CN110079592B - 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 - Google Patents

用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法。探针包括延伸探针和连接探针，所述延伸探针包括延伸臂，测序标签序列1区，保护结构1区，其中延伸臂与测序标签序列1区之间还可有UID序列1区；所述连接探针包括连接臂，测序标签序列2区和保护结构2区；其连接臂与测序标签序列2区之间还可有UID序列2区。采用本发明具有操作简便、实验周期短、成本低廉、灵敏度高、特异性高，可直接在DNA水平上检测已知和未知的基因融合类型的优点。

Description

用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序 靶向捕获目标区域的探针和方法
技术领域
本发明涉及涉及生物技术测序领域，尤其涉及一种适用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的方法。
背景技术
目标区域靶向测序是一种对感兴趣的目标区域进行捕获、富集后进行高通量测序的研究策略。随着越来越多基因组测序项目的完成，定制化目标区域测序逐渐成为研究者针对具体研究区域的首选方法。目标区域靶向测序相对于全基因组测序其主要优势在于可针对特定区域进行测序，极大地提高了特定目标区域的研究效率，显著降低了研究成本，且结果更准确，更容易发现低频变异。该技术可用于识别和研究复杂疾病，在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力。目前常见的靶向捕获目标区域的方法主要有以下两种：多重PCR、杂交捕获。
多重PCR具有灵敏度高、特异性好、重复性好、操作简便、价格低廉等优点。但大量引物在同一反应管，容易产生大量的引物二聚体、引物交叉扩增、部分扩增子无法扩增等问题。多重PCR法无法检测未知的基因融合类型，且该方法只适用于捕获相对较小的目标区域。
杂交捕获能够对全外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，可扩展性好，能检测低频突变和未知的基因融合类型。但缺点是操作流程极其复杂、周期较长、成本较高、需要依赖较多特殊的仪器设备，这些缺点在一定程度上限制了其在实际临床诊断上的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、实验周期短、成本低廉、灵敏度高、特异性高，并可以直接在DNA水平上检测已知和未知的基因融合类型的适用于高通量测序的靶向捕获目标区域的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,包括延伸探针和连接探针，其中延伸探针由以下结构组成：
延伸臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt的序列；
测序标签序列1区：用于测序平台测序的Tag1序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
保护结构1区：为3～17个硫代修饰序列或1个间臂；其中3～17个硫代修饰序列是将测序标签序列1区的5’端的3～17个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-17个碱基进行硫代修饰；用于保护探针，阻止外切酶酶切；优选的，为3～7个硫代修饰序列或1个间臂；
所述延伸探针的延伸臂与测序标签序列1区之间还有UID序列1区；优选的，所述UID序列1区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列；
所述连接探针由以下结构组成：
连接臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt序列，在合成探针时，连接臂5’端进行磷酸化修饰，也可以自行通过磷酸化反应对5’端进行磷酸化修饰；
测序标签序列2区：用于测序平台测序的Tag2序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
保护结构2区：为3～19个硫代修饰序列或1个间臂，用于保护探针，阻止外切酶酶切；其中3～19个硫代修饰序列是将测序标签序列2区的3’端的3～19个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-19个碱基进行硫代修饰；优选的，为3～7个硫代修饰序列或1个间臂；
另一方面，本发明提供另一种用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,包括延伸探针和连接探针，其中延伸探针由以下结构组成：
延伸臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt的序列；
测序标签序列1区：用于测序平台测序的Tag1序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
保护结构1区：为3～17个硫代修饰序列或1个间臂；其中3～17个硫代修饰序列是将测序标签序列1区的5’端的3～17个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-17个碱基进行硫代修饰；用于保护探针，阻止外切酶酶切；优选的，为3～7个硫代修饰序列或1个间臂；
所述连接探针由以下结构组成：
连接臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt序列，在合成探针时，连接臂5’端进行磷酸化修饰，也可以自行通过磷酸化反应对5’端进行磷酸化修饰；
测序标签序列2区：用于测序平台测序的Tag2序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
所述连接探针的连接臂与测序标签序列2区之间还有UID序列2区；优选的，所述UID序列2区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列；
保护结构2区：为3～19个硫代修饰序列或1个间臂，用于保护探针，阻止外切酶酶切；其中3～19个硫代修饰序列是将测序标签序列2区的3’端的3～19个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-19个碱基进行硫代修饰；优选的，为3～7个硫代修饰序列或1个间臂。
另一方面，本发明提供另一种用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,包括延伸探针和连接探针，其中延伸探针由以下结构组成：
延伸臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt的序列；
测序标签序列1区：用于测序平台测序的Tag1序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
所述延伸探针的延伸臂与测序标签序列1区之间还有UID序列1区；优选的，所述UID序列1区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列；
保护结构1区：为3～17个硫代修饰序列或1个间臂；其中3～17个硫代修饰序列是将测序标签序列1区的5’端的3～17个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-17个碱基进行硫代修饰；用于保护探针，阻止外切酶酶切；优选的，为3～7个硫代修饰序列或1个间臂；
所述连接探针由以下结构组成：
连接臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt序列，在合成探针时，连接臂5’端进行磷酸化修饰，也可以自行通过磷酸化反应对5’端进行磷酸化修饰；
测序标签序列2区：用于测序平台测序的Tag2序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
所述连接探针的连接臂与测序标签序列2区之间还有UID序列2区；优选的，所述UID序列2区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列；
保护结构2区：为3～19个硫代修饰序列或1个间臂，用于保护探针，阻止外切酶酶切；其中3～19个硫代修饰序列是将测序标签序列2区的3’端的3～19个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-19个碱基进行硫代修饰；优选的，为3～7个硫代修饰序列或1个间臂。
进一步，所述测序标签序列1是在SEQ ID NO:1的5’端减少0～18个碱基的序列。
进一步，所述测序标签序列2是在SEQ ID NO:2的反向互补序列的3’端减少0～16个碱基的序列，其中SEQ ID NO:2为Illumina Nextera Library Prep Kits中NexteraTransposase Adapters Read 2的一段序列。
本发明还提供任一所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针用于检测已知和未知的基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的用途。
本发明还提供一种适用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的方法，其特征在于，使用了所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针；
优选的，步骤为，
探针与核酸样本杂交；
延伸、连接酶连接反应：当延伸探针和连接探针都锚定到核酸样本的靶区域后，利用DNA聚合酶的聚合功能，从延伸探针的3’端延伸到连接探针的5’端，连接酶连接，得到连接产物；
或者，当延伸探针3’端硫代修饰，且连接臂Tm值高于延伸臂Tm时,探针与核酸样本杂交、延伸、连接反应同时进行；
外切酶消化线性探针和核酸：为了消除核酸样本和剩余探针对后续PCR扩增的影响，利用单链核酸外切酶、双链核酸外切酶将探针和核酸样本消化，只保留上一步的连接产物。
PCR扩增；其中上游引物结构依次为从5’端开始为测序时用于簇生成的序列区，index序列区；与测序标签序列1反向互补配对的全长序列区；优选的，上游引物的5’端，或3’端，或5’端和3’端均硫代；其中下游引物结构依次从5’端开始为测序时用于簇生成的序列区，index序列区；测序标签序列2全长序列区；优选的，下游引物的5’端，或3’端，或5’端和3’端均硫代；
文库纯化：采用磁珠或电泳后切胶回收或柱纯化方式进行文库纯化；
高通量测序。
进一步，所述探针与核酸样本杂交中，所述核酸样本是DNA，RNA，由RNA反转录得到的cDNA，或DNA和RNA的混合物，或DNA和cDNA的混合物。
进一步，所述PCR扩增的上游引物为SEQ ID NO:3，或其5’端硫代或其3’端硫代或其5’端和3’端均硫代后的序列所示。
进一步，所述PCR扩增的下游引物为SEQ ID NO:4，或其5’端硫代或其3’端硫代或其5’端和3’端均硫代后的序列所示。
SEQ ID NO:1为5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
SEQ ID NO:2为5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3’。
本发明的方法包括以下部分：
1.探针与核酸样本杂交
探针与核酸样本杂交是指探针与单链的核酸样本的靶区域具有互补配对的序列，在合适的杂交体系和温度下进行杂交。核酸样本可以是DNA、RNA或者由RNA反转录得到的cDNA，也可以是DNA和cDNA或DNA和RNA的混合物。图1中描绘了探针结构。探针的来源可以是多种合成方式，也可以合成后通过分子生物学手段进行改造。探针包括两种类型：连接探针和延伸探针。
2、延伸、连接酶连接反应：
当延伸探针和连接探针都锚定到靶区域后，利用DNA聚合酶的聚合功能，从延伸探针3’端延伸到连接探针的5’端。优选保真性高的DNA聚合酶。然后利用连接酶将切口连接。当然，杂交、延伸、连接反应也可以同时进行。
3.外切酶消化线性探针和核酸：
为了消除核酸样本和剩余探针对后续PCR扩增的影响，利用单链核酸外切酶、双链核酸外切酶将探针和核酸样本消化，只保留上一步的连接产物。
4.PCR扩增：
用含有与探针结构中测序标签序列相同或互补结构的上下游引物(5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG3’，SEQ ID NO:3和
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATAGAGGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’，SEQ ID NO:4)进行文库扩增。下划线为index序列，用于混合文库测序时区分不同文库的标签，该序列可更改。注意，也可以对PCR引物的5’端和3’端进行硫代修饰，将外切酶和PCR试剂混合。
5.文库纯化：
为了去除文库中的酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、离子、引物、引物二聚体等杂质，采用Beckman公司的AgencourtAMPure XP磁珠对文库进行纯化，也可采用电泳后切胶回收或者柱纯化等其他方式进行纯化。
6.高通量测序
制备好的文库经浓度、片段质控合格后在高通量测序仪上测序。本发明的文库测序方法包括但不限于可逆末端终止测序法，也可以是其它测序平台。测序类型可以为单端测序或双端测序。在本发明的实施方案中，所述的测序平台为Illumina，测序类型为双端测序。
与目前常规的靶向捕获的方法相比，本发明的有益效果主要有：
1、本发明具有操作简便、实验周期短、成本低廉、灵敏度高、特异性高等特点；
2、可以直接在DNA水平上检测已知和未知的基因融合类型。
附图说明
图1是本发明的探针结构及探针与模板杂交示意图。
图2是本发明的探针结构及探针与模板杂交示意图。
图3是本发明的探针结构及探针与模板杂交示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中探针和引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。H1650细胞系可购自上海泽叶生物科技有限公司等公司。H2228、H3122细胞系可购自上海泽叶生物科技有限公司、上海继和生物科技有限公司等公司。
以下实施例中，N代表A或T或G或C任意碱基。
实施例1：靶向捕获人类EGFR基因
在该实施例中，使用靶向人类EGFR基因的第18、19号外显子的2对探针，探针等摩尔数混合，探针结构如图2和图3所示。
探针序列如下：
P1-a(延伸探针),如SEQ ID NO:5所示：
5’A-s-C-s-G-s-CTCTTCCGATCT
Figure BDA0001559730030000061
P1-b(连接探针),如SEQ ID NO:6所示：
5’
Figure BDA0001559730030000062
NNNNNNNNNNNN
Figure BDA0001559730030000063
P2-a(延伸探针),如SEQ ID NO:7所示：
5’A-s-C-s-G-s-CTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNN
Figure BDA0001559730030000064
P2-b(连接探针),如SEQ ID NO:8所示：
5’
Figure BDA0001559730030000065
s表示硫代修饰，P表示磷酸化修饰；P1-a中下划线部分为Illumina测序标签序列1，下划点线为延伸臂；P1-b中的12个N表示UID序列2区，双下划线部分为连接臂；P2-a中的12个N表示UID序列1区，下划点线为延伸臂；双下划线部分为连接臂；波浪下划线为Illumina测序标签序列2；P1-a中的3个硫代修饰为保护结构1区，P1-b中的3个硫代修饰为保护结构2区。
步骤：1、探针与核酸样本杂交：杂交反应体系如表1。
表1实施例1的杂交反应体系表
试剂 体积
纯化水 6μL
50ng/μL H1650细胞系DNA 2μL
3×10<sup>-3</sup>μM探针混合物(即SEQ ID NO:5-8的混合物) 1μL
10×Ampligase Buffer(Epicentre) 1μL
程序为95℃变性5min，55℃孵育2h。
2、延伸、连接酶连接反应：然后在上述杂交产物中再加入以下试剂，见表2，进行延伸、连接反应，反应程序为55℃孵育1h。
表2实施例1的延伸、连接酶连接反应再加入试剂表
Figure BDA0001559730030000071
3、外切酶消化线性探针和核酸：利用核酸外切酶将剩余的探针和模板DNA消化。在上述产物中再加入以下试剂，见表3，37℃孵育40min，95℃孵育5min。
表3实施例1的外切酶消化线性探针和核酸反应再加入试剂表
试剂 体积
Exonuclease I(NEB) 0.5μL
Exonuclease III(NEB) 0.5μL
Lambda Exonuclease(NEB) 0.5ul
4、PCR扩增：在上述产物中再加入以下试剂进行PCR扩增，见表4，
表4实施例1的PCR扩增反应再加入试剂表
Figure BDA0001559730030000072
Figure BDA0001559730030000081
标签1引物序列，如SEQ ID NO:9所示：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA-s-G3’
标签2引物序列，如SEQ ID NO:10所示：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATAGAGGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T3’,下划线部分为index序列，可更改。
98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；72℃延伸2min，4℃保温。
5、文库纯化：扩增结束后使用Agencourt AMPure XP磁珠对文库进行纯化。
6、测序：然后对文库进行质控，Illumina测序仪上机测序。测序结果见表5。
表5实施例1的测序结果表
实验组 序列条数 比对率 覆盖度
1 852,746 92.04％ 100％
由表5可以看出，覆盖度100％，说明目标区域均被捕获富集，比对率大于90％表明本发明特异性较高。
实施例2：使用优化流程靶向捕获人类BRCA、EGFR基因
在该实施例中，使用靶向人类BRCA、EGFR基因的5对探针，探针等摩尔数混合，优化流程为将酶切试剂、PCR试剂同时加入反应管。探针结构如图1所示。
1、探针与核酸样本杂交：
探针序列如下：
P3-a(延伸探针),如SEQ ID NO:11所示：
5’A-s-C-s-A-s-C-s-T-s-C-s-T-s-T-s-T-s-C-s-C-s-C-s-T-s-A-s-C-s-A-s-C- s-GACGCTCTTCCGATCTNNN
Figure BDA0001559730030000082
P3-b(连接探针),如SEQ ID NO:12所示：
5’
Figure BDA0001559730030000083
NNN
Figure BDA0001559730030000084
Figure BDA0001559730030000085
-C3’
P4-a(延伸探针),如SEQ ID NO:13所示：
5’C-s-C-s-C-s-T-s-A-s-C-s-ACGACGCTCTTCCGATCTNNNN
Figure BDA0001559730030000086
3’
P4-b(连接探针),如SEQ ID NO:14所示：
5’
Figure BDA0001559730030000091
NNNN
Figure BDA0001559730030000092
NH2C63’
P5-a(延伸探针),如SEQ ID NO:15所示：
5’A-s-T-s-C-s-C-s-C-s-C-s-T-s-A-s-C-s-ACGACGCTCTTCCGATCTNNNN
Figure BDA0001559730030000093
’
P5-b(连接探针),如SEQ ID NO:16所示：
5’
Figure BDA0001559730030000094
NNNN
Figure BDA0001559730030000095
P3’
P6-a(延伸探针),如SEQ ID NO:17所示：
5’SpC3CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNN
Figure BDA0001559730030000096
3’
P6-b(连接探针),如SEQ ID NO:18所示：
5’
Figure BDA0001559730030000097
NNNN
Figure BDA0001559730030000098
SpC33’
s表示硫代修饰,P表示磷酸化修饰，SpC3表示间臂的一种类型，NH2C6表示氨基修饰，N表示可以为A、T、C、G任意一种碱基，下划线部分为Illumina测序标签序列1，P3-a中的NNN表示UID序列1区，P3-b中的NNN表示UID序列2区。P4-a中的NNNN表示UID序列1区，P4-b中的NNNN表示UID序列2区。P5-a中的NNNN表示UID序列1区，P5-b中的NNNN表示UID序列2区。P6-a中的NNNN表示UID序列1区，P6-b中的NNNN表示UID序列2区。下划点线为延伸臂，双下划线部分为连接臂，波浪下划线为Illumina测序标签序列2。P3-a的17个硫代修饰为保护结构1区，P3-b的19个硫代修饰为保护结构2区。P4-a的6个硫代修饰为保护结构1区，P4-b的NH2C6为保护结构2区。P5-a的9个硫代修饰为保护结构1区，P5-b的磷酸化为保护结构2区。P6-a的SpC3为保护结构1区，P6-b的SpC3为保护结构2区。
杂交反应体系如表6。
表6实施例2的杂交反应体系表
试剂 体积
纯化水 6μL
50ng/μL H1650细胞系DNA 2μL
3×10<sup>-3</sup>μM探针混合物(即SEQ ID NO:11-18的混合物) 1μL
10×Ampligase Buffer(Epicentre) 1μL
程序为95℃变性5min，55℃孵育2h。
2、延伸、连接酶连接反应：然后在上述杂交产物中再加入以下试剂进行延伸、连接反应，反应程序为55℃孵育1h。
表7实施例2的外切酶消化线性探针和核酸反应再加入试剂表
Figure BDA0001559730030000101
3、外切酶消化线性探针和核酸、PCR扩增：在上述产物中再加入以下试剂将剩余的探针和模板DNA消化，再进行PCR扩增：
表8实施例2的外切酶消化线性探针和核酸、PCR扩增的再加入试剂表
试剂 体积
Exonuclease I(NEB) 0.5μL
Exonuclease III(NEB) 0.5μL
Lambda Exonuclease(NEB) 0.5ul
2×iProof HF Master Mix(Bio-Rad) 50μL
纯化水 29.5μL
20μM标签3引物 2μL
20μM标签4引物 2μL
反应程序为37℃孵育40min，95℃孵育5min，98℃预变性30s。98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，27cycles。72℃延伸2min，4℃保温。
标签3引物序列,如SEQ ID NO:19所示：
5’C-s-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTFGCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA-s-G3’
标签4引物序列,如SEQ ID NO:20所示：
5’A-s-ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T3’,下划线部分为index序列，可更改。
98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；72℃延伸2min，4℃保温。
4、扩增结束后使用Agencourt AMPure XP磁珠对文库进行纯化。
5、然后对文库进行质控，Illumina测序仪上机测序。结果见表9。
表9实施例2的实验结果表
实验组 序列条数 比对率 覆盖度
1 846,728 91.16％ 100％
从表9的结果可以看出，覆盖度100％，说明目标区域均被捕获富集，比对率大于90％表明本发明特异性较高。
实施例3：靶向捕获人类EML4exon 6ins 33；ALK exon 20融合基因
在该实施例中，使用靶向人类EML4exon 6ins 33；ALK exon 20融合基因类型的1对探针，探针结构如图1所示。
1、探针与核酸样本杂交：探针序列如下：
P7-a(延伸探针),如SEQ ID NO:21所示：
5’G-s-A-s-T-s-C-s-A-s-G-s-T-s-ACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN
Figure BDA0001559730030000111
3’P7-b(连接探针),如SEQ ID NO:22所示：
5’
Figure BDA0001559730030000112
NNNNN
Figure BDA0001559730030000113
-s-T-s-G-s-G-s-A-s-T-s-T-s-G3’
其中s表示硫代修饰；下划线部分为Illumina测序标签序列1；P7-a中的NNNNN表示UID序列1区，下划点线的为延伸臂；P7-b中的NNNNN表示UID序列2区；双下划线部分为连接臂；波浪下划线为Illumina测序标签序列2。P7-a中的7个硫代修饰为保护结构1区，P7-b中的7个硫代修饰为保护结构2区。
杂交反应体系如表10：
表10实施例3的杂交反应体系表
试剂 体积
纯化水 6μL
50ng/μL H2228细胞系DNA 2μL
3×10<sup>-3</sup>μM探针(即SEQ ID NO:21-22的混合物) 1μL
10×Ampligase Buffer(Epicentre) 1μL
程序为95℃变性5min，60℃孵育2h。
2、延伸、连接酶连接反应：然后在上述杂交产物中再加入以下试剂进行延伸、连接反应，反应程序为60℃孵育1h。
表11实施例3的延伸、连接酶连接反应再加入试剂表
Figure BDA0001559730030000121
3、外切酶消化线性探针和核酸：利用核酸外切酶将剩余的探针和模板DNA消化。在上述产物中再加入以下试剂：
表12实施例3的外切酶消化线性探针和核酸反应再加入试剂表
试剂 体积
Exonuclease I(NEB) 0.5μL
Exonuclease III(NEB) 0.5μL
Lambda Exonuclease(NEB) 0.5ul
37℃孵育40min，95℃孵育5min。
4、PCR扩增：在上述产物中再加入以下试剂进行PCR扩增。
表13实施例3的PCR扩增反应再加入试剂表
试剂 体积
2×iProof HF Master Mix(Bio-Rad) 50μL
纯化水 29.5μL
20μM标签5引物 2μL
20μM标签6引物 2μL
标签5引物序列,如SEQ ID NO:9所示：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA-s-G 3’
标签6引物序列,如SEQ ID NO:10所示：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTCTGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T 3’下划线部分为index序列，可更改。
98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；72℃延伸2min，4℃保温。
5、文库纯化：扩增结束后使用Agencourt AMPure XP磁珠对文库进行纯化。
6、然后对文库进行质控，Illumina测序仪上机测序。实验结果如表13。
表13实施例3的实验结果表
实验组 序列条数 比对率 覆盖度
组1 617,342 97.36％ 100％
由表13可以看出，覆盖度100％，说明目标区域均被捕获富集，比对率大于97％表明本发明特异性较高。
实施例4：靶向捕获人类EML4 exon 13；ALK exon 20融合基因
在该实施例中，模板为RNA，使用靶向人类EML4exon 13；ALK exon 20融合基因类型的1对探针，探针结构如图1所示。
1、探针与核酸样本杂交：探针序列如下：
P8-a(延伸探针),如SEQ ID NO:23所示：
5’G-s-T-s-A-s-ACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN
Figure BDA0001559730030000131
3’
P8-b(连接探针),如SEQ ID NO:24所示：
5’
Figure BDA0001559730030000132
NNNNN
Figure BDA0001559730030000133
-s-C-s-G-s-T3’
其中s表示硫代修饰；下划线部分为Illumina测序标签序列1；P8-a中的NNNNN表示UID序列1区，下滑点线的为延伸臂；P8-b中的NNNNN表示UID序列2区；双下划线部分为连接臂；波浪下划线为Illumina测序标签序列2。P8-a中的3个硫代修饰为保护结构1区，P8-b中的3个硫代修饰为保护结构2区。
反转录引物P9：GACCGACTACAACCCCAACT SEQ ID NO:25。
反转录反应体系如表14：
表14实施例4的反转录反应体系表
50ng H3122 RNA 1
5×M-MLV Buffer 2
反转录引物P9(10uM) 1
dNTP Mixture(10mM) 0.5
RTase M-MLV(RNase H-)(200U/μl) 0.5
RNase Free H<sub>2</sub>O 5
程序为42℃孵育1h。
反转录产物1.8X磁珠纯化，10ul纯化水洗脱。
杂交反应体系如表15：
表15实施例4的杂交反应体系表
试剂 体积
反转录纯化产物 8μL
3×10<sup>-3</sup>μM探针(即SEQ ID NO:23-24的混合物) 1μL
10×Ampligase Buffer(Epicentre) 1μL
程序为95℃变性5min，60℃孵育2h。
7、延伸、连接酶连接反应：然后在上述杂交产物中再加入以下试剂进行延伸、连接反应，反应程序为60℃孵育1h。
表16实施例4的延伸、连接酶连接反应再加入试剂表
Figure BDA0001559730030000141
8、外切酶消化线性探针和核酸：利用核酸外切酶将剩余的探针和模板DNA消化。在上述产物中再加入以下试剂：
表17实施例4的外切酶消化线性探针和核酸反应再加入试剂表
试剂 体积
Exonuclease I(NEB) 0.5μL
Exonuclease III(NEB) 0.5μL
Lambda Exonuclease(NEB) 0.5ul
37℃孵育40min，95℃孵育5min。
9、PCR扩增：在上述产物中再加入以下试剂进行PCR扩增。
表18实施例4的PCR扩增反应再加入试剂表
Figure BDA0001559730030000142
Figure BDA0001559730030000151
标签5引物序列,如SEQ ID NO:9所示：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA-s-G 3’标签6引物序列,如SEQ ID NO:10所示：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGGCTCTGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T 3’下划线部分为index序列，可更改。
98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，32cycles；72℃延伸2min，4℃保温。
10、文库纯化：扩增结束后使用Agencourt AMPure XP磁珠对文库进行纯化。
11、然后对文库进行质控，Illumina测序仪上机测序。实验结果如表19。
表19实施例4的实验结果表
实验组 序列条数 比对率 覆盖度
组1 652,783 96.54％ 100％
由表19可以看出，覆盖度100％，说明目标区域均被捕获富集，比对率大于96％表明本发明特异性较高。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门艾德生物医药科技股份有限公司
<120> 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区
域的探针和方法
<130> ADSW-17003-CNI
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
caagcagaag acggcatacg agatttctgc ctgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tagaggcaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(3)
<400> 5
acgctcttcc gatctaccct tgtctctgtg t 31
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 磷酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5'端的A磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (44)..(46)
<400> 6
agcccagagt ccttgcnnnn nnnnnnnnct gtctcttata cacatc 46
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
acgctcttcc gatctnnnnn nnnnnnncag catgtggcac cat 43
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 磷酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5‘端的A磷酸化
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (31)..(34)
<400> 8
accttttctc atgtctctgt ctcttataca catc 34
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (66)..(66)
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatctagta cggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (70)..(70)
<400> 10
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tagaggcaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 11
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(17)
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnattt ttttaaagct aaagtattga 60
ctctttaaat gttaaacaaa aatact 86
<210> 12
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 磷酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5’端的G磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(53)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (69)..(87)
<400> 12
gataccacag ataagctact ttttgaaaaa ctgacactaa atataactct nnnctgtctc 60
ttatacacat ctccgagccc acgagac 87
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(6)
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
ccctacacga cgctcttccg atctnnnntg agggctgagg tgacccttg 49
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 磷酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5‘端的A磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 氨基修饰
<222> (55)..(55)
<223> NH2C6氨基修饰
<400> 14
agatcaaagt gctgggctcc ggnnnnctgt ctcttataca catctccgag cccac 55
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(9)
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 15
atcccctaca cgacgctctt ccgatctnnn ngaccatgag aggccctgcg g 51
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5’端的T磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 硫酸化
<222> (56)..(56)
<223> 3’端的T磷酸化
<400> 16
tcaagagagc ttggttggga gctnnnnctg tctcttatac acatctccga gcccac 56
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 间臂
<222> (1)..(1)
<223> SpC3间臂
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 17
ccctacacga cgctcttccg atctnnnntc actgggcagc atgtggca 48
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 磷酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5‘端的A磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 间臂
<222> (58)..(58)
<223> SpC3间臂
<400> 18
agagaagcaa catctccgaa agccannnnc tgtctcttat acacatctcc gagcccac 58
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (66)..(66)
<400> 19
caagcagaag acggcatacg agatttctgc ctgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(1)
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (70)..(70)
<400> 20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atagcctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 21
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(7)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 21
gatcagtacg acgctcttcc gatctnnnnn gaagagcagt gaatggggaa taa 53
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5’端的T磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (52)..(58)
<400> 22
ttattcccca ttcactgctc ttcnnnnnct gtctcttata cacatctccg atggattg 58
<210> 23
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (1)..(3)
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 23
gtaacgacgc tcttccgatc tnnnnngcta ctgtagagcc cacacctg 48
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 磷酸化
<222> (1)..(1)
<223> 5‘端的A磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 硫代修饰
<222> (48)..(50)
<400> 24
atgcagatgg agctgcagan nnnnctgtct cttatacaca tctccgacgt 50
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
gaccgactac aaccccaact 20

Claims (19)

1.一种用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,包括延伸探针和连接探针，其中延伸探针由以下结构组成：
延伸臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt的序列；
测序标签序列1区：用于测序平台测序的Tag1序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
保护结构1区：为3～17个硫代修饰序列或1个间臂；其中3～17个硫代修饰序列是将测序标签序列1区的5’端的3～17个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-17个碱基进行硫代修饰；用于保护探针，阻止外切酶酶切；
所述延伸探针的延伸臂与测序标签序列1区之间还有UID序列1区；
所述连接探针由以下结构组成：
连接臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt序列，在合成探针时，连接臂5’端进行磷酸化修饰，或自行通过磷酸化反应对5’端进行磷酸化修饰；
测序标签序列2区：用于测序平台测序的Tag2序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
保护结构2区：为3～19个硫代修饰序列或1个间臂，用于保护探针，阻止外切酶酶切；其中3～19个硫代修饰序列是将测序标签序列2区的3’端的3～19个碱基进行硫代修饰或任意的一段3-19个碱基进行硫代修饰。
2.如权利要求1所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,所述保护结构1区：为3～7个硫代修饰序列或1个间臂。
3.如权利要求1所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,所述UID序列1区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列。
4.如权利要求1所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,所述保护结构2区：为3～7个硫代修饰序列或1个间臂。
5.一种用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,包括延伸探针和连接探针，其中延伸探针由以下结构组成：
延伸臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt的序列；
测序标签序列1区：用于测序平台测序的Tag1序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
保护结构1区：测序标签序列1区的5’端进行3～17个硫代修饰或引入1个间臂，从而对5’端进行保护，阻止外切酶酶切；
所述连接探针由以下结构组成：
连接臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt序列，在合成探针时，连接臂5’端进行磷酸化修饰，或自行通过磷酸化反应对5’端进行磷酸化修饰；
测序标签序列2区：用于测序平台测序的Tag2序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
所述连接探针的连接臂与测序标签序列2区之间还有UID序列2区；
保护结构2区：测序标签序列2区的序列的3’端进行3-19个硫代修饰，或引入1个间臂或磷酸化、氨基的修饰对3’端进行保护，阻止外切酶和高保真DNA聚合酶酶切。
6.如权利要求5所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于，所述UID序列2区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列。
7.一种用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,包括延伸探针和连接探针，其中延伸探针由以下结构组成：
延伸臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt的序列；
测序标签序列1区：用于测序平台测序的Tag1序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
所述延伸探针的延伸臂与测序标签序列1区之间还有UID序列1区；
保护结构1区：测序标签序列1区的5’端进行3～17个硫代修饰或引入1个间臂，从而对5’端进行保护，阻止外切酶酶切；
所述连接探针由以下结构组成：
连接臂：与核酸模板互补结合的长度为16～50nt序列，在合成探针时，连接臂5’端进行磷酸化修饰，或自行通过磷酸化反应对5’端进行磷酸化修饰；
测序标签序列2区：用于测序平台测序的Tag2序列；是测序平台任意建库试剂盒中转座子Adapters、接头上的序列或其互补序列；
所述连接探针的连接臂与测序标签序列2区之间还有UID序列2区；
保护结构2区：测序标签序列2区的3’端进行3-19个硫代修饰，或引入1个间臂或磷酸化、氨基的修饰对3’端进行保护，阻止外切酶和高保真DNA聚合酶酶切。
8.如权利要求7所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,所述UID序列1区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列。
9.如权利要求7所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于,所述UID序列2区由3～12个随机碱基组成，用于区分原始模板的标签序列。
10.权利要求1-9任一所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于，所述测序标签序列1是在SEQ ID NO:1的5’端减少0～18个碱基的序列。
11.权利要求1-9任一所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针，其特征在于，所述测序标签序列2是在SEQ ID NO:2的反向互补序列的3’端减少0～16个碱基的序列，其中SEQ ID NO:2为Illumina Nextera Library Prep Kits中NexteraTransposase Adapters Read 2的一段序列。
12.权利要求1-11任一项所述用于非疾病诊断用途的检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针用于检测已知和未知的基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的用途。
13.一种适用于非疾病诊断用途的检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的方法，其特征在于，使用了权利要求1-11任一项所述用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的探针。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤为，
探针与核酸样本杂交；
延伸、连接酶连接反应：当延伸探针和连接探针都锚定到核酸样本的靶区域后，利用DNA聚合酶的聚合功能，从延伸探针的3’端延伸到连接探针的5’端，连接酶连接，得到连接产物；
或者，探针与核酸样本杂交、延伸、连接反应同时进行；
外切酶消化线性探针和核酸：为了消除核酸样本和剩余探针对后续PCR扩增的影响，利用单链核酸外切酶、双链核酸外切酶将探针和核酸样本消化，只保留上一步的连接产物；
PCR扩增；其中上游引物结构依次为从5’端开始为测序时用于簇生成的序列区，index序列区；与测序标签序列1反向互补配对的全长序列区；其中下游引物结构依次从5’端开始为测序时用于簇生成的序列区，index序列区；测序标签序列2全长序列区；
文库纯化：采用磁珠或电泳后切胶回收或柱纯化方式进行文库纯化；
高通量测序。
15.权利要求14所述的方法，其特征在于，所述探针与核酸样本杂交中，所述核酸样本是DNA，RNA，由RNA反转录得到的cDNA，或DNA和RNA的混合物，或DNA和cDNA的混合物。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中，上游引物的5’端，或3’端，或5’端和3’端均硫代。因突变和已知、未知的基因融合类型的探针。
17.权利要求14所述适用于检测基因突变和已知、未知的基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的方法，其特征在于，所述PCR扩增的上游引物为SEQ ID NO:3，或其5’端硫代或其3’端硫代或其5’端和3’端均硫代后的序列所示。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中，下游引物的5’端，或3’端，或5’端和3’端均硫代。
19.权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的下游引物为SEQ ID NO:4，或其5’端硫代或其3’端硫代或其5’端和3’端均硫代后的序列所示。
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