KR102451174B1 - 핵산의 다중 검출 - Google Patents

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Abstract

복수의 독특한 표적 서열을 함유하는 목적하는 핵산 종(예: 염색체)이 회전 원 증폭에 의해 증폭되고 검출되는 복수의 특이적 프로브를 사용하여 검출되는 신규한 접근법이 본원에 기재된다. 복수의 프로브는 검출가능한 신호를 제공하기 위해 사용되고, 여기서, 신호의 크기는 이들의 표적 서열을 인식하는 프로브의 수에 비례한다. 복수의 프로브로부터 개별 신호는 단일 누적 검출가능한 신호로 전환되어 다중 프로빙을 통해 개별 신호를 증폭시킨다. 10개 이상의 프로브는 10배 이상의 신호 증폭을 생성한다. 생성된 신호는 신호가 수득되는 특정 생성물을 생성하기 위해 서열 특이적 혼성화 및 효소 촉매작용을 사용하여 표적 인식시 올바르게 반응된 프로브에 의존한다.

Description

핵산의 다중 검출{MULTIPLEX DETECTION OF NUCLEIC ACIDS}
상호참조
본원은 2013년 12월 2일에 출원된 영국 출원 번호 1321196. 6의 이점을 특허청구하고, 이 출원은 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 특정 서열에 결합하는 프로브를 사용하여 다중 핵산 서열을 병렬로 검출하는 다중 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 태아 이수성의 비침습성 산전 진단에 이러한 방법의 사용을 포함하여, 핵산 종의 정량화, 예를 들면, 샘플 중 두 개의 상이한 염색체의 상대량을 측정함에 관한 것이다.
다수의 질환은 종에 대한 염색체 또는 염색체 세그먼트의 정상 수와 비교하여 개체의 세포 내의 염색체 수의 불균형(이수성) 또는 염색체 세그먼트의 수의 불균형(부분적 이수성)에 의해 유도되거나 이를 특징으로 한다. 인간 이배체 게놈은 23 쌍의 염색체; 쌍 염색체 1 내지 22 및 성 염색체 XX 또는 XY를 갖는다. 용어 염색체성 및 3염색체성은 누락 또는 여분의 염색체를 의미하는 반면, 부분 염색체성 및 부분 3염색체성은 염색체의 부분의 손실 또는 획득 각각에 의해 유도되는 유전 물질의 불균형을 의미한다. 개체의 게놈에서 이수성 및 부분적 이수성은 다운 증후군(인간 염색체 21의 3염색체성) 및 터너 증후군(성 염색체의 염색체성 또는 부분 염색체성)과 같은 선천적 장애와 관련된다. 이수성 및 부분적 이수성은 또한 성인 조직에서 체세포 변이를 통해 생성될 수 있다. 예를 들면, 다수의 암세포는 염색체 단편의 전좌 및 종양 세포의 이수성을 유도하는 염색체 취약성을 나타낸다.
방법은 염색체 결함과 관련된 질환을 진단하기 위한 방법이 개발되고 있다. 전통적인 핵형 분석 방법에는 조직 샘플을 수득하고, 염색체를 염색하고 이들을 광학 현미경 하에 검사함이 포함된다. 문헌[참조:
Figure 112021109732324-pat00001
et al. (Science 273(5274):494-497 1996)]은 상이한 색상의 모든 인 간 염색체를 동시에 가시화하기 위해 형광 동일 반응계 혼성화(FISH)를 사용하여 다색 스펙트럼 핵형 분석을 기재했다. 형광 표지된 프로브는 염색체 특이적 DNA를 상이한 형광단으로 표지함으로써 각 염색체를 위해 제조했다. 스펙트럼적으로 상이한 형광단의 제한된 수가 존재하기 때문에, 조합 표지화 방법을 필요한 수의 상이한 발광 스펙트럼을 생성하기 위해 사용했다. 조합 표지화로 생성된 스펙트럼 차이를 포획하고, 형광 현미경에 부착된 간섭계를 사용하여 분석했다. 이어서, 이미지 처리 소프트웨어는 색상을 각각의 스펙트럼적으로 상이한 조합에 지정하여 개별적으로 착색된 염색체의 가시화를 가능하게 했다.
비교 게놈 혼성화(CGH)는 비교될 두 공급원, 가장 통상적으로 시험 및 참조 공급원으로부터 DNA의 단리, 상이한 색상(일반적으로 적색 및 녹색)의 형광단에 의한 각 DNA 샘플의 독립적 표지화, 그것이 단일 가닥이도록 DNA의 변성, 및 표지된 DNA 샘플이 이들의 기원의 유전자 좌에 결합하는 염색체의 정상적 중기 확산에 대해 1:1 비로 두 생성 샘플의 혼성화를 포함한다. 형광 현미경 및 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 이어서 상이하게 착색된 형광 신호를 두 공급원 사이의 염색체 차이의 동정을 위해 각 염색체의 길이를 따라 비교한다. 염색체의 특정 영역에서 시험 샘플 색상의 고강도는 상응하는 공급원 샘플 중의 그 영역의 물질의 획득을 나타내는 반면, 참조 샘플 색상의 고강도는 그 특정 영역에서 시험 샘플 중의 물질의 손실을 나타낸다. 중성 색상(형광단 표지가 적색 및 녹색일 경우 황색)은 그 위치의 두 샘플 사이에 차이가 없다는 것을 나타낸다. CGH는 문헌(참조: Kallioniemi et al., Science 258(5083):818-21 1992 및 Pinkel et al., Nat Genet. 20(2):207-11 1998)에 기재되어 있었다.
보다 최근에는, 디지털 또는 가상 핵형 분석 방법이 게놈 규모의 카피 수를 정량화하기 위해 개발되었다(참조: Wang et al., PNAS 99(25):16156-16161 2002). 디지털 핵형 분석은 통상의 핵형 분석 또는 염색체 기반 CGH와 비교하여 높은 해상도로 검출되는 카피 수의 차이를 가능하게 한다. 모든 게놈에 대한 특정 유전자 좌로부터 DNA의 짧은 서열을 단리하고 열거한다. 21 bp 각각의 태그는 게놈 중 특정 위치로부터 수득될 수 있고, 일반적으로 그들이 유도된 게놈 유전자 좌를 독특하게 동정하기 위한 충분한 정보를 함유한다. 따라서, 태그는 정확한 염색체 위치에 일치시킬 수 있었고, 태그 밀도는 DNA 서열 내용물에서 이상성을 검출하기 위해 이동하는 윈도우에 대해 평가할 수 있다. 서열 태그를 이들의 염색체 위치에 일치시키는 방법은 고처리량 서열분석, 어레이-비교 게놈 혼성화 및 SNP 어레이의 사용을 포함한다.
어레이는 게놈에서 목적하는 영역에 상보적인 수백 내지 수만 프로브로 구성 된다. 시험 샘플로부터 DNA를 단편화하고, 표지하고 어레이에 혼성화한다. 각 프로브에 대한 혼성화 신호 강도는 어레이 상의 각 위치에 대해 정량화한다. 어레이 상의 각 프로브의 어드레스 및 게놈 중 각 프로브의 어드레스를 알면, 알고리즘은 염색체 순서로 프로브를 정렬시키고 게놈을 인 실리코로 재제작하기 위해 사용한다. 디지털 핵형 분석의 해상도는 어레이 상의 프로브의 밀도에 의존한다.
고정밀 분석이 요구되는 하나의 영역은 비침습성 산전 핵형 분석에 존재한다. 임신한 어머니는 이들의 혈액에 무세포 순환 DNA를 운반하고, 이 중 4 내지 30%는 태아로부터 유래된다. 각 염색체로부터 발생하는 무세포 DNA의 풍부함을 측정함으로써 태아의 핵형을 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 무세포 DNA가 95% 모체 및 5% 태아 DNA로 구성되고, 태아가 염색체 21의 3염색체성을 가지면(다운 증후군), 염색체 21로부터 무세포 DNA의 총량은 동일 크기의 임의의 다른 게놈 영역의 것을 2.5% 초과해야 한다. 태아 DNA에서 염색체 이수성을 관찰하는 것은 상이한 염색체의 상대적 양에서 이러한 약간의 불균형을 검출하기 위해 매우 정밀한 측정을 필요로 한다. 난이도는 편리하여 환자 및 임상의에게 허용되는 방법을 제공하기 위해 비교적 소량의 샘플로 작업할 필요성에 의해 배합된다.
단일 또는 소수의 DNA 분자로부터 특정 표적의 분석은 전통적으로 기술적 과제였다. DNA를 카 피하는 방법은 전형적으로 다운스트림 분석 절차에 충분한 신호를 달성하는데 필요하다. DNA 서열분석, 겔 전기영동 및 DNA 마이크로어레이와 같은 분석 방법은 전형적으로 제공된 샘플 중의 DNA의 신호 증폭을 필요로 한다. 특정 DNA 표적을 증폭시키기 위한 가장 통상적인 증폭 방법은 PCR이고, 이는 DNA 샘플로 부터 특정 표적의 수백만 (또는 수십억) 카피를 제공할 수 있다. 그러나, 분석을 위한 게놈 샘플의 다수의 영역을 증폭시키는 것을 목적으로 할 경우, 증폭 인공물 은 동일한 반응 혼합물에서 함께 다수의 상이한 증폭을 수행한 결과로 발생할 수 있다. 또한, 증폭 단계는, 상대량의 원래의 차이가 증폭된 핵산 생성물의 절대적 크기와 비교하여 아주 작을 수 있고, 상이한 서열이 상이한 효율로 증폭될 수 있기 때문에, 샘플 중의 서열의 상대량에 관한 정보의 손실을 유도할 수 있다.
발명의 요약
본원에 기재된 방법의 일부 구현예는 복수의 고유의 표적 서열을 함유하는 목적하는 핵산 종(예: 염색체)이 다수의 특이적 프로브를 사용하여 검출되는 신규 접근법을 도입한다. 다수의 프로브가 검출가능한 신호를 제공하기 위해 사용되고, 여기서 신호의 크기는 이들의 표적 서열을 인식하는 프로브의 수에 비례한다. 복수의 프로브로부터 개별적 신호는 단일 누적 검출가능한 신호로 변환되어 다중 프로빙을 통해 개별 신호를 증폭시킨다. 10개 이상의 프로브는 10배 이상의 신호 증폭을 생성한다. 생성된 신호는 신호가 수득되는 특정 생성물을 생성하기 위해 서열 특이적 혼성화 및 효소 촉매작용을 사용하여 표적 인식시 정확하게 반응된 프로브에 의존한다.
일부 구현예는 신호 증폭 단계로서 목적하는 표적 분자의 핵산 종 상에서 다수의 유전자 좌의 검출을 사용하고, 따라서 반응된 프로브의 생성물의 증폭을 필요로 하지 않고 신호 생성 및 검출을 가능하게 한다. 그러나, 다중 생성물으로부터의 신호는 전통적 신호 증폭 단계에 의해 임의로 증폭될 수 있다. 신호의 클로날 증폭이 수행될 수 있다. 적합한 증폭 기술은 회전 원 증폭, 브릿지 PCR, emPCR 및 디지털 PCR을 포함한다.
이의 표적 서열을 인식하는 각 프로브는 결찰 생성물을 생성하고, 각 프로브 혼성화로 생성된 결찰 생성물은 개별 신호가 각각으로부터 수득 가능하도록 개별적으로 검출 가능할 수 있다. 그러나, 본 발명의 일부 실시의 우수한 특징은 이러한 개별 신호가 개별적으로 검출될 필요가 없고, 대신 누적 신호로 병합되고, 누적 신호가 검출된다는 것이다. 누적 신호는 개별 신호의 조합이고, 따라서 결찰 생성물을 검출하고/하거나 정량화하기 위해 사용되어 조사 중인 핵산 종의 존재 또는 품질을 나타낼 수 있다. 이는 서열분석 및 마이크로어레이를 포함하는 방법과 비교하여 프로브 신호의 조기 병합을 가능하게 하고, 여기서 개별 신호는 영역을 교차하는 다수의 프로브를 위해 생성한 다음, 신호를 영역을 나타내기 위해 분석에서 병합한다. 신호는 개별 신호가 별도로 맵핑되거나 심문받지 않도록 검출 전에 병합될 수 있다. 이는 단순한 판독 포맷을 가능하게 한다.
다중화에 의한 신호 증폭 방법이, 예를 들면, 핵산 종이 복합 핵산 샘플 중의 최소 또는 미량의 성분인 샘플 중에서 목적하는 핵산 종을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 다중화에 의한 증폭은 신뢰 가능한 검출을 가능하게 한다. 이는, 예를 들면, 진단 목적을 위한 샘플, 예를 들면, 환자 샘플에서 미생물 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 샘플은 존재하는 것들을 검출하고 동정하기 위해 복수 종의 미생물 핵산에 특이적인 프로브로 프로빙할 수 있다. 이는 세균, 바이러스 및 진균과 같은 감염성 질환의 제제의 검출용으로 유용하다. 특이적 핵산 및 전사물이 검출될 수 있다. 다중화에 의한 증폭은 또한 핵산 종을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 두 개 이상의 핵산 - 목적하는 하나 이상의 종 및 하나 이상의 참조 핵산 종 - 을 프로빙함으로써, 본 발명의 방법은 샘플 중의 두 종의 상대량의 정량화를 가능하게 한다. 당해 방법은, 예를 들면, 염색체 카피 수 검출을 위해 염색체 또는 염색체 좌의 검출 또는 정량화에 적용될 경우 특히 유용하다. 특별한 값의 적용은 암 및 선천적 이수성의 진단을 포함하여 염색체 결함을 동정하기 위한 상기 방법의 사용이다. 비침습성 산전 진단(NIPT)을 위한 사용이 구체적으로 기재된다. 본 발명의 방법은 다수의 표적 서열을 포함하는 큰 핵산이 심문되고/검출될 경우, 특히 이러한 핵산이 저 몰량으로 존재할 경우 및 NIPT에서의 경우와 같이, 그들이 매우 높은 정밀도로 측정되거나 정량화되어야 하는 경우에 특히 유용하다.
샘플 중의 핵산 종은 샘플을 프로브 세트와 접촉시키고, 여기서 각 프로브는 검출될 핵산 종 중의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 각 프로브에 의한 각 표적 서열의 인식은 생성물을 생성하고, 생성물로부터 신호의 조합인 누적 신호를 검출함으로써 검출될 수 있고, 여기서 신호의 검출은 샘플 중 핵산 종의 존재를 나타낸다. 핵산 종은 신호 수준을 측정하기 위한 누적 신호를 정량화하고, 이에 의해 샘플 중 핵산 종의 양을 측정함으로써 정량화할 수 있고, 여기서 신호 수준은 샘플 중의 핵산 종의 양에 비례한다. 제1 핵산 종은 샘플을 제1 세트의 프로브 및 제2 세트의 프로브와 접촉시킴으로써 제2 또는 참조 핵산 종에 대해 정량화하고, 여기서 제1 세트 프로브는 각각 제1 핵산 종 내에서 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 제2 세트의 프로브는 각각 제2 또는 참조 핵산 종 내에서 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식한다. 제1 및 제2 누적 신호가 검출되고, 제1 누적 신호는 이들의 표적 서열을 인식하는 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 생성물로부터의 개별 신호의 조합이고, 제2 누적 신호는 이들의 표적 서열을 인식하는 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 생성물로부터의 개별 신호의 조합이다. 제1 및 제2 신호는 제1 및 제2 신호 수준을 각각 측정하기 위해 정량화하고, 이들은 샘플 중의 제1 및 제2 핵산 종의 양에 비례한다. 따라서, 샘플 중의 제1 및 제2 핵산 종의 상대량은 제1 및 제2 신호 수준을 비교함으로써 측정될 수 있다.
예를 들면, 누적 신호는 이들의 표적 서열을 인식하는 프로브의 클로날 증폭되고/되거나 표지된 생성물, 예를 들면, 회전 원 증폭 생성물 또는 각 생성물이 형광 신호를 방출하는 모든 생성물으로부터 방출된 형광 신호의 요약된 열거일 수 있다. 다수의 핵산 종의 상대량을 정량화하기 위해, 상이한 신호가 각 종에 대해 사용되고, 예를 들면, 한 세트의 프로브의 생성물은 다른 세트의 프로브의 생성물과 비교하여 형광의 상이한 파장 또는 스펙트럼을 방출할 수 있다.
신호 출력이 올바른 효소 프로브 반응에 의존하도록, 프로브 표적 인식이 혼성화 및 효소 차별 둘 다에 의존할 경우에 이점이 수득된다. 바람직하게는, 프로브에 의한 표적 서열의 인식은 표적 서열로의 프로브의 혼성화 및 결찰 생성물의 생성을 포함하고, 여기서 결찰 생성물의 생성은 이의 표적 서열에 대한 프로브의 특이적 혼성화에 의존한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 적합하도록 설계된 프로브가 본원에 기재된다. 그러나, 프로브는 임의의 하나의 프로브 설계에 제한되지 않고, 예를 들면, 자물쇠 프로브, 선택기 프로브, 올리고뉴클레오타이드 결찰 프로브, 분자 반전 프로브 및 탠덤 프로브를 포함하는 다양한 공지된 핵산 프로브가 편리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 국면은 샘플 중 핵산 종을 검출하는 방법으로서,
상기 샘플을 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각 프로브가 검출될 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 인식하는, 단계,
핵산 종 중의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계, 및
모든 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 검출시키는 단계를 포함하고, 여기서
상기 신호의 검출이 샘플 중의 핵산 종의 존재를 나타내는, 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 국면은 샘플 중의 핵산 종을 정량화하는 방법으로서,
상기 샘플을 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각 프로브가 정량화될 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
핵산 중의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계,
모든 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 검출시키는 단계,
신호 수준을 측정하기 위해 누적 신호를 정량화하는 단계로서, 상기 신호 수준이 샘플 중의 핵산 종의 양에 비례하는, 단계 및
이에 의해, 샘플 중의 핵산 종의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법인 방법을 제공한다.
당해 방법은 샘플 중의 제2 핵산 종에 대한 제1 핵산 종을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 당해 방법은
샘플을 제1 세트의 프로브 및 제2 세트의 프로브와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트의 프로브는 각각 제1 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 상기 제2 세트의 프로브는 각각 제2 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
제1 및 제2 핵산 종 내의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계,
제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제1 누적 신호를 검출하고, 제1 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제1 신호 수준은 샘플 중의 제1 핵산 종의 양에 비례하는, 단계,
제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제2 누적 신호를 검출하고, 제2 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제2 신호 수준은 샘플 중의 제2 핵산 종의 양에 비례하는, 단계, 및
상기 제1 및 제2 신호 수준을 비교하고, 이에 의해 샘플 중의 제1 및 제2 핵산 종의 상대량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 국면은 샘플 중의 제2 염색체 또는 염색체 좌에 대한 제1 염색체 또는 염색체 좌를 정량화하는 방법으로서,
상기 샘플을 제1 세트의 프로브 및 제2 세트의 프로브와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트의 프로브는 각각 제1 염색체 또는 염색체 좌 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 상기 제2 세트의 프로브는 각각 제2 염색체 또는 염색체 좌 내에서 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
상기 제1 및 제2 염색체 또는 염색체 좌 중의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 핵산의 원인 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계,
상기 핵산의 원의 회전 원 복제 조건을 제공하는 단계,
제1 회전 원 복제 생성물의 수를 계수하는 단계로서, 여기서 회전 원 복제 생성물이 제1 계수를 제공하기 위해 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터 증폭되는, 단계,
제2 회전 원 복제 생성물의 수를 계수하는 단계로서, 여기서 제2 회전 원 복제 생성물이 제2 계수를 제공하기 위해 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터 증폭되는, 단계, 및
상기 제1 및 제2 계수를 비교하고 이에 의해 샘플 중의 제1 및 제2 핵산 종의 상대량을 측정하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
이러한 구현예에서, 회전 원 증폭 생성물은
(a) 기질의 표면 위에 분포된 복수의 복합체를 포함하는 기질을 수득하는 단계로서, 상기 복합체가 각각 단일 RCA 생성물 및 RCA 생성물으로 혼성화되는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 제1 회전 원 증폭 생성물에 상응하는 복합체 및 제2 회전 원 증폭 생성물에 상응하는 복합체가 식별 가능하게 표지되는, 단계; 및
(b) 기질의 영역에 존재하는, 제1 RCA 생성물의 수를 계수하고, 독립적으로, 제2 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계에 의해 개별적으로 계수할 수 있다.
이 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지될 수 있다.
일반적으로, 프로브의 수는 검출되거나 정량화될 핵산 종 각각에 대해 적어도 10일 것이다. 코스의 수는 프로브의 분자의 절대 수보다는 상이한 프로브의 수를 의미한다. 따라서, 핵산은 적어도 10개의 상이한 특정 표적 서열을 함유하고, 누적 신호는 적어도 10개의 독특한 프로브의 개별 신호의 조합이고, 이 누적 신호는 핵산 중 일종을 나타낸다. 고수준의 다중화는 상응하게 고수준의 신호 증폭을 수득하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 적어도 100개, 적어도 1,000개, 적어도 10,000개 또는 그 이상의 프로브를 검출되거나 정량화될 핵산 종 각각을 위해 사용할 수 있다.
언급한 바와 같이, 다양한 프로브 설계가 본 방법에 사용하기에 적합하다. 이들의 표적 서열로 정확한 혼성화 후 결찰 생성물을 생성하는 프로브는 다음을 포함한다:
a) 자물쇠 프로브, 여기서 프로브는 표적 서열로 혼성화하여 원형화하고, 프로브 핵산의 원은 결찰에 의해 생성된다. 자물쇠 프로브는 US 5,854,033 (Lizardi), WO99/49079 (Landegren) 및 US 5,871,921 (Landegren & Kwiatkowski)에 기재되어 있다. 반전 프로브로서 공지된 자물쇠 프로브의 버전은 US 6,858,412 (Willis et al. )에 기재되어 있다. 반전 프로브는 프로브 골격에 절단 부위를 함유하고, 원형화된 프로브가 절단되어 선형 생성물을 형성하도록 한 다음, 이를 증폭시키고 검출할 수 있는 자물쇠 프로브이다.
b) 표적 서열에의 결합시 브릿징 올리고뉴클레오타이드와 함께 원형화하는 탠덤 프로브. 표적 서열은 그들 사이의 브릿징 올리고뉴클레오타이드와 함께 두 프로브 서열의 결찰을 템플릿화한다. 이어서, 두 프로브 서열은 원을 형성하기 위해 결찰시킨다. 이러한 형태의 프로브는 US2013/0172212 (Ariosa)에 기재되어 있다. 탠덤 프로브는 자물쇠 프로브와 유사하지만, 결찰 동안 대신 결찰 후 별도의 단계에서 프로브를 원형화한다.
c) 표적 원형화 프로브. 이러한 형태의 프로브에서, 표적 서열 단편은 템플레이트 올리고뉴클레오타이드에 의해 원형화한다. 표적 서열의 말단은 임의로 그 들 사이의 매개 서열과 함께 결찰시킬 수 있다. 표적 원형화 프로브는 WO2008/033442(Stanford)에 기재된다. EP1997909(WO99/49079로부터 유도됨)는 표적 단편의 프로브로의 혼성화가 표적 핵산을 원형화하기 위해 표적 말단의 템플레이트 결찰에 표적 말단을 함께 가지고 오도록 정의된 5' 표적 서열 및 정의된 3' 표적 서열에 상보성인 두 개의 인접 서열을 갖는 프로브를 기재한다.
d) 표적 서열로 혼성화하고 표적 서열의 각 말단에 결찰되어 프로브 핵산 및 핵산 서열을 함유하는 원형 또는 선형 결찰 생성물을 형성하는, 표적 서열의 말단에 상보성인 하나 또는 두 개의 돌출성 말단을 갖는 이중 가닥 선택기 작제물인 선택기 프로브. 다양한 선택기 프로브가 공지되어 있다. 선택기는, 예를 들면, WO2005/111236(Dahl); WO2011/009941(Olink Genomics); WO2011/067378(Olink Genomics) 및 WO2008/153492(Agilent)에 기재되어 있다.
e) OLA(올리고뉴클레이타이드 결찰 검정) 프로브. 이러한 프로브는 SNP 유전형 분석에 사용하기 위해 기재되었다. 각 프로브는 한 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단이 다른 뉴클레오타이드의 3' 말단에 인접하게 어닐링하고, 이어서 말단이 결찰되도록 표적 서열의 인접 영역에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 쌍을 포함한다. OLA 프로브 접근법의 버전은 업스트림 갭 충전 중합(골든 게이트 검정) 또는 두 개의 플랭킹 프로브 사이에 추가의 올리고뉴클레오타이드의 결찰에 의한 갭 충전(DANSR 검정)을 포함한다. 골든 게이트 검정은 문헌[참조: Fan, J. B. et al. Highly parallel SNP genotyping. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 68, 69-78 (2003)]에 기재되어 있다. DANSR 검정은 문헌[참조: A. B. Sparks, E. T. Wang, C. A. Struble et al, Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy, Prenat Diagn (2012)]에 기재되어 있다.
일반적으로, 본 방법에 사용하기 위한 바람직한 프로브는 표적 서열로 혼성화하고 결찰 생성물을 생성하는 프로브이고, 여기서 결찰 생성물의 생성은 프로브의 이의 표적 서열로의 특이적 혼성화에 의존한다. 이는 상기 나열된 프로브 모두를 포함한다. 바람직하게는, 결찰 생성물은 이중 결찰 생성물(예: 선택기 프로브 및 탠덤 프로브)이다. 바람직하게는, 결찰 생성물은 - 예를 들면, 표적 서열이 핵산 종의 단편이고, 단편 그 자체가 프로브에 결찰되고 따라서 결찰 생성물에 도입되는 표적 서열 자체를 포함한다. 이는 표적 서열이 생성물을 서열분석함으로써 확인될 수 있다. 결찰 생성물은 원형 또는 선형 핵산일 수 있지만, 회전 원 복제 생성물을 클로날 증폭시키고 검출시킬 능력과 같은 원형 생성물을 사용하는(예: 자물쇠 프로브, 선택기 프로브 또는 표적 원형화 프로브를 사용하는) 특정 이점이 있다.
일부 경우에, 따라서, 본 방법에 사용된 프로브는 상기 특징 중의 하나 이상을 갖는다.
본 발명의 방법에 사용하기에 이상적인 프로브의 새로운 설계가 본원에 기재된다. 프로브는 (각종 구현예에서) 상기 속성 모두를 포함하여 특성의 특히 바람직한 조합을 갖는다. 이러한 신규 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 표적 서열 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
각각 유리 5' 및 3' 말단을 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이다.
어닐링 및 결찰을 위한 조건 하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하고, 표적 단편은, 존재하는 경우, 표적 상보적 서열로 혼성화하여 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치한다. 머리 서열의 5' 말단 및 표적 단편의 3' 말단은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드로 혼성화하고, 꼬리 서열의 3' 말단 및 표적 단편의 5' 말단은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드로 혼성화한다. 표적 단편이 존재하는 경우, 표적 단편의 3' 말단은 제1 결찰 접합부를 형성하기 위해 머리 서열의 5' 말단에 결찰되고, 표적 단편의 5' 말단은 제2 결찰 접합부를 형성하기 위해 꼬리 서열의 3' 말단에 결찰되어 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 포함하는 이중 결찰 생성물을 생성한다.
이중 결찰 생성물은 본원의 다른 부분에서 상세히 설명되는 특이적 프로브 설계에 따라 원형 또는 선형일 수 있다.
샘플 분석 방법이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 당해 방법은 a) 단편화된 DNA를 포함하는 샘플(예: 제한 효소로 소화된 샘플)을 제1 세트의 프로브를 포함하는 프로브 혼합물과 혼성화 하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 세트의 프로브의 프로브는 제1 염색체 중의 상이한 부위(즉, 상이한 서열)로 혼성화하고, 제1 염색체로부터 DNA 단편으로 혼성화될 때, 결찰가능하게 인접한 접합부를 함유하는 비공유 원형 생성물을 형성한다. 이러한 문맥에서, 용어 "결찰가능하게 인접한"은 두 올리고뉴클레오타이드 사이에 매개 뉴클레오타이드가 존재하지 않고, 그들이 리가제를 사용하여 서로 결찰될 수 있음을 의미하고자 한다. 이러한 프로브의 예는 상기 및 이하 더욱 상세히 기재된다. 이러한 프로브의 예는 도 3 및 4에 예로써 예시된다. 이어서, 도 2에 도시된 바와 같이, 당해 방법은 b) 복수의 공유 원형 결찰 생성물을 생성하기 위해 결찰가능하게 인접한 접합부를 함께 결찰시키는 단계를 포함한다. 이와 같이, 당해 방법의 다음 단계는 c) 복수의 RCA 생성물 분자를 생성하기 위해 회전 원 증폭(RCA)에 의해 공유 원형 결찰 생성물을 증폭시키는 단계를 포함한다. 이어서, RCA 생성물은 표지화하고 정량화함으로써, 이에 의해 샘플 중의 제1 염색체에 상응하는 DNA의 양의 추정치를 제공할 수 있다. 원형화 생성물은 그들이 회전 원 증폭(RCA)에 의해 증폭될 수 있기 때문에 검출에 상당한 이점을 제공한다. RCA는 단일 분자로 원형화 생성물의 수백 또는 수천개의 카피를 생성하고, 이에 의해 원형화 생성물을 효율적으로 증폭시키고, 예를 들면, 생성물 중의 모티프로 혼성화하는 표지화 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 그들을 비교적 용이하게 검출하도록 한다. 개별 RCA 생성물로부터 신호를 정량화하는 것은 많은 적용(예: 무세포 DNA 분석에 의한 비침습성 산전 진단)에서, 특별한 염색체(예: 염색체 21)에 상응하는 단편의 수는 매우 정확하게 편향 없이 측정될 필요가 있다. 전형적인 분석 방법은, 익히 공지된 바와 같이, 일부 서열이 다른 것들보다 훨씬 더 높은 효율로 증폭되는 매우 편향된 절차인 PCR을 사용한다. 이는 PCR 기초 전략을 많은 진단 노력에서 비실용적이게 한다.
도 8은 회전 원 증폭 생성물이 어떻게 정량화될 수 있는지를 예시한다. 이 방법에서, 정량화 단계는 단계 c)에서 생성된 개별 회전 원 증폭 생성물 분자를 서로 분리하고, 규정 영역 또는 용적에서 개별 회전 원 증폭 생성물 분자의 수를 계수함으로써 수행될 수 있다. 도 8에 도시된 바와 같이, 표적 서열 X 및 플랭킹 서열 A 및 B를 포함하는 원형화 생성물 22(원형화 생성물 22a, 22b, 22c 및 22d로 구성됨)는 RCA 생성물 세트를 생성하기 위해 프라이머 52에 의해 증폭된다. 이어서, RCA 생성물을 표면 위에 분포시키고, RCA 생성물의 수는 현미경으로 직접 계수할 수 있고, 여기서 용어 "분포하는"은 RCA 생성물이 평면 기질의 표면 위에 부착되어 확산되도록 함을 의미하고자 한다. RCA 생성물은 기질에 결합될 필요는 없지만, 어떤 경우에는 (예를 들면, 비오틴 등을 통해) 결합될 수 있다.
이러한 구현예에서, 정량화 단계는 i. 표지된 올리고뉴클레오타이드를 RCA 생성물 분자로 혼성화하는 단계로서, 여기서 표지된 올리고뉴클레오타이드는 RCA 생성물에서 반복되는 서열로 혼성화하고, 이에 의해 각각 단일 RCA 생성물을 포함하는 복수의 복합체 및 RCA 생성물로 혼성화하는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계, 및 ii. 기질의 표면 상의 규정된 영역에서 표지된 복합체의 수를 계수하는 단계로 수행될 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 검출 지점에서, RCA 생성물은 RCA 생성물 자체, 단일 원형화 생성물 및 RCA 생성물에서 반복되는 서열로 혼성화하는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 복합체의 일부이다.
인식된 바와 같이, RCA 생성물은 그들이 기질 상에 분포되기 전후에 표지될 수 있다. 이와 같이, 이러한 구현예에서, 정량화 단계는 (a) 기질 표면에 분포된 표지된 복합체를 포함하는 기질을 수득하는 단계 및 (b) 기질의 제1 영역에 존재하는 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계로 수행될 수 있다. 당해 방법은 다른 사이클릭 생성물이 동시에 정량화될 수 있도록 다중화될 수 있다. 예를 들면, 당해 방법에 사용된 프로브의 세트는 식별가능한 서열을 함유할 수 있고(예를 들면, 염색체 21 프로브는 제1 서열을 함유할 수 있고, 염색체 18 프로브는 제2 서열을 함유할 수 있다), 이들 프로브의 원형화의 결과로 제조된 RCA 생성물의 상이한 세트는 제1 및 제2 서열로 혼성화하는 식별가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 식별할 수 있다.
이러한 구현예에서, 당해 방법은 (a) 기질의 표면 상에 분포된 제1 및 제2 복수의 복합체를 포함하는 기질을 수득하는 단계로서, 여기서 복합체는 각각 단일 RCA 생성물 및 RCA 생성물로 혼성화되는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 제1 및 제2 복수의 복합체는 식별가능하게 표지되고, 제1 및 제2 복수의 복합체는 상이한 염색체에 상응하는, 단계, 및 (b) 제1 복수의 RCA 생성물의 수를 계수하고, 독립적으로 기질의 제1 영역에 존재하는 제2 복수의 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지될 수 있다. 본 방법에 유용한 적합한 식별가능한 형광 표지 쌍은 Cy-3 및 Cy-5 (Amersham Inc., Piscataway, NJ), Quasar 570 및 Quasar 670 (Biosearch Technology, Novato CA), Alexafluor555 및 Alexafluor647 (Molecular Probes, Eugene, OR), BODIPY V-1002 및 BODIPY V1005 (Molecular Probes, Eugene, OR), POPO-3 및 TOTO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR), 및 POPRO3 TOPRO3 (Molecular Probes, Eugene, OR)을 포함한다. 추가로 적합한 식별가능한 검출가능한 표지는 문헌[참조: Kricka et al. (Ann Clin Biochem. 39:114-29, 2002)]에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 게놈 DNA의 단편, 예를 들면, 식물, 동물(예: 파충류, 포유동물, 곤충, 벌레, 어류 등), 조직 샘플, 세균, 진균(예: 효모), 파지, 바이러스, 사체 조직, 고대/고고학 샘플 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 실질적으로 임의의 유기체로부터 게놈 DNA를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 당해 방법에 사용된 게놈 DNA는 포유동물로부터 유도될 수 있고, 여기서 특정 구현예에서, 포유동물은 인간이다. 예시적인 구현예에서, 게놈 샘플은 포유동물 세포, 예를 들면, 인간, 마우스, 래트 또는 원숭이 세포로부터 게놈 DNA를 함유할 수 있다. 샘플은 배양 세포 또는 임상 샘플의 세포, 예를 들면, 조직 생검, 긁힘 또는 세척 또는 법의학적 샘플의 세포(즉, 범죄 현장에서 수집된 샘플의 세포)로부터 제조될 수 있다. 특별한 구현예에서, 핵산 샘플은 세포, 조직, 체액 및 대변과 같은 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있다. 목적하는 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 점액, 가래, 뇌척수액, 흉수, 눈물, 락탈 도관 유체, 림프, 객담, 뇌척수액, 활액, 뇨, 양수 및 정액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특별한 구현예에서, 샘플은 대상체, 예를 들면, 인간으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 분석될 샘플은 혈액, 예를 들면, 임신 여성의 혈액으로부터 수득된 무세포 DNA의 샘플일 수 있다. 특정 구현예에서, 게놈 DNA는, 예를 들면, 발효 전에 전체 게놈 증폭 방법을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 샘플은 미생물 DNA, 예를 들면, 바이러스 또는 세균의 게놈으로부터 DNA를 함유할 수 있다.
임의의 구현예에서, 프로브 혼합물은 제2 세트의 프로브를 포함할 수 있고, 여기서 제2 세트의 프로브의 프로브는 제2 염색체 중의 상이한 부위로 혼성화하고 제1 염색체로부터 DNA 단편으로 혼성화될 때 결찰가능하게 인접한 접합부를 함유하는 비공유 원형 생성물을 형성한다. 이 방법에서, 정량화 단계는 제1 및 제2 염색체에 상응하는 회전 원 증폭 생성물의 수를 별도로 정량화하여 샘플 중의 제1 및 제2 염색체에 상응하는 DNA의 상대량의 추정치를 제공함을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 제1 및 제2 염색체에 상응하는 RCA 생성물은 식별가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드를 그들에게 혼성화하고, 지지체, 예를 들면, 현미경 슬라이드의 표면 위에 그들을 분포시킴으로써 별도로 정량화할수 있다.
당해 방법은 또한 서브-염색체 영역을 조사하는데 사용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 제1 세트의 프로브를 염색체의 제1 영역에서 상이한 부위로 혼성화할 수 있다. 이러한 구현예에서, 프로브 혼합물은 제2 세트의 프로브를 포함할 수 있고, 여기서 제2 세트의 프로브의 프로브는 제1 염색체 중의 제2 영역에서 상이한 부위로 혼성화하고, 제2 염색체로부터 DNA 단편에 혼성화될 때 결찰가능하게 인접한 접합부를 함유하는 비공유 원형 생성물을 형성한다. 이러한 방법에서, 정량화 단계는 제1 염색체의 제1 및 제2 영역에 상응하는 회전 원 증폭 생성물의 수를 별도로 정량화하여 샘플 중의 염색체의 제1 및 제2 영역에 상응하는 DNA의 상대량의 추정치를 제공함을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 제1 및 제2 염색체에 상응하는 RCA 생성물은 식별가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드를 그들에게 혼성화하고, 그들을 지지체의 표면, 예를 들면, 현미경 슬라이드 위에 분포시킴으로써 별도로 정량화할 수 있다.
비침습성 산전 시험 구현예를 위해, 다른 염색체 이상(예: 다른 트리모소미(trimosomies) 또는 특정 영역의 결실 또는 삽입)이 조사될 수 있지만, 표적 단편은, 예를 들면, 인간 염색체 21, 13 또는 18로부터 일 수 있다. 카피-수 변동은 특정 염색체 상에서 삭제되거나 증폭된 게놈의 비교적 큰 영역에 상응하는 게놈 DNA의 변경이다. CNV는 결실, 중복, 반전 및 전좌와 같은 게놈 재배열에 의해 유도될 수 있다. 카피 수 변동은 다양한 형태의 암(참조: Cappuzzo F, Hirsch, et al. (2005) 97 (9): 643-655) 자폐증(참조: Sebat, J., et al. (2007) Science 316 (5823): 445-9)을 포함하는 신경 장애(Sebat, J., et al. (2007) Science 316 (5823): 445-9, 및 정신분열증(참조: St Clair D (2008). Schizophr Bull 35 (1): 9-12)과 관련된다. 특이적 세포 집단 중 목적하는 염색체의 카피 수 변이체 또는 이의 일부의 검출은 질환 또는 장애의 유전적 진단 또는 예후 지표를 동정하기 위한 강력한 도구일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 염색체는 염색체 21이고, 제2 염색체는 염색체 13 및 염색체 18로부터 선택된다.
임의의 구현예에서, 비공유 원형 생성물 각각은 샘플로부터 DNA의 단편을 포함한다. 도 3 및 4에 도시된 실행에서, 방법에 사용된 프로브는 i. 머리 서열 및 꼬리 서열(여기서, 머리 및 꼬리 서열은 제1 올리고뉴클레오타이드 분자의 말단에 존재한다) 및 ii. 머리 서열에 상보적인 업스트림 플랭킹 서열; 표적 단편에 상보성인 표적 상보적 서열; 및 꼬리 서열에 상보적인 다운스트림 플랭킹 서열 순으로 포함하는 부목 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 비공유 원형 생성물에서 표적 단편의 말단은 제1 올리고뉴클레오타이드 분자 중 머리 및 꼬리 서열의 말단에 결찰가능하게 인접한다. 이러한 구현예에서, 부목 서열은 제1 올리고뉴클레오타이드 분자에 존재할 수 있다. 대안적으로, 부목 서열은 제2 올리고뉴클레오타이드 분자에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 적어도 50개(예: 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 500개, 적어도 1,000개, 적어도 2,000개 또는 적어도 5,000개)의 상기 프로브의 세트로 혼성화함을 포함하고, 여기서 상기 프로브는 동일한 염색체(예: 인간 염색체 21, 13 또는 18) 상에서 상이한 단편을 표적화하고, 상기 방법은 표적 단편을 포함하는 복수의 사이클릭 생성물을 유도한다. 생성된 사이클릭 생성물의 수는, 예를 들면, 그들을 RCA를 사용하여 증폭시키고, 상기한 바와 같이 RCA 생성물의 수를 계수함으로써 정량화할 수 있다.
당업자는 이하 기재된 도면이 단지 예시 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 도면은 어떤 식으로든 본 교시의 범위를 제한하고자 의도하지 않는다.
도 1은 목적하는 DNA 표적 종이 다수의 표지된 선형 프로브와 접촉되고, 결합된 표지로부터 누적 신호가 검출되는 본 방법의 하나의 구현예를 개략적으로 도시한다.
도 2는 목적하는 DNA 표적 종이 회전 원 증폭에 의해 클로날 증폭되고, 증폭된 생성물의 누적 신호가 검출되는 본 방법의 하나의 구현예를 개략적으로 도시한다.
도 3은 이의 표적 단편에 결합된 원형화 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프로브를 도시한다. 프로브는 두 버젼 A 및 B에 도시한다.
도 4는 결합된 표적 단편을 갖는 원형화 단일 올리고뉴클레오타이드 프로브를 도시한다.
도 5는 결합된 표적 단편과 함께 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 루프 골격 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원형화 이중 루프 프로브를 도시한다.
도 6은 결합된 표적 단편과 함께 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 선형 골격 올리고뉴클레오타이드로 구성된 선형 루프 프로브를 도시한다.
도 7은 결합된 표적 단편과 함께 2개의 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 선형 프로브를 도시한다.
도 8은 RCA 생성물이 계수될 수 있는 방법을 도시한다.
도 9는 본원에 기재된 방법의 특이성을 나타내는 겔의 이미지이다.
도 10은 본원에 기재된 방법의 정밀도를 나타내는 그래프이다.
도 11 패널 A는 슬라이드의 표면 상의 표지된 RCA 생성물의 이미지를 도시하고, 패널 B는 상이한 염색체로부터 단편의 비가 개별 RCA 생성물을 계수함으로써 어떻게 정확하게 측정될 수 있는지를 도시한다.
표적 서열의 다중 인식
검출되거나 정량화될 핵산 종은 다중 표적 서열을 포함한다. 이러한 표적 서열은 서로 상이하다. 그들은 중복될 수 있지만, 그들은 따라서 핵산 상의 공간적으로 상이한 위치를 나타낸다. 소정의 핵산 내의 표적 서열을 중복되거나 비중복될 수 있거나, 중복 및 비중복 표적 서열의 혼합물이 존재할 수 있다. 바람직하게는 표적 서열은 비중복된다. 효과적으로, 핵산 종을 위한 표적 서열의 세트는 동일한 핵산 종의 검출을 위한 상이한 에피토프를 나타낸다.
일반적으로, 핵산에 적어도 10개, 적어도 100개, 적어도 1,000개 또는 적어도 10,000개의 상이한 표적 서열이 존재하고, 이들 각각은 프로브화할 수 있다.
적합한 프로브의 농도는 샘플 중 핵산 종의 농도 (또는 예상된 농도)를 기초하여 측정할 수 있다. 실시예에 예시된 바와 같이, 프로브는 프로브당 10pM의 농도로 샘플에 첨가할 수 있다. 샘플이 복수의 프로브(예: 프로브의 세트)와 접촉되는 경우, 개별 프로브의 농도는 10pM일 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 검출되거나 정량화되는 목적하는 핵산 종의 예상된 농도를 초과하여 사용된다. 과량의 프로브의 사용은 샘플에 존재하는 표적 서열의 모든 카피가 인식된다는 것을 보장해야 한다. 이는 검출 감도를 최대화한다. 또한, 방법이 정량화를 포함하는 경우, 프로브의 세트로부터 결찰 생성물 또는 누적 신호의 검출이 샘플 중 표적 서열의 양에 비례한다는 것을 보장한다.
핵산의 일종이 서로에 대해 정량화되는 경우, 표적 서열은 핵산 종에 특이적이고, 즉, 핵산의 다른 종에서 발견되지 않고, 바람직하게는 샘플 중에 존재할 수 있는 핵산의 임의의 다른 종에서 발견되지 않는다.
다수의 진단 및 다른 적용을 위해, 핵산 종은 염색체 및 염색체 좌, 예를 들면, 인간 염색체 또는 염색체 좌이다. 따라서, 각 표적 서열 단편은 유기체 게놈의 하나의 염색체에 특이적일 수 있다. 환언하면, 이는 그 게놈의 다른 염색체에서가 아니라 게놈의 하나의 염색체에서만 발견될 수 있다. 일반적으로, 본 방법은 인간 게놈의 분석용으로 사용되고, 이 경우에 표적 서열은 하나의 인간 염색체에 특이적인 단편일 수 있고, 즉 다른 인간 염색체가 아니라 그 염색체에서 발견된다. 예를 들면, 표적 서열은 염색체 21에 특이적일 수 있다. 표적 서열은 염색체의 하나의 유전자 좌에 특이적일 수 있다. 따라서, 그들은 동일 게놈의 동일한 염색체 또는 다른 염색체의 다른 유전자에서가 아니라 그 염색체 좌에서 발견될 수 있다. 예를 들면, 표적 서열은 인간 염색체의 하나의 유전자 좌에 특이적일 수 있다.
샘플 중의 핵산의 소정의 종은 일부 변동성을 포함할 수 있고, 예를 들면, 샘플은 모계 DNA 및 태아 DNA를 함유하는 모계 혈액으로부터 수득된 핵산과 같은 상이한 개체의 염색체를 포함할 수 있다. 여기서, 목적하는 종은 특정 염색체일 수 있지만, 태아 또는 모계 기원인지 염색체의 모든 카피를 검출하는 것이 편리하다. 따라서, 목적하는 종은 하나의 염색체 또는 염색체 좌일 수 있고, 표적 서열은 염색체 또는 염색체 좌의 모계 및 태아 카피 둘 다에서 그 염색체 또는 유전자 좌로부터 발견된다.
핵산의 종은 단편화될 수 있다. 표적 서열은 핵산의 종의 단편의 서열, 즉 표적 단편일 수 있다.
바람직하게는, 표적 서열은 서열이 미리 정의된 단편이다. 말단을 포함하는 전체 단편의 서열은 공지될 수 있다. 미리 정의된 서열의 공지된 단편은 핵산 종의 랜덤보다 특이적 단편화에 의해 생성될 수 있다. 특이적 단편화 방법은 제한 효소에 의한 소화, PCR(예: 다중 PCR), 및 다른 효소, 리보자임 또는 이러한 기술의 조합을 포함하는 서열 지시된 단편 말단 정의의 다른 방법을 포함한다.
바람직한 단편화 방법은 제한 엔도뉴클레아제 또는 둘 이상의 엔도뉴클레아제의 조합에 의한 소화이다. 따라서, 샘플은 핵산의 제한 효소 소화일 수 있고, 표적 서열은 제한 단편일 수 있다.
다양한 특이적 핵산 절단 효소가 공지되어 있고, 특이적 핵산 서열 내의 미리 정해진 위치에서 절단하는 효소 또는 특이적 핵산 인식 서열 전 또는 후에 절단하는 엔도뉴클레올리틱 효소 및 절단 효소(측면-절단 효소)를 포함하는 임의의 적합한 효소가 본 방법에 사용될 수 있다. 리보자임과 같은 촉매 핵산은 DNA 분획화를 위해 또한 사용될 수 있다. 효소는 무딘 말단 또는 점착성 말단을 생성하기 위해 이중 가닥 핵산을 절단할 수 있거나, 핵산의 단일 가닥을 절단할 수 있다. 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV 및 타입 V를 포함하는 다양한 형태의 제한 효소가 공지되어 있다. 적합한 효소 또는 효소의 조합은 목적하는 바와 같이 본 발명의 방법에 사용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 샘플 중 핵산(예: DNA 10ng)은 상응하는 적합한 제한 효소 완충제에서 제한 효소(예: 1U)로 소화될 수 있다. 반응물을 적합한 조건하(예: 1시간 동안 37℃)에, 이어서 효소 불활성화(예: 80℃에서 20분 동안)로 배양할 수 있다.
단편화된 핵산을 제공하는 다른 편리한 방법은 핵산의 종으로부터 특이적 선형 서열의 증폭을 위한 프라이머를 사용하는 것이다. 다중 PCR을 사용하여 다중 특이적 단편을 증폭시키기 위한 다중 특이적 프라이머 쌍으로 핵산을 처리할 수 있다. 이러한 경우에, 표적 서열의 말단은 프라이머의 쌍의 서열에 상응한다.
핵산의 샘플은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들면, 환자로부터 생물학적 조직 또는 유체의 샘플로서 제공할 수 있다. 샘플은 혈액 샘플, 전혈, 혈장, 또는 혈청, 조직 샘플, 예를 들면, 조직의 포르말린 고정 파라핀 매립 샘플일 수 있거나, 혈액 또는 조직으로부터 추출된 핵산의 샘플일 수 있다.
샘플은 핵산을 함유하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플에 함유된 핵산은 DNA 및/또는 RNA일 수 있다. 샘플은 복합체, 예를 들면, 전체 유기체, 조직 또는 세포 집단으로부터 전체 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 이의 분획일 수 있다. 이와 관련하여, 이는, 예를 들면, 핵산 분리 절차 또는 세포 용해 절차의 직접 생성물일 수 있거나, 이는 임의의 방식으로 추가로 분획화되거나 정제될 수 있고, 예를 들면, 이는 임의의 방식으로 부분적으로 또는 완전히 분리되거나 어떤 방식으로 처리된 핵산, 예를 들면, cDNA를 생성하기 위한 RNA를 함유할 수 있다. 샘플은 임의의 진핵생물 또는 원핵생물 또는 바이러스 공급원으로부터일 수 있고, 예를 들면, 미생물(예: 세균 또는 진균), 식물 또는 동물일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 검출되거나 정량화될 핵산의 종은 미생물 DNA일 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 인간 기원, 예를 들면, 인간 게놈 DNA이다. 샘플은 동물로부터 조직 또는 혈액 샘플일 수 있고, 여기서 검출될 핵산은 미생물, 예를 들면, 세균, 바이러스 또는 진균이다. 많은 진단적 및 다른 적용을 위해, 샘플은 단편화 염색체(예: 인간 염색체 또는 미생물 염색체)의 샘플이다. 비침습성 산전 진단에 관한 방법의 경우, 샘플은 임신 여성의 혈액으로부터 유래되고, 태아 DNA를 포함한다. 다른 예에서, 검출되거나 정량화될 핵산은 종양 관련 DNA이다.
샘플 중의 핵산의 소정의 종은 일부 변동성을 포함할 수 있고, 예를 들면, 샘플은 상이한 개체의 염색체, 예를 들면, 모계 DNA 및 태아 DNA를 함유하는 모체 혈액으로부터 수득된 핵산을 포함할 수 있다. 여기서, 목적하는 종은 특별한 염색체일 수 있지만, 태아 또는 모계 기원인지 그 염색체의 모든 카피를 검출하는 것이 편리하다. 따라서, 목적하는 종은 하나의 염색체 또는 염색체 좌일 수 있고, 표적 단편은 염색체 또는 염색체 좌의 모체 및 태아 카피 둘 다에서 그 염색체 또는 유전자 좌로부터 수득된다.
본 발명의 방법은 시험관내 샘플 상에서 수행될 수 있다. 따라서, 방법은 일반적으로 인간 또는 동물 신체 상에서 생체내로 수행되는 진단 또는 수술 또는 치료에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법을 포함하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 시험관내 진단 방법의 결과는 환자의 후속적 치료를 통지하기 위해 사용될 수 있다.
표적 핵산의 변성
프로브는 혼성화를 통해 적어도 부분적으로 단일 가닥 형태로 표적 서열을 인식하고 결합시킨다. 프로브의 일부 설계의 경우에, 표적 서열은 완전 단일 가닥화되어야 하고, 특히 표적 서열의 전장으로 혼성화되는 것들이어야 한다. 다른 프로브의 경우, 표적 서열의 유일한 영역으로 혼성화하는 것들, 단지 부분적 단일 가닥 표적 핵산이 필요하다. 따라서, 사용되는 프로브의 형태에 따라 표적 서열의 결합 부위를 프로브에 노출시키기 위해 적합한 조건이 제공되어야 한다.
샘플 중 표적 서열이 이미 단일 가닥 또는 적어도 부분적 단일 가닥화되는 경우, 단일 가닥 표적 서열을 이의 상보적 핵산 가닥으로부터 분리하기 위해 조건이 제공되어야 한다. 이러한 조건은 변성 조건 또는, 일부 경우에, 엑소뉴클레아제에 의한 치료일 수 있다.
변성 조건은 표적 서열을 이의 상보적 서열로부터 분리하기에 충분히 고온일 수 있다. 변성 조건은 적합한 시간, 예를 들면, 10분 동안 95℃에서 배양일 수 있다. 또는, 화학적 변성을 수행할 수 있다.
상보성 및 혼성화
프로브와 이의 표적 서열 사이의 특이적 결합은 본 방법의 중요한 특징이다. 프로브는 바람직하게는 표적 서열을 인식하는 단일 표적 상보적 서열을 포함한다. 그러나, 예를 들면, 자물쇠 프로브 및 선택기 프로브에 의해 예시된 바와 같이, 프로브는 표적 서열의 상이한 영역에 상보성인 복수의 서열을 포함할 수 있다.
표적 서열을 위한 최대 특이성은 프로브와 표적 서열 사이의 완전한 혼성화가 존재하도록 표적 서열 또는 표적 서열의 영역의 완전한 상보체인 표적 상보적 서열을 포함하는 경우, 달성된다. 그러나, 모든 경우에 필수적이지 않고, 예를 들면, 샘플 중의 정확한 대립유전자와 무관하게 표적 서열을 검출하는 것을 목적으로 하는 대립유전자 변형을 나타내는 서열의 검출을 가능하게 하기 위해 작은 정도의 불일치가 허용될 수 있다. 또는, 복수의 프로브가 변이체 서열용으로 설계될 수 있다. 이는 상이한 대립유전자 또는 돌연변이의 검출 및 식별 둘 다를 가능하게 할 수 있다. 대다수의 프로브는 이들의 표적 서열에 대한 완전한 상보성을 갖지만, 일부 프로브는 최소한의 불일치로 표적에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법에 사용된 프로브는 각각 표적 서열 또는 표적 서열의 영역과 5개 미만의 염기 쌍 불일치를 갖는 표적 상보적 서열을 포함한다. 임의로 표적 서열 또는 영역과 표적 상보적 서열 사이에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 염기 쌍 불일치가 존재할 수 있다. 불일치는 상보적 서열이 불일치된 점에서 루프를 형성하도록 상응하는 염기가 하나의 서열로부터 부재하는 점일 수 있거나, 비상보적 뉴클레오타이드가 하나의 서열에 존재하고 따라서 다른 서열의 상응하는 위치에서 염기와 쌍을 이루지 않는 경우에 발생할 수 있다. 부정확한 염기 쌍, 즉 A 또는 T와 C 또는 G의 쌍이 존재하는 경우, 혼성화가 불일치에 인접하는 뉴클레오타이드 사이의 염기 쌍에 기인하여 표적 서열과 표적화 올리고뉴클레오타이드의 표적 상보적 서열 사이에서 발생하지만, 수소 결합은 두 가닥의 염기 사이에서 발생하지 않는다. 불일치는 워블 염기일 수 있다. 워블 염기는 일반적으로 표적 단편 중의 공지된 유전적 변동의 위치와 쌍을 이루는 표적 상보적 서열 중의 위치에 상응한다. 프로브는 워블 염기 위치에 대한 특이적 합성 사이클 동안 하나 또는 다수의 디데옥시뉴클레오타이드를 첨가함으로써 합성될 수 있다. 이는 전형적으로 전통적인 뉴클레오타이드 합성을 위한 경우이다. 또는, 복수의 별도 프로브가 생성될 수 있고, 각 유전적 변이체에 대해 하나가 생성될 수 있다. 이는 전형적으로 프로브가 마이크로어레이 기반 합성을 사용하여 합성되는 경우이다. 워블 염기는 코돈 사이의 단일 뉴클레오타이드 차이에 상응할 수 있고, 여기서 상이한 코돈은 동일한 아미노산을 암호화한다.
일반적으로, 보다 긴 표적 서열 또는 이의 영역을 혼성화하기 위한 보다 긴 표적 상보적 서열은 보다 짧은 상보적 서열과 비교하여 높은 수의 불일치를 허용할 수 있다. 표적 상보적 서열은, 예를 들면, 표적 서열 또는 이의 영역과 8개 중 최대 1개, 9개 중 1개 또는 10개 중 1개의 염기쌍 불일치를 가질 수 있다. 임의의 이러한 불일치는 그들이, 예를 들면, 제한 효소 소화에 의해 결찰 또는 서열 특이적 표적 단편화를 억제하지 않도록 표적 상보적 서열 및 표적 서열 또는 영역의 내부 영역으로 제한되어야 한다. 따라서, 바람직하게는 표적 서열의 각 말단에서 말단 6 내지 8 뉴클레오타이드, 바람직하게는 말단 10 뉴클레오타이드에서 표적 서열과 표적 상보적 서열 사이에 완전한 상보성이 존재한다.
바람직하게는, 프로브는 표적 서열과 동일한 길이인 단일 표적 상보적 서열을 포함한다. 따라서, 표적 서열의 전장은 표적 상보적 서열에 의해 결합된다. 표적 서열의 표적화 올리고뉴클레오타이드로의 혼성화는 표적 분자의 두 말단에 또는 표적의 두 개의 비인접 영역에 결합하는 프로브와 대조적인, 두 핵산 분자 사이의 단일 결합 이벤트를 나타낸다.
표적 상보적 서열은 적어도 10개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 적어도 15개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 이는 최대 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 바람직한 범위는 10 내지 20개 뉴클레오타이드, 10 내지 30개 뉴클레오타이드 및 10 내지 40개 뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 비교적 짧은 표적 상보적 서열은 상응하게 짧은 표적 서열을 결합하기에 적합하다. 짧은 서열은, DNA 리가제가 염기 쌍 불일치에 민감하고, 우선적으로 완전하게 일치된 서열을 결찰하기 때문에, 이중 결찰 반응의 특이성에 기여한다. 불일치가 이중 가닥 서열에 결합된 DNA 리가제의 발자국에 존재하는 경우, 서열은 결찰되지 않을 수 있고, 이는 상이하지만 유사한 서열의 서열보다 우선적으로 표적 서열을 검출하는데 높은 특이성을 보장하는 추가적인 교정 단계를 제공한다. DNA 리가제는 전형적으로 닉의 각 측면에 6 내지 8개 염기의 발자국을 갖는다. 따라서, 표적 서열이 20개 염기이면, 염기 중 12 내지 16개가 리가제 특이성에 의해 커버된다.
프로브 혼성화는 특히 혼성화 서열의 중앙 부분에서 불일치에 대해 차별하는 반면, 결찰은 표적의 말단에서 불일치에 대해 차별한다. 함께, 이는 매우 특이적 검출을 생성한다.
본원의 다른 곳에서 보다 상세히 기재된 바와 같이, 프로브는 바람직하게는
표적 서열보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 5' 및 3' 말단을 각각 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이다.
이러한 프로브는 핵산의 종이 단편화되고, 표적 서열이 정의된 서열의 단편인 경우에 사용하기에 특히 적합하다. 표적화 올리고뉴클레오타이드는 그것이 플랭킹 서열 뿐만 아니라 표적 상보적 서열을 포함하기 때문에 표적 서열보다 더 길다. 업스트림 플랭킹 영역은 표적화 올리고뉴클레오타이드 중의 표적 상보적 서열의 업스트림 또는 5'이다. 다운스트림 플랭킹 영역은 표적화 올리고뉴클레오타이드 중의 표적 상보적 서열의 다운스트림 또는 3'이다. 따라서, 표적 상보적 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 내부이고, 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 의해 플랭킹되기 때문에, 표적화 올리고뉴클레오타이드의 말단을 포함하지 않는다.
표적 서열 및 표적 상보적 서열의 혼성화에 의해 생성된 이중 가닥 서열은, 그것이 표적 및 프로브의 혼성이기 때문에, 혼성 이중 가닥 서열로서 간주될 수 있다. 전형적으로, 이중 가닥 서열은 이중 나선 형태를 채택하고, 여기서 표적 서열은 하나의 가닥이고, 표적화 올리고뉴클레오타이드는 이중 나선의 다른 가닥이다. 혼성 이중 가닥 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열로 플랭킹되고, 이는 또한 이중 가닥 서열을 생성하기 위해 머리 및 꼬리 서열로 혼성화한다. 또한, 이들은 전형적으로 이중 가닥 핵산의 정상적 이중 나선 형태를 채택한다.
업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열은 바람직하게는 서로 상이하다, 즉 바람직하게는 상이한 서열을 갖는다. 머리 서열이 다운스트림 플랭킹 서열에 대해서가 아니라 업스트림 플랭킹 서열에 대해 상보적이고, 꼬리 서열이 업스트림 플랭킹 서열에 대해서가 아니라 다운스트림 플랭킹 서열에 대해 상보적인 것이 바람직하다. 이는, 머리 및 꼬리 서열이 단지 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열로 혼성화한다는 것을 보장한다.
머리 서열은 일반적으로 업스트림 플랭킹 서열과 동일한 길이일 것이다. 꼬리 서열은 일반적으로 다운스트림 플랭킹 서열과 동일한 길이일 것이다.
플랭킹 서열의 통상적 길이는 10 내지 40개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 10 내지 20개 또는 10 내지 30개 뉴클레오타이드이다. 플랭킹 서열은 서로 동일한 길이일 수 있다. 하나 또는 두 개의 플랭킹 서열은 표적 상보적 서열과 동일한 길이일 수 있다. 따라서, 업스트림 및/또는 다운스트림 플랭킹 서열은 적어도 10개의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 적어도 15개의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 이는 최대 20, 25, 30, 35 또는 40개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
바람직하게는, 머리 서열은 업스트림 서열의 상보체이다. 바람직하게는, 꼬리 서열은 다운스트림 서열의 상보체이다. 서열의 완전한 일치는 머리 및 꼬리 서열이 표적 서열로의 결찰을 위해 올바르게 배치되도록 프로브의 최적 결합에 바람직하다. 그러나, 임의로, 머리 서열과 업스트림 플랭킹 서열 사이 및/또는 꼬리 서열과 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 염기 쌍 불일치가 존재할 수 있다. 바람직하게는, 5개 미만의 염기 쌍 불일치가 존재한다.
표적 상보적 서열 이외에, 프로브는 일반적으로 표적 서열 또는 샘플에 존재할 수 있는 다른 핵산에 대해 상보적이어서는 안된다. 이는 표적 이외의 핵산으로 프로브의 불필요한 혼성화를 회피하는 것이다. 따라서, 프로브가 인간 게놈 DNA의 서열을 결합시키기 위한 것이면, 프로브는, 프로브가 샘플 중의 다른 핵산으로가 아니라 단지 표적 서열로 혼성화하도록 표적 상보적 서열 이외의 서열이 인간 게놈 DNA에 대해 상보적이 아니도록 설계될 수 있다.
프로브는 하나 이상의 맞춤 서열을 포함할 수 있다. 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 서열에 대해 상보적이지 않고 - 즉, 이는 어닐링 조건하에 (맞춤 서열 이외의) 프로브의 다른 영역 또는 표적 서열로 혼성화한다. 맞춤 서열은 검출을 위해, 예를 들면, 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 세트에 속하는 프로브를 동정하기 위한 바코드 또는 표지로서 사용될 수 있다.
결찰 생성물의 생성
어닐링 및 결찰을 위한 조건하에, 프로브는 이들의 표적 서열로 혼성화하고, 결찰 생성물을 생성하기 위해 결찰된다. 각 프로브의 혼성화는 결찰 생성물의 생성을 유도한다. 따라서, 결찰 생성물의 생성은 이의 표적 서열로 프로브의 특이적 혼성화에 의존한다.
결찰 생성물은 프로브 핵산 또는 표적 핵산을 포함하거나 이로 이루어지거나, 프로브 및 표적 핵산을 모두 포함할 수 있다. 결찰 생성물은 핵산의 5' 말단의 핵산의 3' 말단에의 결찰에 의해 형성된 결찰 접합부를 포함한다. 복수의 핵산이 함께 결찰되는 경우, 두 개의 결찰 접합부가 존재할 수 있다.
형성된 결찰 생성물의 종류는 사용된 프로브의 종류에 의존한다. 결찰 생성물은 핵산의 원일 수 있거나 선형 핵산 분자일 수 있다.
원형 결찰 생성물을 형성하는 프로브의 예는 자물쇠 프로브이다. 다양한 종류의 자물쇠 프로브, 예를 들면, 표준, 갭 충전, 분자 반전 프로브(MIP)가 공지되어 있다. 자물쇠 프로브는 말단에 표적 상보적 서열 및 사이에 비표적 상보적 서열을 갖는 선형 올리고뉴클레오타이드이다. 어닐링 및 결찰 조건하에, 표적 상보적 서열은 표적 서열의 인접 영역으로 혼성화하기 위해 머리를 함께 꼬리로 향하도록 하고, 결찰되어 핵산의 원을 형성한다. 따라서, 프로브는 표적 서열로 혼성화하여 원형화하고, 결찰 생성물은 프로브 핵산의 원이다. 원형 결찰 생성물은 전형적으로 선형 프로브의 5' 및 3' 말단이 함께 결찰되는 하나의 결찰 접합부를 함유한다. 브릿징 올리고뉴클레오타이드 및 갭-충전 프로브를 포함하는 변동이 공지되어 있다. 프로브는 프로브 골격에 절단 부위를 함유하여 원형화된 결찰 생성물이 절단되도록 하여 선형 생성물을 형성하고, 이어서 이를 증폭시키고 검출할 수 있다(MIP).
바람직하게는, 프로브의 표적 서열로의 혼성화는 표적 서열에의 결찰을 위한 프로브의 올리고뉴클레오타이드를 배치한다. 따라서, 표적 서열은 결찰 생성물에 도입시킬 수 있다. 이는, 그것이 결찰 생성물을 서열분석함으로써 표적 서열이 확인될 수 있도록 하기 때문에 자물쇠 프로브와 같은 프로브에 비해 이점을 갖는다. 바람직하게는, 프로브는 이의 표적 서열의 각 말단에 결찰되어 표적 서열의 각 말단에 결찰 접합부를 형성한다. 이러한 방법에서, 검출되거나 정량화될 핵산의 종은 바람직하게는 표적 서열에 상응하는 표적 단편을 생성하기 위해 단편화된다. 이어서, 표적 단편의 말단은 프로브의 말단에 결찰되어 결찰 생성물 내에서 표적 서열을 포획할 수 있다. 이러한 경우에, 표적 단편은 매우 특이적 반응으로 양 말단에 결찰된다. 표적 단편이 전형적으로 핵산의 특이적 단편화의 생성물이기 때문에, 이러한 말단은 일반적으로 특이적인 소정의 서열을 갖는다. 결찰 단계에서, 이러한 말단은 각각 머리 및 꼬리 서열에 대한 서열-의존적 결찰에 의해 특이적으로 검출된다. 바람직하게는, 표적 단편의 프로브에의 결합은 표적 단편의 3' 말단 및 머리 서열의 5' 말단 사이에 하나, 표적 단편의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이에 하나, 두 개의 완전 일치된 결찰가능한 접합부를 생성한다.
핵산의 5' 말단의 핵산의 3' 말단에의 결찰은 두 말단이 상보적 서열의 인접하는 뉴클레오타이드로 염기 쌍을 형성할 때 발생할 수 있다. 인접하는 뉴클레오타이드에 대한 각각의 말단 뉴클레오타이드의 염기 쌍 형성은 두 말단 사이에 닉을 함유하는 핵산 가닥을 형성한다. 두 말단의 결찰은 DNA 리가제에 의해 촉매화될 수 있다. 따라서, 결찰을 위한 조건을 제공하면 일반적으로 DNA 리가제 효소 및 DNA 리가제가 연속 핵산 가닥을 형성하기 위해 두 말단을 결찰시켜 닉을 밀폐시키는 반응 조건을 제공함을 포함한다. 다수의 리가제 효소, 예를 들면, 암플리가제(에피센트르)가 시판되고, 이의 적합한 조건은 1U 효소를 첨가하고 리가제 완충제에서 1시간 동안 55℃에서 배양하는 것이다.
표적 서열을 도입하는 결찰 생성물을 생성하는 프로브의 예는 선택기 프로브이다. 이러한 프로브는 표적 서열의 말단에 상보적인 하나 또는 두 개의 돌출성 말단을 갖는 이중 가닥 선택기 작제물이고, 이는 표적 서열로 혼성화하고, 표적 서열의 각 말단에 결찰되어 프로브 핵산 및 표적 서열을 함유하는 원형 또는 선형 결찰 생성물을 형성한다. 어닐링 및 결찰을 위한 조건하에, 선택기의 말단 서열을 단편의 말단 서열로 혼성화하고, 선택기에 결찰시킨다. 프로브가 각각 돌출성 말단을 갖는 선택기 작제물의 쌍을 포함하는 경우, 각각은 결찰 생성물이 두 프로브 서열 사이에 표적 서열을 포함하는 선형 핵산이도록 표적 단편의 하나의 단편에 결찰될 수 있다. 프로브가 두 개의 돌출성 말단을 갖는 단일 선택기 작제물을 포함하는 경우, 이는 결찰 생성물이 표적 서열 및 프로브 핵산을 포함하는 원형 핵산이도록 표적 단편의 각 말단에 결찰될 수 있다. 두 경우에, 결찰 생성물은 두 개의 결찰 접합부를 포함한다.
적합한 프로브의 다수의 다른 예는 본원의 다른 곳에 기재된다.
일부 구현예에서, 본 방법은
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 5' 및 3' 말단을 각각 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 프로브를 사용할 수 있고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이고,
어닐링 및 결찰을 위한 조건하에, 머리 및 꼬리 서열이 플랭킹 서열로 혼성화하고, 표적 단편이, 존재할 경우, 표적 상보적 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 표적 단편의 말단을 배치하고, 표적 단편의 3' 말단은 제1 결찰 접합부를 형성하기 위해 머리 서열의 5' 말단에 결찰시키고, 표적 단편의 5' 말단은 제2 결찰 접합부를 형성하기 위해 꼬리 서열의 3' 말단에 결찰시켜 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 포함하는 이중 결찰 생성물을 생성한다.
이러한 프로브에서, 표적화 올리고뉴클레오타이드는 플랭킹 서열 사이의 표적 상보적 서열의 위치에 기인하여 머리 및 꼬리 서열에 결찰시키기 위한 표적 단편을 템플릿화한다. 표적 단편의 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정한다. 표적 단편은 갭 중의 표적 상보적 서열로 혼성화한다. 따라서, 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편의 표적화 올리고뉴클레오타이드로의 혼성화는 표적 단편의 3' 말단을 머리 서열의 5' 말단과 병렬로 배치하고, 표적 단편의 5' 말단을 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치한다.
두 말단을 병렬로 배치하면 DNA 리가제가 말단을 함께 결찰시키는 기질을 제공한다. 머리 서열의 5' 말단 및 표적 단편의 3' 말단을 표적화 올리고뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드로 혼성화하고, 꼬리 서열의 3' 말단 및 표적 단편의 5' 말단은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 인접 뉴클레오타이드로 혼성화하는 것이 바람직하다. 따라서, 업스트림 플랭킹 서열은 개입 뉴클레오타이드 없이 표적 상보적 서열에 바로 인접할 수 있다. 유사하게, 다운스트림 플랭킹 서열은 개입 뉴클레오타이드 없이 표적 상보적 서열에 바로 인접할 수 있다. 인접한 3' 및 5' 말단은 연속적 핵산 가닥을 형성하기 위해 그들 사이의 닉을 밀봉하는 DNA 리가제에 의해 직접 결찰시킬 수 있다.
이중 결찰의 생성물, 즉 머리 서열 및 꼬리 서열 모두를 표적 단편에 결찰시킨 생성물은 핵산의 연속 가닥이다. 이는 그것이 어떠한 닉 또는 갭을 함유하지 않고, 따라서 가닥 중 모든 뉴클레오타이드는 공유 결합된다는 의미에서 연속적이다.
프로브는 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 핵산의 연속 가닥이 핵산의 원이도록 설계될 수 있다. 여기서, 용어 원은 유리 말단 없이 밀폐된 루프인 가닥의 위상을 의미한다.
표적 단편의 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정한다. 표적 단편은 갭 중 표적 상보적 서열로 혼성화함으로써 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치하고, 표적 단편 및 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 핵산의 원을 완성한다.
원을 형성하는 핵산 분자는 병렬로 이들의 말단을 갖는다. 말단의 결찰은 적어도 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속적 원형 가닥을 생성한다.
핵산의 원을 형성하는 프로브는 머리 및 꼬리 서열이 단일 핵산 분자 위에 제공된 프로브를 포함한다. 예를 들면, 표적화 올리고뉴클레오타이드 이외에, 프로브는 각각 이의 5' 말단 3' 말단에 머리 및 꼬리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 여기서 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 및 꼬리 서열은 어닐링 조건하에 표적화 올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열에 트랜스로 결합한다. 골격 올리고뉴클레오타이드는 머리 및 꼬리 서열 사이에 맞춤 서열을 포함할 수 있다. 도 3은 이러한 프로브의 구현예를 예시한다. 또는, 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 및 꼬리 서열은 그들 사이에 맞춤 서열 없이 인접할 수 있다.
다른 예에서, 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 말단에 존재할 수 있고, 어닐링 조건하에 플랭킹 서열에 시스로 결합한다. 표적화 올리고뉴클레오타이드는 표적화 올리고뉴클레오타이드와 머리 및/또는 꼬리 서열 사이에 맞춤 서열을 포함할 수 있다. 도 4는 이러한 프로브의 구현예를 예시한다.
핵산의 원을 형성하는 프로브는 또한 머리 및 꼬리 서열이 상이한 핵산 분자 위에 제공된 프로브를 포함한다. 이러한 경우에, 어닐링 조건하에 형성하는 핵산의 원은 적어도 3개의 핵산 분자 - 표적 단편, 머리 서열 및 꼬리 서열을 포함할 것이다. 핵산 분자의 말단은 이미 언급된 바와 같이 모두 병렬로 존재할 것이다. 2개 이상의 결찰 반응은 이러한 경우에 핵산의 연속적 원형 가닥을 형성하기 위해 필요하다. 예는 꼬리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단인 경우이고, 프로브는 이의 5' 말단에 머리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 어닐링 조건하에, 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합한다. 시스로의 결합은 결합이 동일 핵산 분자 상에서 발생한다, 즉 핵산의 단일 가닥이 상이한 영역을 함께 모아 혼성화하는 3차원 구조를 형성함을 의미한다. 트랜스로의 결합은 결합이 상이한 핵산 분자 사이에서 발생함을 의미한다. 임의로, 골격 올리고뉴클레오타이드는 어닐링 조건하에 헤어핀 구조를 형성함으로써 표적화 올리고뉴클레타이드의 5' 말단과 병렬로 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단을 배치하는 역전된 반복 서열의 쌍을 포함한다. 두 개의 말단 사이에 닉이 존재한다. 이러한 종류의 프로브는 도 5에 예시된다. 결찰 조건이 제공되면, 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단은 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 결차로딘다. 이중 결찰의 생성물은 표적화 올리고뉴클레오타이드, 표적 단편 및 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산의 원이다. 또는, 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단과 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 사이에 갭이 존재하는 경우, 도 5에 도시된 프로브는 결찰에 의해 원형화되지 않고 - 대신, 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 핵산의 연속 가닥은 핵산의 선형 가닥이다.
프로브는 대안적으로 머리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 존재하고 프로브가 이의 3' 말단에 꼬리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하도록 반대 배향으로 배열할 수 있다. 이러한 경우에, 어닐링 조건하에, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합한다. 다시, 골격 올리고뉴클레오타이드는 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단과 병렬로 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 배치하기 위해 어닐링 조건하에 헤어핀 구조를 형성하는 역전된 반복 서열의 쌍을 포함할 수 있다. 이어서, 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단은 이중 결찰의 생성물이 표적화 올리고뉴클레오타이드, 표적 단편 및 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산의 원이도록 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 결찰시킨다. 대안적으로, 상기 언급된 바와 같이, 어닐링은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 근처에 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 배치할 수 있지만, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 갭에 의해 분리된다. 이어서, 결찰된 생성물은 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 선형 가닥일 것이다.
골격 올리고뉴클레오타이드는 어닐링 조건하에 골격 올리고뉴클레오타이드가 도 5에 도시된 바와 같이, 헤어핀 루프를 형성하도록 역전된 반복 서열 사이에 맞춤 서열을 포함할 수 있다.
언급된 바와 같이, 프로브는 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥이 핵산의 선형 가닥이도록 설계될 수 있다. 표적 단편 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이에 갭을 규정한다. 표적 단편은 갭 중의 표적 상보적 서열로 혼성하고, 이에 의해 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치하고 표적 단편 및 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 핵산의 가닥을 완성한다. 가닥을 형성하는 핵산 분자는 이들의 말단을 병렬로 갖는다. 용어 병렬은 다른 곳에서 논의되고 있다. 결찰되는 말단 사이에 닉이 존재한다. 말단의 결찰은 적어도 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 생성한다.
프로브는 이의 3' 말단에 꼬리 서열을 갖는 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 이의 5' 말단에 머리 서열을 갖는 선형 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 어닐링 조건하에, 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합한다. 표적화 올리고뉴클레오타이드는 어닐링 조건하에 표적화 올리고뉴클레오타이드가 헤어핀 루프를 형성하도록 다운스트림 플랭킹 서열과 꼬리 서열 사이에 맞춤 서열을 포함할 수 있다. 어닐링 조건하에 형성된 핵산의 선형 가닥은 골격 올리고뉴클레오타이드, 표적 단편 및 표적화 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 도 6은 이 배열을 예시한다.
프로브는 동일하게 반대 배향으로 배열할 수 있고, 여기서 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 존재하고, 프로브는 이의 3' 말단에 꼬리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 경우에, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합한다.
결찰 생성물로서 선형 핵산 가닥을 형성하는 프로브의 다른 형태는 개별 골격 올리고뉴클레오타이드 상에 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 프로브이다. 이러한 프로브는 유리 5' 말단을 갖는 머리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드 및 유리 3' 말단을 갖는 꼬리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 여기서 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열에 트랜스로 결합한다. 하나 또는 두 개의 골격 올리고뉴클레오타이드는 맞춤 서열을 추가로 포함할 수 있다. 도 7은 이러한 종류의 프로브를 예시한다.
바람직하게는, 이의 비결찰된 형태의 프로브의 올리고뉴클레오타이드는 선형이다. 따라서, 바람직하게는 표적화 올리고뉴클레오타이드는 선형 핵산 분자이다. 하나 이상의 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프로브의 경우, 이들은 또한 바람직하게는 선형이다. 이는, DNA의 원이 단지 프로브의 원형화 구현예의 성공적인 결찰 결과로서 형성되는 결찰된 프로브 및 비결찰된 프로브 사이의 편리한 차별화를 가능하게 한다. 선형 핵산 분자는 회전 원 복제에 의해 증폭되지 않는다.
생성물의 증폭
본 발명의 방법에서 신호 검출은 신호가 수득되는 특정 생성물을 생성하기 위해 서열 특이적 혼성화 및 효소 촉매 작용을 사용하여 표적 인식 후 올바르게 반응된 프로브에 의해 또는 프로브로부터 생성된 신호에 의존한다. 본 발명의 방법은 신호 증폭 단계로서 목적하는 표적 분자의 핵산 종의 복수의 유전자 좌의 검출을 사용하고, 따라서 반응된 프로브의 생성물의 증폭을 필요로 하지 않고 신호 생성 및 검출을 가능하게 한다. 신호가 수득될 수 있고, 누적 신호는 결찰 생성물을 증폭시키지 않고 검출할 수 있다. 그러나, 임의로, 다중 생성물으로부터의 신호는 전통적 신호 증폭 단계로 증폭시킬 수 있다.
방법은 검출 전에 결찰 생성물을 농축시킴을 포함할 수 있다. 생성물은 증폭 및/또는 고상 화학에 의해 농축시킬 수 있다. 원형 핵산 생성물은 선형 핵산 생성물을 소화하기 위해 샘플을 엑소뉴클레아제(예: 람다 엑소뉴클레아제)로 처리하여 선택적으로 농축시킬 수 있다. 일반적으로, 결찰 생성물이 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호될 때 엑소뉴클레아제 분해를 결찰 생성물을 농축시키기 위해 사용할 수 있다. 이어서, 엑소뉴클레아제는 중합을 포함하는 임의의 후속 단계 전, 예를 들면, 회전 원 증폭 전에 불활성화되어야 한다(예: 열에 의해). 실시예 2에서 예시된 바와 같이, 비반응된 프로브 및 단편을 제거하기 위해 1U 엑소뉴클레아제를 첨가할 수 있다. 적합한 조건은 상응하는 엑소뉴클레아제 완충제에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음, 80℃에서 20분 동안 효소 불활성화한다. 포획/검출 방법이 사용될 경우, 결찰 생성물은 생성물을 포획 모이어티를 통해 고상으로 포획함으로써 농축시킬 수 있다. 실시예 1에서 예시된 바와 같이, 선형 결찰 생성물을 함유하는 용액을 최종 용적 200ml로 트리스-HCl(pH 7.5), 3.5mM EDTA 및 0.07% 트윈-20에서 10ml M-280 스트렙타비딘 암호화된 자기 비드(인비트로겐)와 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양할 수 있다. 배양 후, 비드는 환 자석을 사용하여 수집하고, 상청액은 제거한다. 결찰 생성물을 농축시키는 다른 방법은 결찰 생성물은 구체적으로 크기 선택함을 포함한다.
결찰 생성물은 클로날 증폭으로 증폭시킬 수 있다. 적합한 증폭 기술은 회전 원 증폭(이하 참조), 브릿지 PCR (참조: Adessi C, et al., Nucleic Acids Res. 2000 Oct 15;28(20):E87), 에멀젼 PCR (에멀젼 중 디지털 PCR은 문헌(참조: Dressman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 22;100(15):8817-22. Epub 2003 Jul 11)에 기재되어 있다) 및 디지털 PCR (참조: Vogelstein & Kinzler, Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Aug 3;96(16):9236-41)을 포함한다. 겔 중 클로날 편재된 증폭은 문헌 (참조: Mitra & Church, Nucleic Acids Res. 1999 December 15; 27(24): e34)에 기재되어 있었다. 본 발명의 방법의 구현예는 결찰 생성물을 증폭시키고, 증폭된 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 수득함을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결찰 생성물은 결찰 접합부에 결쳐 또는 이중 결찰 생성물의 경우, 모든 결찰 접합부에 걸쳐 증폭시킨다.
결찰 생성물은 핵산의 원인 경우, 증폭은 핵산의 원의 회전 원 복제를 위한 조건을제공하고, 회전 원 복제의 생성물을 검출함을 포함할 수 있다. 회전 원 복제는 문헌(참조: US 5,854,033 (Lizardi) 및 Fire & Xu, Proc Natl Acad Sci USA. 1995 May 9;92(10):4641-5)에 기재되어 있었다. 회전 원 복제는 증폭된 서열의 탠덤 반복체를 함유하는 큰 DNA 분자를 생성하는, 가닥 변위 DNA 폴리머라제를 사용하는 원형 핵산 분자의 증폭이다. DNA 폴리머라제는 목적하는 한 진행하는 진보적인 회전 원 중합 반응에서 프라이머 신장 및 가닥 변위를 촉매작용한다. 이는 PCR 복제의 단일 사이클 및 각 사이클이 표적 서열의 카피 수의 이중화로 제한되는 다른 증폭 기술보다 큰 크기 순서의 원형화 프로브 서열 증폭을 유도한다. 추가의 증폭은 가닥 변위 반응의 캐스케이드를 사용하여 수득할 수 있다. 회전 원 복제는 과분지된 회전 원 복제일 수 있다. 과분지된 RCA는 문헌(참조: Lizardi et al., Nat Genet. 1998 Jul;19(3):225-32)에 기재되어 있다. 회전 원 복제를 위한 조건은 실시예에 예시되고, 예를 들면, 1U의 phi29 폴리머라제(New England Biolabs)에 의한 배양은 37℃에서 1시간 동안 상응하는 phi29 완충제 및 뉴클레오타이드(dNTP)에 첨가할 수 있다.
검출
결찰 생성물은, 개별 신호가 이의 상응하는 프로브에 의한 각 표적 서열의 인식으로부터 생성되는 결찰 생성물로부터 수득가능하도록 개별적으로 검출가능할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에서, 결찰 생성물은 개별적으로 검출될 필요가 없다. 결찰 생성물로부터의 개별 신호는 누적 신호로 병합되고, 누적 신호가 검출된다.
신호의 종류 및 검출 방법은 적합하게는 프로브의 종류에 기초하여 선택될 수 있거나, 프로브는 목적하는 신호 종류 및 검출 방법을 가능하게 하도록 설계될 수 있다. 상기 방법은 신호 또는 신호 검출 수단의 특정 종류에 한정되지 않고 - 오히려, 방법은 복수의 프로브로부터의 개별 신호를 단일 누적 검출가능한 신호로 전환시키고, 이에 의해 프로빙 단계의 다중 성질을 통해 개별 신호를 증폭시키는 임의의 방법으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 결찰 생성물로부터 신호의 검출은 프로브의 이의 표적 서열로의 결합 후 각 생성물의 형성에 의존하고, 따라서 표적 서열이 샘플에 존재하는 경우를 나타낸다. 따라서, 신호는 하나의 결찰 접합부 또는, 이중 결찰 생성물의 경우, 두 결찰 접합부를 포함하는 생성물로부터 구체적으로 수득될 수 있다. 개별 신호는 각 표적 서열로의 프로브 혼성화의 결과로서 형성된 각 결찰 접합부로부터 수득가능할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 프로브의 세트가 목적하는 종의 10개의 표적 서열을 인식하는 10개의 상이한 프로브를 포함하는 경우, 결찰 접합부를 포함하는 10개의 결합 생성물이 존재할 것이고, 10개의 결찰 생성물로부터 개별 신호의 조합인 누적 신호가 검출될 수 있다. 물론, 이 실시예에서, 분자 프로브, 표적 서열 및 결찰 생성물의 실제 수는, 일반적으로 각 표적 서열의 다중 카피가 존재할 것이고 샘플이 각 프로브의 복수의 카피와 접촉되기 때문에, 10보다 클 수 있다.
세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물은 그 세트의 개별 신호 특성을 생성할 수 있고, 이는 각 세트의 프로브로부터 누적 신호가 식별되고 별도로 정량화될 수 있도록 상이한 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터 수득된 신호와 상이하다. 예를 들면, 세프 내의 프로브는 그 세트에 일반적이고 각 세트로부터의 프로브가 편리하게 동정되도록 다른 세트의 프로브의 맞춤 서열과 상이한 맞춤 서열을 공유한다. 프로브의 각 세트는 핵산의 종에 특이적인 복수의 표적 서열을 결합시키기 위한 적어도 500, 600, 700, 800, 900 또는 적어도 1,000개의 상이한 프로브를 함유할 수 있다. 예를 들면, 방법은 각각의 염색체 21, 13 및 18에 각각 1000개 상이한 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 각 염색체에 대해 1개 독특한 맞춤 서열로 표지된 각 세트의 3개의 상이한 세트의 프로브를 사용할 수 있다. 경우에 따라, 특이적 대립 유전자 및 또는 유전자 좌를 암호화하는 모티프는 고 다중화로 맞춤 서열에 도입할 수 있다.
샘플 중 둘 이상의 염색체의 상대량은 각각이 하나의 염색체에 특이적인 표적 서열을 인식하는 프로브의 둘 이상의 세트 각각으로부터 이중 결찰 생성물로부터 누적 신호를 검출하고 상이한 누적 신호를 정량화함으로써 측정할 수 있다.
결찰 생성물로부터 신호를 수득하기 위한 편리한 방법은 증폭 조건을 제공하고, 증폭 생성물의 존재에 대해 시험하는 것이다. NASPA, LAMP, T7 증폭, PCR 또는, 결찰 생성물이 원인 경우, 회전 원 복제와 같은 다수의 증폭 접근법이 가능하다. 신호를 수득하는 단계는 결찰 접합부에 걸친 증폭 및 증폭 생성물로부터 신호의 검출(예: PCR에 의해 또는, 프로브의 원형화 구현예의 경우, 회전 원 복제에 의해), 또는 하나의 말단에서 연속 핵산 가닥을 포획하고, 이의 다른 말단에서 검출함을 포함할 수 있다. 신호는 핵산을 위한 임의의 통상적 검출 시스템, 예를 들면, 형광성 표지의 검출, 효소 결합 검출 시스템, 항체 매개된 표지 검출 및 방사성 표지의 검출을 사용하여 증폭되거나 증폭되지 않은 결찰 생성물로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는, 회전 원 증폭 생성물은 표지된 검출 올리고뉴클레오타이드의 RCA 생성물 중의 모티프, 예를 들면, 프로브의 맞춤 서열 중의 모티프로의 혼성화로 검출된다. 결찰 생성물의 양은 샘플에 존재하는 표적 서열의 양에 직접 비례하기 때문에, 정량적 측정은 신뢰가능하게 샘플 중 표적 서열의 양을 나타낸다. 이러한 방법의 주요 이점은 결찰 단계가 대립 유전자 식별을 수득하기 위해 조작될 수 있고, DNA 복제 단계가 등온이고, 증폭 반응이 선형이고 매우 점진적안 효소에 의해 촉매작용되기 때문에 신호가 엄밀히 정량적이다는 것이다. DNA 폴리머라제 반응을 위해 사용된 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 반응 혼합물 중의 세트의 모든 프로브 또는 프로브의 다수의 세트에 대해 동일할 수 있다.
신호 검출의 일례는 포획/표지 기술을 사용한다. 여기서, 결찰 생성물은 결찰 접합부의 한 측면 위에 포획 모이어티를, 결찰 접합부의 다른 측면 위에 표지를 포함하고, 상기 방법은 결찰 생성물을 포획 모이어티를 통해 기질 상에서 포획하고, 기질을 세척하고, 기질 및 포획된 결찰 생성물을 포함하는 포획 분획을 유지시키고, 포획된 분획 중 결찰 생성물 상에서 표지를 검출함으로써 결찰 생성물로부터 신호를 수득함을 포함한다. 이러한 방법은 생성물의 한쪽 말단이 포획되고 나머지가 검출되도록 결찰 생성물이 선형인 경우에 특히 적합하다. 그러나, 상기 방법은 또한 결찰 생성물이 원형인 경우에 이를 선형 생성물로 전환시키기 위해 원을 절단하는 단계를 포함시킴으로써 사용될 수 있다. 신호는 이종성 표지 또는 프로브의 서열, 예를 들면, 맞춤 서열로부터 유도될 수 있다.
형광성 표지는, 예를 들면, 제1 및 제2 세트의 프로브를 상이한 형광성 표지로 표지화함으로써 사용될 수 있다. 따라서, 방법은 샘플 중의 핵산을 프로브의 제1 세트 및 프로브의 제2 세트와 접촉시키고, 제1 및 제2 누적 신호를 검출시킴을 포함하고, 여기서
제1 누적 신호는 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물에 의해 방출된 제1 파장에서의 형광이고,
제2 누적 신호는 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물에 의해 방출된 제2 파장에서의 형광이다.
이러한 구현예의 일부에서, 제1 및 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물의 회전 원 복제의 생성물은 식별가능하게 표지된다.
포획/검출 방법은 별도의 핵산 분자를 포함하는 프로브(예: 별도의 핵산 분자 위의 머리 및 꼬리 서열)와 함께 사용하기에 특히 편리하다. 이어서, 결찰 생성물은 단일 핵산 분자(결찰 생성물) 중의 두 분자의 서열(예: 머리 및 꼬리 서열)을 함유하는 반면, 결찰되지 않은 프로브는 그렇지 않다. 따라서, 신호는 하나의 서열(예: 머리 서열)을 함유하는 핵산 분자를 포획하고, 결찰되지 않은 프로브 핵산을 제거하기 위해 세척한 다음, 포획된 분획 중의 다른 서열(예; 꼬리 서열)의 존재를 검출함으로써 결찰 생성물로부터 수득할 수 있다. 결찰되지 않은 프로브에서 두 서열은 단지 핵산 사이의 혼성화에 의해 연결되고, 세척에 의해 분리되는 반면, 결찰된 프로브가 연속 핵산 가닥 중의 결찰 접합부의 각 측면 위에 두 개의 서열을 함유한다, 즉 공유 결합되기 때문에, 검출은 결찰된 프로브에 대해 특이적이다.
언급된 바와 같이, 프로브는 포획 모이어티를 수반하도록 변형될 수 있다. 포획 모이어티는 비드와 같은 고형 기질에의 부착을 가능하게 할 수 있다. 적합한 포획 모이어티는 스트렙타비딘과 쌍을 이뤄 변형된 프로브 핵산이 스트렙타비딘으로 코팅된 고체 기질 상에서 단리되도록 하는 비오틴이다. 프로브를 샘플과 결합하기 전에 포획 모이어티를 갖는 프로브를 제공하는 것이 편리할 수 있다. 또는, 포획 모이어티는 결찰 단계 후에 도입할 수 있다.
프로브가 머리 또는 꼬리 서열을 함유하는 골격 올리고뉴클레오타이드, 및 각각 꼬리 또는 머리를 함유하는 별도의 핵산(표적화 올리고뉴클레오타이드, 또는 제2 골격 올리고뉴클레오타이드)을 포함하는 경우, 이들 핵산 분자 중의 어느 하나는 포획 모이어티를 수반할 수 있고, 예를 들면, 비오티닐화될 수 있다.
프로브의 하나의 핵산 분자가 포획 모이어티를 수반하는 경우, 나머지는 표지를 수반한다. 핵산 서열 자체는 검출되는 핵산 분자를 동정하는, 예를 들면, 다른 세트의 프로브가 아니라 세트의 모든 프로브에 존재하는 맞춤 서열을 검출하는 표지로서 사용하는 것이 가능하다. 상보적 올리고뉴클레오타이드가 검출용으로 사용될 수 있다. 또는, 핵산은 이종성 표지, 예를 들면, 형광단을 수반할 수 있다. 이종성 표지는 핵산 자체의 일부가 아니다. 사용될 수 있는 다른 표지는 양자점, 생물발광, 티라미드 신호 증폭과 같은 신호 생성 효소 캐스케이드, 및 방사성 모이어티를 포함한다. 방법은, 이어서, 각각 표지의 존재를 검출하고, 예를 들면, 형광을 검출하고, 양자점을 검출하고, 생물발광을 검출하고, 효소에 의해 생성된 신호를 검출하거나 방사성을 검출함을 포함할 수 있다.
일례로서, 결찰 생성물로부터 신호를 수득하는 단계는 프로브의 골격 올리고뉴클레오타이드를 포획 모이어티를 통해 기질 위에서 포획하고, 결찰되지 않은 프로브를 제거하기 위해 기질을 세척하고, 기질 및 포획된 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 포획된 모이어티를 유지시키고, 포획된 분획 중의 이중 결찰 생성물로부터 신호를 수집함을 포함할 수 있다. 이중 결찰 생성물이 표지를 수반하는 경우, 이는 포획된 분획에서 표지를 검출함을 포함할 수 있다.
포획 모이어티는 스트렙타비딘-기질에 대한 친화성을 갖는 비오틴-분자일 수 있다. 다른 적합한 친화성 태그는 히스티딘 함유 서열, 예를 들면, 골격 올리고뉴클레오타이드의 정제용으로 사용될 수 있는 코발트, 니켈, 구리와 같은 고정된 금속 이온에 대한 친화성을 갖는 폴리히스티딘-태그를 포함한다. 따라서, 포획 모이어티는 포획될 서열, 예를 들면, His-태그 서열의 일부일 수 있거나, 이는 핵산 자체의 일부가 아닌 이종성 모이어티일 수 있다.
적합한 고체 기질은 비드, 예를 들면, 자석을 사용하여 포획된 생성물의 농축을 촉진시키기 위한 자기 비드이다. 기질은 포획 모이어티를 위한 결합 부재로 코팅될 수 있고, 예를 들면, 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드를 비오티닐화 프로브와 함께 사용할 수 있다.
정량화
정량화는 샘플 중의 핵산 종의 양을 측정한다. 일부 경우에, 이 양을 측정하고 공지된 대조군과 비교하여 샘플 중의 핵산의 절대량 또는 상대량의 측정을 가능하게 할 수 있다. 다른 경우에, 핵산의 복수 종을 샘플 내에서, 예를 들면, 동시에 프로빙할 수 있다. 이는 핵산의 하나의 종이 참조로서 사용되는 것을 가능하도록 하여 핵산의 상이한 종을 서로에 대해 정량화하고, 예를 들면, 샘플이 염색체 1보다 염색체 21의 복수를 함유한다는 것을 측정한다.
양은 농도 또는 양(예: 몰 또는 질량)으로서 표현할 수 있고, 농도가 샘플의 용적으로 나누어진 핵산의 양인 경우 둘은 교환가능하다.
프로브
프로브의 예 및 이들의 특징은 이미 상기 기재되어 있다. 일부 추가의 특징 및 예는 여기에 기재된다.
프로브 핵산은 바람직하게는 DNA이다. 그러나, 이는 자연 발생적이든 아니든 따른 핵산일 수 있다. DNA의 표준 염기는 A, T, C 및 G이지만, 당해 방법의 프로브 핵산은 임의로 비표준 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법의 방법에 사용하기 위한 프로브는 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 머리 및 꼬리 서열을 포함할 수 있다. 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 일부일 수 있거나, 그들 중 하나 또는 둘 다는 상이한 핵산 분자 위에 존재할 수 있다. 임의로, 프로브는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 머리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드 및 꼬리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 프로브는 결찰되지 않은 형태로 1개, 2개 또는 3개의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 프로브는 정량화되거나 동정되는 핵산의 종으로부터 생성된 정의된 서열의 단편인 표적 서열로 혼성화하기 위한 것이다. 이러한 표적 서열은 표적 단편으로서 칭명될 수 있다.
표적화 올리고뉴클레오타이드는 표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유한다. 머리 및 꼬리 서열은 각각 유리 5' 및 3' 말단을 갖고, 각각 플랭킹 서열의 업스트림 및 다운스트림에 상보적이다. 표적 단편 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정하고, 여기서 표적 단편은 갭 중의 표적 상보적 서열로 혼성화하여 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치한다.
이러한 종류의 프로브는
(i) 핵산의 종이 표적 단편으로 단편화되는 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 표적 단편이 단일 가닥화되는 변성 조건을 제공하는 단계,
(iii) 샘플을 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각 프로브는 검출될 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 표적 서열은 표적 단편의 서열이고, 각 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 5' 및 3' 말단을 각각 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적인, 단계,
(iv) 머리 및 꼬리 서열이 플랭킹 서열로 혼성화하고, 표적 단편이, 존재하는 경우, 프로브의 표적 상보적 서열로 혼성화함으로써 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치하는 어닐링 조건을 제공하는 단계,
(v) 표적 단편이 존재하는 경우, 표적 단편의 3' 말단이 제1 결찰 접합부를 형성하기 위해 머리 서열의 5' 말단에 결찰되고, 표적 단편의 5' 말단이 제2 결찰 접합부를 형성하기 위해 꼬리 서열의 3' 말단에 결찰되어 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 포함하는 이중 결찰 생성물을 생성하도록 하는 결찰 조건을 제공하는 단계, 및
(vi) 모든 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 검출하는 단계로서, 신호의 검출이 샘플에 핵산 종의 존재를 나타내는, 단계를 포함하는 방법으로 핵산의 종을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
핵산의 종은
(i) 핵산의 종이 표적 단편으로 단편화되는 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 표적 단편이 단일 가닥화되는 변성 조건을 제공하는 단계,
(iii) 샘플을 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각 프로브는 정량화될 핵산 종의 상이한 표적 단편을 특이적으로 인식하고, 각 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 5' 및 3' 말단을 각각 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적인, 단계,
(iv) 머리 및 꼬리 서열이 플랭킹 서열로 혼성화하고, 표적 단편이, 존재하는 경우, 프로브의 표적 상보적 서열로 혼성화함으로써 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치하는 어닐링 조건을 제공하는 단계,
(v) 표적 단편이 존재하는 경우, 표적 단편의 3' 말단이 제1 결찰 접합부를 형성하기 위해 머리 서열의 5' 말단에 결찰되고, 표적 단편의 5' 말단이 제2 결찰 접합부를 형성하기 위해 꼬리 서열의 3' 말단에 결찰되어 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 포함하는 이중 결찰 생성물을 생성하도록 하는 결찰 조건을 제공하는 단계,
(vi) 모든 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 검출하는 단계, 및
(vii) 신호 수준을 측정하기 위해 누적 신호를 정량화하고, 여기서 신호 수준은 샘플 중 핵산 종의 양에 비례하고, 이에 의해 샘플 중 핵산 종의 양을 검출하는 단계를 포함하는 방법으로 정량화된다.
상기 방법은 샘플 중 핵산의 제2 종에 대해 핵산의 제1 종을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 방법은
(i) 핵산의 제1 및 제2 종이 표적 단편으로 단편화되는 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 표적 단편이 단일 가닥화되는 변성 조건을 제공하는 단계,
(iii) 샘플을 프로브의 제1 세트 및 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로서, 제1 세트의 프로브는 핵산의 제1 종의 상이한 표적 단편을 특이적으로 인식하고, 제2 세트의 프로브는 핵산의 제2 종의 상이한 표적 단편을 특이적으로 인식하고, 여기서 각 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 5' 및 3' 말단을 각각 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적인, 단계,
(iv) 머리 및 꼬리 서열이 플랭킹 서열로 혼성화하고, 표적 단편이, 존재하는 경우, 프로브의 표적 상보적 서열로 혼성화함으로써 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치하는 어닐링 조건을 제공하는 단계,
(v) 표적 단편이 존재하는 경우, 표적 단편의 3' 말단이 제1 결찰 접합부를 형성하기 위해 머리 서열의 5' 말단에 결찰되고, 표적 단편의 5' 말단이 제2 결찰 접합부를 형성하기 위해 꼬리 서열의 3' 말단에 결찰되어 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 포함하는 이중 결찰 생성물을 생성하도록 하는 결찰 조건을 제공하는 단계,
(vi) 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제1 누적 신호를 검출하고, 제1 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 상기 제1 신호 수준은 샘플 중 핵산의 제1 종의 양에 비례하는, 단계,
(vii) 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제2 누적 신호를 검출하고, 제2 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 상기 제2 신호 수준은 샘플 중 핵산의 제2 종의 양에 비례하는, 단계, 및
(viii) 제1 및 제2 신호 수준을 비교함으로써 샘플 중 제2 및 제2 핵산 종의 상대량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
프로브는 갭 중 표적 단편의 혼성화가 핵산의 원을 완성하도록 설계될 수 있고, 상기 원은 표적 단편 및 머리 및 꼬리 서열을 포함한다.
프로브의 머리 및/또는 꼬리 서열은 바람직하게는 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은 맞춤 서열에 결합된다.
프로브의 일부 구현예에서, 단일 핵산 분자는 머리 및 꼬리 서열을 포함한다.
머리 및 꼬리 서열은 그들이 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하도록 표적화 올리고뉴클레오타이드로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 머리 및 꼬리 서열은 골격 올리고뉴클레오타이드의 각각 5' 말단 및 3' 말단에 존재할 수 있다. 맞춤 서열은 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 및 꼬리 서열 사이에 포함될 수 있다. 이러한 프로브의 예는 도 3에 도시된다. 또는, 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 및 꼬리 서열은 매개 뉴클레오타이드 서열 없이 인접할 수 있다. 이러한 경우에, 표적화 올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열은 골격 올리고뉴클레오타이드의 전장에 따라 혼성화하고, 이를 원형화할 수 있다.
프로브는, 갭 중의 표적 단편의 혼성화가 표적 단편, 머리 및 꼬리 서열, 표적 상보적 서열 및 플랭킹 서열을 포함하는 핵산의 가닥을 완성하도록 머리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단이고/이거나 꼬리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단이도록 설계될 수 있다. 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 말단에 존재하고 플랭킹 서열에 시스로 결합할 수 있다. 이러한 프로브의 예는 도 4에 도시된다. 프로브의 이러한 버전에서, 머리 및 꼬리 서열 및 표적 상보적 서열은 모두 표적 단편과 함께 원형화된다. 맞춤 서열은 올리고뉴클레오타이드의 루프에 배치될 수 있다. 프로브 핵산은 비교적 길지만, 미리 조립되고 상이한 프로브 핵산 분자의 혼성화를 필요로 하지 않는 한 분자로 올리고뉴클레오타이드 구조를 결합하는 이점을 갖는다.
프로브는 또한 표적화 올리고뉴클레오타이드로부터 핵산의 개별 분자인 골격 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 설계될 수 있다. 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단일 수 있고, 머리 서열은 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단이다. 또는, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단일 수 있고, 꼬리 서열은 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단일 수 있다. 맞춤 서열은, 예를 들면, 머리 또는 꼬리 서열과 플랭킹 서열 사이에 루프를 제공하기 위해 표적화 올리고뉴클레오타이드에 도입할 수 있다. 이러한 프로브 접근법을 사용하는 이점은 검출 서열이 루프에 도입될 수 있고, 다중 방법, 특히 고-플렉스 검출 방식에 의한 높은 다중화에 유리할 수 있는 표적 상보적 서열과 관련된다는 것이다. 골격 올리고뉴클레오타이드는 맞춤 서열을 추가로 포함할 수 있다. 두 올리고뉴클레오타이드에 프로브를 제공함으로써, 프로브 핵산 분자는 단일 올리고뉴클레오타이드 버전보다 더 짧지만, 동일한 기능을 유지한다.
프로브의 다른 설계는 두 골격 올리고뉴클레오타이드에 머리 및 꼬리 서열을 제공한다. 따라서, 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴크렐오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드,
유리 5' 말단을 갖는 머리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 3' 말단을 갖는 꼬리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
여기서, 상기 머리 및 꼬리 올리고뉴클레오타이드 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이다.
하나의 골격 올리고뉴클레오타이드는 다른 골격 올리고뉴클레오타이드가 검출용으로 사용되고 이종성 표지를 수반할 수 있는 경우에 포획 모이어티를 수반할 수 있다. 하나 또는 두 개의 골격 올리고뉴클레오타이드는 추가로 맞춤 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적화 올리고뉴클레오타이드는 맞춤 서열을 포함할 수 있다.
표적 단편 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정하고, 여기서 표적 단편은 갭 중 표적 상보적 서열로 혼성화하여 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치한다. 갭 중 표적 단편의 혼성화는 표적 단편과 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 핵산의 가닥을 완성한다. 가닥은 포획 모이어티 및 표지를 수반하여 본원의 다른 곳에서 기재된 포획/검출 방법을 사용하여 검출을 가능하게 한다.
디지털 핵형 분석 및 비침습성 산전 진단
본 발명의 방법의 일부 실시는 표적 DNA의 정확한 정량화가 추구하는 분야에 특별한 이점을 제공한다. 이는 다수의 핵산 기초 진단 기술을 포함한다. 하나의 이러한 영역은 환자의 샘플학적 샘플(예: 혈액)에서 암 DNA의 분석이다. 다른 이러한 영역은 무세포 DNA 분석에 의한 비침습성 산전 진단(NIPT)이다.
NIPT가 갖는 문제는 다수의 특이적 게놈 단편이 염색체 이수성을 진단하기 위해 필요한 통계적 신뢰성을 달성하기 위해 계수되어야 한다는 것이다. 태아 DNA가 임신 여성의 혈류 중 유전 물질의 4 내지 30%를 구성하는 모계 DNA와 혼합되기 때문에, 태아 DNA에서 염색체 이수성을 관찰하는 것은 매우 정확한 측정을 필요로 한다.
본 발명의 방법은 모계 혈액 샘플 중 유리 원형 태아 DNA를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 염색체의 상이한 단편에 지시된 복수의 프로브 및 제2 염색체의 상이한 단편에 지시된 복수의 프로브를 사용함으로써, 방법은 샘플 중 두 염색체의 상대수의 불균형이 높은 신뢰도로 측정되도록 한다. 이는 3염색체성과 같은 염색체 이수성이 심지어 모계 DNA의 높은 배경에 대해 태아 DNA로부터 진단되도록 한다.
본 발명의 방법은, 예를 들면, 3염색체성과 같은 염색체 이상의 진단을 위한 태아 핵산을 검출하기 위해 임신 여성으로부터 모계 혈액 샘플을 시험하고, 진단용 종양 DNA를 위한 환자 샘플을 시험하거나 환자에서 종양의 존재를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 다른 용도는 미생물 핵산의 존재를 위한 물질의 시험 샘플을 포함하고, 여기서 미생물 핵산의 검출은 세균, 바이러스 또는 진균과 같은 감염성 제제일 수 있는 미생물에 의한 물질의 감염을 나타낸다. 샘플은 환자의 조직 또는 혈액 샘플일 수 있다.
보다 일반적으로, 수백 또는 수천 개의 상이한 프로브를 사용함으로써, 본 발명의 방법의 일부 실행은 수백 또는 수천 개의 특이적 핵산 단편을 검출하여 도높은 정밀도를 달성하여 진단 적용 범위에 걸쳐 이점을 제공할 수 있다. 특정 질환과 관련되는 염색체 또는 염색체 좌로부터 다수의 DNA 단편의 검출은 심지어 샘플 중 약간의 차이가 확실하게 검출될 수 있도록 그 염색체 또는 유전자 좌의 양이 대조 염색체 또는 유전자 좌에 대해 측정되도록 할 수 있다.
짧은 표적 단편을 분석함으로써 모계 혈액 중 매우 단편화된 무세포 DNA의 큰 비율은 고효율로 분석될 수 있다. 이는 매우 작은 양의 무세포 DNA가 모계 혈액에 이용가능하기 때문에 중요하다.
개체로부터 수득된 핵산 샘플 중 제2 염색체 또는 염색체 좌에 대해 제1 염색체 또는 염색체 좌를 정량화하는 방법은
샘플을 프로브의 제1 세트 및 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 세트의 프로브는 각각 제1 염색체 또는 염색체 좌 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 상기 제2 세트의 프로브는 각각 제2 염색체 또는 염색체 좌 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
상기 제1 및 제2 염색체 또는 염색체 좌 중 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계,
상기 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제1 누적 신호를 검출하고, 제1 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제1 신호 수준은 샘플 중의 제1 염색체 또는 염색체 좌의 양에 비례하는, 단계,
상기 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제2 누적 신호를 검출하고, 제2 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제2 신호 수준은 샘플 중의 제2 염색체 또는 염색체 좌의 양에 비례하는, 단계, 및
상기 제1 및 제2 신호 수준을 비교하여 샘플 중의 제1 및 제2 염색체 또는 제1 및 제2 염색체 좌의 상대량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 태아의 이수성(예: 3염색체성)을 진단하기 위해 사용될 수 있고, 핵산 샘플은 모계 혈액으로부터 수득된 샘플이고 모계 DNA와 혼합된 무세포 태아 DNA를 함유하고, 제1 및 제2 신호 수준의 불균등 비율은 이수성(예: 3염색체성)의 지표이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 국면을 입증하고 추가로 예시하기 위해 제공되고, 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
이 실시예는 본 발명의 방법을 사용하여 모계 혈액 중 유리 원형 태아 DNA의 검출 및 정량화를 예시한다.
혈액 샘플은 임신중인 모친으로부터 수집하고, 유리 원형 DNA는 혈장으로부터 추출한다. 이어서, DNA를 분석 및 정량화에 제공된 염색체로부터 기원하는 DNA 단편과 특이적으로 반응하는 표적화된 특이적 DNA 프로브와 반응시킨다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 표적화하고, 염색체 21 및 참조 염색체로부터 특이적 단편과 반응시키기 위해 소위 "로터스 프로브"의 사용을 예시한다. 그러나, 특이적 DNA 단편을 표적화하는 다른 프로브 기반 기술, 예를 들면, 자물쇠 프로브/분자 반전 프로브(MIP), 선택기 프로브, 올리고뉴클레오타이드 결찰 프로브를 대신 사용할 수 있었다.
두 염색체 각각으로부터 복수의 단편을 표적화하는 로터스 프로브가 제공된다. 표적 인식시, 프로브는 형광으로 표지된 하나의 말단과 비오틴으로 표지된 다른 말단을 갖는, 이들의 상응하는 단편과 결찰 생성물을 생성한다. 결찰 생성물은 각각 표적화될 개별 염색체를 나타내는 두 개의 상이한 형광단으로 표지된다. 프로토콜은 다음과 같이 예시될 수 있다:
1) 10ng의 DNA는 상응하는 적합한 제한 효소 완충제에서 제한 효소 1단위로 소화시킨다. 반응물은 1시간 동안 37C에서 배양한 다음, 80℃에서 20분 동안 효소 불활성화한다.
2) DNA 단편은 95℃에서 10분 동안 단일 가닥 단편으로 변성시키고 선형 결찰 생성물을 형성하기 위해 프로브 및 리가제와 혼합한다. 프로브 풀을 1U의 암플리가제(에피센트르)와 함께 10pM 개별 농도로 첨가하고, 리가제 완충제에서 55℃에서 1시간 동안 배양한다.
3) 결찰 생성물은 자기 스트렙타비딘 비드 상에서 포획한다. 비반응된 프로브 및 단편을 제거하기 위해, 용액은 최종 용적 200ml로 트리스-HCl (pH 7.5), 3.5mM EDTA 및 0.07% 트윈-20 중 10ml M-280 스트렙타비딘 코팅된 자기 비드(인비트로겐)와 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양한다. 배양 후, 비드를 환 자석을 사용하여 수집하고, 상청액을 제거한다.
4) 잔류하는 비드 결합 프로브를 검출하고 정량화한다. 총 형광 강도는 두 개의 표지 각각에 대해 측정하고, 상대적 강도를 두 색상 사이에서 측정한다.
5) 산전 진단의 경우, 최종 결과는 형광의 상대량에 기초한다. 단순화된 예; 모계 혈액 중 1000 게놈 등가물 및 10%의 모든 유리 원형 DNA가 태아로부터 유도되고, 총 형광을 생성하기 위해 1000 염색체 21 표적화 프로브가 사용되는 경우, 정상 샘플이 1,000,000 형광단의 신호를 생성하는 것은 3염색체성 21 태아가 1,050,000 형광단에 상응하는 신호는 생성하는 것과 함께 샘플로서였다. 또한, 1000 프로브가 이수성에 적용되지 않은 표적화 "정상화" 영역이고, 제2 형광단으로 표지되는 경우 높은 통계적 정밀도를 달성하기 위해, 상대량을 측정할 수 있다.
실시예 2
다음 실시예에서, 로투스 프로브가 두 염색체 각각으로부터 복수의 단편을 표적화한다. 표적 인식 후, 프로브가 이들의 상응하는 단편과 원형화 결찰 생성물을 생성한다. 원형화 결찰 생성물은 후속적 표지화용으로 사용될 수 있는 두 서열 모티프 중 어느 하나를 함유하고, 각 서열 모티프는 표적화될 두 염색체 중 어느 하나에 상응한다. 프로토콜은 다음과 같이 예시될 수 있다:
1) 10ng의 DNA는 상응하는 적합한 제한 효소 완충제에서 제한 효소 1단위로 소화시킨다. 반응물은 1시간 동안 37C에서 배양한 다음, 80℃에서 20분 동안 효소 불활성화한다.
2) DNA 단편은 95℃에서 10분 동안 단일 가닥 단편으로 변성시키고 원을 형성하기 위해 프로브 및 리가제와 혼합한다. 프로브 풀을 1U의 암플리가제(에피센트르)와 함께 10pM 개별 농도로 첨가하고, 리가제 완충제에서 55℃에서 1시간 동안 배양한다.
3) 1U 엑소뉴클레아제를 비반응 프로브 및 단편을 제거하기 위해 첨가한다. 1U의 람다 엑소뉴클레아제(에피센트르)를 상응하는 엑소뉴클레아제에서 37℃에서 1시간 동안 첨가한 다음, 80℃에서 20분 동안 효소 불활성화한다.
4) 잔류하는 원은 회전 원 증폭, RCA에 의해 카피한다. 1U의 phi29 폴리머라제(New England Biolabs)는 37℃에서 1시간 동안 상응하는 phi29 완충제 및 뉴클레오타이드(dNTP)에 첨가한다. 각각 두 개의 상이한 형광단 중의 어느 하나로 표지된, RCA-생성물에 상보적인 프로브를 RCA-혼합물에 첨가한다. 생성되는 표지된 RCA-생성물은 개별적으로 계수하고, RCA-생성물의 상대수는 두 색상 사이에서 측정된다.
5) 산전 진단의 경우, 최종 결과는 형광의 상대량를 기준으로 한다. 단순화된 예: 모계 혈액 중 1000 게놈 등가물 및 10%의 모든 유리 원형 DNA가 태아로부터 유도되고, 총 형광을 생성하기 위해 1000 염색체 21 표적화 프로브가 사용되는 경우, 정상 샘플이 1,000,000 형광단의 신호를 생성하는 것은 3염색체성 21 태아가 1,050,000 형광단에 상응하는 신호는 생성하는 것과 함께 샘플로서였다. 또한, 1000 프로브가 이수성에 적용되지 않은 표적화 "정상화" 영역이고, 제2 형광단으로 표지되는 경우 높은 통계적 정밀도를 달성하기 위해, 상대량을 측정할 수 있다.
실시예 3
재료 및 방법
샘플 제조: 10ml 혈액은 각 대상체로부터 무세포 DNA 튜브(Streck, Omaha, NE)로 수집했다. 혈장은 이중 원심분리 프로토콜(10분 동안 1600g, 이어서 10분 동안 16000g, 제1 스핀 후 튜브 전송 후)에 의해 혈액으로부터 단리시켰다. cfDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라서 퀴아젠(Qiagen) ccf 핵산 키트(Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 단리시켰다. 생성되는 DNA는 50ul의 완충제(퀴아젠 키트의 일부)에서 용출시켰다.
프로브 및 골격 설계: 본원에 기재된 다중 프로브 기술은 수천 염색체 단편의 특이적 및 동시 증폭을 가능하게 한다. 프로브는 염색체 21, 18 및 13 각각으로부터 2500 내지 5000 단편(표적)을 포획하기 위해 설계했다. 표적은 게놈에 독특한 서열, 표적 서열에 공지된 다형성도 CNV도 포함하지 않고 균일한 AT/GC 조성 및 18 내지 35bp 사이의 크기를 갖도록 선택했다. 각 염색체 13 및 18로부터 2500 단편을 표적화하는 프로브는 단일 올리고 프로브 풀을 생성하기 위해 염색체 21로부터 5000 프로브 표적화 단편과 함께 풀링했다.
프로브의 예시적 서열, "N"은 표적 상보적 서열을 나타낸다: ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTGCCTTGTCATTCGGGAGCACTAACTGCTG (서열번호 1)
프로브의 말단에 상보적인 머리 및 꼬리 서열을 갖는 골격은 서열분석 및 디지털 계수 둘 다를 위한 서열 모티프를 포함하도록 설계되었다. 두 개의 골격은 결과 섹션에서 설명하는 실험에 사용했다: 염색체 13 및 18을 표적화하는 프로브에 상보적인 하나: (/5Phos/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGTCGGACAGGTGGCTCCACTAAATAGACGCA); 서열번호 2, 및 염색체 21을 표적화하는 하나의 골격: (/5Phos/GGCCTAACTCAACAGACGGAAGGGTCACATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGCAGTTAGTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA; 서열번호 3).
생화학 프로브 프로토콜 : 50ul의 정제 cfDNA는 총 용적 55ul로 1x NEB4 완충제(New England Biolabs) 및 1x BSA에서 5U의 MseI(New England Biolabs)로 37C에서 30분 동안, 이어서 65C에서 20분 동안 열 불활성화에 의해 소화시켰다. 이어서, 소화된 DNA를 프로브 및 골격과 함께 결찰 혼합물과 혼합시켰다. 55ul의 소화된 DNA를 총 용적 70ul로 프로브(1pM/프로브), 골격(각각 60nM), 1x 결찰 완충제(에피센트르), 100U의 암플리가제(에피센트르), 1mM NAD 및 5mM Mg2+와 혼합했다. 소화된 단편은 먼저 95C에서 5분 동안에 이어, 16시간 동안 55C 혼성화 및 결찰에 의해 단일 가닥 DNA로 변성시켰다. 이어서, 결찰 혼합물을 임의의 잔류하는 선형 DNA 분자를 제거하기 위해 엑소뉴클레아제로 처리했다. 결찰 생성물은 37℃에서 60분 동안 총 용적 75ul로 20U의 ExoI(NEB) 및 5U의 ExoIII(NEB) 및 1x BSA와 혼합한 후, 65C에서 10분 동안 열 불활성화시켰다.
분석 : 서열 분석을 위해, 엑소 처리된 원은 일루미나 서열분석 기기에 상보적 서열분석 프라이머로 증폭시키고, 이어서 제조업자 프로토콜에 따라 일루미나 Miseq 기기에 부하했다.
디지털 분석을 위해, 엑소 처리된 반응물을 원의 연쇄체 카피의 개별 DNA 물체를 생성하기 위해 회전 원 증폭 반응(RCA)에 적용했다. 37,5ul의 엑소 처리된 원을 총 용적 50ul로 4mM DTT, 3U의 phi29 폴리머라제(NEB), 0,1uM 프라이머, 1mM dNTP 혼합물(NEB) 및 1x BSA와 혼합하고, 37C에서 1시간 동안, 이어서 65C에서 10분 동안 열 불활성화에 의해 배양했다. 이어서, RCA 반응물은 골격 서열에 상보적인 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드로 표지했다. 50ul의 RCA 생성물을 총 용적 100ul로 0,1% 트윈 20(시그마), 5nM 표지된 올리고뉴클레오타이드, 및 2x SSC(Sigma)와 혼합했다. 표지된 RCA 생성물은 최종적으로 폴리-리신(시그마)로 코팅된 현미경 슬라이드 위에 부착시키고, 형광 현미경으로 계수했다.
결과
본원에 기재된 프로브 방법은 일루미나 서열분석 및 디지털 계수 시스템 상에서 입증했다. 프로브 방법의 성능을 입증하기 위해, 3염색체성 21을 갖는 DNA 샘플을 상이한 농도로 정상 혈장 샘플(3 내지 5ml 혈장)으로부터 추출된 DNA와 혼합했다. 이어서, 샘플을 프로브 방법을 통해 수반하고, 서열분석으로 평가했다.
도 8에 도시된 결과를 위해, 100ng의 세포주 DNA를 상기한 프로토콜에 적용했다. 10,000 프로브를 염색체 13, 18 및 21로부터 10,000개 상응하는 염색체 단편을 특이적으로 원형화하기 위해 풀에서 혼합했다. 이어서, 10,000개의 생성되는 원을 일루미나-상응하는 PCR 프라이머로 증폭시키고, 서열분석 전에 겔 상에서 분석했다. 레인 1은 DNA 래더에, 레인 2는 소화 후 DNA 샘플에, 레인 3은 10,000 증폭된 단편을 갖는 PCR 생성물에 상응한다.
도 9에 도시된 결과를 위해, 12개의 정상 혈장 샘플은 상이한 농도로 3염색체성 21을 갖는 DNA를 수반하는 샘플과 병행하여 분석했다. DNA를 추출하고, 10K-플렉스 프로브 프로토콜을 통해 처리하고, 최종적으로 일루미나 서열분석기 상에서 서열분석했다. 99% 특이성을 제공하는 신뢰 구간을 사용하여, 양성 샘플은 추산된 정상 분포에 기초하여 90% 감도로 검출한다.
추가 기술
하기 조항은 본 발명의 양태를 나타내고, 본 기술의 일부이다.
1. 샘플 중의 핵산 종을 검출하는 방법으로서,
상기 샘플을 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각 프로브가 검출될 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 인식하는, 단계,
핵산 종 중의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계, 및
모든 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 검출시키는 단계를 포함하고, 여기서
상기 신호의 검출이 샘플 중의 핵산 종의 존재를 나타내는, 방법.
2. 샘플 중의 핵산 종을 정량화하는 방법으로서,
상기 샘플을 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 각 프로브가 정량화될 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
핵산 종 중의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계, 및
모든 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 검출시키는 단계를 포함하고, 여기서
신호 수준을 측정하기 위해 누적 신호를 정량화하는 단계로서, 상기 신호 수준이 샘플 중의 핵산 종의 양에 비례하는, 단계 및
이에 의해, 샘플 중의 핵산 종의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
3. 샘플 중의 제2 핵산 종에 대한 제1 핵산 종을 정량화하는 방법으로서,
샘플을 제1 세트의 프로브 및 제2 세트의 프로브와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트의 프로브는 각각 제1 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 상기 제2 세트의 프로브는 각각 제2 핵산 종 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
제1 및 제2 핵산 종 내의 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 각 결찰 생성물이 결찰 접합부를 포함하는 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계,
제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제1 누적 신호를 검출하고, 제1 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제1 신호 수준은 샘플 중의 제1 핵산 종의 양에 비례하는, 단계,
제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제2 누적 신호를 검출하고, 제2 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제2 신호 수준은 샘플 중의 제2 핵산 종의 양에 비례하는, 단계, 및
상기 제1 및 제2 신호 수준을 비교하고, 이에 의해 샘플 중의 제1 및 제2 핵산 종의 상대량을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
4. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 서열이 비중첩성인, 방법.
5. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브의 세트가 각각 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는 적어도 10개 프로브를 포함하는, 방법.
6. 조항 5에 있어서, 상기 프로브의 세트가 각각 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는 적어도 100개 프로브를 포함하는, 방법.
7. 조항 6에 있어서, 상기 프로브의 세트가 각각 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는 적어도 1,000개 프로브를 포함하는, 방법.
8. 조항 7에 있어서, 상기 프로브의 세트가 각각 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는 적어도 10,000개 프로브를 포함하는, 방법.
9. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 결찰 생성물을 증폭시키는 단계, 및 증폭된 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 조항 9에 있어서, 상기 증폭은 클로날 증폭인, 방법.
11. 조항 9 또는 10에 있어서, 상기 결찰 접합부에 걸쳐 상기 결찰 생성물을 증폭하는 단계를 포함하는, 방법.
12. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 결찰 생성물이 각각 제1 및 제2 결찰 접합부를 포함하는 이중 결찰의 생성물인, 방법.
13. 조항 12에 있어서, 상기 제1 및 제2 결찰 접합부에 걸쳐 상기 결찰 생성물을 증폭하는 단계를 포함하는, 방법.
14. 조항 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 결찰 생성물을 증폭시키는 단계 없이 상기 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 누적 신호를 수득하는 단계를 포함하는, 방법.
15. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결찰 생성물이 핵산의 원인, 방법.
16. 조항 15에 있어서, 핵산의 원의 회전 원 복제를 위한 조건을 제공하는 단계 및 상기 회전 원 복제의 생성물을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
17. 조항 16에 있어서, 상기 회전 원 복제가 과분지된 회전 원 복제인, 방법.
18. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결찰 생성물이 선형 핵산인, 방법.
19. 조항 18에 있어서, 결찰 생성물은 결찰 접합부의 한 측면 위에 포획 모이어티를, 결찰 접합부의 다른 측면 위에 표지를 포함하고, 상기 방법은 결찰 생성물을 포획 모이어티를 통해 기질 상에서 포획하고, 기질을 세척하고, 기질 및 포획된 결찰 생성물을 포함하는 포획 분획을 유지시키고, 포획된 분획 중 결찰 생성물 상에서 표지를 검출함으로써 결찰 생성물로부터 신호를 수득함을 포함하는, 방법.
20. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 신호가 형광인, 방법.
21. 조항 20에 있어서, 샘플 중의 핵산을 프로브의 제1 세트 및 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계, 및 제1 및 제2 누적 신호를 검출시키는 단계를 포함하고,
제1 누적 신호는 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물에 의해 방출된 제1 파장에서의 형광이고,
제2 누적 신호는 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물에 의해 방출된 제2 파장에서의 형광이다.
22. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 결찰 생성물을 생성하기 위해 결찰되는, 방법.
23. 조항 22에 있어서, 상기 프로브 및 상기 표적 서열이 결찰 생성물을 생성하기 위해 결찰되는, 방법.
24. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 결찰 생성물이 상기 표적 서열을 포함하는 핵산의 원인, 방법.
25. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산의 종이 단편화된, 방법.
26. 조항 25에 있어서, 상기 표적 서열이 핵산 종의 단편의 서열인, 방법.
27. 조항 25 또는 26에 있어서, 상기 샘플이 핵산의 제한 효소 소화이고, 상기 표적 서열이 제한 단편인, 방법.
28. 조항 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 상기 표적 서열의 각 말단에 결찰되는, 방법.
29. 조항 28에 있어서, 상기 프로브가 각각 하기를 포함하고:
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 표적 서열 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 5' 및 3' 말단을 각각 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 프로브 (여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이다), 여기서
어닐링 및 결찰을 위한 조건하에, 머리 및 꼬리 서열이 플랭킹 서열로 혼성화하고, 표적 단편이, 존재할 경우, 표적 상보적 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 표적 단편의 말단을 배치하고, 표적 단편의 3' 말단은 제1 결찰 접합부를 형성하기 위해 머리 서열의 5' 말단에 결찰시키고, 표적 단편의 5' 말단은 제2 결찰 접합부를 형성하기 위해 꼬리 서열의 3' 말단에 결찰시켜 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥을 포함하는 이중 결찰 생성물을 생성하는, 방법.
30. 조항 29에 있어서, 상기 단편화된 핵산의 샘플이 핵산의 제한 효소 소화이고, 상기 표적 서열이 제한 단편인, 방법.
31. 조항 28 또는 29에 있어서, 이중 결찰 생성물을 검출하는 단계가 핵산의 연속 가닥의 제1 및 제2 결찰 접합부에 걸친 증폭 및 증폭 생성물이 존재하는지 여부를 검출하기 위한 조건을 제공하는 것을 포함하는, 방법.
32. 조항 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥이 핵산의 원인, 방법.
33. 조항 32에 있어서, 이중 결찰 생성물을 검출하는 단계가 회전 원 복제 및 증폭 생성물이 존재하는지 여부를 검출하기 위한 조건을 제공하는 것을 포함하는, 방법.
34. 조항 33에 있어서, 상기 회전 원 복제가 과분지된 회전 원 복제인, 방법.
35. 조항 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브는 핵산 분자 상의 머리 및 꼬리 서열을 포함하는, 방법.
36. 조항 35에 있어서, 상기 프로브는 각각 이의 5' 말단 3' 말단에 머리 및 꼬리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 및 꼬리 서열은 어닐링 조건하에 표적화 올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하는, 방법.
37. 조항 36에 있어서, 골격 올리고뉴클레오타이드는 머리 및 꼬리 서열 사이의 맞춤 서열을 포함하고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 방법.
38. 조항 36에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드는 머리 및 꼬리 서열은 인접한, 방법.
39. 조항 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 말단에 존재하고, 어닐링 조건하에 플랭킹 서열에 시스로 결합하는, 방법.
40. 조항 39에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드는 상기 표적 올리고뉴클레오타이드 및 머리 및/또는 꼬리 서열 사이의 맞춤 서열을 포함하고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 방법.
41. 조항 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 꼬리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단이고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 머리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
어닐링 조건하에, 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하는, 방법.
42. 조항 41에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드는 역전된 반복 서열의 쌍을 포함하고,
어닐링 조건하에 상기 역전된 반복 서열의 쌍은 헤어핀 구조를 형성함으로써 표적화 올리고뉴클레타이드의 5' 말단과 병렬로 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단을 배치하는 역전된 반복 서열의 쌍을 포함하고,
결찰을 위한 조건 하에 표적 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단은 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 결찰되고, 이로써 이중 결찰의 생성물이 표적화 올리고뉴클레오타이드, 표적 단편 및 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산의 원이 되는, 방법.
43. 조항 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 꼬리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단이고, 상기 프로브는 이의 3' 말단에 머리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
어닐링 조건하에, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하는, 방법.
44. 조항 43에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드는 역전된 반복 서열의 쌍을 포함하고,
어닐링 조건하에 상기 역전된 반복 서열의 쌍은 헤어핀 구조를 형성함으로써 표적화 올리고뉴클레타이드의 3' 말단과 병렬로 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단을 배치하는 역전된 반복 서열의 쌍을 포함하고,
결찰을 위한 조건 하에 표적 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단은 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 결찰되고, 이로써 이중 결찰의 생성물이 표적화 올리고뉴클레오타이드, 표적 단편 및 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산의 원이 되는, 방법.
45. 조항 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드는 역전된 반복 서열 사이에 맞춤 서열을 포함하여, 이로써 어닐링 조건하에 골격 올리고뉴클레오타이드가 헤어핀 루프를 형성하는, 방법.
46. 조항 29 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 머리 및 꼬리 서열 및 표적 단편을 포함하는 핵산의 연속 가닥이 핵산의 선형 가닥인, 방법.
47. 조항 46에 있어서, 상기 꼬리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단이고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 머리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
어닐링 조건하에, 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하는, 방법.
48. 조항 41, 42 또는 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 올리고뉴클레오타이드는 어닐링 조건하에 표적화 올리고뉴클레오타이드가 헤어핀 루프를 형성하도록 다운스트림 플랭킹 서열과 꼬리 서열 사이에 맞춤 서열을 포함하는, 방법.
49. 조항 46에 있어서, 상기 머리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단이고, 상기 프로브는 이의 3' 말단에 꼬리 서열을 갖는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
어닐링 조건하에, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 플랭킹 서열에 시스로 결합하고, 골격 올리고뉴클레오타이드의 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 다운스트림 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하는, 방법.
50. 조항 43, 44 또는 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 올리고뉴클레오타이드는 어닐링 조건하에 표적화 올리고뉴클레오타이드가 헤어핀 루프를 형성하도록 업스트림 플랭킹 서열과 머리 서열 사이에 맞춤 서열을 포함하는, 방법.
51. 조항 41 내지 45 또는 47 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드가 포획 모이어티를 수반하는, 방법.
52. 조항 46에 있어서, 상기 프로브는 유리 5' 말단을 갖는 머리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드 및 유리 3' 말단을 갖는 꼬리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하는, 방법.
53. 조항 52에 있어서, 골격 올리고뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다는 맞춤 서열을 추가로 포함하고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 방법.
54. 조항 52 또는 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드가 포획 모이어티를 수반하는, 방법.
55. 조항 54에 있어서, 상기 기타 골격 올리고뉴클레오타이드가 이종성 표지를 수반하는, 방법.
56. 조항 55에 있어서, 상기 표지는 형광단인, 방법.
57. 조항 51 또는 54 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 이중 결찰 생성물이 존재하는지 여부를 검출하는 단계는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포획 모이어티를 통해 기질 위에서 포획하는 단계, 결찰되지 않은 프로브를 제거하기 위해 기질을 세척하는 단계, 기질 및 포획된 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 포획된 모이어티를 유지시키는 단계, 포획된 분획 중의 이중 결찰 생성물의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함하는, 방법.
58. 조항 55 또는 56에 있어서, 이중 결찰 생성물이 존재하는지 여부를 검출하는 단계는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포획 모이어티를 통해 기질 위에서 포획하는 단계, 결찰되지 않은 프로브를 제거하기 위해 기질을 세척하는 단계, 기질 및 포획된 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 포획된 모이어티를 유지시키는 단계, 포획된 분획 중의 이중 결찰 생성물의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함하는, 방법.
59. 조항 51 또는 54 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 포획 모이어티가 비오틴인, 방법.
60. 조항 29 또는 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적-상보적 서열이 10 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, 방법.
61. 조항 29 또는 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적-상보적 서열이 표적 단편과 5 염기쌍 미만의 불일치를 갖는, 방법.
62. 조항 61에 있어서, 상기 표적-상보적 서열이 표적 단편의 완전한 상보체인, 방법.
63. 조항 29 또는 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 플랭킹 서열이 각각 10 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, 방법.
64. 조항 29 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열이 서로 상이한, 방법.
65. 조항 29 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 머리 서열은 업스트림 플랭킹 서열과 5개 미만의 염기 쌍 불일치를 갖고, 상기 꼬리 서열은 다운스트림 플랭킹 서열과 5개 미만의 염기 쌍 불일치를 갖는, 방법.
66. 조항 65에 있어서, 상기 머리 서열은 업스트림 플랭킹 서열의 완전 상보체이고, 상기 꼬리 서열은 다운스트림 플랭킹 서열의 완전 상보체인, 방법.
67. 조항 29 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드가 선형인, 방법.
68. 조항 29 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 단편화된 인간 염색체의 샘플인, 방법.
69. 조항 68에 있어서, 상기 핵산의 종은 염색체이고, 상기 표적 서열은 상기 염색체에 특이적인 인간 게놈 단편인, 방법.
70. 조항 68에 있어서, 상기 핵산의 종은 염색체 좌이고, 상기 표적 단편은 상기 인간 게놈의 유전자 좌에 특이적인, 방법.
71. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브 핵산이 DNA인, 방법.
72. 조항 68 또는 69에 있어서, 상기 방법은 단편화된 염색체 샘플과 염색체의 다중 단편의 결합을 위한 프로브 세트를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 세트 내 각 프로브는 상기 염색체에 특이적인 상이한 표적 단편을 결합하기 위한 것인, 방법.
73. 조항 72에 있어서, 상기 프로브는 공통의 맞춤 서열을 공유하는, 방법.
74. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 단편화된 염색체 샘플과 2 이상의 염색체의 다중 단편의 결합을 위한 프로브 세트를 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 프로브 세트는:
제1 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편의 결합을 위한 제1 세트의 프로브; 및
제2 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편의 결합을 위한 제2 세트의 프로브; 및 임의로
하나 이상의 추가 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편의 결합을 위한 하나 이상의 추가 세트의 프로브를 포함하는, 방법.
75. 조항 74에 있어서, 프로브의 각 세트는 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편을 결합시키기 위한 적어도 500개의 상이한 프로브를 포함하는, 방법.
76. 조항 74 또는 75에 있어서, 세프 내의 프로브는 그 세트에 일반적이고 다른 세트의 프로브의 맞춤 서열과 상이한 맞춤 서열을 공유하는, 방법.
77. 조항 76에 있어서, 각 프로브 세트를 위한 이중 결찰 생성물 내의 맞춤 서열로부터의 누적 신호를 검출 및 정량화함으로써 샘플 내 2개 이상의 염색체의 상대적 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
78. 조항 72 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 염색체 또는 염색체들이 인간의 것인, 방법.
79. 조항 28에 있어서, 상기 프로브가 이중 가닥 선택기 작제물을 포함하고, 각 개별 선택기가 상기 표적 단편의 말단에 상보적인 하나 또는 두 개의 돌출성 말단 서열을 포함하고, 여기서
어닐링 및 결찰을 위한 조건하에, 상기 선택기의 말단 서열은 상기 단편의 말단 서열로 혼성화하고 선택기에 결찰되는, 방법.
80. 조항 22에 있어서, 상기 프로브가, 각각 말단에 표적 상보적 서열을, 사이에 비표적 상보적 서열을 갖는 선형 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 자물쇠 프로브이고, 여기서
어닐링 및 결찰을 위한 조건하에, 상기 표적 상보적 서열은 상기 표적 서열의 인접 영역으로 혼성화하기 위해 머리를 함께 꼬리로 향하게 하고, 결찰되어 핵산의 원을 형성하는, 방법.
81. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산의 종이 염색체 또는 염색체 좌인, 방법.
82. 상기 조항 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 혈액 또는 조직 샘플인, 방법.
83. 조항 82에 있어서, 상기 샘플이 임신 여성의 혈액으로부터의 태아 및 모계 DNA의 혼합물을 함유하는, 방법.
84. 조항 81 또는 82에 있어서, 상기 검출 또는 정량화될 핵산 종이 종양-연관된 DNA인, 방법.
85. 조항 81 또는 82에 있어서, 상기 검출 또는 정량화될 핵산 종이 미생물 DNA인, 방법.
86. 개체로부터 수득된 핵산 샘플 중 제2 염색체 또는 염색체 좌에 대해 제1 염색체 또는 염색체 좌를 정량화하는 방법은
상기 샘플을 제1 세트의 프로브 및 제2 세트의 프로브와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트의 프로브는 각각 제1 염색체 또는 염색체 좌 내의 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하고, 상기 제2 세트의 프로브는 각각 제2 염색체 또는 염색체 좌 내에서 상이한 표적 서열을 특이적으로 인식하는, 단계,
상기 제1 및 제2 염색체 또는 염색체 좌 중 표적 서열이 적어도 부분적으로 단일 가닥화되는 조건을 제공하는 단계,
프로브가 이들의 표적 서열로 혼성화하고 결찰 생성물을 생성하는 어닐링 및 결찰 조건을 제공하는 단계,
상기 제1 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제1 누적 신호를 검출하고, 제1 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제1 신호 수준은 샘플 중의 제1 염색체 또는 염색체 좌의 양에 비례하는, 단계,
상기 제2 세트의 프로브에 의해 생성된 결찰 생성물로부터의 개별 신호의 조합인 제2 누적 신호를 검출하고, 제2 신호 수준을 측정하기 위해 이를 정량화하는 단계로서, 여기서 상기 제2 신호 수준은 샘플 중의 제2 염색체 또는 염색체 좌의 양에 비례하는, 단계, 및
상기 제1 및 제2 신호 수준을 비교하여 샘플 중의 제1 및 제2 염색체 또는 제1 및 제2 염색체 좌의 상대량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
87. 조항 83 또는 86에 있어서, 태아 내 3염색체성을 진단하기 위하여, 상기 핵산 샘플은 모계 혈액으로부터 수득된 무세포 태아 DNA이고, 제1 및 제2 신호 수준의 불균등 비율은 3염색체성)의 지표인, 방법.
88. 단일 가닥 핵산 단편을 결합시키기 위한 핵산 프로브로서, 상기 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 표적 서열 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
각각 유리 5' 및 3' 말단을 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이고, 이로써
표적 단편 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정하고, 여기서 표적 단편은 갭 중의 표적 상보적 서열로 혼성화하여 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치되고, 그리고
갭 중 표적 단편의 혼성화가 핵산의 원을 완성하고 상기 원은 표적 단편 및 머리 및 꼬리 서열을 포함하는, 핵산 프로브.
89. 조항 88에 있어서, 상기 머리 및/또는 꼬리 서열은 맞춤 서열에 결합되고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 핵산 프로브.
90. 조항 88 또는 89에 있어서, 단일 핵산 분자는 머리 및 꼬리 서열을 포함하는, 핵산 프로브.
91. 조항 88 또는 89에 있어서, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열에 트랜스로 결합하도록 표적화 올리고뉴클레오타이드로부터 분리된, 프로브.
92. 조항 91에 있어서, 상기 머리 및 꼬리 서열은 골격 올리고뉴클레오타이드의 각각 5' 말단 및 3' 말단에 존재하는, 프로브.
93. 조항 92에 있어서, 골격 올리고뉴클레오타이드는 머리 및 꼬리 서열 사이의 맞춤 서열을 포함하고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 프로브.
94. 조항 92에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드는 머리 및 꼬리 서열은 인접한, 프로브. 95. 단일 가닥 핵산 단편을 결합시키기 위한 핵산 프로브로서, 상기 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드 및 표적 서열 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴클레오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드, 및
각각 유리 5' 및 3' 말단을 갖는 머리 및 꼬리 서열을 포함하고, 여기서 머리 및 꼬리 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이고, 이로써
표적 단편 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정하고, 여기서 표적 단편은 갭 중의 표적 상보적 서열로 혼성화하여 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치되고, 그리고
갭 중의 표적 단편의 혼성화가 표적 단편, 머리 및 꼬리 서열, 표적 상보적 서열 및 플랭킹 서열을 포함하는 핵산의 가닥을 완성하도록 머리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단이고/이거나 꼬리 서열이 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단인, 프로브.
96. 조항 88 또는 95에 있어서, 머리 및 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 단부에 존재하고, 플랭킹 서열에 시스로 결합하는, 프로브.
97. 조항 88 또는 95에 있어서, 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단일 수 있고, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드로부터 분리된 골격 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단인, 프로브.
98. 조항 88 또는 95에 있어서, 꼬리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단일 수 있고, 머리 서열은 표적화 올리고뉴클레오타이드로부터 분리된 골격 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단인, 프로브.
99. 조항 97 또는 98에 있어서, 상기 골격 올리고뉴클레오타이드은 맞춤 서열을 추가로 포함하고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 프로브.
100. 단일 가닥 핵산 단편을 결합시키기 위한 핵산 프로브로서, 상기 프로브는
표적 단편보다 더 길고, 표적화 올리고뉴클레오타이드와 표적 단편 사이의 혼성화가 표적화 올리고뉴크렐오타이드의 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열 사이에 위치된 이중 가닥 서열을 형성하도록 내부 표적 상보적 서열을 함유하는 표적화 올리고뉴클레오타이드,
유리 5' 말단을 갖는 머리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드, 및
유리 3' 말단을 갖는 꼬리 서열을 포함하는 골격 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
여기서, 상기 머리 및 꼬리 올리고뉴클레오타이드 서열은 각각 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열에 상보적이고,
일 골격 올리고뉴클레오타이드는 포획 모이어티를 수반하고, 다른 골격 올리고뉴클레오타이드는 이종성 표지를 수반하고,
표적 단편 존재하의 어닐링 조건하에, 머리 및 꼬리 서열은 플랭킹 서열로 혼성화하여 머리 서열의 5' 말단과 꼬리 서열의 3' 말단 사이의 갭을 규정하고, 여기서 표적 단편은 갭 중의 표적 상보적 서열로 혼성화하여 표적 단편의 말단을 머리 서열의 5' 말단 및 꼬리 서열의 3' 말단과 병렬로 배치되고, 그리고
갭 중 표적 단편의 혼성화는 표적 단편과 머리 및 꼬리 서열을 포함하는 핵산의 가닥을 완성하고, 상기 가닥은 상기 포획 모이어티 및 표지를 수반하는, 프로브.
101. 조항 100에 있어서, 상기 포획 모이어티가 비오틴인, 프로브.
102. 조항 100 또는 101에 있어서, 상기 표지는 형광단인, 프로브.
103. 조항 100 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 골격 올리고뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다는 맞춤 서열을 추가로 포함하고, 상기 맞춤 서열은 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은, 프로브.
104. 조항 88 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 표적 올리고뉴클레오타이드는 프로브의 다른 영역 또는 표적 단편에 상보적이지 않은 맞춤 서열을 추가로 포함하는, 프로브.
105. 조항 88 또는 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적-상보적 서열이 10 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, 프로브.
106. 조항 88 또는 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적-상보적 서열이 표적 단편과 5 염기쌍 미만의 불일치를 갖는, 프로브.
107. 조항 106에 있어서, 상기 표적-상보적 서열이 표적 단편의 완전한 상보체인, 프로브.
108. 조항 88 또는 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 플랭킹 서열이 각각 10 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는, 프로브.
109. 조항 88 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적화 올리고뉴클레오타이드의 상기 업스트림 및 다운스트림 플랭킹 서열이 서로 상이한, 프로브.
110. 조항 88 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 머리 서열은 업스트림 플랭킹 서열과 5개 미만의 염기 쌍 불일치를 갖고, 상기 꼬리 서열은 다운스트림 플랭킹 서열과 5개 미만의 염기 쌍 불일치를 갖는, 프로브.
111. 조항 110에 있어서, 상기 머리 및 꼬리 서열이 플랭킹 서열의 완전한 상보체인, 프로브.
112. 조항 88 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오타이드가 선형인, 프로브.
113. 조항 88 또는 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 단편이 제한 엔도뉴클레아제 단편인, 프로브.
114. 조항 88 또는 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 단편이 인간 게놈 단편인, 프로브.
115. 조항 114에 있어서, 상기 표적 단편이 일 염색체에 특이적인 인간 게놈 단편인, 프로브.
116. 조항 115에 있어서, 상기 표적 단편이 인간 게놈 단편의 일 유전자 좌에 특이적인, 프로브.
117. 조항 88 또는 116 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브 핵산이 DNA인, 프로브.
118. 단일 가닥 표적 핵산 단편에 결합시키기 위한 프로브 세트로서, 조항 88 내지 117 중 어느 하나의 복수의 프로브를 포함하고, 상기 프로브는 다중 상이한 표적 단편을 결합시키기 위한 상이한 복수의 표적-상보적 서열을 갖는, 프로브 세트.
119. 조항 118에 있어서, 인간 염색체의 다중 단편을 결합시키기 위한 것으로서, 상기 세트 내 각 프로브는 상기 염색체에 특이적인 상이한 표적 단편을 결합하기 위한 것인, 프로브 세트.
120. 조항 119에 있어서, 상기 프로브는 공통의 맞춤 서열을 공유하는, 프로브 세트.
121. 2 이상의 인간 염색체의 상이한 단편을 결합시키기 위한 프로브 세트로서,
제1 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편의 결합을 위한 제1 세트의 프로브; 및
제2 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편의 결합을 위한 제2 세트의 프로브; 및 임의로
하나 이상의 추가 염색체에 특이적인 복수의 표적 단편의 결합을 위한 하나 이상의 추가 프로브를 포함하는, 프로브 세트.
122. 조항 121에 있어서, 세프 내의 프로브는 그 세트에 일반적이고 다른 세트의 프로브의 맞춤 서열과 상이한 맞춤 서열을 공유하는, 프로브 세트.
123. 하나 이상의 용기 내 용액 내에 조항 118 내지 122 중 어느 하나의 프로브 세트 또는 세트들을 포함하는, 키트.
124. 핵산 종의 존재에 대한 샘플 시험을 위한, 조항 88 내지 117 중 어느 하나의 프로브, 조항 118 내지 122 중 어느 하나의 프로브 세트 또는 세트들, 또는 조항 123의 키트의 용도.
125. 핵산 종으로부터 수득된 표적 단편의 존재에 대한 샘플 시험을 위한 프로브 세트의 용도로서,
상기 세트의 각 프로브는 표적 단편의 완전한 상보체인 서열을 함유하는 표적 올리고뉴클레오타이드, 및 표적 올리고뉴클레오타이드 상에서의 표적 단편과 인접하여 혼성화하는 머리 및 꼬리 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
표적 단편 및 프로브 사이의 혼성화는 머리 및 꼬리 서열에 대한 결찰을 위한 표적 단편을 템플릿화하는, 용도.
일 구현예는 하기를 포함하는 샘플 분석 방법을 제공한다:
a) 단편화된 DNA를 포함하는 샘플을 제1 세트의 프로브를 포함하는 프로브 혼합물과 혼성화 하는 단계로서, 여기서 상기 제1 세트의 프로브를 포함하는 프로브는:
i. 제1 염색체 내 상이한 부위에 혼성화하고; 그리고
ii. 제1 염색체로부터 DNA 단편으로 혼성화될 때 결찰가능하게 인접한 접합부를 함유하는 비공유 원형 생성물을 형성하고;
b) 복수의 공유 원형 결찰 생성물을 생성하기 위해 결찰가능하게 인접한 접합부를 함께 결찰시키는 단계;
c) 복수의 RCA 생성물 분자를 생성하기 위해 회전 원 증폭(RCA)에 의해 공유 원형 결찰 생성물을 증폭시키는 단계;
d) RCA 생성물 분자를 표지화하는 단계; 및
e) 단계 d)에서의 RCA 생성물은 표지화하고 정량화함으로써, 이에 의해 샘플 중의 제1 염색체에 상응하는 DNA의 양의 추정치를 제공하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예에서, 제1 염색체는 염색체 21, 13 또는 18일 수 있다.
임의의 구현예에서, 프로브 혼합물은 제2 세트의 프로브를 포함할 수 있고, 여기서 제2 세트 프로브의 프로브는 제2 염색체 중의 상이한 부위로 혼성화하고 제1 염색체로부터 DNA 단편으로 혼성화될 때 결찰가능하게 인접한 접합부를 함유하는 비공유 원형 생성물을 형성하고, 그리고 단계 e)는 제1 및 제2 염색체에 상응하는 회전 원 증폭 생성물의 수를 별도로 정량화하여 샘플 중의 제1 및 제2 염색체에 상응하는 DNA의 상대량의 추정치를 제공하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 세트의 프로브를 염색체의 제1 영역에서 상이한 부위로 혼성화한다. 이러한 구현예에서, 프로브 혼합물은 제2 세트의 프로브를 포함할 수 있고, 여기서 제2 세트 프로브의 프로브는 제2 염색체 중의 상이한 부위로 혼성화하고 제1 염색체로부터 DNA 단편으로 혼성화될 때 결찰가능하게 인접한 접합부를 함유하는 비공유 원형 생성물을 형성하고, 그리고 단계 e)는 제1 및 제2 염색체에 상응하는 회전 원 증폭 생성물의 수를 별도로 정량화하여 샘플 중의 제1 및 제2 염색체에 상응하는 DNA의 상대량의 추정치를 제공하는 것을 포함한다.
임의의 구현예에서, 제1 염색체는 염색체 21이고, 제2 염색체는 염색체 13 및 염색체 18로부터 선택된다.
임의의 구현예에서, 비공유 원형 생성물 각각은 샘플로부터 DNA의 단편을 포함한다. 이러한 구현예에서, 단계 a)의 프로브는:
i. 머리 서열 및 꼬리 서열(여기서, 머리 및 꼬리 서열은 제1 올리고뉴클레오타이드 분자의 말단에 존재한다) 및
ii. 하기를 포함하는 부목 서열;
머리 서열에 상보적인 업스트림 플랭킹 서열;
표적 단편에 상보성인 표적 상보적 서열; 및
꼬리 서열에 상보적인 다운스트림 플랭킹 서열;
그리고 비공유 원형 생성물에서 표적 단편의 말단은 제1 올리고뉴클레오타이드 분자 중 머리 및 꼬리 서열의 말단에 결찰가능하게 인접한다.
이러한 구현예에서, 부목 서열은 제1 올리고뉴클레오타이드 분자에 존재할 수 있다. 대안적으로, 부목 서열은 제2 올리고뉴클레오타이드 분자에 존재할 수 있다.
임의의 구현예에서, 샘플은 제한 효소와 함께 소화될 수 있다.
임의의 구현예에서, 샘플은 게놈 DNA, 예를 들어 혈액으로부터 단리된 무세포 DNA를 포함한다.
임의의 구현예에서, 샘플은 임신중인 인간의 혈류로부터 단리된 무세포 DNA를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 염색체는 조직 생검으로부터 단리될 수 있다.
임의의 구현예에서, 염색체는 미생물 염색체일 수 있다.
임의의 구현예에서, 정량화 단계는 단계 c)에서 생성된 개별 회전 원 증폭 생성물 분자를 서로 분리하고, 규정 영역 또는 용적에서 개별 회전 원 증폭 생성물 분자의 수를 계수함으로써 수행될 수 있다.
이러한 구현예에서, 정량화 단계는
i. 표지된 올리고뉴클레오타이드를 RCA 생성물 분자로 혼성화하는 단계로서, 여기서 표지된 올리고뉴클레오타이드는 RCA 생성물에서 반복되는 서열로 혼성화하고, 이에 의해 각각 단일 RCA 생성물을 포함하는 복수의 복합체 및 RCA 생성물로 혼성화하는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계, 및
ii. 기질의 표면 상의 규정된 영역에서 표지된 복합체의 수를 계수하는 단계로 수행될 수 있다.
이러한 구현예에서, 정량화 단계는
(a) 기질 표면에 분포된 표지된 복합체를 포함하는 기질을 수득하는 단계 및
(b) 기질의 제1 영역에 존재하는 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계로 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 당해 방법은
(a) 기질의 표면 상에 분포된 제1 및 제2 복수의 복합체를 포함하는 기질을 수득하는 단계로서, 여기서 복합체는 각각 단일 RCA 생성물 및 RCA 생성물로 혼성화되는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 제1 및 제2 복수의 복합체는 식별가능하게 표지되고, 제1 및 제2 복수의 복합체는 상이한 염색체에 상응하는, 단계, 및
(b) 제1 복수의 RCA 생성물의 수를 계수하고, 독립적으로 기질의 제1 영역에 존재하는 제2 복수의 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지될 수 있다.
이러한 구현예에서, 프로브의 제1 세트는 적어도 50개의 프로브를 포함할 수 있다.
명세서에서 선행 기술에 대한 참조 문헌은 이 선행 기술이 모든 관할권에서 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다거나, 또는 이 선행 기술은 당업자에 의해 임의의 다른 선행 기술과 결합될 것으로 합리적으로 예상될 수 있다는 인정이나 제안이 아니다.
명확하고 의심의 여지를 없애기 위해, 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고, 본 명세서에서 사용된 용어 "포함하다" 및 "포함하는", "포함하다" 및 "포함된"과 같은 용어의 변형은 추가적인 추가, 구성 요소, 정수 또는 단계를 제외하는 것을 의도하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Dahl, Carl OF Ericsson, John O <120> Multiplex Detection of Nucleic Acids <130> VANA-002WO <150> GB 1321196.6 <151> 2013-12-02 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31)..(60) <223> positions 31 to 60 represent a target complementary sequence on human chromosome 21. <400> 1 atgtgaccct tccgtctgtt gagttaggcc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 tcgtgccttg tcattcggga gcactaactg ctg 93 <210> 2 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> c has 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (64)..(73) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 cgcacacgat taaggtccag tcacaggcag agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag 60 tgtnnnnnnn nnngtgtaga tctcggtggt cgccgtatca tttcatgctg ctaacggtcg 120 agtcggacag gtggctccac taaatagacg ca 152 <210> 3 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> g has a 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (64)..(73) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 ggcctaactc aacagacgga agggtcacat agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag 60 tgtnnnnnnn nnngtgtaga tctcggtggt cgccgtatca tttcatgctg ctaacggtcg 120 agcagttagt gctcccgaat gacaaggcac ga 152

Claims (7)

  1. 회전 원 증폭(RCA) 생성물을 정량화하는 방법으로서,
    (a) RCA 생성물을 표지하는 단계;
    (b) 표지된 RCA 생성물을 기질 상에 분포하는 단계로서, 상기 표지된 RCA 생성물은 각각
    (i) RCA 생성물,
    (ii) 단일 원형화 결찰 생성물, 및
    (iii) RCA 생성물에서 반복되는 서열로 혼성화하는 복수의 표지된 올리고뉴클레오타이드, 를 포함하는 단계; 및
    (c) 기질의 한 영역에 존재하는 RCA 생성물의 수를 계수하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 다중화되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 기질은 식별가능한 RCA 생성물의 다중 세트를 포함하고, 상기 식별가능한 RCA 생성물의 상이한 세트는 식별가능한 서열을 함유하고 기질 상에 분포되기 전에 식별가능하게 표지되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식별가능한 RCA 생성물의 다중 세트는, 인간 염색체 18에 상응하는 RCA 생성물 세트 및 인간 염색체 21에 상응하는 RCA 생성물 세트를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표지된 RCA 생성물을 기질 표면 상에 분포하는 단계는, 제1 및 제2 복수의 표지된 RCA 생성물을 기질 표면 상에 분포하는 단계를 추가로 포함하는 단계로서;
    (i) 제1 및 제2 복수의 복합체는 식별가능하게 표지되고,
    (ii) 제1 및 제2 복수의 복합체는 상이한 염색체에 상응하는 것;
    인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 및 제2 복수의 표지된 RCA 생성물은 형광 표지된 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 원형화 결찰 생성물은 임신한 여성의 혈액으로부터 수득된 gDNA 단편을 포함하는 것인 방법.
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3013983T3 (da) 2013-06-25 2023-03-06 Prognosys Biosciences Inc Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning
GB2520765A (en) 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Multiplex detection of nucleic acids
GB2520763A (en) * 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Nucleic acid probe and method of detecting genomic fragments
WO2015189390A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Q-Linea Ab Method for detecting and characterising a microorganism
JP6828007B2 (ja) 2015-04-10 2021-02-10 スペーシャル トランスクリプトミクス アクチボラグ 生物学的試料の空間識別されるマルチプレックスな核酸分析
GB201507026D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Linea Ab Q Medical sample transportation container
GB201507376D0 (en) 2015-04-30 2015-06-17 Vanadis Diagnostics Ab Use of a porous transparent capillary membrane for counting rolling circle amplification products
PL3350342T3 (pl) * 2015-09-18 2020-08-24 Vanadis Diagnostics Zestaw sond do analizowania próbki DNA i sposób jego zastosowania
GB2554767A (en) 2016-04-21 2018-04-11 Q Linea Ab Detecting and characterising a microorganism
KR102376437B1 (ko) * 2016-10-27 2022-03-17 바나디스 다이아그노스틱스 회전환 증폭 생성물을 처리하는 방법
GB201621514D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Q-Linea Ab Padlock probe detection method
CN106929593B (zh) * 2017-04-27 2021-04-30 华侨大学 一种原位核酸检测方法
CN109252224A (zh) * 2017-07-14 2019-01-22 深圳华大基因股份有限公司 一种环状探针和基于环状探针捕获的测序文库构建方法
US11117128B2 (en) 2017-08-25 2021-09-14 Vanadis Diagnostics Ab Filtration device
CN112166199A (zh) 2018-04-02 2021-01-01 普罗格尼迪公司 用于对核酸分子进行计数的方法、系统和组合物
US20220025429A1 (en) * 2018-12-05 2022-01-27 Egi Tech (Shen Zhen) Co., Limited Rolling circle amplification method, method for preparing sequencing library, and dna nanosphere prepared therefrom
EP3894586A2 (en) 2018-12-10 2021-10-20 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of a biological analyte in a biological sample
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3947718A4 (en) 2019-04-02 2022-12-21 Enumera Molecular, Inc. METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR COUNTING NUCLEIC ACID MOLECULES
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN112029841B (zh) * 2019-06-03 2024-02-09 香港中文大学 定量端粒长度和基因组基序的方法
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
EP4242325A3 (en) 2020-04-22 2023-10-04 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
CN116438454A (zh) 2020-09-21 2023-07-14 普罗根尼蒂公司 用于分离细胞游离dna的组合物和方法
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
AU2021409136A1 (en) 2020-12-21 2023-06-29 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
WO2023287765A1 (en) * 2021-07-13 2023-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted probe silencing
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
CN113801923A (zh) * 2021-10-20 2021-12-17 南京鼓楼医院 一种可直接用于血清标志物检测的数字滚环扩增检测方法
CN116625999B (zh) * 2023-05-17 2023-11-28 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9400522D0 (sv) 1994-02-16 1994-02-16 Ulf Landegren Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
JP4493844B2 (ja) 1998-03-25 2010-06-30 ランデグレン、ウルフ 錠型（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブのローリングサークル複製
US6316229B1 (en) * 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
EP1313881A2 (en) 2000-06-06 2003-05-28 TM Bioscience Corporation Capture moieties for nucleic acids and uses thereof
ATE380883T1 (de) 2000-10-24 2007-12-15 Univ Leland Stanford Junior Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna
GB2378245A (en) 2001-08-03 2003-02-05 Mats Nilsson Nucleic acid amplification method
AU2002366099A1 (en) 2001-11-19 2003-06-10 Parallele Bioscience, Inc. Multiplex oligonucleotide addition and target amplification
AU2003298672A1 (en) * 2002-11-19 2005-01-28 Singulex, Inc. Detection of target molecules through interaction with probes
WO2005047547A1 (en) 2003-11-04 2005-05-26 Applera Corporation Concatameric ligation products: compositions, methods and kits for same
SE0401270D0 (sv) 2004-05-18 2004-05-18 Fredrik Dahl Method for amplifying specific nucleic acids in parallel
ES2556113T3 (es) 2005-07-04 2016-01-13 Erasmus University Medical Center Ensayo de captura en chip (4C) de conformación cromosómica
US20070087355A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Barrett Michael T Comparative genomic hybridization assays and compositions for practicing the same
US8038595B2 (en) 2006-01-25 2011-10-18 Beth Israel Deaconess Medical Center Devices and methods for tissue transplant and regeneration
US8293501B2 (en) 2006-09-12 2012-10-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for performing low background multiplex nucleic acid amplification reactions
US20100291636A1 (en) 2007-06-11 2010-11-18 Olink Genomics Ab Method for introducing common and/or individual sequence elements in a target nucleic acid molecule
US20090061424A1 (en) 2007-08-30 2009-03-05 Sigma-Aldrich Company Universal ligation array for analyzing gene expression or genomic variations
GB0912909D0 (en) 2009-07-23 2009-08-26 Olink Genomics Ab Probes for specific analysis of nucleic acids
WO2011068909A2 (en) * 2009-12-01 2011-06-09 Brigham And Women's Hospital, Inc. Aptamer cell compositions
GB0921264D0 (en) 2009-12-03 2010-01-20 Olink Genomics Ab Method for amplification of target nucleic acid
WO2011142836A2 (en) * 2010-05-14 2011-11-17 Fluidigm Corporation Assays for the detection of genotype, mutations, and/or aneuploidy
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US11270781B2 (en) * 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
GB2492042B (en) 2011-05-11 2020-04-15 Agilent Technologies Inc Selector probes for nucleic acid analysis comprising at each end a non-adjacent target specific region
US20140336058A1 (en) 2011-12-02 2014-11-13 Qiagen Gmbh Method and kit for characterizing rna in a composition
AU2013209499B2 (en) 2012-01-20 2018-05-10 Sequenom, Inc. Diagnostic processes that factor experimental conditions
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
AU2013245272B2 (en) 2012-04-06 2018-04-05 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy by allelic ratio analysis using targeted massively parallel sequencing
EP2653559A1 (en) 2012-04-20 2013-10-23 Samsung Electronics Co., Ltd Polynucleotide and use thereof
US20140342354A1 (en) * 2013-03-12 2014-11-20 Counsyl, Inc. Systems and methods for prenatal genetic analysis
GB2520765A (en) 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Multiplex detection of nucleic acids
GB2520763A (en) 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Nucleic acid probe and method of detecting genomic fragments
US10174383B2 (en) * 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Goransson 등, Nucleic Acids Research, Vol 37, No. 1, 페이지 1-9 (2008.11.25.)*
Goransson 등, PLoS ONE, Vol 7, No. 2, 페이지 1-9 (2012.02.22.)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20200140922A1 (en) 2020-05-07
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