CN116438454A - 用于分离细胞游离dna的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于从样品中分离细胞游离核酸例如细胞游离DNA的组合物和方法。在特定的实施方案中，本文提供了使用抗dsDNA抗体从样品中分离细胞游离DNA并提供例如用于核酸测定的分离的细胞游离DNA的样品的组合物和方法。在特定的实施方案中，该技术涉及提供富含胎儿细胞游离胎儿DNA的来自母体样品的细胞游离DNA。

Description

用于分离细胞游离DNA的组合物和方法
本申请要求2020年9月21日提交的美国临时申请序列号63/081,308的优先权，其通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于从样品例如血液样品中分离循环细胞游离DNA(cfDNA)的组合物和方法。具体地，本文提供了使用抗dsDNA抗体从样品中分离细胞游离DNA并提供分离细胞游离DNA的样品的方法。在特定的实施方案中，该技术涉及提供来自母体样品的细胞游离DNA，其相对于来自母体样品的细胞游离母体DNA富含胎儿细胞游离DNA。
发明背景
遗传测试是若干医学应用中使用的重要工具，包括产前检测和检测与各种疾病状态(包括自身免疫性疾病、心血管疾病、移植排斥和癌症)相关联的基因。然而，从患者收集遗传物质的常规方法仍然具有很大的侵入性。例如，针对遗传异常的产前筛查通常依赖于侵入性规程，诸如羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样，这两者均与流产和/或对发育中胎儿的针损伤的小风险相关联。作为另一个示例，癌症诊断通常需要进行肿瘤活检，这是侵入性且有风险的规程，在某些情况下可能是不可能的。
循环细胞游离DNA (cfDNA)的分离和使用代表非侵入性检测方法的可行替代方案，包括针对各种疾病状态的诊断方法。例如，cfDNA可以获得自癌症患者并用于评估非自身(例如，肿瘤)DNA，其可以用于癌症预后、诊断、对疗法的响应和复发评估。然而，cfDNA片段相对稀少，因此影响了为了精确性而需要足够水平的cfDNA的遗传测试的广泛使用。因此，需要用于从生物样品中分离cfDNA的改良方法。
循环细胞游离胎儿DNA的分离和使用代表非侵入性产前检测(NIPT)方法的特别理想的替代方案。来自胎儿的cfDNA可以获得自母亲的血液，因此潜在消除用于某些遗传测试的羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样的需要。然而，cfDNA片段，特别是胎儿cfDNA片段在母亲的循环中相对稀少。此外，NIPT方法的精确性在很大程度上取决于样品中存在的cfDNA的胎儿分数。因此，需要用于富集细胞游离胎儿DNA的方法和组合物，即用于从母体样品中捕捉相对于从样品中捕捉的细胞游离DNA总量而言更大的细胞游离胎儿DNA级分的方法和组合物。
发明内容
本发明提供了用于分离样品中的细胞游离DNA的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于分离样品中的细胞游离胎儿DNA的组合物和方法。
在一些方面，本文提供用于富集样品中的cfDNA的方法，其包括使样品与抗双链脱氧核糖核酸(dsDNA)抗体接触，并从样品中分离cfDNA。可以在从样品中分离cfDNA之前执行使样品与抗dsDNA抗体接触的步骤。
cfDNA分离期间使用的洗涤剂允许分离不同的膜结合区室。例如，使用Triton X-100溶解对洗涤剂敏感的膜，但不溶解富含胆固醇的膜(例如，洗涤剂抗性膜)。膜在各种洗涤剂中区别地溶解，如Schuck et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:10中所报道，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，样品是生物流体。例如，生物流体可以是血液、血清或血浆。在一些实施方案中，生物流体获得自妊娠受试者。在一些实施方案中，生物流体获得自患者。例如，生物流体可以获得自患有疾病状态或处于发展疾病状态风险中的患者，该疾病状态包括自身免疫性疾病、心血管疾病、移植排斥或癌症。
cfDNA可以通过任何合适的方法从样品中分离。在一些实施方案中，cfDNA使用市售试剂盒分离。
在一些实施方案中，与未接触抗dsDNA抗体的样品相比，本文提供的方法导致样品中cfDNA的富集浓度或量。在一些实施方案中，与未接触抗dsDNA抗体的样品相比，本文提供的方法导致样品中胎儿cfDNA的富集浓度或量。
在一些实施方案中，可以执行本文描述的用于富集cfDNA的方法并且可以随后使富集的cfDNA经受遗传分析的方法。遗传分析可以包括分析任何期望基因突变，包括碱基取代、插入、缺失、易位，或分析特定核酸序列的拷贝数变化，这些变化可能起因于例如染色体数、基因拷贝数、表达水平的变化等。本文描述的用于富集cfDNA的方法可用于评估受试者的各种疾病状态，包括自身免疫性疾病、心血管疾病、移植排斥和癌症。在一些实施方案中，遗传分析可以包括“自身”和“非自身”核酸的量化，诸如衍生自受试者的cfDNA的量化和衍生自同种异体移植物的cfDNA的量化(例如用于评估移植排斥的风险)。在一些实施方案中，遗传分析可以包括衍生自肿瘤的cfDNA(例如循环肿瘤cfDNA)的量化。例如，通过本文所述的方法获得的富集的cfDNA可以用于诊断和/或预后癌症的遗传筛查方法。在一些实施方案中，通过本文所述方法获得的富集胎儿cfDNA级分可以用于遗传筛查方法，例如产前检测，特别是用于非侵入性产前检测(NIPT)。NIPT旨在分析在子宫内怀有胎儿的女性的血液中循环的来自胎儿的细胞游离DNA (cfDNA)。
在一些实施方案中，该技术提供了：
1.用于从样品中捕捉细胞游离DNA的方法，其包括：
a)使样品与包含外源性抗dsDNA抗体的组合物接触以形成包含所述抗dsDNA抗体和细胞游离DNA的抗体-DNA复合物；
b)从所述样品中分离所述抗体-DNA复合物以提供捕捉的细胞游离DNA。
2.如实施方案1所述的方法，其进一步包括从所述抗体-DNA复合物中释放捕捉的细胞游离DNA的步骤c)。
3.如实施方案1所述的方法，其进一步包括测定所述捕捉的细胞游离DNA。
4.如实施方案3所述的方法，其中所述测定包括将捕捉的细胞游离DNA添加到反应混合物中。
5.如实施方案4所述的方法，其中将捕捉的细胞游离DNA添加到反应混合物中包括将所述抗体-DNA复合物添加到所述反应混合物中。
6.如实施方案4所述的方法，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶，优选地选自核酸聚合酶、核酸酶和连接酶的核酸修饰酶。
7.如实施方案1所述的方法，其中所述捕捉的细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
8.如实施方案1所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有小于500bp，优选小于300bp的长度的多个dsDNA片段。
9.如实施方案8所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有50和200bp之间的长度的多个dsDNA片段。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述多个dsDNA片段具有包含在约143bp和166bp处的峰的大小分布。
11.如实施方案1所述的方法，其中所述样品包括从受试者分离的生物流体。
12.如实施方案11所述的方法，其中所述生物流体包括血液或血液制品。
13.如实施方案12所述的方法，其中所述血液制品包含血浆。
14.如实施方案11所述的方法，其中所述受试者是妊娠受试者或疑似患有肿瘤的受试者。
15.包含抗体-DNA复合物的组合物，其包含：
a)外源性抗dsDNA抗体和
b)得自来自受试者的样品的细胞游离DNA。
16.如实施方案15所述的组合物，其中所述样品包含来自受试者的生物流体。
17.如实施方案16所述的组合物，其中所述生物流体包括血液或血液制品。
18.如实施方案15所述的组合物，其中所述细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
19.如实施方案15所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物基本上无来自受试者的生物流体。
20.如实施方案15所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在缓冲液中。
21.如实施方案15所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在反应混合物中。
22.如实施方案21所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶。
23.如实施方案22所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸酶和连接酶中的一种或多种。
24.如实施方案15所述的组合物，其中所述组合物进一步包含固体支持物。
25.如实施方案24所述的组合物，其中所述固体支持物包括珠。
26.用于从样品中分离cfDNA的试剂盒或系统，所述试剂盒或系统包含外源性抗dsDNA抗体。
27.如实施方案26所述的试剂盒或系统，其进一步包含固体支持物，优选珠。
28.如实施方案27所述的试剂盒或系统，其中所述固体支持物包含抗体结合试剂。
29.如实施方案28所述的试剂盒或系统，其中所述抗体结合试剂包含蛋白质，优选蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或蛋白质L。
30.如实施方案26所述的试剂盒或系统，其进一步包含选自下组的一种或多种试剂：
a)缓冲液；
b)盐；
c)洗涤剂；
d)防腐剂；
e)蛋白酶抑制剂；
f)核酸酶抑制剂；和
g)核酸修饰试剂。
31.如实施方案3或实施方案4所述的方法，其中将捕捉的细胞游离DNA添加到反应混合物中包括将所述抗体-DNA复合物添加到所述反应混合物中。
32.如实施方案31所述的方法，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶，优选地选自核酸聚合酶、核酸酶和连接酶的核酸修饰酶。
33.如实施方案31-32中任一项所述的方法，其中所述捕捉的细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
34.如实施方案31-33中任一项所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有小于500bp，优选小于300bp的长度的多个dsDNA片段。
35.如实施方案34所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有50和200bp之间的长度的多个dsDNA片段。
36.如实施方案35所述的方法，其中所述多个dsDNA片段具有包含在约143bp和166bp处的峰的大小分布。
37.如实施方案31-36中任一项所述的方法，其中所述样品包括从受试者分离的生物流体。
38.如实施方案37所述的方法，其中所述生物流体包括血液或血液制品。
39.如实施方案38所述的方法，其中所述血液制品包含血浆。
39.如实施方案37-39中任一项所述的方法，其中所述受试者为妊娠受试者或疑似患有肿瘤的受试者。
41.如实施方案15-17中任一项所述的组合物，其中所述细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
42.如实施方案41所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物基本上无来自受试者的生物流体。
43.如实施方案41或42所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在缓冲液中。
44.如实施方案41-43中任一项所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在反应混合物中。
45.如实施方案44所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶。
46.如实施方案45所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸酶和连接酶中的一种或多种。
47.如实施方案15-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含固体支持物。
48.如实施方案47所述的组合物，其中所述固体支持物包括珠。
49.如实施方案26-29中任一项所述的试剂盒或系统，其进一步包含选自下组的一种或多种试剂：
a)缓冲液；
b)盐；
c)洗涤剂；
d)防腐剂；
e)蛋白酶抑制剂；
f)核酸酶抑制剂；和
g)核酸修饰试剂。
在不脱离所描述的技术的范围和精神的情况下，所描述的组合物、方法和技术的使用的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合具体示例性实施方案描述了该技术，但是应当理解所要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体实施方案。事实上，对分子生物学、分子诊断学、核酸结构、生物化学、医学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述模式的各种修改旨在在权利要求的范围内。
定义
为了便于理解本发明，一些术语和短语定义如下：
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确关联的含义，除非上下文另有明确规定。如本文所用，短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管它可以指代。此外，如本文所用，短语“在另一个实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管它可以指代。因此，如下所述，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以容易地组合本发明的各种实施方案。
此外，如本文所用，术语“或”是包含性的“或”运算符并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的并且允许基于未描述的额外因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数引用。“在……中”的含义包括“在……中”和“在……上”。
本申请的权利要求中所用，过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为特定的材料或步骤“以及那些不实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤”，如In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)中所讨论的。例如，“基本上由”所列举的元素“组成”的组合物可能含有未列举的污染物，其水平使得污染物尽管存在但与纯组合物，即“由”所列举的组分“组成”的组合物相比不改变所列举的组合物的功能。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指任何生物体，包括植物、微生物和动物(例如，哺乳动物诸如狗、猫、家畜和人)。
如本文所用，关于核酸的术语“自身”是指衍生自从其中分离样品的受试者或患者的核酸。例如，“自身cfDNA”是指起源于受试者的cfDNA。如本文所用，关于核酸的术语“非自身”是指衍生自不同于从其中分离样品的受试者或患者的来源的核酸。例如，“非自身cfDNA”可以指从同种异体移植物(例如，移植到从其中分离样品的受试者中的衍生自不同受试者的器官、组织、细胞等)释放的cfDNA。从同种异体移植物中释放的cfDNA也可以称为“供体衍生”。
本说明书和权利要求中的术语“样品”以其最广泛的含义使用。在一些实施方案中，样品是组织样品。在一些实施方案中，样品是生物流体，诸如血液、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、胃肠液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴液或痰。在特定的实施方案中，样品是血液、血清或血浆。在一些实施方案中，样品获得自妊娠受试者。在一些实施方案中，样品获得自疑似患有肿瘤的受试者。在一些实施方案中，样品获得自人受试者。
如本文所用，关于受试者使用的术语“妊娠”是指正在例如在受试者的子宫中孕育一个或多个胎儿的受试者，例如女性。
如本文所用，术语“母体样品”是指获得自妊娠受试者例如女性的生物样品。
如本文所用，本文中的术语“生物流体”是指取自生物来源的流体，并且包括例如血液、血清、血浆、痰、灌洗液、脑脊液、尿液、精液、汗液、泪液、唾液等等。如本文所用，术语“血液”、“血浆”和“血清”明确涵盖其级分或经处理的部分。类似地，当样品取自活检、拭子、涂片等时，“样品”明确涵盖衍生自活检、拭子、涂片等的经处理的级分或部分。
如本文所用，关于核酸(包括DNA、RNA等)的术语“母体”和“胎儿”分别是指妊娠受试者的核酸和妊娠受试者怀有的一个或多个胎儿的核酸。
如本文所用，术语“对应于”有时指存在于不同受试者的基因组中的核酸序列，例如基因或染色体，并且其不一定在所有基因组中具有相同序列，但用于提供感兴趣序列(例如，基因或染色体)的身份而不是遗传信息。
如本文所用，与样品结合使用的术语“细胞游离”和“基本上细胞游离”涵盖通常与样品相关的细胞组分被除去的样品的制备物。例如，血浆样品通过除去通常与其相关的血细胞例如红细胞而基本上细胞游离。在一些实施方案中，基本上细胞游离的样品经处理以除去细胞，否则这些细胞将贡献核酸到从样品中分离的核酸的总量中。
如本文所用，与样品，例如来自受试者的流体样品(例如，尿液、唾液、血液、血浆等)结合使用的术语“细胞游离DNA”(“cfDNA”)是指存在于样品中但不在样品中发现的细胞内的细胞外DNA(不同于细胞中DNA的DNA)。如关于血液和血液制品使用的，“细胞游离DNA”有时被称为“循环游离DNA”，并且是指在血液中循环但不包含在血液细胞中的DNA片段。类似地，“细胞游离核酸”是指在样品中发现但不在样品中发现的细胞内的任何核酸。细胞游离核酸可以但不一定与样品中的其他组分，例如外泌体或其他微泡、蛋白质、脂质等缔合。cfDNA不限于任何特定长度的DNA或DNA片段，并且在健康个体中，cfDNA的长度可以为从少于100个碱基对(bp)至超过10,000bp的范围，优选约30至500bp，优选约50至400bp，优选约100至300bp。
在血液循环中，cfDNA主要作为细胞核、组蛋白复合DNA存在。组蛋白复合DNA的最常见大小为约166bp，并且在分析cfDNA大小分布时，可以在人体血液中检测到这种大小的倍增的特定阶梯模式。短于约166bp的片段可能是接头修整或非核小体降解的结果细胞游离DNA。受试者中赘生物例如肿瘤的存在可以改变受试者中cfDNA的大小分布。例如，当分析来自患有肿瘤的受试者的cfDNA片段大小的分布时，该分布可能显示相对于来自健康受试者的DNA而言小于150bp的DNA的峰的增加。参见，例如，M.Grunt,et al.,Transl CancerRes 2018；7(Suppl 2):S171-S184；和Jiping Shi,et al.,Theranostics 2020；10(11):4737-4748，出于所有目的，每一篇均通过引用其整体并入本文。
如本文所用，“细胞游离胎儿DNA”(“cffDNA”)是指在母体血液中循环或已从母体血液中分离出来的细胞外胎儿DNA。虽然cffDNA不限于任何特定大小，但通常大多数ccfDNA显著短于母体cfDNA，通常，母体血浆中胎儿cfDNA的长度短于500bp，并且主要部分短于300bp。一般地，当分析胎儿cfDNA的片段大小的分布时，分布包括约143bp和166bp处的峰，当与母体DNA相比时，166bp峰相对于143bp峰有所减少。参见，例如，YM Dennis Lo,et al.,Sci Transl Med,Dec 8；2(61):61ra91(2010)，出于所有目的通过引用其整体并入本文。
如本文所用，术语“胎儿分数”是指存在于包含胎儿和母体核酸(例如，胎儿和母体cfDNA)的样品中的胎儿核酸(例如，细胞游离胎儿DNA)的级分。胎儿分数通常用于表征母亲血液中的cfDNA，反映血液中或从血液中分离的DNA中的cfDNA的部分是cffDNA。
如本文所用，与制备物(例如样品的分离组分)结合使用的术语“基本上无”涵盖通常从其中除去与样品相关联的其他组分的制备物。例如，当任何残留样品或体液虽然存在，但与纯组合物，即“由”所列举的组分“组成”的组合物相比，不改变分离组分的功能时，分离的DNA，包括作为抗体-DNA复合物一部分的从样品(例如体液，诸如血浆)中分离出的DNA被称为“基本上无”样品或体液。
如本文所用，术语“染色体”是指活细胞的携带遗传性的基因载体，其衍生自包含DNA和蛋白质组分(尤其是组蛋白)的染色质链。本文采用常规的国际公认的个体人基因组染色体编号系统。
如本文所用，术语“染色体特异性”是指仅在该特定类型的染色体中发现的序列或特征。
如本文所用，术语“靶标”是指试图从其他分子中分选出来用于评估、测量或其他表征的分子。例如，靶核酸可以从样品中的其他核酸分选，例如通过探针结合、扩增、分离、捕捉等。
如本文所用，术语“基因剂量”是指基因、基因区域、染色体或其片段或部分的拷贝数。正常个体携带大多数基因或基因区域的两个拷贝，两条染色体各一个。然而，存在某些例外，例如，当基因或基因区域位于X或Y染色体上时，或者当基因序列存在于假基因中时。
如本文所用，术语“非整倍性”是指其中细胞、组织或个体不存在染色体的正常整倍体互补物或除染色体的正常整倍体互补物之外，具有一个或多个完整染色体或染色体区段的情况。
如本文所用，给定测定(或一起使用的测定集)的“灵敏性”是指报告特定形式或变体(例如突变、基因复制、染色体复制)超过阈值的样品的百分比，该阈值区分表现出变异表型(例如，癌细胞、非整倍性)的样品和表现出正常或野生型表型(例如，非癌细胞、整倍性)的样品。在一些实施方案中，“阳性”被定义为报告与待检测的疾病或病症的存在相关联的测定结果的临床证实的变体，并且假阴性被定义为报告与疾病或病症的不存在相关联的测定结果的临床证实的变体。因此，灵敏性的值反映对已知变体或患病样品执行的给定诊断测定将产生指示存在变异或疾病的结果的概率。如此处所定义，计算出的灵敏性值的临床相关性代表给定测定在应用于患有临床病况的受试者时将检测到存在该临床病况的概率的估计。使用本文描述的技术，有可能在不需要生成序列读段的情况下实现一定水平的精确性。精确性可以指灵敏性，它可以指特异性，或者它可以指它们的一些组合。期望的精确性水平可能在90％到95％之间；它可能在95％到98％之间；它可能在98％和99％之间；它可能在99％和99.5％之间；它可能在99.5％和99.9％之间；它可能在99.9％和99.99％之间；它可能在99.99％和99.999％之间，它可能在99.999％和100％之间。高于95％的精确性水平可以称为高精确性。
如本文所用，给定测定(或一起使用的测定集)的“特异性”是指报告与待检测的疾病或病况的存在相关联的测定结果的正常样品的百分比，并且假阳性是定义为报告与疾病或病症的存在相关联的测定结果的临床证实的正常样品。因此，特异性的值反映对已知正常样品执行的给定诊断测定将产生指示存在变异或疾病的结果的概率。如此处所定义，计算出的特异性值的临床相关性代表给定标志物在应用于没有临床病症的受试者时将检测到不存在该临床病症的概率的估计。
术语“基因”是指包含产生具有非编码功能的RNA(例如，核糖体或转移RNA)、多肽或前体所必需的控制和编码序列的DNA序列。RNA或多肽可以由全长编码序列或编码序列的任何部分(只要保留期望的活性或功能)编码。
如本文所用，术语“基因区域”是指基因、其外显子、其内含子及其上游和下游侧翼区域，例如，分别位于转录起始位点和终止位点的5’和3’的5至10千碱基。
如本文所用，术语“基因序列”是指基因、其内含子及其上游和下游侧翼区域，例如，分别位于转录起始位点和终止位点的5’和3’的5至10千碱基的序列。
如本文所用，术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交的强度(即核酸之间缔合的强度)受诸如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性以及所形成的杂交体的Tm等因素的影响。“杂交”方法涉及将一种核酸退火至另一种互补核酸，即具有互补核苷酸序列的核酸。含有互补序列的两种核酸聚合物通过碱基配对相互作用找到彼此并退火的能力是公认的现象。Marmur and Lane,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46:453(1960)和Doty etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46:461(1960)对“杂交”过程的最初观察已随后将该过程改进为现代生物学的基本工具。
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选至少5个核苷酸，更优选至少约10-15个核苷酸且更优选至少约15至30个核苷酸。确切的大小取决于许多因素，而这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式生成，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合。
因为单核苷酸以使得一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸经由磷酸二酯键在一个方向上附接至其相邻的3’氧方式反应来制备寡核苷酸，如果寡核苷酸的5’磷酸不与单核苷酸戊糖环的3’氧连接，则其末端称为“5’末端”，并且如果寡核苷酸的3’氧不与后续单核苷酸戊糖环的5’磷酸连接，则其末端称为“3’末端”。如本文所用，核酸序列，即使在较大寡核苷酸的内部，也可以说具有5’和3’末端。如果以5’到3’方向沿着核酸链移动时第一区域的3’末端在第二区域的5’末端之前，则沿着核酸链的第一区域被称为在另一个区域的上游方向。
当两个不同的、非重叠的寡核苷酸与相同线性互补核酸序列的不同区域退火，并且一个寡核苷酸的3’末端朝向另一个的5’末端时，前者可以称为“上游”寡核苷酸，并且后者可以称为“下游”寡核苷酸。类似地，当两个重叠的寡核苷酸与相同的线性互补核酸序列杂交，安置第一寡核苷酸使得其5’末端位于第二寡核苷酸的5’末端的上游，并且第一寡核苷酸的3’末端位于第二寡核苷酸的3’末端上游时，第一寡核苷酸可以称为“上游”寡核苷酸，第二寡核苷酸可以称为“下游”寡核苷酸。
术语“引物”是指当置于启动引物延伸的条件下时，例如在存在核苷酸和合适的核酸聚合酶的情况下，能够充当合成起始点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以天然存在，可以使用分子生物学方法例如限制性消化物的纯化来制备，或可以合成产生。在优选的实施方案中，引物由DNA构成或包含DNA。
选择与模板的特定序列链“基本上”互补的引物。引物必须充分互补以与模板链杂交以发生引物伸长。引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可以附接至引物的5’末端，而引物序列的其余部分基本上与该链互补。非互补碱基或更长的序列可以散在于引物中，只要该引物序列与模板序列具有足够的互补性以杂交并从而形成模板引物复合物用于合成引物的延伸产物。
如本文所用，术语“序列变异”是指两个核酸之间的核酸序列的差异。例如，野生型结构基因和该野生型结构基因的突变体形式可以在序列上因存在单个碱基取代和/或缺失或插入一个或多个核苷酸而不同。据说这两种形式的结构基因在序列上彼此不同。可能存在结构基因的第二突变形式。据说这第二突变形式在序列上不同于野生型基因和该基因的第一突变形式。
如本文所用，术语“核苷酸类似物”是指修饰的或非天然存在的核苷酸，包括但不限于具有改变的堆叠相互作用的类似物，诸如7-脱氮嘌呤(即，7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)；具有替代氢键合构型的碱基类似物(例如，诸如Iso-C和Iso-G以及S.Benner的美国专利号6,001,983中描述的其他非标准碱基对)；非氢键类似物(例如，非极性、芳香族核苷类似物，诸如2,4-二氟甲苯，由B.A.Schweitzer and E.T.Kool,J.Org.Chem.,1994,59,7238-7242，B.A.Schweitzer and E.T.Kool,J.Am.Chem.Soc.,1995,117,1863-1872描述)；“通用”碱基，诸如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(诸如分别为“K”和“P”核苷酸；P.Kong,et al.,Nucleic Acids Res.,1989,17,10373-10383，P.Kong et al.,Nucleic Acids Res.,1992,20,5149-5152)。核苷酸类似物包括碱基类似物，并且包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式，并且包括但不限于在美国专利号5,663,37；5,432,272；6,001,983；6,037,120；6,140,496；5,912,340；6,127,121和6,143,877中描述的修饰的碱基和核苷酸，其中每篇通过引用其整体并入本文；基于嘌呤或嘧啶环系统的杂环碱基类似物，以及其他杂环碱基。
如本文所用，术语“连续的核酸链”是指具有连续的、共价连接的主链结构的核酸链，没有切口或其他中断。每个核苷酸的碱基部分的配置，无论是碱基配对、单链还是错配，均不是连续链定义中的要素。连续链的主链不限于在天然存在的未修饰核酸中发现的磷酸核糖或脱氧核糖磷酸组成。本发明的核酸可以包含主链结构中的修饰，包括但不限于硫代磷酸酯残基、膦酸酯残基、2’取代的核糖残基(例如，2’-O-甲基核糖)和含有替代糖(例如，阿拉伯糖)的残基。
如本文所用，术语“连续双链体”是指双链核酸的区域，其中双链体内的碱基对的进程中没有中断(即，沿着双链体的碱基对没有扭曲以适应缺口、凸起或与连续双链体区域的范围错配)。如本文所用，该术语仅指双链体内的碱基对的排列，不暗示核酸链的主链部分的连续性。具有不间断碱基配对但在一条或两条链中具有切口的双链体核酸在连续双链体的定义内。
术语“双链体”是指核酸的状态，其中一条链上的核苷酸的碱基部分通过氢键合它们排列在第二条链上的互补碱基而结合。处于双链体形式的条件反映核酸碱基的状态。由于碱基配对，核酸链通常也呈现具有大沟和小沟的双螺旋的三级结构。螺旋形式的假设隐含在成为双链体的行为中。
术语“模板”是指其上通过模板依赖性核酸聚合酶的活性从核苷三磷酸建立互补拷贝的核酸链。在双链体内，按照惯例，模板链被描绘和描述为“底部”链。同样，非模板链通常被描绘和描述为“顶部”链。
如应用于多核苷酸的，术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含在至少20个核苷酸位置的比较窗口内，经常在至少25-50个核苷酸的窗口内与参考序列相比具有至少85％序列同一性、优选至少90至95％序列同一性、更通常至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性的百分比通过将参考序列与多核苷酸序列比较来计算，其可能包括在比较窗口内总共占参考序列的20％或更少的缺失或添加。参考序列可以是更大序列的子集，例如，作为全长序列的剪接变体。
如应用于多肽的，术语“基本同一性”是指当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认缺口权重进行最佳比对时，两个肽序列共享至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％的序列同一性或更多(例如，99％的序列同一性)。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所用，术语“标记物”是指可以用于提供可检测(优选可量化)效果并且可以附接至核酸或蛋白质的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记物，诸如32P；结合部分，诸如生物素；半抗原(haptens)诸如地高辛(digoxigenin)；发光、磷光或荧光部分；质量标签；和单独或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制(“猝灭”)或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。FRET是两个分子(例如，两个染料分子，或染料分子和非荧光淬灭剂分子)的电子激发态之间的距离依赖性相互作用，其中激发从供体分子转移到接受体分子而没有发射光子。(Stryer et al.,1978,Ann.Rev.Biochem.,47:819；Selvin,1995,Methods Enzymol.,246:300，均通过引用并入本文)。如本文所用，术语“供体”是指在第一波长处吸收并在第二更长波长处发射的荧光团。术语“接受体”是指具有与供体发射光谱重叠的吸收光谱的部分，诸如荧光团、发色团或淬灭剂，并且能够在靠近供体基团(通常在1-100nm之间)时吸收来自供体的部分或大部分发射能量。如果接受体是荧光团，它通常在第三还更长的波长处重新发射；如果它是发色团或猝灭剂，那么它释放从供体吸收的能量而不发射光子。在一些实施方案中，检测来自供体染料的可检测发射的变化(例如，当接受体部分靠近或远离时)。在一些实施方案中，检测来自接受体染料的可检测发射的变化。在优选的实施方案中，接受体染料的发射光谱不同于供体染料的发射光谱，使得来自染料的发射可以彼此区分(例如，光谱分辨)。
在一些实施方案中，供体染料与多个接受体部分组合使用。在优选的实施方案中，供体染料与非荧光猝灭剂和接受体染料组合使用，使得当供体染料靠近猝灭剂时，其激发被转移到猝灭剂而不是接受体染料，并且当淬灭剂被除去时(例如，通过探针的切割)，供体染料激发被转移到接受体染料。在特别优选的实施方案中，检测来自接受体染料的发射。参见，例如，Tyagi,et al.,Nature Biotechnology 18:1191(2000)，其通过引用并入本文。
标记物可以提供可通过荧光(例如，简单荧光、FRET、时间分辨荧光、荧光偏振等)、放射性、比色法、重力法、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性、质量或受质量影响的行为的特征(例如，MALDI飞行时间质谱法)等检测的信号。标记物可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)，或者替代地，可以是电中性的。标记物可以包含核酸或蛋白质序列或由核酸或蛋白质序列组成，只要包含标记物的序列是可检测的。
在一些实施方案中，标记物包含用于检测的颗粒。在优选的实施方案中，颗粒是磷光体颗粒。在特别优选的实施方案中，磷光体颗粒是上转换磷光体颗粒(参见，例如，Ostermayer,F.W.Preparation and properties of infrared-to-visible conversionphosphors.Metall.Trans.752,747–755[1971])。在一些实施方案中，掺杂稀土的陶瓷颗粒用作磷光体颗粒。磷光体颗粒可以通过任何合适的方法检测，包括但不限于上转换磷光体技术(UPT)，其中上转换磷光体将低能量红外(IR)辐射转移到高能量可见光。虽然本发明不限于任何特定机制，但在一些实施方案中，UPT通过多光子吸收和掺杂剂依赖性磷光的后续发射将红外光上转换为可见光。参见，例如，2002年6月4日授予Zarling等人的美国专利号6,399,397；van De Rijke,et al.,Nature Biotechnol.19(3):273-6[2001]；Corstjens,et al.,IEE Proc.Nanobiotechnol.152(2):64[2005]，每一篇均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“固体支持物”或“支持物”是指提供另一种材料可以附接于其上的基底结构的任何材料。支持物或基底可以是但不一定是固体。支持材料包括光滑的固体支持物(例如，光滑的金属、玻璃、石英、塑料、硅、晶片、碳(例如，金刚石)和陶瓷表面等)，以及纹理和多孔材料。固体支持物不需要是平的。支持物包括任何类型的形状，包括球形(例如珠)。支持材料还包括但不限于凝胶、水凝胶、气凝胶、橡胶、聚合物和其他多孔和/或非刚性材料。
如本文所用，术语“珠”和“颗粒”可互换使用，并且是指小支持物，通常是固体支持物，当在溶液中时能够四处移动(例如，它的尺寸小于溶液所在的外壳或容器的尺寸)。在一些实施方案中，当溶液未混合(例如，通过摇动、热混合、涡旋)时，珠可以从溶液中沉降出来，而在其他实施方案中，珠可以以胶体方式悬浮于溶液中。在一些实施方案中，珠是完全或部分球形或圆柱形的。然而，珠不限于任何特定的三维形状。在一些实施方案中，珠或颗粒可以是顺磁性的。例如，在一些实施方案中，珠和颗粒包含磁性材料，例如氧化亚铁。
珠或颗粒不限于任何特定尺寸，并且在包含多个颗粒的制备物中，颗粒可以是尺寸(例如，直径)上基本均匀的或者可以是不同尺寸的混合物。在一些实施方案中，珠包含纳米颗粒或由纳米颗粒组成，例如，直径小于约1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm或1nm的颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒珠的平均直径在5和20nm之间。
附接于固体支持物的材料，例如用于免疫沉淀的材料，诸如抗体和抗体结合蛋白，可以附接于固体支持物的任何部分(例如，可以附接于多孔固体支持物材料的内部部分或外部部分，或附接于其他非平坦(非平面)支持物上的平坦或平面部分，反之亦然)。在该技术的优选实施方案中，生物分子诸如核酸或蛋白质分子附接于固体支持物。当生物材料通过化学或物理相互作用固定到固体支持物时，则它“附接”于固体支持物上。在一些实施方案中，附接是通过共价键。然而，附接不必是共价的，也不必是永久的。在一些实施方案中，附接可以通过条件的变化，例如通过温度、离子变化、螯合剂的添加或除去，或表面和结合分子所暴露的溶液条件的其他变化而解除或解离。
在一些实施方案中，材料附接于第一支持物并定位于第二支持物的表面。例如，在一些实施方案中，包含铁或磁性颗粒的材料可以磁性地定位到表面或表面的区域，诸如玻片或孔的平坦表面。
如本文所用，关于例如，用于包被或用于分子的附接的支持物或基底，术语“表面”广义地指可达到目的的支持物或基底的部分。例如，珠或器皿或板的一部分易于被包被、功能化、附接至部分，例如寡核苷酸或其他大分子，或以其他方式处理，可以被认为是珠或板的“表面”，即使该表面位于珠或器皿的内部部分(例如，在孔内、在烧结基质内、在孔内等)。类似地，为柔性的和/或多孔的(例如，水凝胶、气凝胶、网状物)，并且可达到目的，例如，被包被、功能化、附接至部分、衍生化等的基质的一部分，可以被认为是基质的表面。在某些实施方案中，支持物可以包括支持物表面，有时称为第一表面，其是结构支持材料的表面，例如，在没有涂层或改性层的情况下，并且可以进一步包括基底表面，有时称为第二表面，其是在例如通过聚合物涂层或其他涂层来进行支持物表面改性后，可达到目的的表面。在一些实施方案中，基底表面包含能够与一种或多种分析物诸如寡核苷酸或多肽共价或非共价复合的官能团，该分析物包含适合与基底表面官能团复合的反应性或结合基团。
如本文所用，术语“洗涤剂”是指具有润湿剂和乳化剂特性的一组合成的、有机的、液体的或水溶性的剂中的任一者，并且包括阴离子剂(例如，十二烷基硫酸钠、月桂基钠硫酸盐、月桂基硫酸铵)、阳离子(例如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵)直链烷基苯磺酸盐(例如十二烷基苯磺酸钠)、非离子(例如吐温(例如聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯或聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯)；TRITON(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚、类固醇和类固醇糖苷(例如，皂苷、毛地黄皂苷)；和两性离子(净中性)剂，诸如3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS)，化合物。一些实施方案，“洗涤剂”包含剂的混合物，例如，
Figure BDA0004228157810000171
洗涤剂，其包含十二烷基苯磺酸钠、C12-C15醇醚硫酸钠。
在一些实施方案中，靶分子，例如生物材料，通过“间隔分子”或“接头基团”附接至固体支持物。此类间隔分子是具有附接至生物材料的第一部分和附接至固体支持物的第二部分的分子。间隔分子通常包含原子链，例如碳原子，其在第一部分和第二部分之间提供额外的距离。因此，当附接至固体支持物时，间隔分子允许固体支持物和生物材料之间的分离，但同时附接至两者。接头和间隔物的示例包括但不限于碳链，例如C3和C6(己二醇)、1’,2’-双脱氧核糖(dSpacer)；可光解(PC)间隔物；三甘醇(TEG)；和六乙二醇间隔子(Integrated DNA Technologies,Inc.)。
如本文所用，术语“阵列”和“微阵列”是指包含多个预定义座位的表面或容器，这些座位是可寻址的以分析座位，例如以确定测定的结果。在阵列中的座位处的分析不限于任何特定类型的分析并且包括例如用于指示该座位处的结果的原子、分子、化学反应、光或荧光发射、抑制或改变(例如，强度或波长)的检测的分析。预定义座位的示例包括网格或任何其他图案，其中待分析的座位由其在阵列图案中的已知位置确定。例如，微阵列一般性描述于Schena,“Microarray Biochip Technology,”Eaton Publishing,Natick,MA,2000中。阵列的示例包括但不限于具有非随机结合到表面(例如，以网格或其他规则图案)的多个分子的支持物和包含多个定义的反应座位的器皿(例如，孔)，其中可以检测分子或信号生成反应。在一些实施方案中，阵列包括接收珠的孔的图案化分布，例如，如上文针对SIMOA技术所描述的。还参见美国专利号9,057,730；9,556,429；9,481,883；和9,376,677，出于所有目的，其中每篇通过引用整体并入本文。
如本文所用，如在提及座位或位点时使用的术语“分散的”和“分散”，例如，在支持物或表面上，是指分布或散布在表面上或表面周围的座位或位点的集合，其中该座位中的至少一些与其他座位充分分离，使得它们彼此可单独检测或分辨，例如通过检测器诸如显微镜。分散的座位可以是有序排列的，或者它们可以是不规则分布或散布的，如下所述。
如本文所用，如在提及座位或位点的散布或分布，例如，在固体支持物或表面上时使用的术语“不规则”，是指座位以非排列方式分布在表面上或表面中。例如，可以通过应用特定浓度的溶液将分子不规则地分散在表面上，该特定浓度提供表面上分子之间的期望近似平均距离，但是在不由表面上的任何图案或通过应用溶液预定义或可寻址的位置处(例如，喷墨打印)。在此类实施方案中，表面分析可以包括通过检测可能出现的任何地方的信号来找到分子的座位(例如，扫描整个表面以检测表面上任何地方的荧光)。这与仅在预定座位(例如，网格阵列中的点)通过分析表面或容器来定位信号以确定在网格中的每个座位处出现多少(或什么类型)信号形成对比。
如本文所用，关于信号的术语“不同的”是指可以彼此区分的信号，例如，通过光谱特性诸如荧光发射波长、颜色、吸光度、质量、大小、荧光偏振特性、电荷等，或通过与另一部分，诸如与化学试剂、酶、抗体等相互作用的能力。
如本文所用，术语“核酸检测测定法”是指确定感兴趣的核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定法包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性切割分析(例如INVADER测定(Hologic,Inc.))并且描述于例如美国专利号5,846,717；5,985,557；5,994,069；6,001,567；6,090,543和6,872,816；Lyamichev et al.,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall et al.,PNAS,USA,97:8272(2000)和美国专利号9,096,893中，出于所有目的，其中每篇通过引用整体并入本文)；酶错配切割方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，通过引用整体并入本文)；如上所述的聚合酶链式反应(PCR)；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其通过引用整体并入本文)；滚环扩增(例如，美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，通过引用整体并入本文)；称为“RAM放大”的滚环扩增的变异(参见，例如，美国专利5,942,391，通过引用整体并入本文；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，通过引用整体并入本文)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，通过引用整体并入本文)；E传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，通过引用整体并入本文)；循环探针技术(例如，美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，通过引用整体并入本文)；Dade Behring信号放大方法(例如，美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,61，通过引用整体并入本文)；连接酶链反应(例如，BaranyProc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；和夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，通过引用整体并入本文)。
如本文所用，术语“核酸修饰酶”是指催化核酸修饰的酶。例如，DNA链当在DNA聚合酶的作用下延伸、与另一个核酸或核苷酸接合、或当通过连接酶的末端接合作用环化、当被内切核酸酶切割、或当被核酸酶例如外切核酸酶完全或部分消化时被修饰。核酸修饰酶可以通过它们的一般结构识别核酸，而不限于核酸中核苷酸的特定顺序，或者核酸修饰酶的作用可以响应核酸链中的特定核苷酸或核苷酸顺序。
如本文所用，术语“蛋白质相互作用”涵盖多肽链内(例如，在链的折叠中)、多肽链之间(例如，在四级结构或多亚基蛋白质的形成中)，或在多肽和其他样品组分(例如，核酸、脂质、碳水化合物等)之间的相互作用，例如离子键、氢键合、范德华力、疏水和亲水作用。蛋白质相互作用的破坏可以包括使蛋白质变性，例如，以除去或减少催化活性，或可以包括将蛋白质与通常与之缔合的另一分子分离，例如在样品中。
在一些实施方案中，靶核酸经扩增(例如，通过PCR)并且使用侵入性切割测定法同时检测扩增的核酸。配置用于执行与扩增测定组合的检测测定(例如，侵入性切割测定)的测定法描述于美国专利号9,096,893中，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。额外的扩增加侵入性切割检测配置，称为QuARTS方法，描述于例如美国专利号8,361,720；8,715,937；8,916,344；和9,212,392中，出于所有目的，其中每篇通过引用并入本文。如本文所用，术语“侵入性切割结构”是指包含i)靶核酸，ii)上游核酸(例如侵入性或“INVADER”寡核苷酸)，和iii)下游核酸(例如，探针)，其中上游和下游核酸与靶核酸的连续区域退火，并且其中在上游核酸的3’部分与下游核酸和靶核酸之间形成的双链体之间形成重叠。来自上游和下游核酸的一个或多个碱基相对于靶核酸碱基占据相同位置的地方发生重叠，无论上游核酸的重叠碱基是否与靶核酸互补，并且无论这些碱基是天然碱基还是非天然碱基。在一些实施方案中，与下游双链体重叠的上游核酸的3’部分是非碱基化学部分，诸如芳香环结构，例如，如美国专利号6,090,543中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，核酸中的一种或多种可以附接至彼此，例如，通过共价联接诸如核酸茎环，或通过非核酸化学联接(例如，多碳链)。如本文所用，术语“瓣内切核酸酶测定”包括如上所述的“INVADER”侵入性切割测定和QuARTS测定。
如本文所用，术语“数字PCR”、“单个分子PCR”和“单个分子扩增”是指配置为提供来自单个起始分子的扩增产物或信号的PCR和其他核酸扩增方法。通常，样品例如通过连续稀释或通过分成足够小的部分(例如，在微室中或在乳液中)来分开，使得如泊松分布评估的每个部分或稀释物平均不超过单个拷贝的靶核酸。单个分子PCR的方法描述于例如US 6,143,496中，其涉及一种方法，包括将样品分开至多个室，使得至少一个室具有至少一个靶标，并扩增靶标以确定有多少个室具有靶分子；US 6,391,559；其涉及用于容纳和分配流体的组件；和US 7,459,315，其涉及一种将样品分开至具有样品室的组件的方法，其中样品通过与室的表面亲和力分隔，然后用可固化的“置换液”密封室。还参见US6,440,706和US6,753,147，以及Vogelstein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96,pp.9236–9241,August 1999。还参见US 20080254474，其描述了与甲基化检测组合的数字PCR的组合。
如本文所用，术语“测序”是广义的，并且可以指本领域已知的任何技术，该技术允许鉴定核酸的至少部分中的至少一些连续核苷酸的顺序，包括但不限于延伸产物的至少部分或载体插入物。在一些实施方案中，测序允许区分不同靶序列之间的序列差异。示例性测序技术包括靶向测序、单分子实时测序、基于电子显微术的测序、晶体管介导的测序、直接测序、随机鸟枪法测序、Sanger双脱氧终止测序、靶向测序、外显子测序、全基因组测序、通过杂交的测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、凝胶电泳、双重测序、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模并行签名测序(massively parallel signaturesequencing)、乳浊液PCR(emulsion PCR)、低温变性共扩增-PCR(co-amplification atlower denaturation temperature-PCR，COLD-PCR)、多重PCR、通过可逆染料终止子的测序、配对末端测序、近端测序(near-term sequencing)、外切核酸酶测序、通过连接的测序、短读测序(short-read sequencing)、单分子测序、边合成边测序、实时测序、反向终止子测序、离子半导体测序、纳米球测序、纳米孔测序、454测序、Solexa基因组分析仪测序、miSeq(Illumina)、HiSeq 2000(Illumina)、HiSeq 2500(Illumina)、Illumina基因组分析仪(Illumina)、Ion Torrent PGMTM(Life Technologies)、MinIONTM(Oxford NanoporeTechnologies)、实时SMRTTM技术(Pacific Biosciences)、Probe-Anchor Ligation(cPALTM)(Complete Genomics/BGI)、
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测序、MS-PET测序、质谱分析及其组合。在一些实施方案中，测序包括使用仪器检测测序产物，例如但不限于ABI/>
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377 DNA测序仪、/>
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310,3100,3100-Avant,3730或373OxI遗传分析仪、ABI/>
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3700DNA分析仪或Applied Biosystems SOLiDTM系统(均来自Applied Biosystems)、GenomeSequencer 20系统(Roche Applied Science)或质谱仪。在某些实施方案中，测序包括乳浊液PCR。在某些实施方案中，测序包括高通量测序技术，例如但不限于大规模并行签名测序(MPSS)。
如本文所用，关于通过肽键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用。多肽可以是合成的或天然存在的，并且可以是短的，例如，在两个至30个氨基酸残基之间，或者长度可以是数百或数千个氨基酸残基。多肽可以由20种主要的天然氨基酸构成，或可以包含一个或多个非天然氨基酸，例如肽核酸残基，其在肽链主链上包含嘧啶或嘌呤碱基，或天然氨基酸的修饰形式(例如，在侧基结构中进行修饰)。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指抗原结合免疫球蛋白，并且包括单克隆抗体(mAb)和多克隆Ab。该术语进一步包括具有结合抗原的能力的抗体的所有修饰形式，例如包含免疫球蛋白结构部分的片段抗体(fAb)。
如本文所用，术语“免疫沉淀”广泛用于指使用直接或间接固定化在支持物上的抗体(例如，抗体可以通过与附接于支持物上的蛋白质结合来固定化)，从复杂的混合物例如血浆富集或纯化特定材料或抗原(例如蛋白质或蛋白质复合物、dsDNA、RNA、DNA-RNA杂交体或其他核酸等)的方法。参见，例如，“Immunoprecipitation(IP)technical guide andprotocols,Tech Tip#64,Thermo Scientific TR0064.0,(2009)，出于所有目的将其整体并入本文。
如本文所用，术语“凝集素”是指与糖和糖分子(例如，糖蛋白和糖脂上或复杂碳水化合物中的糖部分)特异性结合的一类非抗体蛋白。
如本文所用，术语“反应混合物”是指能够在一段时间内在适当的外部条件下一起反应以产生产物的试剂的混合物。反应混合物可以包含核酸修饰试剂，例如核酸连接试剂、滚环扩增试剂、PCR扩增试剂、瓣测定试剂，其配方在本领域中是独立已知的。
如本文所用，术语“混合物”指元素的组合，其是散在的且不以任何特定顺序。混合物是异质的并且不能在空间上分隔成不同的成分。元素混合物的示例包括溶解或悬浮在同一溶液中的多种不同元素，或溶解/悬浮的元素和附接于固体支持物上的元素的组合，其中附接于支持物上的元素是混合物的溶液部分中溶解或悬浮的元素可接近的。
如本文所用，在提及流体反应混合物的组分中使用的术语“拥挤剂”和“体积排除剂”可互换使用，并且是指减少反应混合物中的可用流体体积，从而增加反应物大分子(例如核酸、酶等)的有效浓度的化合物，通常为聚合物化合物。拥挤试剂包括例如甘油、乙二醇、聚乙二醇、聚蔗糖、血清白蛋白、酪蛋白和葡聚糖。
如本文所用，术语“数字测序”、“单分子测序”和“下一代测序(NGS)”可互换使用并且指确定个体核酸分子的核苷酸序列。用于个体分子测序的系统包括但不限于454 FLXTM或454 TITANIUMTM(Roche)、SOLEXATM/Illumina基因组分析仪(Illumina)、HELISCOPETM单分子测序仪(HelicosBiosciences)和SOLIDTM DNA测序仪(Life Technologies/AppliedBiosystems)仪器，以及Intelligent Biosystems和Pacific Biosystems等公司仍在开发的其他平台。还参见名称为“Non-invasive fetal genetic screening by digitalanalysis”的美国专利号7,888,017，其涉及母体和胎儿DNA(例如cfDNA)的数字分析。
如本文所用，术语“探针”或“杂交探针”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，无论是天然存在于纯化的限制性消化物中还是合成、重组或通过PCR扩增产生，其能够至少部分地与另一个感兴趣的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定序列的检测、鉴定和分离。在一些优选的实施方案中，本发明中使用的探针将标记有“报告分子”，以便在任何检测系统中都是可检测的，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。并非旨在将本发明限于任何特定的检测系统或标记物。
如本文所用，术语“MIP”是指分子倒置探针(或环状捕捉探针)。分子倒置探针(或环状捕捉探针)是核酸分子，其包含一对独特的多核苷酸臂，该臂与靶核酸杂交以形成切口或缺口和多核苷酸接头(例如，通用主链接头)。在一些实施方案中，独特的多核苷酸臂与彼此紧邻的靶链杂交以形成可连接的切口(通常称为“挂锁探针(padlock probe)”)，而在一些实施方案中，必须进一步修饰杂交的MIP(例如，通过聚合酶延伸、碱基切除和/或瓣切割)以形成可连接的切口。形成环状核酸的MIP探针连接通常指示互补靶链的存在。在一些实施方案中，MIP包含一个或多个独特的分子标签(或独特的分子标识符)。在一些实施方案中，MIP可以包含超过一个独特的分子标签，诸如两个独特的分子标签、三个独特的分子标签或更多。在一些实施方案中，每个MIP中的独特多核苷酸臂位于MIP的5’和3’末端，而独特的分子标签和多核苷酸接头位于MIP的5’和3’末端内部。例如，在本公开的一些实施方案中使用的MIP包含以下组分：第一独特多核苷酸臂-第一独特分子标签-多核苷酸接头-任选的第二独特分子标签-第二独特多核苷酸臂。在一些实施方案中，MIP是5’磷酸化的单链核酸(例如，DNA)分子。参见，例如，2016年7月29日提交的WO 2017/020023和2016年7月29日提交的WO 2017/020024，出于所有目的将其中每篇通过引用并入本文。
如本文所用，如例如关于探针核酸中使用的术语“环状核酸”和“环化核酸”，是指例如通过连接在末端接合以形成连续的环状核酸链的核酸链。
独特的分子标签可以是可检测的任何标签，并且可以掺入或附接至核酸(例如，多核苷酸)并允许检测和/或鉴定包含该标签的核酸。在一些实施方案中，标签在测序期间掺入或附接至核酸(例如，通过聚合酶)。标签的非限制性示例包括核酸标签、核酸索引或条形码、放射性标记物(例如，同位素)、金属标记物、荧光标记物、化学发光标记物、磷光标记物、荧光团猝灭剂、染料、蛋白质(例如，酶、抗体或其部分、接头、结合对的成员)等或其组合。在一些实施方案中，特别是测序实施方案中，标签(例如，分子标签)是核苷酸或核苷酸类似物(例如，包含核酸类似物、糖和一到三个磷酸基团的核苷酸)的独特的、已知的和/或可鉴定的序列。在一些实施方案中，标签是六个或更多个连续核苷酸。许多基于荧光团的标签可用于各种不同的激发和发射光谱。任何合适类型和/或数量的荧光团可以用作标签。在一些实施方案中，1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、50个或更多、100个或更多、500个或更多、1000个或更多、10,000个或更多、100,000个或更多不同的标签用于本文描述的方法(例如，核酸检测和/或测序方法)。在一些实施方案中，一种或两种类型的标签(例如，不同的荧光标记物)连接到文库中的每个核酸。在一些实施方案中，染色体特异性标签用于使染色体计数更快或更高效。标签的检测和/或定量可以通过合适的方法、机器或装置进行，其非限制性示例包括流式细胞术、定量聚合酶链反应(qPCR)、凝胶电泳、发光计、荧光计、分光光度计、合适的基因芯片或微阵列分析、Western印迹、质谱、层析、细胞荧光分析、荧光显微术、合适的荧光或数字成像方法、共聚焦激光扫描显微术、激光扫描细胞术、亲和层析、手动批处理模式分离、电场悬浮、合适的核酸测序方法和/或核酸测序装置等及其组合。
在MIP中，独特的多核苷酸臂设计为与核酸靶标中，例如，在RNA、cfDNA(例如胎儿cfDNA)或基因组核酸样品中的特定靶序列(或位点)的上游和下游紧靠杂交。在一些实施方案中，MIP与靶序列的杂交产生无缺口的可连接切口，即MIP的两个臂与靶链中的连续序列杂交，使得在杂交时不形成重叠或缺口。此类零缺口MIP通常称为“挂锁”探针。参见，例如，M.Nilsson,et al.“Padlock probes:circularizing oligonucleotides for localizedDNAdetection”.Science.265(5181):2085–2088(1994)；J.Banér,et al.,Nucleic AcidsRes.,26(22):5073–5078(1998)。在其他实施方案中，杂交的MIP/靶核酸复合物需要修饰以产生可连接的切口。例如，在一些实施方案中，杂交留下缺口，该缺口例如，通过在连接之前聚合酶延伸MIP的3’末端来填充，而在其他实施方案中，杂交形成重叠瓣结构，其必须例如通过瓣内切核酸酶或3’外切核酸酶修饰以产生可连接的切口。在一些实施方案中，MIP包含独特的分子标签，其是随机生成的短核苷酸序列。在一些实施方案中，独特分子标签不与位于基因组核酸片段上或基因组核酸样品中的任何序列或位点杂交。在一些实施方案中，MIP中的多核苷酸接头(或主链接头)在本公开的实施方案中使用的所有MIP中是通用的。
在一些实施方案中，MIP被引入到衍生自测试受试者(或参考受试者)的核酸片段中，以执行对位于核酸样品(如基因组DNA)上的靶序列或位点(或对照序列或位点)的捕捉。在一些实施方案中，片段化有助于通过分子倒置探针捕捉靶核酸。在一些实施方案中，例如，当核酸样品由细胞游离核酸组成时，可能不需要片段化来改善分子倒置探针对靶核酸的捕捉。例如，在一些类型的样品中，细胞游离核酸在样品中被片段化，因此进一步的片段化是不必要的，甚至可能对靶核酸的捕捉有害。如本文更详细描述的，在捕捉感兴趣的靶序列(例如，基因座)之后，可以使捕捉的靶标经受酶促缺口填充和连接步骤，以便将靶序列的拷贝掺入环样结构。在一些实施方案中，例如含有标记物、半抗原等的核酸类似物可以掺入填充的部分中，用于例如下游检测、纯化或其他处理步骤中。在一些实施方案中，可以通过延长杂交和缺口填充温育期来提高MIP对核酸片段上靶序列的捕捉效率。(参见，例如，Turner E H,et al.,Nat Methods.2009Apr.6:1-2.)。
在一些实施方案中，根据本公开用于捕捉靶位点或靶序列的MIP包含以下组分：
第一靶向多核苷酸臂——第一独特靶向分子标签——多核苷酸接头——任选的第二独特靶向分子标签——第二靶向多核苷酸臂。
在一些实施方案中，本公开中用于捕捉对照位点或对照序列的MIP包含以下组分：
第一对照多核苷酸臂——第一独特对照分子标签——多核苷酸接头——任选的第二独特对照分子标签——第二对照多核苷酸臂。
MIP技术可以用于检测或扩增复杂混合物中的特定核酸序列。使用MIP技术的优势之一在于其高度多路复用的能力，其允许在包含数千个MIP的单个反应中捕捉数千个靶序列。MIP技术的各个方面描述于，例如，Hardenbol et al.,“Multiplexed genotyping withsequence-tagged molecular inversion probes,”Nature Biotechnology,21(6):673-678(2003)；Hardenbol et al.,“Highly multiplexed molecular inversion probegenotyping:Over 10,000targeted SNPs genotyped in a single tube assay,”GenomeResearch,15:269-275(2005)；Burmester et al.,“DMET microarray technology forpharmacogenomics-based personalized medicine,”Methods in Molecular Biology,632:99-124(2010)；Sissung et al.,“Clinical pharmacology and pharmacogeneticsin a genomics era:the DMET platform,”Pharmacogenomics,11(1):89-103(2010)；Deeken,“The Affymetrix DMET platform and pharmacogenetics in drugdevelopment,”Current Opinion in Molecular Therapeutics,11(3):260-268(2009)；Wang et al.,“High quality copy number and genotype data from FFPE samplesusing Molecular Inversion Probe(MIP)microarrays,”BMC Medical Genomics,2:8(2009)；Wang et al.,“Analysis of molecular inversion probe performance forallele copy number determination,”Genome Biology,8(11):R246(2007)；Ji et al.,“Molecular inversion probe analysis of gene copy alternations revealsdistinct categories of colorectal carcinoma,”Cancer Research,66(16):7910-7919(2006)；和Wang et al.,“Allele quantification using molecular inversion probes(MIP),”Nucleic Acids Research,33(21):e183(2005)，出于所有目的，其中每篇通过引用整体在此并入。还参见美国专利号6,858,412；5,817,921；6,558,928；7,320,860；7,351,528；5,866,337；6,027,889和6,852,487，出于所有目的，其中每篇通过引用整体在此并入。
MIP技术先前已成功应用于其他研究领域，包括癌症生物标志物的新鉴定和亚分类。参见，例如，Brewster et al.,“Copy number imbalances between screen-andsymptom-detected breast cancers and impact on disease-free survival,”CancerPrevention Research,4(10):1609-1616(2011)；Geiersbach et al.,“Unknown partnerfor USP6 and unusual SS18 rearrangement detected by fluorescence in situhybridization in a solid aneurysmal bone cyst,”Cancer Genetics,204(4):195-202(2011)；Schiffman et al.,“Oncogenic BRAF mutation with CDKN2Ainactivation ischaracteristic of a subset of pediatric malignant astrocytomas,”CancerResearch,70(2):512-519(2010)；Schiffman et al.,“Molecular inversion probesreveal patterns of 9p21 deletion and copy number aberrations in childhoodleukemia,”Cancer Genetics and Cytogenetics,193(1):9-18(2009)；Press et al.,“Ovarian carcinomas with genetic and epigenetic BRCA1loss have distinctmolecular abnormalities,”BMC Cancer,8:17(2008)；和Deeken et al.,“Apharmacogenetic study of docetaxel and thalidomide in patients withcastration-resistant prostate cancer using the DMET genotyping platform,”Pharmacogenomics,10(3):191-199(2009)，出于所有目的，其中每篇通过引用整体在此并入。
MIP技术也已经应用于新药相关生物标志物的鉴定。参见，例如，Caldwell etal.,“CYP4F2 genetic variant alters required warfarin dose,”Blood,111(8):4106-4112(2008)；和McDonald et al.,“CYP4F2 Is a Vitamin K1 Oxidase:An Explanationfor Altered Warfarin Dose in Carriers of the V433M Variant,”MolecularPharmacology,75:1337-1346(2009)，出于所有目的，其中每篇通过引用整体在此并入。其他MIP应用包括药物开发和安全性研究。参见，例如，Mega et al.,“Cytochrome P-450Polymorphisms and Response to Clopidogrel,”New England Journal ofMedicine,360(4):354-362(2009)；Dumaual et al.,“Comprehensive assessment ofmetabolic enzyme and transporter genes using the Affymetrix TargetedGenotyping System,”Pharmacogenomics,8(3):293-305(2007)；和Daly et al.,“Multiplex assay for comprehensive genotyping of genes involved in drugmetabolism,excretion,and transport,”Clinical Chemistry,53(7):1222-1230(2007)，出于所有目的，其中每篇通过引用整体在此并入。MIP技术的进一步应用包括基因型和表型数据库。参见，例如，Man et al.,“Genetic Variation in Metabolizing Enzyme andTransporter Genes:Comprehensive Assessment in 3Major East AsianSubpopulations with Comparison to Caucasians and Africans,”Journal ofClinical Pharmacology,50(8):929-940(2010)，出于所有目的，其中每篇通过引用整体在此并入。
如本文所用，关于MIP探针的术语“捕捉”或“捕捉”是指分子倒置探针与其对应的靶向位点之间的结合或杂交反应。在一些实施方案中，在捕捉时，产生或形成环状复制子或MIP复制子。在一些实施方案中，靶向位点是缺失(例如，一个或多个外显子的部分或完全缺失)。在一些实施方案中，靶MIP设计成与感兴趣的天然存在的(例如，野生型)基因组区域结合或杂交，靶缺失预期位于该区域。靶MIP设计为不与表现出缺失的基因组区域结合。在这些实施方案中，预期不发生靶MIP和缺失的靶位点之间的结合或杂交。此类结合或杂交的不存在指示靶缺失的存在。在这些实施方案中，短语“捕捉靶位点”或短语“捕捉靶序列”是指通过检测此类结合或杂交的不存在来检测靶缺失。如在提及其他寡核苷酸时使用的，例如，“捕捉寡核苷酸”，该术语是指捕捉寡核苷酸与待捕捉的核酸之间的结合或杂交反应，例如，待固定化、从溶液中除去或以其他方式被操作与捕捉寡核苷酸杂交。
如在提及分离细胞游离核酸(例如，cfDNA)时使用的，术语“捕捉”或“正在捕捉”是指细胞游离核酸与第二剂(例如，寡核苷酸或抗体)的结合以形成可从样品中的其他组合中分离的复合物。核酸，例如与识别并结合作为同源抗原的dsDNA的抗体形成复合物的dsDNA，可以称为被抗体“捕捉”或“捕捉”在抗dsDNA抗体-DNA复合物中。
如本文所用，关于抗dsDNA抗体，术语“外源性的”是指从不同于含有cfDNA或已从其中捕获cfDNA的来源或样品的来源分离和纯化的抗dsDNA抗体。例如，在某种程度上，从受试者收集的样品包含来自受试者身体的抗dsDNA抗体，例如，由受试者的免疫系统产生或治疗性地施用于受试者的，任何抗dsDNA抗体在样品中不是“外源性的”，而是对该受试者“内源性的”。包含在用于从样品中分离cfDNA的系统或试剂盒中的抗dsDNA抗体通常相对于来自不同于从其分离抗dsDNA抗体的受试者的任何受试者的样品是固有外源性的。重组抗dsDNA抗体，例如在微生物宿主中表达或体外合成的抗体，被认为对来自人或其他动物受试者的任何样品是外源性的。
如本文所用，术语“MIP复制子”或“循环复制子”是指经由捕捉反应(例如，MIP与其靶向序列之间的结合或杂交反应)生成的环状核酸分子。在一些实施方案中，MIP复制子是单链环状核酸分子。在一些实施方案中，靶向MIP捕捉或杂交至靶序列或位点。在捕捉反应或杂交之后，在一些实施方案中，引入连接反应混合物以连接由两个靶向多核苷酸臂的杂交形成的切口以形成单链环状核苷酸分子，即靶向MIP复制子，而在一些实施方案中，MIP的杂交留下缺口，并且引入连接/延伸混合物以延伸和连接两个靶向多核苷酸臂之间的缺口区域以形成靶向MIP复制子。在一些实施方案中，对照MIP捕捉或杂交至对照序列或位点。在捕捉反应或杂交后，引入连接反应混合物以连接由两个对照多核苷酸臂的杂交形成的切口，或引入连接/延伸混合物以延伸和连接两个对照多核苷酸臂之间的缺口区域以形成单链环状核苷酸分子，即对照MIP复制子。MIP复制子可以通过聚合酶链式反应(PCR)扩增以产生多个靶向MIP扩增子，它们是双链核酸分子。MIP复制子在滚环扩增或RCA中有特殊应用。RCA是等温核酸扩增技术，其中DNA聚合酶将单个核苷酸连续添加到与环状模板退火的引物中，从而产生含有数十至数百至数千个串联重复(与环状模板互补)的单链DNA的长串联体。参见，例如，M.Ali,et al.“Rolling circle amplification:a versatile tool forchemical biology,materials science and medicine”.Chemical Society Reviews.43(10):3324–3341，出于所有目的，其通过引用整体并入本文。还参见WO 2015/083002，出于所有目的，其通过引用整体并入本文。
RCA中通常用于DNA扩增的聚合酶是Phi29、Bst和Vent外切DNA聚合酶，Phi29 DNA聚合酶因其出色的持续合成能力和链置换能力而是优选的。
如本文所用，术语“扩增子”是指经由扩增反应(例如，PCR反应)生成的核酸。在一些实施方案中，扩增子是单链核酸分子。在一些实施方案中，扩增子是双链核酸分子。在一些实施方案中，使用常规技术扩增靶向MIP复制子以产生多个靶向MIP扩增子，它们是双链核苷酸分子。在一些实施方案中，使用常规技术扩增对照MIP复制子以产生多个对照MIP扩增子，它们是双链核苷酸分子。
当关于瓣测定(例如，INVADER侵入性切割测定)使用时，术语“探针寡核苷酸”或“瓣寡核苷酸”是指在存在侵入性寡核苷酸的情况下与靶核酸相互作用以形成切割结构的寡核苷酸。
术语“侵入性寡核苷酸”是指在与探针和靶核酸之间杂交的区域相邻的位置处与靶核酸杂交的寡核苷酸，其中侵入性寡核苷酸的3’末端包含与探针和靶标之间杂交的区域重叠的部分(例如，化学部分，或一个或多个核苷酸)。侵入性寡核苷酸的3’末端核苷酸可能与或可能不与靶标中的核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，侵入性寡核苷酸在其3’末端包含的序列与位于与靶链退火的探针寡核苷酸的部分的5’末端处的序列基本上相同。
如本文所用，术语“瓣内切核酸酶”或“FEN”是指一类核酸酶，通常为5’核酸酶，其在具有含有由另一条核酸链置换的链之一上(例如，使得在单链和双链DNA之间的接合处存在重叠的核苷酸)的单链5’突出端或瓣的双链体的DNA结构上充当结构特异性内切核酸酶。FEN催化单链和双链DNA接合处磷酸二酯键的水解切割，释放突出端或瓣。Flap内切核酸酶由Ceska和Savers(Trends Biochem.Sci.1998 23:331-336)和Liu等人(Annu.Rev.Biochem.200473:589-615；通过引用整体并入本文)综述。FEN可以是单个酶、多亚基酶，或者可以作为另一种酶或蛋白质复合物(例如DNA聚合酶)的活性存在。
瓣内切核酸酶可以是热稳定的。例如，来自档案嗜热生物体的FEN-1瓣状内切核酸酶是典型的热稳定酶。如本文所用，术语“FEN-1”是指来自真核生物或古细菌生物体的非聚合酶瓣内切核酸酶。参见，例如，WO 02/070755和Kaiser M.W.,et al.(1999)J.Biol.Chem.,274:21387，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“切割的瓣”是指作为瓣测定的切割产物的单链寡核苷酸。
当用于提及瓣切割反应时，术语“盒”是指寡核苷酸或寡核苷酸的组合，其配置为响应于瓣或探针寡核苷酸的切割而生成可检测信号，例如，在瓣裂解测定中在一级或第一切割结构中形成。在优选的实施方案中，盒与通过瓣寡核苷酸的切割产生的非靶切割产物杂交以形成第二重叠切割结构，使得盒然后可以由相同的酶例如FEN-1内切核酸酶切割。
在一些实施方案中，盒是包含发夹部分的单一寡核苷酸(即，其中盒寡核苷酸的一个部分在反应条件下与相同寡核苷酸的第二部分杂交以形成双链体的区域)。在其他实施方案中，盒包含至少两个寡核苷酸，该寡核苷酸包含可以在反应条件下形成双链体的互补部分。在优选的实施方案中，盒包含标记物，例如荧光团。在特别优选的实施方案中，盒包含产生FRET效应的经标记部分。在此类实施方案中，盒可以称为“FRET盒”。参见，例如，2015年8月4日发布的US 9,096,893，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，如提及探针瓣或臂所用的短语“基本上不互补”是指瓣部分充分非互补以不会与核酸序列，例如靶核酸或扩增的DNA选择性杂交，在指定的退火条件或严格条件下，涵盖术语“基本上非互补”和“完全非互补”。
如本文所用，术语“信号”是指任何可检测的效果，诸如将由标记物或由组分或产物在测定反应中的作用或积累引起或提供的。
如本文所用，术语“检测器”是指系统或系统的组件，例如仪器(例如照相机、荧光计、电荷耦合装置、闪烁计数器、固态纳米孔装置等)或反应介质(X射线或相机胶卷、pH指示剂等)，其可以向用户或系统的另一个组件(例如，计算机或控制器)传达信号或效应的存在。检测器不限于特定类型的所检测信号，并且可以是光度或分光光度系统，其可以检测紫外光、可见光或红外光，包括荧光或化学发光；辐射探测系统；电荷检测系统；用于检测电子信号的系统，例如电流或电荷扰动；光谱系统诸如核磁共振光谱、质谱或表面增强拉曼光谱；系统诸如凝胶或毛细管电泳或凝胶排阻层析；或本领域已知的其他检测系统，或其组合。
如本文所用，术语“检测”是指定量或定性鉴定例如样品内的分析物(例如DNA、RNA或蛋白质)。如本文所用，术语“检测测定”是指出于检测样品内的分析物的目的而执行的试剂盒、测试或规程。当在靶分析物存在的情况下执行时，检测测定产生可检测的信号或效应，并且包括但不限于结合杂交、核酸切割(例如外切或内切核酸酶)、核酸扩增、核苷酸测序、引物延伸、核酸连接、抗原-抗体结合、一抗与二抗的相互作用和/或核酸(例如，寡核苷酸)或多肽(例如，蛋白质或小肽)的构象变化的过程的测定。
如本文所用，术语“产前或妊娠相关疾病或病症”是指影响孕妇、胚胎或胎儿的任何疾病、病症或病况。产前或妊娠相关病症还可以指与妊娠相关联或直接或间接因妊娠引起的任何疾病、病症或病况。这些疾病或病况可以包括任何和所有出生缺陷、先天性疾病或遗传性疾病或病况。产前或妊娠相关疾病的示例包括但不限于恒河猴病(Rhesusdisease)、新生儿溶血病、β-地中海贫血、性别决定、妊娠决定、遗传性孟德尔遗传病、染色体畸变、胎儿染色体非整倍性、胎儿染色体三体、胎儿染色体单体、8号三体、13号三体(Patau综合征)、16号三体、18号三体(Edwards综合征)、21号三体(唐氏综合征)、X染色体相关疾病、X三体(XXX综合征)、X单体(特纳综合征)、XXY综合征、XYY综合征、XYY综合征、XXXY综合征、XXYY综合征、XYYY综合征、XXXXX综合征、XXXXY综合征、XXXYY综合征、XXYYY综合征、脆性X综合征、胎儿生长受限、囊性纤维化、血红蛋白病、胎儿死亡、胎儿酒精综合征、镰状细胞性贫血、血友病、Klinefelter综合征、dup(17)(p11.2p1.2)综合征、子宫内膜异位症、Pelizaeus-Merzbacher病、dup(22)(q11.2q11.2)综合征、猫眼综合征、cri-du-chat综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Williams-Beuren综合征、Charcot-Marie-Tooth病、压迫易感性神经病(neuropathy with liability to pressure palsies)、Smith-Magenis综合征、神经纤维瘤病、Alagille综合征、Velocardiofacial综合征、DiGeorge综合征、类固醇硫酸酯酶缺乏症、Prader-Willi综合征、Kallmann综合征、小眼症伴线性皮肤缺损、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、Pelizaeus-Merzbacher病、Y上的睾丸决定因子、无精子症(因子a)、无精子症(因子b)、无精子症(因子c)、1p36缺失、苯丙酮尿症、泰-萨克斯病、肾上腺增生症、范科尼贫血症、脊髓性肌萎缩症、杜兴氏肌营养不良症、亨廷顿氏病、肌强直性营养不良症、罗伯逊易位症、天使综合征、结节性硬化症、共济失调性毛细血管扩张症、开放性脊柱裂、神经管缺陷、腹壁缺陷、小于胎龄儿、先天性巨细胞病毒、软骨发育不全、马凡氏综合征、先天性甲状腺功能减退症、先天性弓形虫病、生物素酶缺乏症、半乳糖血症、枫糖尿症、同型半胱氨酸尿症、中链酰基辅酶A脱氢酶缺陷、结构性出生缺陷、心脏缺陷、四肢异常、马蹄内翻足(club foot)、无脑畸形(anencephaly)，无嗅脑畸形(arhinencephaly)/前脑无裂畸形(holoprosencephaly)、脑积水、无眼症/小眼症、无耳症/小耳症、大血管转位、法洛四联症、左心发育不全综合征、主动脉缩窄、腭裂不伴唇裂的、唇裂伴或不伴腭裂、食管闭锁/狭窄伴或不伴瘘管、小肠闭锁/狭窄、肛门直肠闭锁/狭窄、尿道下裂、性别不定、肾发育不全、囊肿肾、轴前多指症(preaxial polydactyly)、肢体缩小缺陷(limb reduction defects)、膈疝、失明、白内障、视力问题、听力损失、耳聋、X连锁肾上腺白质营养不良、雷特综合征、溶酶体疾病、脑瘫、自闭症、无舌畸形(aglossia)、白化病、眼白化病、眼皮肤白化病、妊娠糖尿病，Arnold-Chiari畸形、CHARGE综合征、先天性膈疝、短指(brachydactlia)、无虹膜(aniridia)、足裂和手裂、异色症、矮耳症(Dwarnian ear)、Ehlers Danlos综合征、大疱性表皮松解症、Gorham病、桥本氏综合征、胎儿水肿、张力减退(hypotonia)、Klippel-Feil综合征、肌肉萎缩症、成骨不全症、早衰症、Smith Lemli Opitz综合征、色盲、X连锁淋巴组织增生性疾病、脐疝(omphalocele)、腹裂(gastroschisis)、先兆子痫、子痫、早产临产(pre-term labor)、早产(premature birth)、流产、宫内发育迟缓、异位妊娠、妊娠剧吐、晨吐或成功引产可能性。
在一些NIPT实施方案中，本文所述的技术还包括估计样品的胎儿分数，其中胎儿分数用于帮助确定来自测试受试者的遗传数据是否指示非整倍性。用于确定或计算胎儿分数的方法是本领域已知的。
如本文所用，术语“有效检测测定”是指已显示可精确预测靶标检测与表型(例如医学状况)之间关联的检测测定。有效检测测定的示例包括但不限于，当检测到靶标时，精确预测医学表型95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％或99.9％的次数的检测测定。有效检测测定的其他示例包括但不限于作为分析物特异性试剂(即由FDA法规定义)或体外诊断(即经FDA批准)合格和/或销售的检测测定。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。在反应测定的上下文中，此类递送系统包括允许从一个位置到另一个位置的反应试剂(例如，适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液、执行测定的书面说明等)的储存、运输或递送。例如，试剂盒包含含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如，盒子)。如本文所用，术语“碎片化试剂盒”是指包含两个或更多个单独容器的递送系统，这些容器各自含有总试剂盒组分的子部分。容器可以一起或分开地递送给预期的接收者。例如，第一容器可以含有用于测定的酶，而第二容器含有寡核苷酸。术语“碎片化试剂盒”旨在涵盖包含美国联邦食品、药品和化妆品法案第520(e)节规定的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。事实上，包含两个或更多个单独容器的任何递送系统都包含在术语“碎片化试剂盒”中，这些容器各自含有总试剂盒成分的子部分。相反，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳期望组分中的每一者的单个盒子中)含有反应测定的所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括碎片化试剂盒和组合试剂盒。
如本文所用，术语“信息”是指事实或数据的任何集合。关于使用计算机系统(包括但不限于互联网)存储或处理的信息，该术语是指以任何格式(例如，模拟、数字、光学等)存储的任何数据。如本文所用，术语“与受试者相关的信息”是指附属于受试者(例如，人、植物或动物)的事实或数据。术语“基因组信息”是指附属于基因组的信息，包括但不限于核酸序列、基因、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白质表达、与基因型相关的表型等。“等位基因频率信息”是指有关等位基因频率的事实或数据，包括但不限于等位基因身份、等位基因的存在与受试者(例如人受试者)特征之间的统计相关性、个体或群体中等位基因的存在或不存在、等位基因存在于具有一个或多个特定特征的个体中的可能性百分比等。
如本文所用，术语“测定验证信息”是指由测试结果数据的处理(例如借助计算机处理)产生的基因组信息和/或等位基因频率信息。测定验证信息可以用于例如将特定候选检测测定鉴定为有效检测测定。
附图简述
专利或申请文件含有至少一张彩色绘图。专利局将在请求并支付必要的费用后提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1显示了用于富集胎儿cfDNA的方法的示例性工作流程和合适的下游步骤(例如，验证和确定获得的cfDNA的胎儿分数)。
图2显示了使用Triton X-100作为洗涤剂比较遵循不同胎儿cfDNA富集方案的DNA产率的Agilent TapeStation(Agilent目录号5067-5584)凝胶。泳道如下：
A0-DNA梯
A1-无输入cfDNA，经受J Med Screen,2020 Mar；27(1):1-8(其全部内容通过引用并入本文)中描述的纯化方案。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如所述执行。扩增的DNA用作凝胶的模板。
B1-cfDNA经受与泳道A1相同的方案。输入是2mL含有cfDNA的血浆。
C1-含有cfDNA的样品(200μL血浆)与抗dsDNA抗体一起温育而无需用顺磁珠进行后续免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤使用上述泳道A1(和B1)的方案执行，没有初始的DynaBeadTMc fDNA纯化步骤。
D1-含有cfDNA的样品(200μL血浆)遵循泳道A1中使用的方案纯化。
E1-对照样品(无cfDNA输入)与抗dsDNA抗体一起温育并使用蛋白G顺磁珠(NewEngland Biolabs，目录号S1430S)进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤使用上述泳道A1的方案执行，没有初始的DynaBeadTM cfDNA纯化步骤。
F1-从患者#1分离的含有cfDNA的样品(200μL血浆)与抗dsDNA抗体一起温育，并使用蛋白G顺磁珠(New England Biolabs，目录号S1430S)进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤使用上述泳道A1的方案执行，没有初始的DynaBeadTM cfDNA纯化步骤。
G1-从患者#2分离出的含有cfDNA的样品(200μL血浆)与抗dsDNA抗体一起温育，并使用蛋白G顺磁珠(New England Biolabs，目录号S1430S)进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤使用上述泳道A1的方案执行，没有初始的DynaBeadTM cfDNA纯化步骤。
图3显示了使用Triton X-100作为洗涤剂比较遵循不同胎儿cfDNA富集方案的DNA产率的Agilent TapeStation(Agilent目录号5067-5584)凝胶。对于每条泳道，血浆合并自三个个体。泳道如下：
A0-DNA梯
A1-2mL血浆经受J Med Screen,2020 Mar；27(1):1-8中描述的纯化方案。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如所述执行。扩增的DNA用作凝胶的模板。
B1-2mL血浆经受描述用于泳道A1的方案，但反应物中添加蛋白G和蛋白A珠。
C1-200μL血浆与抗ssDNA抗体一起温育并用蛋白G珠进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如泳道A1中那样执行。
D1-200μL血浆与抗ssDNA抗体一起温育。没有执行蛋白G免疫沉淀步骤。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如泳道A1中那样执行。
E1-200μL血浆与抗dsDNA抗体一起温育并用蛋白G珠进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如泳道A1中那样执行。
F1-200μL血浆与抗dsDNA抗体一起温育。没有执行蛋白G免疫沉淀步骤。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如泳道A1中那样执行。
图4显示了比较使用标准纯化制备的cfDNA与使用如本文所述的抗dsDNA抗体处理制备的cfDNA的胎儿cfDNA产率(胎儿分数)的表格。通过指示的三种方法测量胎儿分数。
发明详述
在一些方面，本文提供了用于从样品例如血浆样品中分离细胞游离DNA的组合物和方法。在特定的实施方案中，该技术提供了用于从血浆中捕捉细胞游离DNA并且例如在核酸检测测定中分析捕捉的细胞游离DNA的方法和组合物，而无需干预醇沉淀、离液剂处理或者盐或pH介导的DNA吸附到基质，例如柱基质、过滤器或颗粒。
在一些实施方案中，本文提供了用于分离血浆中的膜结合区室以进行后续cfDNA分析的不同生化富集方法。本发明使用膜结合的细胞游离DNA的差异纯化来选择独特的DNA来源。在一些实施方案中，在分离cfDNA期间使用的特定洗涤剂允许分离不同的膜结合区室。膜在各种洗涤剂中区别地溶解，如Schuck et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:10中所报道，其全部内容通过引用并入本文。例如，使用Triton X-100溶解对洗涤剂敏感的膜，但不溶解富含胆固醇的膜(例如，洗涤剂抗性膜)。因此，使用不含胆固醇的溶解膜的洗涤剂能够从血浆中选择独特的DNA来源。虽然从血浆中分离出的细胞游离DNA衍生自体内许多细胞的细胞死亡，但已显示胎儿细胞游离DNA起源于滋养层细胞。通过从血浆中分离膜区室，选择性分离细胞游离DNA可以产生更高百分比的胎儿细胞游离DNA。
在一些方面，本文提供了用于提供来自母体样品的细胞游离DNA的制备物的组合物和方法，其中分离的细胞游离DNA是胎儿DNA的级分增加或富集。
在一些方面，本文提供了用于从样品中分离cfDNA的方法，其包括使样品与抗dsDNA抗体接触，使用Triton X-100溶解缺乏胆固醇的膜，以及从样品中分离cfDNA。在从样品中分离cfDNA之前执行将样品与抗dsDNA抗体接触的步骤。
在一些方面，本文提供了用于提供来自需要评估一种或多种疾病状态的受试者的细胞游离DNA的制备物的组合物和方法。疾病状态可以是移植排斥。例如，本文所述的组合物和方法可以用于提供来自受试者的含有自身和非自身(例如，供体衍生)cfDNA的细胞游离DNA的制备物。此类制备物可以用于评估受试者中移植排斥的风险的方法中。例如，超过阈值的供体衍生cfDNA的水平可以用于量化受试者中移植排斥的风险。
在一些实施方案中，疾病状态可以是癌症。例如，本文所述的组合物和方法可以用于提供含有衍生自受试者内正常细胞更新的cfDNA和肿瘤衍生cfDNA的细胞游离DNA的制备物。肿瘤衍生cfDNA的存在和/或量可以用于诊断和/或预测受试者中的癌症进展。在一些实施方案中，肿瘤衍生cfDNA的存在和/或量可以用于诊断和/或预测受试者中癌症复发的风险。
在一些实施方案中，样品是组织样品。在一些实施方案中，样品是生物流体。在一些实施方案中，样品是尿液、血液、血清或血浆。在特定的实施方案中，样品是血浆样品。样品可以获得自妊娠受试者。
“抗dsDNA抗体”可以是优先与双链DNA结合的任何合适的抗体。在一些实施方案中，与单链DNA(ssDNA)相比，抗dsDNA抗体对双链DNA具有更高的结合亲和力。在一些实施方案中，抗dsDNA抗体不具有可检测的与ssDNA的结合。在一些实施方案中，抗dsDNA抗体不具有可检测的与RNA的结合。在一些实施方案中，抗dsDNA抗体可以从合适的供应商处购买。抗dsDNA抗体可以是任何形式或制备物，例如，它可以是或包含天然抗体、重组抗体、片段抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，或抗体形式或制备物的其他变体。
在一些方面，免疫沉淀步骤中使用的洗涤剂将使某些膜透化，从而允许抗体接近并结合先前由膜闭塞的DNA。在特定的实施方案中，Triton X-100(Millipore-Sigma目录号9002-93-1)在DNA分离期间用作洗涤剂以透化不含胆固醇的膜。在特定的实施方案中，用于透化膜的合适洗涤剂包括SDS、皂苷、CHAPS、Tween20、Brij 96、Brij 98和Lubrol洗涤剂。使用此类洗涤剂可能能够增强在由特定细胞膜类型所包围的区室内发现的胎儿cfDNA。例如，胎儿cfDNA可能存在于由被此类洗涤剂透化的膜(例如，无胆固醇膜)所包围的区室内。
在实施方案中，本文所述的方法可以用于捕捉循环cfDNA。例如，循环cfDNA可能是从同种异体移植物中释放的供体衍生cfDNA。作为另一个示例，循环cfDNA可以是从癌性肿瘤中释放的肿瘤衍生cfDNA。在此类实施方案中，抗dsDNA抗体可以有效地结合循环cfDNA以形成DNA-抗体复合物，而不需要在cfDNA分离步骤中使用特定的洗涤剂。
如本文所用，抗dsDNA抗体是不同形式的抗体，其对DNA的特定修饰，例如甲基化碱基具有特异性。如本文所用，抗dsDNA抗体是指结合dsDNA的抗体，无论甲基化状态如何。该技术的抗dsDNA抗体也可能与单链DNA具有强反应性。例如，在一些实施方案中，使用来自Abcam,Discovery Drive,Cambridge Biomedical Campus,Cambridge,CB2 0AX,UK的抗dsDNA抗体[35I9 DNA]，产品编号ab27156。该抗体是针对dsDNA的小鼠单克隆抗体，对双链DNA具有主要特异性，通过免疫CE测量得出该抗体与ssDNA和dsDNA相互作用的KD分别为0.71μM和0.09μM。斑点印迹上已观察到与ssDNA和dsDNA两者的强烈反应，以及与RNA的非常弱的反应性。该抗体的DNA结合的最小大小为>16个碱基。
使样品与抗dsDNA抗体接触可以包括在促进抗体与双链DNA结合的条件下将样品与抗体温育合适的持续时间。例如，样品可以与抗体温育1分钟至24小时。例如，样品可以与抗体温育1分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、12小时、24小时或48小时。
在一些实施方案中，样品可以在与抗dsDNA抗体接触之前、同时或之后与一种或多种合适的试剂接触。这些额外的试剂可以与含有抗dsDNA抗体的组合物分别地与样品接触。替代地，一种或多种合适的额外试剂可以包括在含有抗dsDNA抗体的组合物中。合适的试剂包括缓冲液、盐、洗涤剂、防腐剂、抑制剂等。在一些实施方案中，作为cfDNA分离方案的一部分，此类试剂在与抗dsDNA抗体温育后添加到样品中。
在将样品与抗dsDNA抗体接触后，cfDNA从样品中分离。例如，抗dsDNA抗体可能与样品中的cfDNA结合，从而产生DNA-抗体复合物。DNA-抗体复合物可以从样品中分离(例如免疫沉淀)。可以采用后续处理步骤(例如，加热、杂交捕捉期间的变性等)以从cfDNA中除去抗体，以允许将富集的cfDNA用于下游NIPT方法。
cfDNA-抗体复合物可以通过任何合适的方法从样品中分离。例如，可以使用与复合物中的抗体结合的抗体结合蛋白从样品中分离DNA-抗体复合物。例如，DNA-抗体复合物可以使用“抗体结合试剂”，例如抗体结合蛋白，例如细菌蛋白，例如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L从样品中分离。在一些实施方案中，抗体结合蛋白对缀合至抗体的实体具有亲和力。例如，抗体可以经生物素化并且抗体结合蛋白可以对生物素具有亲和力。例如，抗体可以经生物素化并且可以使用亲和素/链霉亲和素来分离DNA-抗体复合物。
抗体结合蛋白可以固定化在合适的底物/支持物上。合适的支持物包括固体支持物(例如，光滑的金属、玻璃、石英、塑料、硅、晶片、碳(例如，金刚石)和陶瓷表面等)，以及纹理和多孔材料。在一些实施方案中，支持物是珠(例如顺磁珠或磁珠)。支持材料还包括但不限于凝胶、水凝胶、气凝胶、橡胶、聚合物和其他多孔和/或非刚性材料。
在一些实施方案中，cfDNA可以使用市售的用于cfDNA分离的试剂盒来分离。合适的试剂盒可通过各种供应商获得，包括ThermoFisher Scientific(例如，MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit)；Qiagen(例如，QIAsymphony PAXgene Blood ccfDNA试剂盒、QIAamp ccf/DNA/RNA试剂盒等)，以及其他。可以修改合适的试剂盒和使用它们的方案以优化cfDNA富集。
在一些实施方案中，与在cfDNA分离之前未接触抗dsDNA抗体的样品相比，本文提供的方法导致细胞游离DNA的富集浓度或量。细胞游离DNA可以包括自身cfDNA、肿瘤衍生cfDNA、胎儿cfDNA和/或供体衍生cfDNA。
在一些实施方案中，与在cfDNA分离之前未接触抗dsDNA抗体的样品相比，本文提供的方法导致细胞游离胎儿DNA的富集浓度或量。DNA包裹在蛋白质中，因此阻止从血浆中轻松纯化。传统的cfDNA分离方法使用苛刻的溶液(离液盐、pH、苛刻的洗涤剂)使蛋白质变性以释放DNA来将DNA和蛋白质分开，用于使用标准沉淀方法(PEG、乙醇等)进行后续纯化。相比之下，本文描述的方法使用抗dsDNA抗体结合DNA，以及后续的免疫沉淀步骤将整个DNA-蛋白质-抗体复合物从血浆中拉出。后续的处理步骤从复合物中除去蛋白质和/或DNA，留下富集的cfDNA级分。不希望受理论的束缚，有可能标准cfDNA分离方案可能足以捕捉母体cfDNA，但导致胎儿cfDNA回收的显著损失，因为已知胎儿cfDNA片段比母体cfDNA短(参见Chan et al.,2004,Clinical Chemistry 50:1 88-92，其全部内容通过引用并入本文)。相比之下，本文描述的更温和的方法可能更有效地防止这些较短的cfDNA片段在处理步骤期间的损失。不受任何特定作用机制或理论的束缚，与在cfDNA分离之前破坏所有膜的方法相比，预期洗涤剂敏感膜(但不是洗涤剂抗性膜，诸如脂筏)的完全或部分破坏在从母体血浆纯化cfDNA期间富集胎儿cfDNA。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法获得的cfDNA的胎儿分数的进一步富集可以通过优化胎儿cfDNA的cfDNA分离步骤来实现。如上所述，已知胎儿cfDNA片段比母体cfDNA片段短。因此，与细胞游离母体DNA相比，基于大小的选择可能优先选择细胞游离胎儿DNA。此类基于大小的选择可以通过使用不同大小的磁珠来实现，如Hu et al.,J TranslMed 2019 17:124中所述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法获得的cfDNA的胎儿分数的进一步富集可以通过在靶向测序之前修复提取的cfDNA分子来实现。已知胎儿衍生cfDNA分子比母体片段更短且更碎片化，并因此可能具有更多的DNA损伤。通过修复这些受损的胎儿cfDNA分子，可以进一步增强胎儿cfDNA的富集。合适的修复方法描述于例如Vong et al.,PrenatalDiagnosis 2019 39:88-99，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可以执行本文描述的用于富集cfDNA的方法并且富集的cfDNA可以随后经受期望的方法遗传测试。在一些实施方案中，分离的cfDNA可以经受用于非侵入性产前检测(NIPT)的期望方法。NIPT旨在分析在子宫内怀有胎儿的女性的血液中循环的胎儿cfDNA。对母体血液中细胞游离DNA的分析可以用于评估胎儿的健康。
遗传测试(包括NIPT)可能涉及评估样品的一种或多种突变。遗传分析可以包括分析任何期望突变，包括碱基取代、插入、缺失、易位，或分析特定核酸序列拷贝数的变化，这些变化可能起因于例如染色体数、基因拷贝数、表达水平的变化等。例如，富集的cfDNA可以经受用于分析特定核酸序列拷贝数的变化的方法，这些变化可能起因于例如染色体数、基因拷贝数、表达水平等的变化。例如，可以在用于评估由任何染色体异常，包括非整倍性(例如存在额外的染色体拷贝或缺失的染色体拷贝)；染色体的缺失或复制部分、单个基因的变异(例如SNP)等引起的染色体疾病的方法中采用富集的cfDNA。
在一些实施方案中，遗传测试可能涉及评估cfDNA样品中已知与癌症相关联的一个或多个突变。在一些实施方案中，遗传测试可能涉及评估样品中非自身(例如，供体衍生)cfDNA的存在和/或量，诸如评估移植风险。
在特定的实施方案中，本文所述技术可用于制备分离的细胞游离DNA和富含胎儿cfDNA的细胞游离DNA，用于以下技术一起使用：包括但不限于2019年11月5日发布的US 10,465,245；2017年2月2日提交的WO/2017/020024；2016年9月11日提交的WO/2017/083366；2016年11月16日提交的WO2017/087560；2017年11月16日提交的WO2018/094031；2019年2月4日提交的WO2019/195346；和2020年4月4日提交的Sekedat等人的PCT申请序列号PCT/US20/26456中描述的技术；出于所有目的，每一篇通过引用其整体并入本文。
实验实施例
实施例1
本实施例提供了用于富集和后续分析来自样品(诸如血液样品)的cfDNA(诸如胎儿cfDNA)的工作流程的示例。示例性工作流程示意图显示于图1中。
样品收集
收集静脉血(大约20mL)并储存在Streck血液收集管(例如细胞游离BCT管)或替代的含有EDTA的血液收集管中。在环境温度下将样品运送到实验室并按如下进行处理：
·在室温下以2000x g离心血液20分钟以从血液中获得血浆级分。
·将血浆转移到新的、无菌、无核酸酶的聚丙烯管中，并以3220x g离心30分钟。
·血浆在-80℃下冷冻，直到进行cfDNA富集。
细胞游离DNA(cfDNA)分离
·血浆在冰上解冻
·如表1中所示创建2x IP缓冲液(10mL总最终体积)。
表1
Figure BDA0004228157810000411
·将等体积的2x IP缓冲液添加到血浆样品中并通过轻弹将管混合。
·将1μL抗dsDNA抗体添加到管中(abcam目录号ab27156)
·将20μL Protein G Beads磁珠添加到管中
·将管在加热振荡器中于4℃下温育过夜，同时以500rpm振荡
·样品在1x IP缓冲液中清洗4次。添加1x Ampligase反应缓冲液用于最后一次清洗(Ampligase 1X反应缓冲液通常包含：20mM Tris-HCl(pH 8.3)、25mM KCl、10mM MgCl2、0.5mM NAD和0.01％ Triton X-100。)
·将珠重悬浮于15μL 1x扩增酶缓冲液中。
·可以将包含捕捉的DNA的珠直接添加到DNA测定方法中，例如PCR、连接测定、RCA等。下面描述的MIP捕捉实验显示，可以分析DNA而无需从支持物上洗脱或除去抗体或其他蛋白质的处理。
cfDNA富集之后，可以执行合适的方法来评估cfDNA，诸如用于评估可能指示胎儿健康的cfDNA中的突变的方法。
注意，表1中的确切试剂和浓度仅是示例性的，并且可以进行修改以优化用于cfDNA富集的条件。可以使用替代试剂(例如盐、缓冲液、抑制剂、洗涤剂等)和/或浓度。
实施例2
本实施例提供了使样品经受各种细胞游离DNA富集方案后cfDNA产率的比较。特别地，比较了有和没有抗dsDNA抗体温育的方案。结果显示于图2中。
特别地，对泳道B1、D1、F1和G1的比较表明，与抗dsDNA抗体的温育和用顺磁珠(例如蛋白G珠)进行的后续免疫沉淀从仅200μL血浆中产生足够的cfDNA。这由200bp处的条带显示，该条带指示已捕捉cfDNA、已连接成圆圈，然后如J Med Screen,2020 Mar；27(1):1-8(其全部内容通过引用并入本文)中所述进行PCR扩增的分子倒置探针。150bp处的条带指示未使用的分子倒置探针。
B1-输入为2mL血浆。不执行抗dsDNA抗体温育步骤。
D1-输入为200μL血浆。不执行抗dsDNA抗体温育步骤。
F1-从患者#1分离的含有cfDNA的样品(200μL血浆)与抗dsDNA抗体一起温育，并使用蛋白G顺磁珠(New England Biolabs，目录号S1430S)进行免疫沉淀。执行后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤。
G1-从患者#2分离出的含有cfDNA的样品(200μL血浆)与抗dsDNA抗体一起温育，并使用蛋白G顺磁珠(New England Biolabs，目录号S1430S)进行免疫沉淀。执行后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤。
如所示，与泳道D1相比，泳道F1和G1在200bp处显示出更强的条带。每条泳道使用血浆的样品体积。因此，与抗dsDNA抗体的温育和用顺磁珠进行的免疫沉淀改善样品中cfDNA的富集。该输入量是在没有抗dsDNA温育步骤的情况下生成类似信号所需血浆的量的约1/10(例如，如泳道B1中所示。)实施例3
本实施例提供了使样品经受各种细胞游离DNA富集方案后cfDNA产率的比较。特别地，比较了有和没有抗dsDNA抗体和抗ssDNA抗体温育的方案。结果显示于图3中。凝胶顶部和底部的深色条带显示系统的低分子量和高分子量标志物。综上所述，结果表明，与抗dsDNA抗体温育，但不与抗ssDNA抗体温育，结果增强cfDNA从血浆样品中的分离。这由200bp处的条带显示，该条带指示已捕捉cfDNA、已连接成圆圈，然后如J Med Screen,2020Mar；27(1):1-8(其全部内容通过引用并入本文)所述进行PCR扩增的分子倒置探针。特别是，泳道E1的200bp条带与泳道B1的条带强度相当，而血浆的输入体积为仅1/10。此外，泳道C1未显示可见条带，指示与抗ssDNA抗体和蛋白G珠温育不是用于cfDNA免疫沉淀的有效手段。
A1-血浆经受J Med Screen,2020 Mar；27(1):1-8中描述的纯化方案。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如所述执行。扩增的DNA用作凝胶的模板。
B1-血浆经受描述用于泳道A1的方案，但反应物中添加蛋白G和蛋白A珠。
C1-血浆与ssDNA抗体一起温育并用蛋白G珠进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如泳道A1中那样执行。
E1-血浆与dsDNA抗体一起温育并用蛋白G珠进行免疫沉淀。后续的杂交、缺口延伸、连接和PCR扩增步骤如泳道A1中那样执行。
实施例4
本实施例提供了使样品经受各种细胞游离DNA富集方案后cfDNA产率的比较。特别地，比较了有和没有抗dsDNA抗体温育的方案。结果显示于图4中。
在“标准纯化”行中显示的结果显示使用J Med Screen,2020 Mar；27(1):1-8(其全部内容通过引用并入本文)中描述的方法获得的值。简而言之，使用改编用于MicrolabStar液体处理系统(Hamilton Robotics；Reno,NV,USA)的定制DynaMax cfDNA提取方案(Thermo Fisher Scientifc；Waltham,MA,USA)分离样品。分离的cfDNA样品从DynaBeads洗脱到单个低结合96孔聚合酶链反应(PCR)板(Eppendorf)中用于测试。使用描述的MIPcfDNA测定方案，将cfDNA样品与已鉴定的捕捉探针混合，并在热循环仪中温育以生成杂交的探针-cfDNA产物。使用修改后的MIP延伸/连接方案以从cfDNA中捕捉重复序列。从捕捉方案生成的单链环状DNA用作含有与MIP主链结合的引物的通用PCR反应物中的模板。PCR产物文库用Ampure XP珠(Agencourt AMPure XP,Beckman Coulter；Brea,CA,USA)纯化，样品浓度归一化至1ng/uL，并将样品合并到多路复用测序文库中。
图4显示了可以计算测定测序结果中胎儿cfDNA的量的三种算法。SNP方法着眼于基因组中数百个已知SNP的SNP比率。CHRY方法确定样品中Y染色体的存在，因此完全指示男性胎儿DNA。CHR X方法评估样品中的X染色体。GOF指的是拟合优度，或者测序结果与计算胎儿分数的算法模型的拟合有多好。值越接近1表示拟合优度越好。所使用的算法经过训练以适合J Med Screen,2020 Mar；27(1):1-8中描述的测定法，因此使用本文所述的抗dsDNA抗体的纯化方案的GOF值稍差也不足为奇。
如图4所示的结果是使用相同的血浆样品获得的，差异被认为是由于cfDNA制备步骤(例如，抗体温育和免疫沉淀)的差异。这些数据是在三个独立的实验中观察到的，并且表明与抗dsDNA抗体的温育可以改善cfDNA胎儿级分的富集。
本申请中引用的所有文献和类似材料，包括上述参考书目中描述的出版物，并且包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网网页，出于任何目的通过引用其整体明确并入。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本文描述的各种实施方案所属领域的普通技术人员普遍理解的相同含义。当并入的参考文献中术语的定义与本教导中提供的定义不同时，以本教导中提供的定义为准。

Claims (49)

1.用于从样品中捕捉细胞游离DNA的方法，其包括：
a)使样品与包含外源性抗dsDNA抗体的组合物接触以形成包含所述抗dsDNA抗体和细胞游离DNA的抗体-DNA复合物；
b)从所述样品中分离所述抗体-DNA复合物以提供捕捉的细胞游离DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括从所述抗体-DNA复合物中释放捕捉的细胞游离DNA的步骤c)。
3.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测定所述捕捉的细胞游离DNA。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述测定包括将捕捉的细胞游离DNA添加到反应混合物中。
5.如权利要求4所述的方法，其中将捕捉的细胞游离DNA添加到反应混合物中包括将所述抗体-DNA复合物添加到所述反应混合物中。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶，优选地选自核酸聚合酶、核酸酶和连接酶的核酸修饰酶。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述捕捉的细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有小于500bp，优选小于300bp的长度的多个dsDNA片段。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有50和200bp之间的长度的多个dsDNA片段。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述多个dsDNA片段具有包含在约143bp和166bp处的峰的大小分布。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括从受试者分离的生物流体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述生物流体包括血液或血液制品。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述血液制品包含血浆。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述受试者是妊娠受试者或疑似患有肿瘤的受试者。
15.包含抗体-DNA复合物的组合物，其包含：
a)外源性抗dsDNA抗体和
b)得自来自受试者的样品的细胞游离DNA。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述样品包含来自所述受试者的生物流体。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述生物流体包括血液或血液制品。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所述细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
19.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物基本上不含来自受试者的生物流体。
20.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在缓冲液中。
21.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在反应混合物中。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸酶和连接酶中的一种或多种。
24.如权利要求15所述的组合物，其中所述组合物进一步包含固体支持物。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述固体支持物包括珠。
26.用于从样品中分离cfDNA的试剂盒或系统，所述试剂盒或系统包含外源性抗dsDNA抗体。
27.如权利要求26所述的试剂盒或系统，其进一步包含固体支持物，优选珠。
28.如权利要求27所述的试剂盒或系统，其中所述固体支持物包含抗体结合试剂。
29.如权利要求28所述的试剂盒或系统，其中所述抗体结合试剂包含蛋白质，优选蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或蛋白质L。
30.如权利要求26所述的试剂盒或系统，其进一步包含选自下组的一种或多种试剂：
a)缓冲液；
b)盐；
c)洗涤剂；
d)防腐剂；
e)蛋白酶抑制剂；
f)核酸酶抑制剂；和
g)核酸修饰试剂。
31.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中将捕捉的细胞游离DNA添加到反应混合物中包括将所述抗体-DNA复合物添加到所述反应混合物中。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶，优选地选自核酸聚合酶、核酸酶和连接酶的核酸修饰酶。
33.如权利要求31-32中任一项所述的方法，其中所述捕捉的细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
34.如权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有小于500bp，优选小于300bp的长度的多个dsDNA片段。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞游离DNA包含具有50和200bp之间的长度的多个dsDNA片段。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述多个dsDNA片段具有包含在约143bp和166bp处的峰的大小分布。
37.如权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述样品包括从受试者分离的生物流体。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述生物流体包括血液或血液制品。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述血液制品包含血浆。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述受试者为妊娠受试者或疑似患有肿瘤的受试者。
41.如权利要求15-17中任一项所述的组合物，其中所述细胞游离DNA包含细胞游离胎儿DNA。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物基本上不含来自受试者的生物流体。
43.如权利要求41或42所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在缓冲液中。
44.如权利要求41-43中任一项所述的组合物，其中所述抗体-DNA复合物在反应混合物中。
45.如权利要求44所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸修饰酶。
46.如权利要求45所述的组合物，其中所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸酶和连接酶中的一种或多种。
47.如权利要求15-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含固体支持物。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述固体支持物包括珠。
49.如权利要求26-29中任一项所述的试剂盒或系统，其进一步包含选自下组的一种或多种试剂：
a)缓冲液；
b)盐；
c)洗涤剂；
d)防腐剂；
e)蛋白酶抑制剂；
f)核酸酶抑制剂；和
g)核酸修饰试剂。
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