CN105714383B - 一种基于分子反向探针的测序文库构建方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于分子反向探针的测序文库构建方法和试剂，该方法包括：用分子反向探针与变性核酸进行退火杂交，分子反向探针包括5’端的锚定序列和3’端的延伸序列以及二者之间的测序接头序列，锚定序列和延伸序列分别与变性核酸中的目标区域两端的序列反向互补；以目标区域为模板，从3’端的延伸序列开始进行聚合反应，生成目标区域的互补序列；将5’端的锚定序列与目标区域的互补序列连接形成环状核酸分子；使用核酸外切酶消化未环化的线性分子，得到含有目标区域的单链环状分子。将得到的单链环状分子进行测序，从而实现对目标区域捕获测序。本发明的方法实现将单链环状文库构建和目标区域捕获融为一体，从而大大缩减建库流程和周期。

Description

一种基于分子反向探针的测序文库构建方法和试剂

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于分子反向探针的测序文库构建方法和试剂。

背景技术

随着DNA测序技术的发展，高通量测序技术已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域。尽管随着测序技术的不断更新和普及，测序技术的成本也越来越低，但全基因组测序技术本身的花费还是很昂贵。用来调和这一问题的一个较好的方案是将感兴趣的目标区域富集出来后再进行高通量测序。传统的序列捕获技术，通常是将高通量测序文库构建好后，再利用探针进行目标区域的文库富集再测序。

以CG(Complete Genomics)测序平台为代表的测序平台，需要先构建单链环状文库，然后以单链环状文库为模板，在滚环扩增引物序列的引导下进行滚环扩增，形成DNA纳米球(DNA nanoball，DNB)，再进行测序。构建单链环状文库本身是一个耗时、耗力、耗成本的过程，一般需要经过核酸的片段化和选择处理、片段的末端修复、3’端接头和5’端接头连接、缺口平移、聚合链式反应(PCR)、单链分离和环化等过程，整个过程最快也需要1-2天，并且很多步骤都需要进行磁珠纯化。此外，PCR过程可能引入碱基错误，导致测序结果不准确。此后为捕获目标区域，进行杂交还需要2-5天时间。

分子反向探针(Molecular Inversion Probe，MIP)技术是一种核酸目标区域捕获技术，能够用于捕获感兴趣的目标区域，用于下游处理或分析。目前MIP的应用方法，主要体现在通过MIP捕获目标区域，然后以MIP上所带有的PCR引物序列进行扩增得到大量线性扩增产物，根据需要在PCR引物序列上可以引入测序平台的接头序列，进而将线性扩增产物用于测序。

目前还未见MIP技术在以单链环状文库为测序对象的测序平台中的应用，来解决单链环状文库构建耗时、耗力、耗成本并且目标区域富集复杂的问题。

发明内容

本发明提供一种基于分子反向探针的测序文库构建方法和试剂，实现将单链环状文库构建和目标区域捕获融为一体，从而大大缩减建库流程和周期。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种基于分子反向探针的测序文库构建方法，包括如下步骤：

使用分子反向探针与变性核酸进行退火杂交，分子反向探针包括5’端的锚定序列和3’端的延伸序列以及锚定序列与延伸序列之间的测序接头序列，锚定序列和延伸序列分别与变性核酸中的目标区域两端的序列反向互补；

在聚合酶作用下，以目标区域为模板，从3’端的延伸序列开始进行聚合反应，生成目标区域的互补序列；

在连接酶作用下，将5’端的锚定序列与目标区域的互补序列连接形成环状核酸分子；

使用核酸外切酶消化未环化的线性分子，得到含有目标区域的单链环状分子。

作为本发明的优选方案，上述测序接头序列为以单链环状文库为测序对象的测序平台的测序接头序列，优选为CG测序平台的测序接头序列。

作为本发明的优选方案，测序接头序列包括标签序列、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列。

作为本发明的优选方案，5’端的锚定序列和3’端的延伸序列的长度为15-25个碱基。

作为本发明的优选方案，核酸外切酶为外切酶I和外切酶III。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种基于分子反向探针的测序文库构建试剂，包括如下组成部分：

分子反向探针，用于与变性核酸进行退火杂交，分子反向探针包括5’端的锚定序列和3’端的延伸序列以及锚定序列与延伸序列之间的测序接头序列，锚定序列和延伸序列分别与变性核酸中的目标区域两端的序列反向互补；

聚合酶，用于以目标区域为模板，从3’端的延伸序列开始进行聚合反应，生成目标区域的互补序列；

连接酶，用于将5’端的锚定序列与目标区域的互补序列连接形成环状核酸分子；

核酸外切酶，用于消化未环化的线性分子，得到含有目标区域的单链环状分子。

作为本发明的优选方案，上述测序接头序列为以单链环状文库为测序对象的测序平台的测序接头序列，优选为CG测序平台的测序接头序列。

作为本发明的优选方案，测序接头序列包括标签序列、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列。

作为本发明的优选方案，5’端的锚定序列和3’端的延伸序列的长度为15-25个碱基。

作为本发明的优选方案，核酸外切酶为外切酶I和外切酶III。

本发明的方法以特别设计的分子反向探针为基础，将单链环状文库构建和目标区域捕获融为一体，与传统的先构建全基因组文库再利用目标区域捕获技术将目标区域捕获出来再进行测序的方法相比，在流程和周期上大大缩短，一般只需要一天即可得到最终的上机测序文库。由于流程简单，因此可实现低起始量(低于100ng)、高通量、短周期、低成本的建库。此外，本发明的方法不需要PCR扩增文库，可以大大降低在建库过程中由于PCR所造成的错误。

附图说明

图1为本发明基于分子反向探针的测序文库构建方法的一个实施方案的技术原理示意图；

图2为本发明基于分子反向探针的测序文库构建方法的一个实施方案中的分子反向探针的测序接头序列部分(包括标签序列、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列)的序列结构示意图；

图3为本发明一种实施方案的环化DNA分子PCR扩增以及再环化的原理示意图；

图4为本发明中的第一种分子反向探针的制备原理示意图；

图5为本发明中的第二种分子反向探针的制备原理示意图；

图6为本发明中的第三种分子反向探针的制备原理示意图；

图7为本发明基于分子反向探针的测序文库构建方法的一个实施例得到的测序文库的凝胶电泳检测结果图，其中M表示DNA Marker，泳道1和2表示PCR产物验证结果；

图8为本发明基于分子反向探针的测序文库构建方法的另一个实施例得到的文库Agilent Bioanalyzer2100质检结果；

图9为本发明基于分子反向探针的测序文库构建方法的另一个实施例得到的各基因区域测序深度分布图；

图10为本发明基于分子反向探针的测序文库构建方法的另一个实施例得到的目标区域在不同深度下的测序覆盖度。

具体实施方式

本发明中涉及到的术语解释如下：

index pooling测序：把多个文库加上标签序列后混合在一起上机测序的一种测序方式。

oligo pools：将多种序列混合在一起合成的一种序列合成方式，一次可实现94K种序列一起合成。

Gibson组装：由J.Craig Vente研究所的Daniel Gibson开发，是最常用的序列拼接方案。

Agilent Bioanalyzer 2100：Agilent 2100生物芯片分析系统，基于微流控芯片技术的一种检测设备，可在30分钟内给出多达12个样品的定性定量数字化数据。

Ampligase：一种连接酶，Epicentre公司出品，配有10×Ampligase Buffer。

Phusion：一种高保真DNA聚合酶，Thermo fisher公司出品，货号F-530L。

Exo III：核酸外切酶III，该酶作用于双链DNA，沿3'→5'方向逐步催化去除单核苷酸。

Exo I：核酸外切酶I，该酶作用于单链DNA，按3'→5'方向降解单链DNA。

Phusion MM：一种高保真DNA聚合酶，Thermo fisher公司出品，货号F-531L。

TA Buffer：一种兼容各种限制性内切酶和核酸修饰酶的缓冲液。

T4DNA Ligase：T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端。

SE50：Single end 50测序，即5’-3’单向测序50nt。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

请参考图1，本发明使用一个包括5’端的锚定端序列(即锚定序列)、3’端的延伸端序列(即延伸序列)和中间的连接序列的分子反向探针(A)与变性核酸如基因组DNA进行退火杂交(B)，其中锚定序列和延伸序列分别与变性核酸中的目标区域两端的序列反向互补，连接序列包括测序接头序列即测序平台使用的接头序列(本领域公知各平台有所不同)；然后在聚合酶作用下，以目标区域为模板，从3’端的延伸序列开始进行聚合反应，生成目标区域的互补序列；再在连接酶作用下，将5’端的锚定序列与目标区域的互补序列连接形成环状核酸分子；最后使用核酸外切酶(如ExoIII和ExoI)消化未环化的线性分子(C)，得到含有目标区域的单链环状分子。得到的单链环状分子可用于DNA纳米球制备(D)。

本发明中的变性核酸，可以是任何来源的含待捕获的目标区域的核酸片段，典型但非限定性的例子比如：基因组DNA、基因组DNA经物理打断或转座酶包埋复合体打断得到的随机片段、PCR扩增产物、全基因组扩增(whole gemome amplification，WGA)产物等，特别是基因组DNA作为本发明的核酸用于捕获目标区域。对核酸进行变性的方法，比如本领域公知的热变性或碱变性等均可用于本发明。

需要说明的是，根据需要捕获的目标区域的不同，锚定序列和延伸序列相应地不同，如果需要同时捕获多种不同的目标区域，则使用相对应的多种锚定序列和延伸序列。因此，锚定序列和延伸序列并非固定不变的序列。而连接序列包括测序接头序列，对于特定的测序平台(如CG测序平台)而言，一般是具体序列，即测序平台通常使用的测序接头序列。

在本发明的一个实施方案中，锚定序列和延伸序列的长度为15-25个碱基，过长或过短都不具有优势，因为过长的锚定序列和延伸序列会提高分子反向探针的合成成本，而过短的锚定序列和延伸序列会导致分子反向探针与变性核酸退火杂交的力度不够，容易受温度影响而导致结合不牢。实验发现，长度为15-25个碱基的锚定序列和延伸序列能实现较好的效果。

在本发明的一个实施方案中，测序接头序列包括标签序列(barcode)、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列，其中标签序列用于区分不同的样本，即针对不同样本来源的待捕获的目标区域，使用具有不同标签序列的分子反向探针与其退火杂交。这样可以将不同样本来源的目标区域建库后混合上机测序，测序结果通过各自的标签序列而确认目标区域的样本来源，从而提高处理通量，降低成本。作为标签序列可以是一段适当长度的随机序列，比如8-12个碱基的随机序列，理论上有N个碱基的随机序列在种类上应该有4^N种，足以标记百万以上的样本。滚环扩增引物结合序列即DNA纳米球制备扩增序列。对于以CG测序平台为代表的测序平台，构建好的单链环状文库，需要在引物的引导下进行滚环扩增，形成DNA纳米球，再进行测序。这一过程需要引物引导，引物结合在滚环扩增引物结合序列上发挥引导功能。DNA纳米球制备过程中，每个单链环状分子被滚环扩增成成千上万个重复的分子单元连接的线性分子，并形成纳米球结构。测序引物结合序列是测序引物的结合位点的序列。DNA纳米球制备完成后，在测序引物的引导下，进行测序，读取线性分子上的碱基序列。

测序接头序列中的标签序列、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列三者可以是独立的序列(即没有重叠)，并且它们的位置没有特别限定，可以任意排列，比如图2a所示的标签序列1位于滚环扩增引物结合序列2与测序引物结合序列3之间，或图2b所示的滚环扩增引物结合序列2位于标签序列1与测序引物结合序列3之间，或图2c所示的测序引物结合序列3位于滚环扩增引物结合序列2与标签序列1之间。此外，如图2d所示，滚环扩增引物结合序列2与测序引物结合序列3之间可以有重叠(或共用)序列部分。相邻的两段序列可以直接相连，也可以由几个其它碱基连接。

本发明的分子反向探针的巧妙之处在于，锚定序列和延伸序列分别特异性结合到目标区域两端的序列上后形成反向互补，即锚定序列的5’端与延伸序列的3’端方向相对，这样在聚合酶作用下从延伸序列的3’端聚合形成的目标区域互补序列将与锚定序列的5’端相遇，然后在连接酶作用下即可连接成环。

在连接酶作用下，除了成环的环状分子，还有一些线性分子反向探针存在，这是因为有些分子反向探针没有退火杂交到相应的目标区域上，还有些分子反向探针虽然退火杂交到目标区域上，但是并没有在聚合酶作用下使聚合形成的目标区域互补序列与锚定序列的5’端相遇，导致没法连接成环。这些线性分子反向探针的存在，会影响后续扩增和测序的进行，因此需要使用核酸外切酶消化未环化的线性分子。所使用的核酸外切酶，一般是外切酶I(ExoI)和外切酶III(ExoIII)。其中，外切酶I具有从3’→5’方向水解单链DNA的外切酶活性，释放脱氧核糖核苷5’-单磷酸；而外切酶III作用于双链DNA，沿3'→5'方向逐步催化去除单核苷酸。

请参考图3，若环化后生成的环状DNA分子的量不足，可以通过PCR方式进行扩增。可以根据连接序列上的滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列设计相应的引物，并进行PCR扩增(图3中E)，得到大量线性的DNA分子；然后对PCR扩增得到的线性的DNA分子进行环化(图3中F)，具体可以使用能够同时与线性的DNA分子两端均互补的介导桥序列；最终环化后的DNA分子可以用于DNA纳米球的制备(图3中G)以及上机测序。

本发明中，分子反向探针对于本发明的实现是很关键的，探针的基本结构如上所述，包括5’端的锚定端序列(即锚定序列)、3’端的延伸端序列(即延伸序列)和中间的连接序列。这样的分子反向探针可以通过各种不同的方式得到，本申请中介绍三种用于获得分子反向探针的方法。需要说明的是，本申请中说明的这三种方法仅是示例性的，本申请中的分子反向探针并不局限于这三种方法得到的分子反向探针。

第一种方法，请参考图4，基于PCR的原理进行探针制备：分别设计并合成三段oligo(寡核苷酸)：探针引物L、Ad153连接序列(Ad153Linker，一种自命名的序列)和探针引物R。通过PCR的方式进行扩增，为了应用于index pooling测序，在Ad153Linker中间设计了标签序列。分别将每个位点的探针引物和Ad153Linker加入反应管，采用高保真聚合酶进行扩增；纯化PCR产物后进行磷酸化修饰，使PCR产物5’端磷酸化；通过琼脂糖凝胶电泳进行片段选择；纯化后用Agilent Bioanalyzer2100进行质检，合格后用于后续建库使用。

如下所示，给出一种可以用于上述第一种方法的探针引物L、Ad153Linker和探针引物R，其中捕获区域L和捕获区域R分别表示16-27bp的可变序列，根据捕获区域的序列设计。Ad153Linker中包含一段10bp的标签序列(barcode)，可以是随机序列。

探针引物L：(捕获区域L 16-27bp)AAGTCGGATCGTAGCCATGTCG(SEQ ID NO：1)；

探针引物R：(捕获区域R 16-27bp)AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCT(SEQ ID NO：2)；

Ad153 Linker：AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(10bp barcode)CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO：3)。

第二种方法，请参考图5，将探针序列拆成两部分合成：固定序列部分即骨架，通过oligo合成的方式订制；含有捕获序列(锚定端序列和延伸端序列)的部分通过oligo pools合成的方式订制。使用oligo扩增引物进行PCR反应，实现oligo分子数量的扩增；使用预先构建好的探针骨架，与合成的包含捕获序列的oligos进行Gibson组装，使形成环状DNA；使用通用引物扩增出探针库前体；扩增完成后，使用图5所示的两个限制酶(BspQI及BsrDI，或者其它酶切位点)进行酶切处理；再通过聚丙烯酰胺胶分离去除引物结合区对应的短片段，并纯化浓缩获得的探针库；纯化后用Agilent Bioanalyzer 2100进行质检，合格后用于后续建库使用。

如下所示，给出一种可以用于上述第二种方法的骨架序列，其中捕获区域L和捕获区域R分别表示16-27bp的可变序列，根据捕获区域的序列设计。

Oligo pools：GACCGCTTGGCCTCCGACTT(捕获区域L 16-27bp)TTGACGACTCAGTTGATCCTCGTCACGCAATGGAGTCCAGGT(捕获区域R 16-27bp)AAGTCGGATCGTAGCCATGTCG(SEQ ID NO：4)。

第三种方法，请参考图6，基于第二种方法进行简化，直接用oligo pools合成全长探针序列，在探针两端加上扩增引物区域(扩增引物L和R区域)，合成后用PCR扩增oligos；使用oligo扩增引物进行PCR反应，实现oligo分子数量的扩增；纯化扩增产物，使用限制性内切酶(如Mlyl)进行酶切处理；纯化后用Agilent Bioanalyzer2100进行质检，合格后用于后续建库使用。

如下所示，给出一种可以用于上述第三种方法的全长探针序列，其中捕获区域L和捕获区域R分别表示16-27bp的可变序列，并且包含一段10bp的标签序列(barcode)，可以是随机序列。

Oligo pools：CCATGTCTAACCGGGAAGCAGAGTCGTCAAC(捕获区域L 16-27bp)AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA(10bp barcode)CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(捕获区域R 16-27bp)CAGCTGGACTCATATTGGTAGCGGATGGGCA(SEQ ID NO：5)。

需要说明的是，基于本发明的特点，本发明适用于任何以单链环状文库为测序模板的测序平台，典型地比如CG测序平台，当然也包括现有的其它此类平台以及将来可能开发出来的此类平台。

下面通过具体实施例来详细说明本发明。

实施例1

本实施例以炎黄(YH)的基因组DNA(gDNA)作为实验材料，以耳聋基因检测的某一个位点为实例进行。

检测位点及附近序列如下，其中下划线加粗斜体的为待检测位点；下划线部分的序列为目标区域两端的序列，分别与分子反向探针的锚定序列和延伸序列特异性结合。

5’-AGGATCGTTGTCATCCAGTCtcttccttaggaattcattgcctttgggatcagcacatcttctcaggattcttctcttgttttgtggccaccactgctctttcccgcacggccgtccaggagagcactggaggaaagacaCAGGTAGGAACAACAGCCTT-3’(SEQ ID NO：6)。

根据以上检测位点及附近序列，设计如下分子反向探针序列，其中下划线部分的序列分别为分子反向探针的锚定序列和延伸序列。

5’-pho_CCCAAAGGCAATGAATAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTG AAAGAGCAGTGGTGGC-3’(SEQ ID NO：7)。

将模板(YH gDNA)和分子反向探针，分别在95℃预变性5min后，立刻置于冰上。

按照下表1所示的体系进行退火、延伸和连接反应。

表1

将上述反应体系，按95℃3min→(95℃30s→55℃5min)×20个循环，进行反应。

上述退火、延伸和连接反应之后，使用外切酶消化线性的分子反向探针。具体地，向上述反应体系中，加入2μL外切酶I(ExoI)和1μL外切酶III(ExoIII)，在37℃反应60min，然后70℃反应10min。

然后，将上述消化后的产物用磁珠进行纯化后，溶于1×TE缓冲液中，从而得到最终的单链环状测序文库。

从上述纯化得到的产物中，取5μL进行PCR验证，PCR体系如表2所示。

表2

其中，验证引物-F序列为：5'-GTGCACACAGCCCAGCTT-3'(SEQ ID NO：8)；验证引物-R序列为：5’-CGACCGCTGCGCCTTA-3’(SEQ ID NO：9)。

PCR程序如下：

94℃，3min→(94℃，15s→60℃，30s→68℃，30s)×30个循环→68℃，10min→12℃保温。

PCR产物的凝胶电泳检测结果如图7所示，得到一个与预期大小相符的200bp左右的条带，初步证明本实施例的分子反向探针捕获到了炎黄基因组DNA的目标区域(即上述耳聋基因检测位点)。

对得到的单链环状测序文库，在CG测序平台上进行测序，得到如下所示的序列，其中下划线部分表示捕获到的耳聋基因检测位点的序列，下划线加粗斜体的为与待检测位点的下划线加粗斜体的对应链上的碱基位点。

5’-pho_CCCAAAGGCAATGAATAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTGAAAGAGCAGTGGTGGCCACAAAACAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTTGCTGAT-3’(SEQ ID NO：10)。

上述结果表明，本实施例中的分子反向探针确实捕获到了炎黄基因组DNA中的耳聋基因检测位点的序列，证明本发明方法是成功的。

实施例2

本实施例以人外周血DNA(300ng)作为实验材料，探针区域为先天性耳聋基因12S-rRNA、GJB2、GJB3、SLC26A4上的7个区域。探针位点信息如表3所示。使用Complete Genomics平台作为测序平台，采用SE50测序类型。

表3

实验过程如下：

1、MIP杂交

酶反应体系如表4所示，其中MIP探针采用上述探针制备的第一种方法中的SEQ IDNO：1-3序列得到。

表4

组分	用量
		基因组DNA	5-300ng
MIP探针	1fmol
		Ampligase buffer	2μL
dNTP(10mM)	2μL
		Ampligase	1μL
Phusion	0.5μL
		水	补齐20μL

反应程序：95℃5分钟，65℃30分钟，4℃保温。

2、外切酶消化

酶反应体系如表5所示：

表5

反应程序：37℃1小时，80℃20分钟，4℃保温。

磁珠纯化：采用1.3X PEG32磁珠纯化，回溶20μL TE缓冲液。

3、PCR扩增

酶反应体系如表6所示，其中引物序列如下：

MIP Ad153_PCR2_1：PHO-GACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO：11)；MIP Ad153_PCR2_3：GTTCTGTGAGCCAAGGAGTTG(SEQ ID NO：12)。

表6

组分	用量
		Phusion MM	25μL
步骤2纯化后DNA	10μL
		MIP Ad153_PCR2_1	5μL
MIP Ad153_PCR2_3	5μL
		水	5μL

反应程序：95℃5分钟，(95℃30秒，65℃30秒，72℃30秒)30个循环72℃5分钟，4℃保温。

磁珠纯化：采用1.2X Ampure XP磁珠纯化，回溶30μL TE缓冲液。

4、环化

配制反应体系1如表7，其中介导桥序列如下：

MIP_Splint Oligo：CGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCC(SEQ ID NO：13)。

表7

组分	用量
		DNA	660ng
MIP_Splint Oligo(10pmol/μL)	10μL
		H2O	补足70μL

95℃3分钟预变性后放冰上待用。

配制反应体系2如表8：

表8

组分	用量
		反应体系1	70μL
ATP(0.1M)	1.2μL
		10×TA Buffer	1.2μL
T4DNA Ligase	1.2μL
		水	补足120μL

37℃环化1小时。

配制反应体系3如表9：

表9

组分	用量
		反应体系2	120μL
10×TA Buffer	0.8μL
		Exo I	3.9μL
Exo III	1.3μL

37℃反应1小时。纯化：1.3倍PEG32磁珠纯化，回溶20μL TE缓冲液。

5、质量控制

文库建好后用Agilent Bioanalyzer2100进行质检，合格后用于后续上机测序使用。其中一个检测结果如图8所示。

6、测序：参照Complete Genomics平台标准操作流程操作。

图9示出了本实施例得到的各基因区域测序深度分布图；图10示出了本实施例得到的目标区域在不同深度下的测序覆盖度，证明本发明方法是成功的。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (12)

1.一种基于分子反向探针的测序文库构建方法，包括如下步骤：

使用分子反向探针与变性核酸进行退火杂交，所述分子反向探针包括5’端的锚定序列和3’端的延伸序列以及所述锚定序列与延伸序列之间的测序接头序列，所述锚定序列和延伸序列分别与所述变性核酸中的目标区域两端的序列反向互补；

在聚合酶作用下，以所述目标区域为模板，从所述3’端的延伸序列开始进行聚合反应，生成所述目标区域的互补序列；

在连接酶作用下，将所述5’端的锚定序列与所述目标区域的互补序列连接形成环状核酸分子；

使用核酸外切酶消化未环化的线性分子，得到含有目标区域的单链环状分子。

2.根据权利要求1所述的基于分子反向探针的测序文库构建方法，其特征在于，所述测序接头序列为以单链环状文库为测序对象的测序平台的测序接头序列。

3.根据权利要求1所述的基于分子反向探针的测序文库构建方法，其特征在于，所述测序接头序列为CG测序平台的测序接头序列。

4.根据权利要求1至3任一项所述的基于分子反向探针的测序文库构建方法，其特征在于，所述测序接头序列包括标签序列、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列。

5.根据权利要求1所述的基于分子反向探针的测序文库构建方法，其特征在于，所述5’端的锚定序列和3’端的延伸序列的长度为15-25个碱基。

6.根据权利要求1所述的基于分子反向探针的测序文库构建方法，其特征在于，所述核酸外切酶为外切酶I和外切酶III。

7.一种基于分子反向探针的测序文库构建试剂，包括如下组成部分：

分子反向探针，用于与变性核酸进行退火杂交，所述分子反向探针包括5’端的锚定序列和3’端的延伸序列以及所述锚定序列与延伸序列之间的测序接头序列，所述锚定序列和延伸序列分别与所述变性核酸中的目标区域两端的序列反向互补；

聚合酶，用于以所述目标区域为模板，从所述3’端的延伸序列开始进行聚合反应，生成所述目标区域的互补序列；

连接酶，用于将所述5’端的锚定序列与所述目标区域的互补序列连接形成环状核酸分子；

核酸外切酶，用于消化未环化的线性分子，得到含有目标区域的单链环状分子。

8.根据权利要求7所述的基于分子反向探针的测序文库构建试剂，其特征在于，所述测序接头序列为以单链环状文库为测序对象的测序平台的测序接头序列。

9.根据权利要求8所述的基于分子反向探针的测序文库构建试剂，其特征在于，所述测序接头序列为CG测序平台的测序接头序列。

10.根据权利要求7至8任一项所述的基于分子反向探针的测序文库构建试剂，其特征在于，所述测序接头序列包括标签序列、滚环扩增引物结合序列和测序引物结合序列。

11.根据权利要求7所述的基于分子反向探针的测序文库构建试剂，其特征在于，所述5’端的锚定序列和3’端的延伸序列的长度为15-25个碱基。

12.根据权利要求7所述的基于分子反向探针的测序文库构建试剂，其特征在于，所述核酸外切酶为外切酶I和外切酶III。