有效提升数据的利用率。这些能够实现上述封闭功能的寡核苷酸序列在本领域通常被称为封闭序列。本发明用到的组合标签接头序列与常规接头序列相比多出组合标签且序列多样，因此在进行封闭时，针对性的封闭序列需要加长，需要对组合标签部分进行封闭。本领域技术人员可以根据组合标签接头的序列，设计合适的封闭序列。同时为了增加封闭效果，在设计合成封闭序列时可以加入一定比例闭锁核苷酸(Locked Nucleic Acid,LNA/Bridged Nucleic Acid,BNA)等人造核苷酸，以提升封闭序列熔解温度(melting temperature,Tm)。由于封闭序列会进入到捕获后的PCR体系中，因此要阻断封闭序列3’端，使其不能延伸，一般使用C3spacer修饰。

在本发明的一些实施例中，在所述第一扩增之后进一步包括：利用液相探针对所述扩增产物进行杂交捕获，以便获得目标区域产物；基于所述目标区域产物进行第二扩增，以便获得所述测序文库。借助于液相探针可以针对性的富集与肿瘤相关基因中目标区域，实验通过一次DNA检测进行多基因多位点的深度高通量测序，同时检测基因的多种变异类型，包括点突变，缺失，插入，融合基因，拷贝数变异，并可同时输出MSI、TMB和分子分型检测结果，在检测广度上优于现有的技术。

同时，在研究过程中，发明人注意到：

现有的肿瘤NGS检测技术，有些针对基因组DNA进行检测，可以通过一次检测获取点突变、插入缺失突变、拷贝数变异结果，或者在前述基础上获得融合基因的检测结果。另外一些针对RNA进行检测，获取融合基因、基因表达等信息。但随着临床应用的深入，额外的检测类型如MSI、TMB和分子分型在一些癌种的应用中会被同步要求检测。对于MSI检测，常用的方法为免疫组化(IHC)方法检测 MMR基因蛋白表达，以及PCR方法检测特定的MS位点。TMB检测则需要通过二代测序对特定的Panel (如外全显子WES)进行检测获取突变情况计算得出。基于基因变异的分子分型检测常使用一代测序或PCR法。

为此，在本发明的第二方面，本发明提供了一种检测待测核酸样本基因突变的方法，包括：基于所述待测核酸样本，根据本发明第一方面任一实施例所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；将所述测序结果与参考基因组进行比对，以便确定所述待测核酸样本的基因突变信息。

在本发明的一些实施例中，所述基因突变包括点突变、插入缺失突变、基因融合、拷贝数变异、肿瘤突变负荷、MSI、TMB、分子分型的至少一种。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，包括组合标签接头，所述组合标签接头选自下列中的至少一组：SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12； SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17～SEQ IDNO:20；SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29～SEQID NO:32。应用含有这些组合标签接头的试剂盒，可以用于基因文库的构建以及测序。例如可以将该试剂盒用于肿瘤多基因突变的检测，为临床提供更加安全、准确、灵敏、便捷、高性价比的基因突变检测手段。

在本发明的一些实施例中，以上所述的试剂盒进一步包括末端修复酶混合液和末端修复缓冲液，所述末端修复酶包括聚合酶和多聚核苷酸激酶，所述聚合酶包括T4DNA聚合酶和Klenow大片段，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶；所述末端修复缓冲液包括dNTP混合液、多聚核苷酸激酶缓冲液。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括：加A反应酶和加A反应缓冲液，所述加A反应酶为缺乏5’-3’和3’-5’外切酶活性的聚合酶，所述加A反应缓冲液包括dATP和聚合酶缓冲液。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括含有非离子表面活性剂tween20的DNA溶解液。通过含有非离子表面活性剂tween20的DNA溶解液，显著的提升了文库构建性能且更适合自动化，从而提升工作效率。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括引物，所述引物序列如SEQ IDNO:33～SEQ ID NO:39所示。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的测序文库构建示意图。

图2是根据本发明的实施例提供的一种组合标签接头制备的示意图。

图3是根据本发明的实施例提供的组合标签接头的示意图。

图4是根据本发明的实施例提供的组合标签接头对于测序结果的影响结果。

图5是根据本发明的实施例提供的不同洗脱液对于文库构建质量的影响。

图6是根据本发明的实施例提供的无核酸酶水和纯化洗脱液在手工和自动化条件下对于文库构建的影响结果图。

图7是根据本发明的实施例提供的针对组合标签接头设计blocking oligos对于测序结果的影响图。

图8是根据本发明的实施例提供的组合标签的设计示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

组合标签

在对待检测核酸分子进行测序的过程中，通常引入标签序列使得每个待检测的核酸恩分子上带有唯一的表示序列，来提高测序深度。为了行使标签序列的识别功能以及防污染功能，标签序列设计长度、种类、汉明距离等参数均有一定的要求。例如设计的标签序列的长度为3，汉明距离为3的标签只有四条，数量太少在应用上不太现实。因此设计可用的测序效果较佳的标签序列，用于测序，对于节约测序成本，提高测序质量很重要。

在设计标签序列时，通常情况下的设计思路是首先确定某个具体应用中一个样本所需要的标签数量，然后确定一次NGS测序最大能够检测多少个样本，两者相乘即为总标签数量。根据需求标签的数量选择标签的最短长度，来获取标签序列，用于测序领域。

在本发明的至少一些实施方式中，通过下述方法获取组合标签：(1)根据标签长度设计多个标签序列；(2)对所述多个标签序列进行分组，每组至少2条标签序列，其中组内任意两个标签序列的汉明距离大于等于2，优选至少为3，组间任意两个标签序列的汉明距离大于等于1，优选至少为2。通过该方法获取的组合标签，每组标签对应到一个样本index上，从而实现样本的区分。

在至少一些实施方式中，可以通过下述方法获取组合标签：(1)首先按照组合标签长度(例如长度为6)、一定GC含量(例如50％)来进行设计；(2)将长度为6的标签序列按照2个碱基一组分为三部分，每部分GC含量50％，因此每部分可得到AC、T G、C T、G A、AG、T C、CA、G T这8个短序列，且这8个序列中两两之间汉明距离大于等于1；(3)将三个部分的序列进行组合，可得到512条 (8×8×8)长度为6的标签，且标签互相之间汉明距离至少为1，每条标签GC含量仍然为50％，且不会存在连续3个相同碱基的情况。对512条序列进行分组，例如每组包含2条标签，例如组A中含有标签序列1和标签序列2，组B中含有标签序列3和标签序列4，依次类推；通过分组获得组内汉明距离大于等于2，组间汉明距离大于等于1的标签。

在确定标签长度时，所确定的标签长度可以是4-8个不等，所确定的每个标签序列中的GC含量可以在20～80％之间。另外，在对多个标签序列进行分组时，也可以根据需要，每组含有2～8个标签，例如可以每组含有两个标签序列，含有四个标签序列或者含有六个标签序列等。通过分组使得组内任意2 个标签之间汉明距离大于等于2，优选大于等于3，组间任意两个标签之间汉明距离大于等于1，优选大于等于2。

为此，在本发明的至少一些实施方式中，本发明提供了一种组合标签，包括至少两组标签，所述至少两组标签的每一组含有至少两个标签序列，所述至少两组标签的每一组内任意标签序列间的汉明距离大于等于2，优选大于等于3，所述至少两组标签的每一组间任意标签序列间的汉明距离大于等于1，优选大于等于2。

上述组合标签应用于测序过程中，每组标签用于标记一个样本，能够有效增加测序深度，降低测序成本。例如设计的一组组合标签A，包括标签序列1和标签序列2，其在测序过程中，考虑到连接到待测核酸分子的两端，会产生四种组合，例如标签序列1-标签序列1，标签序列1-标签序列2，标签序列 2-标签序列1，标签序列2-标签序列2，这样针对同一个样本，就会产生四种组合；同样地，涉及一组组合标签B，包括标签序列3和标签序列4，相似地，在测序过程中也会产生四种组合。由此通过多种组合，增加测序深度，降低测序成本。而且一个样本对应了唯一的一组标签，不同样本对应不同的标签组合，可以减少样本之间的污染。

组合标签位于待测核酸分子两侧，即两者共用同一个测序引物。这种设计方式会损失一定的测序长度，因此分子标签不宜过长，为了保证标签间汉明距离，标签也不会太短。标签长度4-10碱基比较合适，标签长度4-6碱基测序效果较优。为了保证标签的测序质量，对于不同标签的同一位置，A/T/G/C 4 种碱基百分比各为25％为最优，标签序列中避免出现连续的3个碱基。为了保证标签正常退火，标签本身GC含量应大于20％，小于80％，最适为50％。

组合标签接头

通过将上述组合标签和接头序列连接，可以获得组合标签接头，用于基因文库的构建和测序。例如将MGISEQ测序平台的接头序列和上述组合标签连接，获得组合标签接头，这些组合标签接头可以是下列中的至少一组：

SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8；

SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12；

SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16；

SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20；

SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24；

SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28；

SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32。

基因文库的构建方法及检测待测核酸样本基因突变的方法

根据本发明的一个方面，利用上述组合标签接头，本发明提供了一种基因文库的构建方法，包括：末端修复、加A、组合标签接头连接、PCR扩增等过程，流程操作简便并降低样本损耗。

在至少一些实施方式中，本发明所提供的基因文库的构建方法包括：

(1)将打断后的基因组DNA、聚合酶、多聚核苷酸激酶、dNTP混合液，以及多聚核苷酸激酶缓冲液混合反应，以便进行末端修复。在dNTP存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，例如利用聚合酶的5’-3’聚合活性将5’突出末端补平和/或聚合酶的3’-5’外切活性将3’突出末端切平，利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基；

(2)将上述末端修复产物和dATP、缺乏5’-3’和3’-5’外切活性的聚合酶、以及聚合酶缓冲液混合，以便进行末端加A。在聚合酶的作用下，利用上述体系可以对末端修复后的DNA分子片段末端加A。

(3)将上述末端加A产物和组合标签接头、连接酶、连接缓冲液混合，进行连接，以便获得连接有组合标签接头的核酸样本。组合标签接头一端为单碱基突出末端，所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端；使上一步产生的3’A突出的双链DNA与接头连接。

(4)基于上述连接有组合标签接头的核酸样本，加入与上述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团。同时引物上带有barcode，为合并测序的样本提供拆分的标签。

利用热变性将扩增产物变成单链脱氧核酸，并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列，与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应，使目的单链核酸环化，得到所述测序文库。

上述方法可以应用于肿瘤多基因检测，例如根据已发表的文章中显示与肿瘤相关的基因、NCCN指南明确指出的与肿瘤有关的变异基因、FDA和NMPA网站上批准的与癌症治疗相关的基因、4个数据库中进行搜索获得资讯，设计了一个包含694基因的肿瘤区域捕获探针，通过杂交捕获技术获得肿瘤目标区域产物，并对产物进行PCR扩增获得产物。

在本发明的至少一些实施方式中，在获得末端修复产物之后，利用磁珠纯化，去除小片段，采用含有非离子表面活性剂tween20的纯化洗脱液进行洗脱。

在本发明的至少一些实施方式中，在连接组合标签接头后，采用磁珠去除过量的接头短片段，使用含有非离子表面活性剂tween20的纯化洗脱液进行洗。

在本发明的至少一些实施方式中，在扩增PCR扩增产物后，采用磁珠纯化，然后将所述PCR产物溶解于纯水中，以减少盐离子对后续的杂交环节影响。

试剂盒

本发明还提供一种试剂盒，试剂盒包括上述组合标签接头。可以将该试剂盒应用于常规的基因文库的构建和测序领域。

在本发明的至少一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括DNA末端修复酶混合液和末端修复缓冲液。其中DNA末端修复酶混合液包含DNA末端修复酶1(T4DNA聚合酶和Klenow大片段)，以及 DNA末端修复酶2(多聚核苷酸激酶)；末端修复缓冲液包含dNTP混合液、多聚核苷酸激酶缓冲液。在至少一些实施方式中，可以用DNA末端修复酶混合液和末端修复缓冲液配制100μL的反应体系，其中每100μL的体系中含有T4DNA聚合酶0-100U，Klenow大片段0-100U，T4多聚核苷酸激酶， dNTP0.02-20mM，镁离子0-100mM，T4DNA聚合酶缓冲液1-10μL。

在本发明的至少一些实施方式中，所述试剂盒还可以进一步包含加A反应酶和加A反应缓冲液。其中加A反应酶由缺乏5’-3’和3’-5’外切活性的聚合酶构成，例如可以是缺乏3’-5’外切功能的 Klenow片段(klenow fragment 3’-5’exo^-)。加A反应缓冲液由dATP、聚合酶缓冲液组成。可以将所述加A反应酶和加A反应缓冲液用于配置35μL反应体系，其中每35μL的体系中含有打断及末端修复产物20-30μL、dATP 0-20mM、聚合酶缓冲液3-5μL、缺乏5’-3’和3’-5’外切活性的聚合酶0-100U。

在本发明的至少一些实施方式中，除了上述组合标签接头之外，还可以包括连接酶、连接缓冲液。所述连接酶可以为T4DNA连接酶。

在本发明的至少一些实施方式中，所述试剂盒还包含PCR反应液和PCR引物。PCR引物包含上游引物及下游引物，其中上游引物为通用引物，下游引物包含分子标签，用于样本数据拆分，两个引物等比例混合，制备成PCR引物。

同时，以上所述的试剂盒还可以用于肿瘤多基因突变的检测。在至少一些实施方式中，所述试剂盒还包含肿瘤区域捕获探针、杂交捕获试剂和杂交洗脱试剂。捕获探针和杂交捕获试剂用于肿瘤目标区域捕获；杂交洗脱试剂用于非特异性捕获区域的洗涤以及最终捕获产物的洗脱。

本发明所提供的试剂盒，可以兼容多种来源DNA样本，以受检者血浆中提取的游离DNA或新鲜组织样本/石蜡包埋组织样本(FFPE)中提取的基因组DNA为检测样本，而且应用于肿瘤多基因突变检测时，可以以受检者血液样本提取的基因组DNA为对照样本，基于高通量测序技术平台和芯片捕获技术，例如可以一次性对694个肿瘤相关基因的10176个EXON，9226个Intron进行测序，并结合生物信息分析，获取该区域的基因突变信息，包括694个基因的点突变、插入缺失突变、部分基因的融合检测及拷贝数变异、肿瘤突变负荷(TMB)、微卫星不稳定(MSI)，提供突变状态的定量评估，全面、系统、准确地解读肿瘤药物与基因的关系。由此一方面有效的提高了文库构建中DNA分子利用率，另一方面通过对接头的改造，可以有效的防止样本间的污染从而更好的服务于临床。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。例如可以通过一些市售的试剂盒中的试剂或者借助于本领域成熟的技术和条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1首先获取了多种组合标签，然后与接头序列连接，获得了组合标签接头序列。

参照图8所示：

1)首先按照组合标签长度为6、GC含量50％来进行设计标签序列；

2)将长度为6的标签序列按照2个碱基一组分为三部分，每部分GC含量50％，因此每部分可得到AC、T G、C T、G A、AG、T C、C A、G T这8个短序列，且这8个序列中两两之间汉明距离大于等于1；

3)将三个部分的序列进行组合，可得到512条(8×8×8)长度为6的标签，且标签互相之间汉明距离至少为1，每条标签GC含量仍然为50％，且不会存在连续3个相同碱基的情况。

4)对512条序列进行挑选和分组，实施例中每组包含2条标签，通过分组获得组内汉明距离大于等于2，组间汉明距离大于等于1的标签，根据标签信息订制接头序列。

基于上述方法所设计的组合标签为：

以组合标签A为例，其含有标签序列ACGTAC和TGCATG(已示在实施例2表1中组合标签接头 A中，下划线处的碱基即为所设计的标签序列)。

以组合标签B为例，其含有标签序列GAACGT和CTTGCA已示在实施例2表1中组合标签接头 A中，下划线处的碱基即为所设计的标签序列)。

具体的其他的组合标签C、组合标签D、组合标签E、组合标签F、组合标签G、组合标签H中含有的标签序列已经在实施例2表1中组合标签接头C、组合标签接头D、组合标签接头E、组合标签接头F、组合标签接头G、组合标签接头H中示出。

然后将所设计的组合标签与接头序列连接，获得组合标签接头，其中所用到的接头序列适用于 BGI-SEQ 500测序平台的接头序列。其中，在组合标签接头的一端(3’末端)设计为单碱基突出末端，所述单碱基突出末端为T，能够在建库时方便与末端加A的DNA进行连接。

所获得的组合标签接头序列如下表1所示：

表1组合标签接头

以组合标签接头A为例，参照图2所示，组合标签接头A中包含两种组合标签接头，即A1和A2，以A1为例，图3下半部分方框中ACGTAC即代表组合标签接头中含有的标签序列，同一方框中下方序列TGCATG代表该标签序列的反向互补序列。两条序列反向互补(加粗区域即为互补区)，然后通过退火形成双链A1。A2也进行相同的操作，获得双链A2。将A1和A2等体积混合，形成最终组合标签接头A。具体可以参照如下操作：

首先进行接头正负链退火，然后将同一组的标签接头混合、稀释制备组合标签接头工作液：

将以上序列使用OAB缓冲液稀释为100μM并按照对应编号退火，例如YUC192_2X2AD_L_A1与 YUC192_2X2AD_R_A1等体积混合，混合后编号为YUC192_2X2AD_A1并放到PCR仪上退火。退火程序为：95℃，2min；1℃/min降温速率降温至20℃。退火后的接头再次两两等体积混合，例如将 YUC192_2X2AD_A1与YUC192_2X2AD_A2等体积混合，制备接头母液，编号为YUC192_2X2AD_A。制备的母液使用OAB缓冲液稀释5倍，即得到工作液。

将所获得的工作液利用bio-analyzer2100进行质控检测，结果表明，所有接头的峰型均正常。

实施例2组合标签接头对测序深度的提升及样本间污染的评估

1、样本选取

阴性样本使用炎黄细胞DNA(YH DNA)，阳性样本使用商品化gDNA标准品HD701。每个样品取 200ng gDNA进行后续实验，做3个重复，其中阴性样本分别命名为YH-1，YH-2，YH-3，阳性样本分别命名为HD701-1，HD701-2，HD701-3。设置如下：

2、样本片段化

使用不含核酸酶超纯水(NF水)将其体积补齐至75μl。将液体转移至打断管内，放入核酸打断仪 (Bioruptor pico)中。打断仪预冷至4℃，打断参数为：

目标片段大小(bp)	打断参数	循环数
			200	打断30s/停30s	16

3、末端修复

(1)提前取出末端修复缓冲液室温解冻，涡旋并短暂离心。酶试剂在使用之前取出；

(2)按下表加入各组分，吹吸混匀并置于冰盒上；

(3)PCR仪上设置末端修复程序如下，将末端修复反应体系置于PCR仪器中反应；

末端修复程序结束后，1.5倍磁珠纯化(磁力板纯化，可人工纯化或自动化纯化)。加入150μl磁珠 A，最后用28.1μl DNA溶解液回溶于0.2ml管中。

4、末端加A

(1)取出加A反应缓冲液室温解冻、涡旋并短暂离心。酶试剂用之前取出；

(2)按下表加入各组分，吹吸混匀并置于冰盒上；

(3)在PCR仪上设置加‘A’程序如下，将加”A”反应体系置于PCR仪器中；

加A程序结束后，不纯化，直接进行下一步反应；

5、接头连接

(1)取出连接缓冲液、组合标签接头室温解冻，涡旋并短暂离心。酶试剂用之前取出；

(2)按下表加入各组分，吹吸混匀，置于冰盒上；

其中，每个样本与接头编号对应关系如下：

样本名称	接头名称
		YH-1	组合标签接头A
YH-2	组合标签接头B
		YH-3	组合标签接头C
HD701-1	组合标签接头D
		HD701-2	组合标签接头E
HD701-3	组合标签接头F

(3)PCR仪上设置接头连接程序如下，将接头连接反应体系置于PCR仪器中；

接头连接程序结束后，磁珠A纯化(板纯，可人工纯化或自动化纯化)。加入30μl无核酸酶水和50μl 磁珠A纯化，最后用41μl DNA溶解液回溶并转移至新的0.2ml PCR管中。

6、文库扩增

(1)取出引物、PCR反应液4℃解冻，涡旋并短暂离心后置于冰盒中；

(2)按下表配制反应体系，置于冰盒暂存；

(3)在PCR仪上设置程序如下，将上一步反应体系置于PCR仪器中，开始反应；

其中样本、接头引物对应关系如下表：

样本名称	接头名称	引物名称
			YH-1	组合标签接头A	引物1和通用引物
YH-2	组合标签接头B	引物2和通用引物
			YH-3	组合标签接头C	引物3和通用引物
HD701-1	组合标签接头D	引物4和通用引物
			HD701-2	组合标签接头E	引物5和通用引物
HD701-3	组合标签接头F	引物6和通用引物

其中各引物序列如下表2所示：

表2各引物序列

PCR程序结束后，磁珠A纯化(板纯，可人工纯化或自动化纯化)。加入100μl磁珠A纯化，最后用32μl无核酸酶水回溶于0.2ml PCR管中保存。

7、文库混样(Pooling)

根据Qubit结果进行文库混样，按下表所示：

样本名称	文库投入量(ng)
		YH-1	300
YH-2	300
		YH-3	300
HD701-1	300
		HD701-2	300
HD701-3	300

8、杂交文库准备

以下杂交试剂1、杂交试剂2、杂交试剂3以及步骤10中用到的洗脱液均来自于市售的杂交试剂盒以及洗脱试剂盒。在该实施例中用到的试剂盒购自于IDT公司。

(1)加7μl杂交试剂1(用于封闭组合标签接头及基因组短重复序列)至混合文库中。盖好管盖，用干净的刀片在分装的EP管盖上戳数个孔，上一步混合物置于离心浓缩仪中蒸干，温度设置为60℃；

(2)将干粉样品取出，贴上封口膜；

9、芯片杂交

(1)将杂交试剂2(2x杂交buffer)、杂交试剂3(杂交增强剂)提前取出，常温解冻；将泛癌种探针从-20℃冰箱中拿出，放在冰上解冻。按下表配置杂交mix；

注：以上组分可以预先混合到一起保存，并命名为“杂交液”。

(2)向干粉样品中加入13μL杂交mix和4μL探针，吹吸混匀，室温静置5-10min充分溶解，而后涡旋，短暂离心；

(3)将上一步液体转至0.2ml PCR管，短暂离心后置于PCR仪上，杂交程序如下；

10、洗脱液配置

试剂盒中洗脱试剂为原液，浓度为10x或2x，实验中工作液浓度需为1x，稀释方法见下表，以下为1个杂交反应用量；

注：以上工作液可预先配置、保存，分别命名为：“磁珠B洗液”、“洗脱液1”、“洗脱液2”、“洗脱液3”、“洗脱液S”。

提前将加热块打开并将温度调至65℃，温浴1X洗脱液1和1X洗脱液S，至少15min；

11、磁珠B重悬液制备

配置方法如下，以下为1个杂交反应用量；

注：以上组分可以预先混合到一起保存，并命名为“磁珠B重悬液”。

12、磁珠B准备

1)从4℃冰箱中取出磁珠B，室温平衡30min，振荡混匀；

2)分装50μL/单杂交用量磁珠B至0.2ml管中；

3)加入100μl的1X磁珠B洗液，上下颠倒混匀10次；

4)置于磁力架至澄清，约1min，去上清；

5)重复3和4步骤两次，共3次；

6)用17μl磁珠B重悬液重悬磁珠，此磁珠用来结合捕获的DNA，标记待用。

13、磁珠捕获

1)探针杂交反应结束后，从PCR仪上，取下杂交反应物；

2)将上一步准备好的17μL磁珠B，加入从PCR仪上取下的0.2ml管中，温和地涡旋，以保证混合均匀，短暂离心；

3)将上一步反应混合物，置于PCR仪中，65℃孵育45min。(期间每10-12分钟，温和地涡旋一次)；

14、洗脱

1)向上一步反应管中，加入100μL 65℃的洗脱液1，吹吸10次，尽量不要产生气泡，之后置于板式磁力架1min，去掉上清；

2)将反应管从磁力架取下，加入150μL 65℃的洗脱液S，吹吸10次，尽量不要产生气泡，65℃孵育5min，之后置于磁力架1min，去掉上清；

3)重复步骤2一次，共2次；

4)将反应管从磁力架取下，加入150μL常温的洗脱液1，充分地涡旋直至重悬，室温孵育2min(期间涡旋30s，静置30s)，以保证混合物均一，短暂离心，置于磁力架上1min，去上清；

5)将反应管从磁力架取下，加入150μL常温的洗脱液2，充分地涡旋直至重悬，室温孵育2min(期间涡旋30s，静置30s)，以保证混合物均一，短暂离心，置于磁力架上1min，去上清；

6)将反应管从磁力架取下，加入150μL常温的洗脱液3，充分地涡旋直至重悬，室温孵育2min(期间涡旋30s，静置30s)，以保证混合物均一，短暂离心，置于磁力架上1min，去上清；

7)将反应管从磁力架取下，加入21μL无核酸酶水重悬磁珠，吹吸10次混匀。(直接带磁珠进行后续PCR)。

15、捕获后PCR

(1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出通用引物，常温融解并震荡离心，PCR反应液4℃解冻，短暂离心后置于冰盒中；

(2)按照下表配制成PCR反应体系，吹吸混匀，短暂离心，置于冰盒上；

注：可根据捕获投入量选择9-12个循环数。

通用引物序列如下表：

PCR程序结束后，磁珠A纯化(板纯，可人工纯化或自动化纯化)。加入50μl磁珠A，最后用32 μl无核酸酶水回溶于1.5ml EP管中保存文库质控；

16、测序及数据分析

将上步构建好的文库经电泳检测合格后进行华大MGISEQ-2000测序仪测序。取构建的单链环状 DNA文库进行DNA纳米球制备、MGISEQ-2000上机测序。测序过程严格按照MGISEQ-2000的标准操作流程进行上机操作。

6例样本首先使用常规分析，即在分析时将标签序列剪切掉，再进行分析，获得测序深度；然后在使用组合标签接头的UMI功能后，分析平均测序深度，其结果如图4所示，有效深度稳定增加10％左右。

统计每个样本相同index下不同接头序列的reads分布，如下表3所示。

表3各样本在相同index下不同接头序列的reads分布

其中，表3中以样本YH-1为例，其使用的为组合标签接头A，所用到的引物为引物1，理想情况下，样本1的数据中都含有组合标签接头A以及引物1的序列。但是实际上发现，含有引物1的数据中有一部分带有组合标签接头B、组合标接头C、组合标签接头D、组合标签接头E、组合标签接头F等。若带有组合标签接头B，由于组合标签接头B应该和引物2连锁，因此如果有组合标签接头B和引物1 连锁的情况，说明该数据是从样本YH-2串扰过来的。由此，计算污染样本YH-1的污染比例为 (14444+12983+5995+13510+6876)/40150747*100％＝0.13％。

从上表可以看出，每种引物下都有少量来源于其它样本的接头序列，而组合标签接头设计有效的将污染的reads分离出来，因此降低了样本间的污染。

变异检出情况如下表4所示：

表4变异检测结果

标准品HD701的3个重复样本突变均有检出，且检出频率与理论频率相近。YH细胞系DNA的3 例阴性样本在对应位点均无检出。

如下表所示，统计6例样本中180个位点，检测灵敏性和特异性均为100％。

	理论阳性	理论阴性
			检测阳性	90	0
检测阴性	0	90
				灵敏性：100％	特异性：100％

实施例3DNA溶解液提升文库构建效果

样本DNA在文库构建操作时，由于管壁、吸头对DNA的吸附以及磁珠纯化回溶时溶解不充分，会在操作过程中损失一定量的DNA，从而导致建库质量不稳定。针对这一情况，在不影响后续酶反应活性的基础上，配置含有非离子表面活性剂tween20的DNA溶解液(配方如下表)来代替传统的无核酸酶水或Low TE缓冲液，从而起到减少DNA吸附，促进DNA溶解的作用。

组分	单次配置用量
		Tris-HCl(1M)	400μl
EDTA(0.5M)	8μl
		tween20(1％,V:V)	2ml
NF水	补至40ml

采用实施例2实验流程，对其建库洗脱液进行比较。建库洗脱液选三种：无核酸酶水、low TE缓冲液、DNA溶解液。采用100ngYH细胞提取DNA进行文库构建，比较使用三种洗脱液后文库扩增浓度发现(图5)，DNA溶解液建库效果最佳，Low TE建库效果最不理想。说明DNA溶解液有效减少文库构建过程中的样本损失，提升文库构建性能。

传统无核酸酶水或者Low TE缓冲液在进行自动化磁珠纯化时往往不能充分溶解DNA或者回收 DNA时有磁珠残留影响实验效果。采用实施例2实验流程，以100ng YH细胞系DNA为样本进行文库构建，共测试32个样本。在实验过程中分别采用无核酸酶水、纯化洗脱液，纯化方式分别采用手工纯化和自动化纯化。如图6所示，使用无核酸酶水进行样本回溶，手工纯化效果要好于自动化纯化效果。使用DNA溶解液，手工纯化效果和自动化纯化效果持平。

实施例4针对组合标签的blocking oligos能够提升捕获效率

由于采用组合标签接头，常规接头的blocking oligos不能对此接头进行有效的封闭。因此使用针对组合标签接头的blocking oligos。6例样本使用炎黄细胞DNA，200ng每例。使用实施例2流程，对比常规blocking oligos与针对组合接头设计的blocking oligos的封闭能力，样本及测试分组信息如下：

样本编号	接头编号	封闭序列
			YH-1	YUC_AD_A	传统blocking oligos
YH-2	YUC_AD_B	传统blocking oligos
			YH-3	YUC_AD_C	传统blocking oligos
YH-4	YUC_AD_D	针对性blocking oligos
			YH-5	YUC_AD_E	针对性blocking oligos
YH-6	YUC_AD_F	针对性blocking oligos

其中，传统blocking oligos指的是能够封闭常规接头的寡核酸序列(在这里只仅同组合标签接头序列中的接头序列进行互补配对，实现相应的封闭)，针对性blockingoligos指的是能够封闭组合标签接头中的组合标签序列的寡核酸序列。组合标签接头序列与常规接头序列相比多出组合标签且序列多样，因此针对性的封闭序列需要加长，对组合标签序列的至少部分序列进行封闭。为了增加封闭效果，合成封闭序列时会加入一定比例闭锁核苷酸(Locked Nucleic Acid,LNA/Bridged Nucleic Acid,BNA)等人造核苷酸，以提升封闭序列熔解温度(melting temperature,Tm)。由于封闭序列会进入到捕获后的PCR体系中，因此要阻断封闭序列3’端，使其不能延伸，一般使用C3spacer修饰。根据上文提到的组合标签接头序列，设计针对性的blocking oligos，并与传统blocking oligos进行比对。

通过测序数据发现(图7)，使用针对组合标签接头的blocking oligos能够有效提升目标区域捕获效率。由于转化出更多的有效数据量，测序深度也有显著提升。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 华大生物科技（武汉）有限公司，天津华大医学检验所有限公司，

深圳华大基因股份有限公司

<120> 基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒

<130> PIDC3193007

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_A1

<400> 1

gaacgacatg gctacgatcc gacttacgta ct 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_A2

<400> 2

gaacgacatg gctacgatcc gactttgcat gt 32

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_A1

<400> 3

gtacgtaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_A2

<400> 4

catgcaaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_B1

<400> 5

gaacgacatg gctacgatcc gacttgaacg tt 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_B2

<400> 6

gaacgacatg gctacgatcc gacttcttgc at 32

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_B1

<400> 7

acgttcaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_B2

<400> 8

tgcaagaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_C1

<400> 9

gaacgacatg gctacgatcc gacttacacg tt 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_C2

<400> 10

gaacgacatg gctacgatcc gactttgtgc at 32

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_C1

<400> 11

acgtgtaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_C2

<400> 12

tgcacaaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_D1

<400> 13

gaacgacatg gctacgatcc gacttgagta ct 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_D2

<400> 14

gaacgacatg gctacgatcc gacttctcat gt 32

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_D1

<400> 15

gtactcaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_D2

<400> 16

catgagaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_E1

<400> 17

gaacgacatg gctacgatcc gacttaccaa ct 32

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_E2

<400> 18

gaacgacatg gctacgatcc gactttggtt gt 32

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_E1

<400> 19

gttggtaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_E2

<400> 20

caaccaaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_F1

<400> 21

gaacgacatg gctacgatcc gacttgatgg tt 32

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_F2

<400> 22

gaacgacatg gctacgatcc gacttctacc at 32

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_F1

<400> 23

accatcaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_F2

<400> 24

tggtagaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_G1

<400> 25

gaacgacatg gctacgatcc gacttactgg tt 32

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_G2

<400> 26

gaacgacatg gctacgatcc gactttgacc at 32

<210> 27

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_G1

<400> 27

accagtaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 28

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_G2

<400> 28

tggtcaaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_H1

<400> 29

gaacgacatg gctacgatcc gacttgacaa ct 32

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_L_H2

<400> 30

gaacgacatg gctacgatcc gacttctgtt gt 32

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_H1

<400> 31

gttgtcaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 32

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC192_2X2AD_R_H2

<400> 32

caacagaagt cggaggccaa gcggtcttag gaagacaa 38

<210> 33

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_R1

<400> 33

tgtgagccaa ggagttgatc ggacctattg tcttcctaag accgcttggc c 51

<210> 34

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_R2

<400> 34

tgtgagccaa ggagttggat tccgtccttg tcttcctaag accgcttggc c 51

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_R3

<400> 35

tgtgagccaa ggagttgcgg cagtaagttg tcttcctaag accgcttggc c 51

<210> 36

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_R4

<400> 36

tgtgagccaa ggagttgtca attaggtttg tcttcctaag accgcttggc c 51

<210> 37

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_R5

<400> 37

tgtgagccaa ggagttgcgg atacgaattg tcttcctaag accgcttggc c 51

<210> 38

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_R6

<400> 38

tgtgagccaa ggagttggct cgttaccttg tcttcctaag accgcttggc c 51

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YUC_Pre_L

<400> 39

gaacgacatg gctacgatcc g 21

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Flowcell primers F

<400> 40

gaacgacatg gctacga 17

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Flowcell primers R

<400> 41

tgtgagccaa ggagttg 17

Claims

1.一种基因文库的构建方法，其特征在于，包括：

基于待测核酸样本，进行末端修复，加A，以便获得经修复的末端加A的核酸样本；

将所述经修复的末端加A的核酸样本和组合标签接头进行连接，以便获得连接有组合标签接头的核酸样本；

基于所述连接有组合标签接头的核酸样本，进行第一扩增，以便获得所述测序文库；

其中，所述组合标签接头含有组合标签和接头序列，所述组合标签包括至少两组标签，所述至少两组标签的每一组含有至少两个标签序列，

所述至少两组标签的每一组内任意标签序列间的汉明距离大于等于2，优选大于等于3，

所述至少两组标签的每一组间任意标签序列间的汉明距离大于等于1，优选大于等于2。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述标签序列为4～10个碱基，优选为4～6个碱基；

任选地，所述标签序列的GC含量为20％～80％，例如为50％；

任选地，所述标签序列上任意位置处碱基A、T、C、G占比分别为25％；

任选地，所述标签序列不含有连续3个相同的碱基；

任选地，所述至少两组标签的每一组标签用于标记同一个样本。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述组合标签接头选自下列中的至少一组：

SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8；

SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12；

SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16；

SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20；

SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24；

SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28；

SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述待测核酸样本的长度为200～300bp，所述待测核酸样本为福尔马林固定石蜡包埋样本或外周血循环肿瘤DNA。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，进一步包括：

在对所述待测核酸样本进行末端修复之后，加A之前，或者将所述经修复的末端加A的核酸和组合标签接头进行连接之后，利用磁珠进行纯化，采用含有非离子表面活性剂的DNA溶解液对所述纯化产物进行洗脱；

任选地，所述非离子表面活性剂为tween20。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用DNA末端修复酶混合液进行所述末端修复，所述DNA末端修复酶混合液包括：聚合酶和多聚核苷酸激酶，所述聚合酶包括T4DNA聚合酶和Klenow大片段，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用引物进行所述第一扩增，所述引物的部分序列能够与所述组合标签接头的部分序列进行互补配对，所述引物上含有分子标签序列；

任选地，进一步包括：利用寡核苷酸对所述组合标签接头进行封闭，所述寡核苷酸能够与所述组合标签接头的至少部分组合标签序列进行互补配对。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述第一扩增之后进一步包括：

利用液相探针对所述扩增产物进行杂交捕获，以便获得目标区域产物；

基于所述目标区域产物进行第二扩增，以便获得所述测序文库。

9.一种待测核酸样本基因突变的检测方法，其特征在于，包括：

基于所述待测核酸样本，根据权利要求1～8中任一项所述的方法构建测序文库；

对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；

将所述测序结果与参考基因组进行比对，以便确定所述待测核酸样本的基因突变信息；

任选地，所述基因突变包括点突变、插入缺失突变、基因融合、拷贝数变异、肿瘤突变负荷、MSI、TMB、分子分型中的至少一种；

任选地，利用MGISEQ测序平台进行所述测序。

10.一种试剂盒，其特征在于，包括：组合标签接头，所述组合标签接头选自下列中的至少一组：

SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8；

SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12；

SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16；

SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20；

SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24；

SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28；

SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：

DNA末端修复酶混合液和末端修复缓冲液；

其中，所述DNA末端修复酶混合液包括聚合酶和多聚核苷酸激酶，所述聚合酶包括T4DNA聚合酶和Klenow大片段，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶；

所述末端修复缓冲液包括dNTP混合液、多聚核苷酸激酶缓冲液；

任选地，进一步包括：

加A反应酶和加A反应缓冲液，所述加A反应酶为缺乏5’-3’和3’-5’外切酶活性的聚合酶，所述加A反应缓冲液包括dATP和聚合酶缓冲液；

任选地，进一步包括T4连接酶和连接缓冲液。

12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：含有非离子表面活性剂tween20的DNA溶解液；

任选地，进一步包括：引物，所述引物序列如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39所示。