JP2001517925A - 核酸の均質増幅および検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を検出または増幅するための方法に関する。この方法は組合せにおいて（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含有する疑いのある媒体、（ii）増幅を望む時標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するためのすべての試薬、および（iii）増幅産物の１本鎖へ結合することができる二つのオリゴヌクレオチドプローブを準備することを含む。プローブの少なくとも一方は二つの配列を有し、これら二つの配列は、（ｉ）非隣接であり、そして前記１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合できるか、または（ii）前記１本鎖の非隣接部位へ結合できる。組合せは標的ポリヌクレオチド配列を増幅するための条件へ服される。次に組合せはプローブの両方がストランドの一つへハイブリダイズして３分子複合体を形成する条件へ服され、この複合体が標識によって検出される。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の均質増幅および検出本発明の分野 有意義な罹病率および死亡率は感染病に関連している。疾病のより良いモニタ リングおよび処置のためにはもっと迅速なそして正確な診断方法が必要とされる 。ＤＮＡプローブ、核酸ハイブリダイゼーションおよびインビトロ増幅技術を用 いる分子方法は、患者診断のために使用される慣用方法へ利益を提供する有望な 方法である。 核酸ハイブリダイゼーションは核酸の本体を検査しそしてその存在を確立する ために使用されている。ハイブリダイゼーションは相補塩基ペアリングを基礎と する。相補的な１本鎖核酸を１所にインキュベートする時、相補的な核酸配列は ２本鎖ハイブリッド分子を形成するようにペアを組む。相補的な核酸配列と水素 結合構造を形成する一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）またはリボ核酸（Ｒ ＮＡ）の能力は、分子生物学研究において分析ツールとして使用されている。高 い比活性の放射性ヌクレオシド三リン酸の入手性およびＴ４ポリヌクレオチドキ ナーゼによるＤＮＡの³²Ｐ標識は、生物学的に関心ある種々の核酸配列を同定し 、単離し、そして特徴化することを可能にした。核酸ハイブリダイゼーションは 、独特の核酸配列に関連する病的状態の診断において大きい可能性を持っている 。これら独特の核酸配列は、挿入、欠除、ポイント変位による、またはバクテリ ア、かび、糸状菌およびウイルスによる感染によって 外来ＤＮＡまたはＲＮＡの取得によるＤＮＡの遺伝子もしくは環境変化からもた らされ得る。核酸ハイブリダイゼーションは、今日まで学術的もしくは産業的分 子生物学研究所において主として採用されていた。臨床医学において診断ツール として核酸ハイブリダイゼーションの使用は限られている。これは患者の体液中 に存在する疾病関連ＤＮＡもしくはＲＮＡのしばしば非常に低い濃度と、そして 核酸ハイブリダイゼーション分析の十分に感受性な方法が存在しないためである 。 特異的核酸配列を検出する一方法は、一般にニトロセルロースペーパー、セル ロースペーパー、ジアゾ化ペーパーまたはナイロン膜のような固相支持体に標的 核酸の固定化を含んでいる。支持体上に標的核酸を固定化した後、支持体は適当 な標識プローブ核酸と約２ないし４８時間接触させられる。上の時間期間後、固 相支持体はハイブリダイゼーションしないプローブを除去するため制御された温 度で数回洗浄される。次に支持体は乾燥され、ハイブリダイズした材料がオート ラジオグラフィーにより、または分光測光方法によって検出される。 非常に低濃度を検出しなければならない時、上の方法は遅くそして労働集約的 であり、そして放射標識より検出が容易でない非アイソトープ標識はしばしば適 しない。 最近、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られるＤＮＡの特異性セグメ ントの酵素増幅方法が記載された。このインビトロ増幅操作は、変性、オリゴヌ クレチドプライマーアンニーリング、および親熱性ポリメラーゼによるプライマ ー延長のくり返しサイクルを基礎としている。ＤＮＡの反対ストライドへアンニ ールするＰＣ Ｒプライマーは、一方のプライマーのポリメラーゼ触媒延長生成物が他方の鋳型 ストランドとして役立ち、その長さがオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端 間の距離によって決まる別々のフラグメントの蓄積へ導くように配置される。 核酸を増幅するための他の方法は、単一プライマー増幅、リガーゼ連鎖反応（ ＬＣＲ），核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）およびＱ−ベーターレプリカー ゼ法である。使用した増幅に関係なく、増幅された生成物が検出される。 核酸を増幅するための上の方法のどれについても、増幅混合物を以前増幅した 材料が汚染し、それによりもとのサンプル中に存在しなかった材料、すなわち汚 染物を増幅するリスクが存在する。増幅生成物の量は非量に多量であることがで き、それにより潜在的な汚染をさらに悪化させる。研究室中に増幅された核酸の エアロゾルが生成すると、この物質を含有する液滴は後の増幅混合物または設備 に侵入することができる。核酸の試みた増幅はその時、増幅されているサンプル 中に標的核酸もしくはその配列が存在しなかったときにさえ、この汚染物質の増 幅されたコピーを生成し得る。そのような汚染はもし容器を清掃しても同じ容器 を多数回増幅のために使用するとやはり発生し得る。たった１分子でさえも時に より以後の増幅に使用すべき他の容器を汚染するのに十分である。この汚染の可 能性は、そのような単一分子が増幅され、検出されることがあり得るので偽のテ ストに導き得る。このテストの結果は、テストしている患者サンプル中の特定の 核酸の存在もしくは不存在を正確に反映しないであろう。 特定の核酸の増幅後、増幅された材料を検出する前に別のステッ プが実施される。核酸を検出するための一方法は核酸プローブを使用する。その ようなプローブを利用する一方法は米国特許Ｎｏ．４，８６８，１０４に記載さ れている。核酸プローブはレポーター基で標識されるかもしくは標識することが できるか、または支持体へ結合もしくは結合されることができる。信号の検出は 標識またはレポーター基の性格に依存する。もし標識もしくはレポーター基が酵 素であるならば、信号発生システムの追加のメンバーは酵素基質等を含んでいる 。 核酸を好ましくは均質形式で増幅し、そして検出するための感受性で簡単な方 法を持つことが望ましい。この方法は工程および試薬の数および複雑性を最小に しなければならない。アッセイ混合物の汚染を防止するのに必要な滅菌および他 のステップは回避されなければならない。関連技術の説明 ３’−標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する、ＰＣＲ生成物のための迅 速な非分離電気化学発光ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイは、Ｇｕｄｉｂ ａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐ ｒｏｂｅｓ，６：４９５−５０３（１９９２）に記載されている。関連する開示 は、国際特許出願ＷＯ９５／０８６４４Ａ１（９５．０３．３０）に見られる。 Ｍａｒｍａｒｏ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒ ｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９４ ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ．５ ４）は、Ｔａｑ Ｍａｎ，均質ＰＣＲアッセイにおいて蛍光原プローブの設計お よび使用を論じている。 ＨＣＶ ＲＮＡの定量的検出のためｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの本来的５ ’ヌクレアーゼを利用するＰＣＲに基づくアッセイはＴｓａｎｇ ｅｔ．，（９ ４ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ Ｎ Ｅ５／９４，Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ．Ｃ３７６）によって開示されている。 Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，９４：２２３−２２８（１９９０）は、ポ リメラーゼ連鎖反応の簡単化比色分析およびＡＩＤＳ患者中のＨＩＶ配列の検出 を開示する。 ドイツ特許出願ＤＥ４２３４０８６−Ａ１（９２．０２．０５）（Ｈｅｎｃｏ ，ｅｔ ａｌ．）は、標的配列と相互作用し得るプローブが増幅中および増幅後 に存在し、そしてプローブの分光法的に測定し得るパラメーターが変化を受け、 それにより信号を発生する囲まれた反応ゾーン中でインビトロで増幅された核酸 配列の測定を論じている。 米国特許Ｎｏ．５，２３２，８２９（Ｌｏｎｇｉａｒｕ ｅｔ ａｌ．）は、 ビチオン標識ＤＮＡプライマーおよび捕獲プローブを使用するポリメラーゼ連鎖 反応による、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出を開示する。 同様な開示は、Ｌｏｅｆｆｅｌｈｏｌｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｃｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３０（１１）：２８４７−２ ８５１（１９９２）によってなされている。 局在化ＤＮＡ検出のための環状化オリゴヌクレオチドである、パ ドロックプローブは、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５ ：２０８５−２０８８（１９９４）によって記載されている。 核酸配列の増幅、検出および／またはクローニングのためのプロセスは、米国 特許Ｎｏ．４，６８３，１９５；４，６８３，２０２；４，８００，１５９，４ ；９６５，１８８および５，００８，１８２に開示されている。ポリメラーゼ連 鎖反応による配列ポリメリゼーションは、Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４（１９８６）によって記載されている。熱 安定性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー指導酵素増幅は、Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７（１９８８）に記載されている。 それぞれ１９８９年１月１９日および１９８９年８月２９日に出願された、米 国特許出願０７／２９９，２８２および０７／３９９，７９５は、単一ポリヌク レオチドプライマーを使用する核酸増幅（ＡＳＰＰ）を記載する。１９８９年７ 月１９日に出願された米国特許出願０７／５５５，３２７は、単一プライマー増 幅に使用するためのポリヌクレオチドの製造法を開示する。米国特許出願０７／ ５５５，９６８は、分子内塩基ペア構造を含んでいる分子を製造する方法を記載 する。単一プライマー増幅に使用するためのポリヌクレオチドを製造する方法は 、１９９１年１０月１１日に出願された米国特許出願０７／７７６，５３８に記 載されている。ポリヌクレオチドの３’末端に規定された配列を導入する方法は １９９３年１０月２０日に出願された米国特許出願０８／１４０，３６９に記載 されている。これら６出願の開示は、「関連技術の説明」と題する 項にリストされている参考文献を含めて参照としてここに取り入れられる。本発明の概要 本発明の一具体例は、標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法である。この 方法は、標的ポリヌクレオチド配列を、その標的ポリヌクレオチド配列の同じス トランドヘ結合し、３分子複合体を形成することがでぎる二つのプローブと混合 することを含む。プローブの少なくとも一方は隣接していない二つの配列を有し 、そして標的ポリヌクレオチド配列の一本鎖上の隣接するまたは隣接しない部位 へ結合することができる。３分子複合体がその後検出される。 本発明の一具体例は、標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそして検出するため の方法に関する。この方法は、（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含有する疑い ある媒体と、（ii）増幅が望まれる時標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施す るために必要なすべての試薬と、そして（iii）増幅の生成物の一本鎖へ結合す ることができる二つのオリゴヌクレオチドプローブの組合せを準備することを含 む。プローブの少なくとも一方は隣接していない、および／または前記一本鎖の 非隣接部位へ結合することができる二つの配列を有する。めいめいのプローブは 標識を含むことができる。この組合せは標的ポリヌクレオチド配列を増幅するた めの条件へ服される。次にこの組合せはプローブの両方がストランドの一方へハ イブリダイズし、３分子複合体を形成する条件へ服され、それが標識によって検 出される。 本発明の一面は、標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそして検出する方法に関 する。この方法においては、標的ポリヌクレオチド配 列を有する標的ポリヌクレオチドを含有する疑いあるサンプルと、標的ポリヌク レオチド配列を増幅しそのコピーを生産するための試薬と、第１のオリゴヌクレ オチドプローブと、そして第２のオリゴヌクレオチドプローブとの組合せを準備 することを含む。コピーは増幅の間プローブへ実質上ハイブリダイズしない。増 幅後プローブの両方はコピーのストランドの一方へハイブリダイズする。プロー ブの各自は上のストランドへハイブリダイズしたプローブの検出を容易化する標 識を含んでいる。上の組合せは標的ポリヌクレオチド配列を増幅し、コピーを生 産する条件へ服される。次に、組合せはプローブが上のストランドの一方へハイ ブリダイズし、３分子複合体を形成する条件へ服される。この複合体は、通常組 合せを光で照射し、そして照射終了後組合せからの光の発射を検出することによ って検出される。 本発明の他の一具体例は、ポリヌクレオチド検体の標的ポリヌクレオチドを増 幅しそして検出する方法である。標的ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレ オチド検体を含有する疑いのあるサンプルと、このポリヌクレオチドを増幅し、 標的ポリヌクレトチド配列のコピーを生産するための試薬と、ヌクレオチド配列 Ｓ１およびＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブと、配列Ｓ３および Ｓ４を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブよりなる組合せが準備される。 プローブの少なくとも一方を含む配列が、（ｉ）これら配列が非隣接でありそし てコピーの一方のストランド上の隣接するまたは隣接しない部位へハイブリダイ ズするか、または（ii）これら配列がコピーの一方のストランド上へハイブリダ イズする部位が非隣接であるように連結される。プローブは、増幅の間コピーへ 実質的にハイブリダイズせず、そして好ましくは増幅を妨害しない。増幅後、プ ローブの両方はコピーの一方のストランドへハイブリダイズすることができる。 プローブの各自は、前記ストランドへハイブリダイズしたプローブの検出を容易 化する標識を含んでいる。この組合せはポリヌクレオチド検体を増幅するための 条件へ服される。次に、組合せは両方のプローブが前記ストランドの一つへハイ ブリダイズし、３分子複合体を形成する条件へ服される。この方法は、前記スト ランドへハイブリダイズしたプローブを含んでいる複合体を検出することをさら に含んでいる。 本発明の他の具体例は、標的ポリヌクレオチドを含んでいる標的ポリヌクレオ チドの検出方法であって、この方法において必要なすべての試薬が最初標的ポリ ヌクレオチドと混合される該方法に向けられる。この方法は、標的ポリヌクレオ チド配列が２本鎖である時標的ポリヌクレオチド配列を１本鎖に解離することを 含む。オリゴヌクレオチドプライマーがこれら１本鎖の各自の３’末端へハイブ リダイズされる。１本鎖の各自へハイブリダイズしたプライマーは１本鎖に沿っ て延長され、標的ポリヌクレオチド配列のコピーがつくられる。コピーは１本鎖 へ解離される。次に、二つのオリゴヌクレオチドプローブが１本鎖の一つへハイ ブリダイズされる。プローブの少なくとも一方は１本鎖の一方とハイブリタイズ する二つの配列を含んでいる。これら配列は非隣接であり、そして該１本鎖上の 隣接もしくは非隣接部位へ結合するか、またはこれら配列がハイブリダイズする 該１本鎖上の部位は非隣接である。両方のプローブの前記１本鎖への結合は検出 され、そしてそのような結合の存在が標的ポリヌクレオチドの存在に関係づけら れる。 本発明の他の具体例は、標的ポリヌクレオチドの標的配列（“標的配列）を検 出するための方法である。この方法は、標的配列をプライマー延長によって増幅 し、そして延長されたプライマーを検出することを含む。特に、標的配列の増幅 は、（ｉ）標的配列の３’末端へ第１のオリゴヌクレオチドプライマー（“第１ のプライマー”）をハイブリダイズし、（ii）ポリメラーゼおよびヌクレオチド 三リン酸の存在下第１のプライマーを少なくとも標的配列に沿って延長し〔ここ で第１のプライマーは（１）延長された第１のプライマー、または（２）延長さ れた第２のオリゴヌクレオチドプライマー（“第２のプライマー）へハイブリダ イズし、そしてそれらに沿って延長されることができる（ここで延長された第２ のプライマーは標的配列に相補的なポリヌクレオチド（相補ポリヌクレオチド） へハイブリダイズしそしてそれに沿って延長されることができる第２のプライマ ーの延長から得られる）〕、（iii）延長した第１のプライマーを標的配列から 解離し、（iv）延長した第１のプライマーの３’末端へ第１もしくは第２のプラ イマーをハイブリダイズし、（ｖ）延長した第１のプライマーに沿って第１もし くは第２のプライマーを延長し、（vi）延長した第１のプライマーから延長した 第１のプライマーもしくは延長した第２のプライマーを解離し、（vii）延長し た第１のプライマーもしくは延長した第２のプライマーの３’末端へ第１のプラ イマーをハイブリダイズし、そして（viii）ステップ（ｖ）−（vii）をくり返 すことを含む方法によって実施される。延長した第１のプライマーおよび／また は延長した第２のプライマーの検出は、ヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有す る第１のオリゴヌクレオチドプローブと、ヌクレオチド配列Ｓ３およびＳ４ を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブとによって達成される。これらプロ ーブの少なくとも一つを含む配列は、（ｉ）その二つの配列が非隣接でありかつ それらが一方の延長したプライマー上の隣接または非隣接部位へ結合するか、そ れとも（ii）それらが一方の延長したプライマー上にハイブリダイズする部位が 非隣接であるように連結される。プローブは増幅の間存在し、増幅の間延長した 第１および／または第２のプライマーへ実質上ハイブリダイズせず、そして増幅 を妨害しない。増幅後、両方のプローブは延長した第１および／または第２のプ ライマーの一つへハイブリダイズすることができ、この態様で３分子複合体を形 成する。プローブの一方または双方は、延長した第１のおよび／または延長した 第２のプライマーへハイブリダイズしたプローブの検出を容易化する標識を含ん でいる。 本発明の他の一具体例は、標的ポリヌクレオチド配列の増幅および検出に使用 するためのキットに関する。このキットは、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列へ 結合することができる二つのオリゴヌクレオチドと、該配列の存在の関数として これらオリゴヌクレオチドの少なくとも一つを修飾することができる酵素を含む 標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するための試薬、（ｂ）増幅生成物の１ 本鎖へ結合することができる二つのオリゴヌクレオチドプローブであって、この プローブの少なくとも一方は、（ｉ）非隣接であり、そして前記１本鎖上の隣接 もしくは非隣接部位へ結合できるか、または（ii）前記１本鎖上の非隣接部位へ 結合することができる二つの配列を有し、各自標識を含有する前記二つのプロー ブの包装した組合せである。プローブの各自は標識へ結合することができる粒子 を含むことができる。このキットはまた、プローブの他方へ結合した、または結 合することができる第２の粒子を含むことができる。増幅を実施するための例示 的試薬は、（ａ）ヌクレオチド三リン酸、（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマー 、および（ｃ）ヌクレオチドポリメラーゼを含む。 本発明の他の一具体例は、標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列 を増幅し、検出するために使用するキットに関する。本発明によるキットは、包 装された組合せにおいて、（ａ）標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズするこ とができ、そして延長されたオリゴヌクレオチドプライマーを生成するように標 的オリゴヌクレオチド配列に沿って延長することができるオリゴヌクレオチドプ ライマー、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、（ｃ）ヌクレオチドポリメラーゼ、（ ｄ）ヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチドプロー ブ、および（ｅ）配列Ｓ３およびＳ４を有する第２のオリゴヌクレオチドプロー ブの組合せを含む。第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも 一方を含んでいる配列は、（ｉ）それらが非隣接であり、そして延長したプライ マーもしくはその相補体上の隣接もしくは非隣接部位へ結合するか、または（ii ）延長したプライマーもしくはその相補体上へそれらがハイブリダイズする部位 が非隣接であるように連結される。プローブは、それらは（ｉ）増幅の間延長し たオリゴヌクレオチドプライマーへ実質上ハイブリダイズせず、（ii）増幅後、 第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの両方は延長したオリゴヌクレオ チドプライマーもしくはその相補配列へハイブリダイズすることができ、そして （iii）プローブの一方もしくは両方が延長したオリゴ ヌクレオチドプライマーもしくはその相補配列へハイブリダイズしたプローブの 検出を容易化する標識を含んでいるという特徴を持っている。 標的ポリヌクレオチド配列を増幅し、検知するための本発明による他の一方法 は、標的ポリヌクレオチド配列を有する標的ポリヌクレオチドを含有している疑 いのあるサンプルと、標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそのコピーを生産する ための試薬と、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオ チドプローブとの組合せを準備することを含む。プローブは増幅の間コピーへ実 質上ハイブリダイズせず、そして増幅を妨害しない。増幅後、プローブの両方は コピーのストランドの一つへハイブリダイズすることができる。少なくとも一方 のプローブは粒子へ会合している。この組合せは標的ポリヌクレオチド配列を増 幅し、そのコピーを生産するための条件へ服される。その後、この組合せはプロ ーブの両方がストランドの一つへハイブリダイズし、そして粒子の凝集を生ずる 条件へ服される。凝集が検出され、そして凝集の存在は標的ポリヌクレオチド配 列の存在を指示する。 標的ポリヌクレオチド配列を検出するための本発明による他の一方法は、標的 ポリヌクレオチド配列を含有する疑いがあるサンプルを、標的ポリヌクレオチド 配列の同じストランドヘ結合することができる二つのプローブと組合わせること を含み、ここでプローブの各自は粒子へ結合しているか、または結合することが できそして粒子の会合を検出することによって標的ポリヌクレオチド配列を検出 することがプローブである。少なくとも一方のプローブは、非隣接であり、かつ 標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖上の隣接もしくは 非隣接部位へ結合することができる二つの配列を有する。 本発明の他の一面は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための試薬である 。この試薬は、標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖へ結合することができる二つ のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで一方のプローブは、非隣接であり かつ標的オリゴヌクレオチド配列の１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合す ることができるか、または（ii）標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖上の非隣接 部位へ結合することができる二つの配列を有する。図面の簡単な説明 図１ないし１１は、本発明に従った代替具体例を図示する概略図である。特定具体例の説明 本発明は、核酸配列、特に上昇温度を必要とする核酸増幅反応の生成物の検出 を提供する。増幅および検出に必要なすべての試薬は増幅に先立って反応混合物 中に含めることができ、そして増幅後および後で検出へかけられるプローブの結 合前に、反応容器を開くおよび／または試薬と生成物を分離する必要はない。こ のようにして汚染が避けられる。 本発明は、標的ポリヌクレオチド配列の検出のため二つ以上のプローブの使用 に関する。好ましくは、プローブの一対が使用され、そのうち少なくとも一方の プローブはループ状プローブである。しかしながら二つ以上の線状プローブ、通 常二つの線状プローブを使用することができ、この場合少なくとも一方のプロー ブは粒子へ結合しているかまたは結合されることができる。二つのプローブは標 的ポリヌクレオチドの１本鎖へ結合することができそして一方、好 ましくは両方のプローブは標識を含んでいる。ループ状プローブは、非隣接のお よび／または標的ポリヌクレオチド配列内の非隣接配列へ結合する二つのポリヌ クレオチド配列を持っている。この性質は核酸増幅の生成物の検出に特に有用で ある。増幅がアンプリコンを有するループ状プローブの融点（アンプリコンとル ープ状プルーブが解離する温度）をこえる温度で実施される時、プローブは増幅 試薬と合併することができるが、増幅を妨害しない。プライマー延長を使用する 増幅の場合、増幅生成物中にビオチンのような特異的結合ペアの一メンバーの導 入を許容するプライマーを採用することができる。この後者の状況においては、 一つだけのループ状プローブを、ループ状プローブヘ結合する標識した認識配列 およびアビジンのような特異的結合ペアで標識した他のメンバーと組合せて使用 することができる。好ましくは、最終生成物中の標識の会合が検出される。 その最も広い局面において、本発明は標的ポリヌクレオチド配列を検出する方 法に関する。さらに詳しくは、本発明は標的ポリヌクレオチド配列を増幅し、検 出するための方法に関する。この方法は、標的ポリヌクレオチド配列の増幅およ び検出を実施するためのすべての試薬を単一の反応容器中に合併し、標的ポリヌ クレオチド配列を増幅してそのコピーを生産し、そしてコピーを検出とすること を含む。そのようなコピーの存在は標的ポリヌクレオチド配列の存在を指示する 。上の試薬へは、標的ポリヌクレオチド配列へ、または増幅の間生成したそのコ ピーへハイブリダイズすることができる二つのオリゴヌクレオチドが含められる 。これらのプローブは標的ヌクレオチド配列の増幅を妨害しない。オリゴヌクレ オチドプロー ブは任意に結合手、またはヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログよりなる 連結基によって一所に連結されることができる。代わりにまたは組合わせて、試 薬の一つは懸濁し得る粒子であり、そして反応媒体から粒子の後からの分離が存 在しない。粒子は一方のオリゴヌクレオチドプローブ上の標識として役立つこと ができる。 一面において本発明は、標的ポリヌクレオチドを標識ポリヌクレオチドへ結合 することができる二つのオリゴヌクレオチドプローブと合併することを含む標的 ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって、少なくとも一方のプロー ブは、（ｉ）非隣接であり、かつ標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖上の隣接も しくは非隣接部位へ結合するか、または（ii）隣接し、かつ標的ポリヌクレオチ ド配列の１本鎖上の非隣接部位へ結合できる二つの配列を持っている前記方法に 関する。 他の一面において本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそして検出す るための方法に関する。この方法は、（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含有す る疑いがある媒体、（ii）標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するために必 要なすべての試薬、そして（iii）増幅生成物の１本鎖へ結合し得る二つのオリ ゴヌクレオチドプローブの組合せを準備することを含む。少なくとも一方のプロ ーブは、非隣接でありかつ前記１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合できる か、または（ii）隣接しかつ該１本鎖上の非隣接部位へ結合することができる二 つの配列を持っている。各プローブは標識を含むことができる。この組合せは標 的ポリヌクレオチドを増幅するための条件へ服される。次に、そして分離するこ となく組合せは、両方のプローブがストランドの一つへハイブリダイズし、３分 子 複合体を形成する条件へ服される。３分子複合体の検出は標識によって実施され 、そして信号発生システムの追加のメンバーを必要ならばこの時に加えることが できる。 本発明の特定具体例の説明へさらに進める前に、多数の術語を提議する。 ポリヌクレオチド検体 ポリマーヌクレオチドである測定すベき化合物もし くは組成物である。これは未修飾の天然状態において約２０ないし１５０，００ ０またはそれ以上のヌクレオチドを持つことができ、そして単離した状態では約 ３０ないし５０，０００またはそれ以上のヌクレオチド、通常約１００ないし２ ０，０００のヌクレオチド、もっと頻繁には５００ないし１０，０００ヌクレオ チドを持つことができる。このように、天然状態から検体の単離はしばしば断片 化を生ずることが明らかである。ポリヌクレオチド検体およびその断片は、精製 したもしくは精製しない形の、ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ，ｓｓＤＮＡ）およびｔ−Ｒ ＮＡ，ｍ−ＲＮＡ，ｒ−ＲＮＡを含むＲＮＡ，ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮ Ａ，クロロプラストＤＮＡおよびＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド，または これらの混合物、遺伝子、クロモソーム、プラスミド、微生物例えばバクテリア 、イースト、ウイルス、ウイロイド、カビ、糸状菌、植物、動物、ヒト等のよう な生物学的材料のゲノムを含んでいる。ポリヌクレオチド検体は生物学的サンプ ルのような複合混合物の僅かのフラクションであり得る。検体は当業者には周知 の操作によって種々の生物学的材料から得ることができる。限定でなく例証のた めそのような生物学的材料のいくつかの例を以下の表に記載する。 表含まれる微生物 鎌型赤血球血症のためのヘモグロビン遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子、がん遺伝 子、ｃＤＮＡ等の遺伝子も含まれる。 ポリヌクレオチドは、適切な場合、例えば裂断または制限内因性ヌクレアーゼ による処理または他の部位特異性化学的分裂方法によって標的ポリヌクレオチド 配列を含むフラグメントを得るように開裂することができる。 本発明の目的のためには、ポリヌクレオチド検体、またはポリヌクレオチド検 体から得た開裂したフラグメントは少なくとも部分的に変性されるか、１本鎖に するか、それを変性または１本鎖とするように処理される。そのような処理は当 業者には周知であり、そして例えば熱もしくはアルカリ処理を含む。例えば２本 鎖ＤＮＡは変性材料を製造するため９０〜１００℃で約１〜１０分間加熱するこ とができる。 核酸またはポリヌクレオチドの増幅 核酸またはポリヌクレオチドの一つ 以上のコピーを生成する（指数増幅）、または核酸またはポリヌクレオチド分子 の相補体の一つのコピーを生成する（線形増幅）を生成する任意の方法。 核酸またはポリヌクレオチドの指数増幅 媒体中に存在する核酸またはポ リヌクレオチド分子の一つ以上のコピーを生成する任意の方法。増幅生産物は時 に“アンプリコン”と呼ばれる。ＤＮＡの特異的２本鎖配列の酵素増幅のための 一方法は、前記したようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られる。こ のインビトロ増幅操作は、変性、オリゴヌクレオチドプライマーアンニーリング 、およびプライマーによってフランキングされるポリヌクレオチド検体の所望配 列のコピーの指数的増加をもたらす、親熱性鋳型依存 ポリヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー延長のくり返しサイクルを基に している。ＤＮＡの二つの反対ストランドへアンニールする二つの異なるＰＣＲ プライマーは、一方のプライマーのポリメラーゼ触媒延長生成物が他方の鋳型ス トランドとして役立つことができ、その長さがオリゴヌクレオチドプライマーの ５’末端間の距離によって規定される別の２本鎖フラグメントの蓄積へ導くよう に配置される。 増幅のための他の方法は上に述べたとおりであり、そして単一オリゴヌクレオ チドプライマーを使用する１本鎖ポリヌクレオチドの増幅を含んでいる。増幅す べき１本鎖ポリヌクレオチドは、相互に相補的な、そのため幹ループ構造を形成 するようにハイブリダイズできる二つの非隣接配列を含んでいる。この１本鎖ポ リヌクレオチドは既にポリヌクレオチド検体の一部でよく、またはポリヌクレオ チド検体の存在の結果作られてもよい。 核酸の増幅の結果を得る他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）として知ら れている。この方法はあらかじめつくった核酸プローブの対を接合するリガーゼ 酵素を使用する。プローブはもし存在すれば核酸検体の各相補ストランドとハイ ブリダイズし、そしてリガーゼはプローブの各ペアを一所に結合し、特定の核酸 配列をくり返すため次のサイクルにおいて役立ち得る二つの鋳型を生成する。 核酸増幅を達成する他の方法は、核酸配列基礎増幅（ＮＡＳＢＡ）である。こ の方法は、特定の核酸のインビトロ、連続、均質および等温増幅を誘発するプロ モーター指令酵素プロセスである。 核酸の特定グループを増幅する他の方法は、Ｑ−ベータ−レプリカーゼ法であ り、これはＱ−ベータ−レプリカーゼのそのＲＮＡ基 質を指数的に増幅する能力に依存している。 核酸またはポリヌクレオチドの線形増幅 核酸またはポリヌクレオチド分 子の通常媒体中に存在する核酸またはポリヌクレオチド検体の一本鎖の相補体の 一つ以上のコピーを生成する任意の方法。このため線形増幅と指数増幅の一つの 相違は、指数増幅は核酸の両方の鎖のコピーをつくのに対し、線形増幅はポリヌ クレオチドの相補ストランドをつくることである。線形増幅においては、生成す る相補体の数は、コピーの数は時間の指数関数である指数増幅に対し、時間の線 形関数として増加する。 標的ポリヌクレオチドの標的配列 同定すべきヌクレオチドの配列。通常 ポリヌクレオチド検体の一部分（標的ポリヌクレオチド）中に、または全部に存 在し、その正体は標的ポリペプチド内に含まれる標的配列の増幅を実施するのに 必要な種々のプライマーおよび他の分子の調製を許容するのに十分な程度知られ ている。一般にプライマー延長増幅において、プライマーは標的ポリヌクレオチ ド内の少なくとも標的配列へハイブリダイズし、そしてそれに沿って延長（鎖延 長）され、このため標的配列は鋳型として作用する。延長されたプライマーは鎖 “延長生産物”である。標的配列は通常二つの限定された配列の間に横たわるが しかし必須ではない。一般にプライマーおよび他のプローブポリヌクレオチドは 、この限定された配列と、またはそのような標的ポリヌクレオチドの少なくとも 一部分と、通常その３’末端の少なくとも１０ヌクレオチドセグメントおよび好 ましくは少なくとも１５，しばしば２０ないし５０ヌクレオチドセグメントとハ イブリダイズする。標的配列は通常約３０ないし５，０００またはそれ以上のヌ クレオチドを、好ましくは ５０ないし１，０００ヌクレオチドを含有する。標的ポリヌクレオチドは一般に より大きい分子のフラクションであるか、またはそれは実質上全体の分子（ポリ ヌクレオチド検体）であってもよい。標的ポリヌクレオチド配列中ヌクレオチド の最小数は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在がサンプル中のポリヌク レオチド検体の存在の特異的指示薬であることを保証するように選定される。非 常に大まかには、配列長さは通常約１．６ｌｏｇ Ｌ ヌクレオチドより大きく 、ここでＬはサンプルの生物学的ソースのゲノム中の塩基の数である。標的ポリ ヌクレオチド中のヌクレオチドの最大数は、通常ポリヌクレオチド検体の長さに よって支配され、そしてその傾向は単離およびアッセイサンプル調製のため必要 な操作の間の裂断または他のプロセス、および配列の検出および／または増幅の 効率によって破られる。 オリゴヌクレオチド ポリヌクレオチド、通常一本鎖、通常合成ポリヌク レオチド、しかし天然ポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドは、通常 少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは１０ないし１００ヌクレオチド、もっと 好ましくは２０〜５０ヌクレオチド、そして通常１０〜３０ヌクレオチドの長さ の配列を含む。 本発明に用いられるオリゴヌクレオチドを製造するため種々の技術を使用する ことができる。そのようなオリゴヌクレオチドは生物学的合成または化学的合成 によって得ることができる。短い配列（約１００ヌレクオチドまで）のためには 、化学的合成が生物学的合成に比較してしばしば一層経済的であろう。経済に加 えて、化学的合成は、合成ステップの間低分子量化合物および／または修飾塩基 を組込む便利な方法を提供する。さらに、化学的合成は標的ポリヌクレオチド結 合配列の長さおよび領域の選択において非常に融通性である。オリゴヌクレオチ ドは、商業的自動核酸シンセサイザーに使用されるような標準的方法によって合 成することができる。適当な修飾したガラスもしくは樹脂上のＤＮＡの合成は、 表面へ共有結合したＤＮＡを生成することができる。このことは洗浄およびサン プル取扱に利益を提供する。より長い配列のためには、分子生物学で使用される 標準的複製方法、例えばＪ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ，１０１：２０−７８（１９８３）に記載されている１本鎖のためのＭ１３の使 用を使用することができる。 オリゴヌクレオチド合成の他の方法は、ホスホトリエステルおよびホスホジエ ステル法（Ｎａｒａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０ （１９７９）、支持上の合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ ａ１，Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒ ｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２（１９８１）），ホス ホルアミデート技術，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｔｈ ｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．２８７−３１ ４（１９８８），および“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ”，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，ｅｄｉｔｏｒ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｄｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７およびそれに含ま れる参照文献に記載されている他の方法を含む。オリゴヌクレオチドプローブ 標的ポリヌクレオチド配列の一部分へ結合する 、本発明において使用されるオリゴヌクレオチド。オ リゴヌクレオチドの設計および調製は本発明方法において重要である。一つの配 慮は、オリゴヌクレオチドプローブがコピーが製造される増幅の間コピーへ実質 上ハイブリダイズしないことである。さらに増幅ステップの後、オリゴヌクレオ チドプローブの両方が、そのようなコピーが生産される限りコピーのストランド の一つへハイブリダイズする。これはサンプル中に存在の疑いある標的ポリヌク レオチド中の標的ポリヌクレオチド配列の存在または不存在に関係している。本 発明に従ったオリゴヌクレオチドプローブのもっと詳しい説明はこの後に見られ る。 オリゴヌクレオチドプライマー 例えば核酸の増幅におけるような、ポリ ヌクレオチド鋳型上の鎖延長に通常使用されるオリゴヌクレオチド。オリゴヌク レオチドプライマーは通常、その３’末端において標的ポリヌクレオチドの限定 された配列とハイブリダイズできる配列を含んでいる、１本鎖の合成ヌクレオチ ドである。通常、オリゴヌクレオチドプライマーは規定された配列またはプライ マー結合部位に対する相補性を少なくとも８０％，好ましくは９０％，もっと好 ましくは９５％，最も好ましくは１００％を有する。オリゴヌクレオチドプライ マーのハイブリダイズし得る配列中のヌクレオチドの数は、オリゴヌクレオチド をハイブリダイズするため使用する厳格な条件が過剰のランダムな非特異的ハイ ブリダイゼーションを防止するような数でなくてはならない。通常オリゴヌクレ オチドプライマーのヌクレオチドの数は、標的ポリヌクレオチドの規定された配 列と少なくとも同じ、すなわち少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なく とも１５ヌクレオチド、一般に約１０ないし２００，好ましくは２０ないし５０ ヌクレオチドであろう。ヌクレオシド三リン酸 ５’−トリリン酸置換基を有するヌクレオシド。 ヌクレオシドは、通常デオキリボースかリボースであるペントース糖の１’−炭 素へ共有結合した、プリンかピリミジン誘導体の含窒素塩基のペントース糖誘導 体である。プリン塩基はアデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），イノシン（Ｉ）およ びそれらの誘導体および類縁体を含む。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ），チ ミン（Ｔ），ウラシル（Ｕ）およびそれらの誘導体と類縁体を含む。ヌクレオシ ド三リン酸は、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのようなデオキシ リボヌクレオシド三リン酸、およびｒＡＴＰ，ｒＣＴＰ，ｒＧＴＰおよびｒＵＴ Ｐのようなリボヌクレオシド三リン酸を含む。 ヌクレオシド三リン酸なる術語はまた、非誘導体化ヌクレオシド三リン酸と同 様な態様で認識され重合される誘導体によって例示される、それらの誘導体およ び類縁体を含む。例証のための限定でないそのような誘導体または類縁体の例は 、ビオチニル化、アミン修飾、アルキル化等により修飾されたものであり、また フォスフォラチオレート、フォスファイト、環原子修飾誘導体等を含む。 ヌクレオチド 核酸ポリマー、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡのモノマー単 位である塩基−糖−リン酸結合物。 修飾ヌクレオチドは、増幅反応の間修飾ヌクレオシドの加入により生じた、従 って核酸ポリマーの一部となった核酸ポリマーの単位である。 ヌクレオシドは、塩基−糖結合物またはリン酸部分を欠いたヌクレオチドであ る。 ヌクレオチドポリメラーゼ ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型に沿っ てポリヌクレオチドの延長のための触媒、通常酵素。この場合は延長は鋳型に対 して相補的である。ヌクレオチドポリメラーゼは鋳型依存性ポリヌクレオチドポ リメラーゼであり、ポリヌクレオチド鋳型と相補的な配列を提供するようにポリ ヌクレオチドの３’末端を延長するためのビルディングブロックとしてヌクレオ シド三リン酸を利用する。通常触媒は、例えば原核ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ，II またはIII）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ｖｌｅ ｎｏｗフラグメント、逆転トランスクリプターゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラー ゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリ メラーゼのような酵素である。細胞、Ｅ．ｃｏｌｉのようなバクテリア、植物、 動物、親熱性バクテリア等のような任意のソースから得られる。 完全にまたは部分的に逐次的に、 本発明において利用されるサンプルと種 々の試薬が同時以外に結合される時、一つ以上が残りの試薬の一つ以上と結合し 、サブコンビネーションを形成し得る。めいめいのサブコンビネーションは次に 本発明の方法に服される。 ハイブリダイゼーションおよび結合 ヌクレオチド配列の環境においては 、これら術語はここでは互換的に使用される。二つのヌクレオチド配列が相互に ハイブリダイズする能力は、二つのヌクレオチドの相補性の程度に基づき、これ はマッチした相補ヌクレオチドペアの割合に基いている。他方の配列に対して相 補的な与えられた配列のヌクレオチドが多ければ多い程、ハイブリダイゼーショ ンのための条件は一層厳格になり、そして二つの配列の結合は一層特異的になる であろう。増大した厳格性は温度の上昇、共溶媒の比 の増大、塩濃度の低下などによって得られる。 同質もしくは実質上同一のポリヌクレオチド 一般に、同一か、またはめ いめい同じポリヌクレオチド配列へハイブリダイズできる二つのポリヌクレオチ ド配列は同質である。配列が各自少なくとも９０％，好ましくは１００％同じも しくは類似の塩基配列（この場合ＴとＵは同じと考える）を持っている場合は同 質かまたは実質的に同一である。このようにリボヌクレオチドＡ，Ｕ，Ｃおよび Ｇは、それぞれｄＡ，ｄＴ，ｄＣおよびｄＧに対し類縁であると解される。同質 配列は両方ともＤＮＡか、または一方がＤＮＡが他方がＲＮＡであることができ る。 相補性 二つの配列は、一方の配列が反平行センセンスにおいて他方の配 列へ結合できる時相補であり、この場合各配列の３’末端が他方の配列の５’末 端へ結合し、そして一方の配列の各Ａ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣはそれぞれ他方の 配列のＴ（Ｕ），Ａ，ＣおよびＧと整列する。 非隣接 単一のポリヌクレオチド配列内の二つの配列は、二つの配列を両 端において接続するヌクレオチドがポリヌクレオチド１本鎖の相補ポリヌクレオ チド配列とのハイブリダイゼーションにおいて相補的ポリヌクレオチドの隣接す るヌクレオチドへハイブリダイズしない時、非隣接である。通常、このヌクレオ チドは、両端において相補的ポリヌクレオチドストランド上の隣接するヌクレオ チドへ同時に結合できない態様に１０原子より大きいまたは小さい鎖によって接 続されるか、または１０原子鎖の両端へ接続される。好都合には、非隣接配列は 、非隣接配列が結合される時相補的ポリヌクレオチド配列へ結合しない一以上の ヌクレオチドリン酸エステ ルによって接続される。代わりに、二つの配列はヌクレオシドモノリン酸エステ ル以外のヒドロキシアルキルリン酸エステルによって接続することができる。二 つの配列の鎖連結の正確な性状は広く変動することができ、そして例えばアルキ レン、エーテル、スルホン、サルフェート、アラルキル、カルボキサミド、スル ホンアミド、ホスホネート、カーバメート等のような各種の基を含むことができ る。 隣接 単一ポリヌクレオチドストランド内の二つの配列は、両端において 二つの配列を接続するヌクレオチドが単一ポリヌクレオチドストランドが相補的 ポリヌクレオチド配列へハイブリダイズする時相補的ポリヌクレオチド配列の隣 接するヌクレオチドへハイブリダイズする時は隣接している。隣接する配列のみ を含んでいるプローブは線状プローブと呼ばれる。 配列のコピー １本鎖ポリヌクレオチドの配列へ相補的である配列から区 別して、この１本鎖ポリヌクレオチド配列の直接の同じコピーである配列。 プライマーを延長する手段 ヌクレオチドポリメラーゼ、または３’末端 以外において少なくともプライマーの３’末端または両方へハイブリダイズでき る配列を持っている１本鎖鋳型ポリヌクレオチド。プライマーを延長する手段は また、酵素および他の材料の基質として作用することができるヌクレオシド三リ ン酸またはその類縁体と、そして二価金属イオン（通常マグネシウム）、ｐＨ， イオン強度、有機溶媒（ホルムアミドのような）などのような、酵素活性のため 必要な条件をも含む。 特異的結合ペアのメンバー（ｓｂｐメンバー） 他方の分子 の特定の立体的および極性構造と特異的に結合し、それによりそれと相補的であ るように限定された表面上のまたは空胴中の区域を有する、二つの異なる分子の 一つ。特異的結合ペアのメンバーは、リガンドおよび受容体（抗リガンド）と呼 ばれる。これらは抗原−抗体のような免疫学的ペアのメンバーでもよく、またオ ペレーターレプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビチン、 ホルモン−ホルモン受容体、核酸重複体、ＩｇＧ−タンパクＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ ，ＤＮＡ−ＲＮＡ等でもよい。 リガンド それに対する受容体が天然に存在するか、または調製し得る化 合物。 受容体（抗リガンド） ある分子の特定の立体的および極性構造、例えば エピトープもしくは決定子部位を認識できる化合物もしくは組成物。例証的受容 体は、天然に存在する受容体、例えばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、 Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、レプレッサー、保護酵素、タンパクＡ、 補体成分Ｃｌｑ，ＤＮＡ結合タンパクもしくはリガンド等を含む。 小有機分子 ビオチン、フルオレセイン、ローダミンおよび他の染料、テ トラサイクリンおよび他のタンパク結合分子、およびハプテン等のような、１５ ００以下、好ましくは１００ないし１０００，より好ましくは３００ないし６０ ０の分子量を有する化合物。小有機分子は、ヌクレオチド配列を標識または支持 体へ結合する手段を提供できる。 支持体または表面 多孔質もしくは非多孔質の水不溶性材料。支持体は親 水性であるか、または親水化することができ、そしてシリカ、硫酸マグネシウム 、アルミナのような無機粉末；天然高分 子材料、特にセルロース材料およびセルロースから誘導された材料、例えば濾紙 、クロマトグラフィー紙等の繊維を含む紙；ニトロセルロース、セルロースアセ テート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース 、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン ）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、 ナイロン、ポリビニルブチレート等のような合成または修飾天然高分子を含み、 それ自体で、または他の材料、バイオガラスとして入手し得るガラス、セラミッ ク、金属等と組合せて使用される。リポソーム、リン脂質担体、および細胞のよ うな天然または合成アセンブリも使用できる。 ｓｂｐメンバーの支持体または表面への結合は、文献に共通して利用できる周 知の技術により達成できる。例えば、千畑一郎のＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎ ｚｙｍｅｓ，Ｈａｌｓｔｅｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７８）、お よびＣｕａｔｒｅｃａｓａｃ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（ １９７０）を見よ。表面はストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子等のような形 状のどのメンバーを持つことができる。 標識 信号発生システムのメンバー。通常標識はオリゴヌクレオチドプロ ーブヘ接合または他の様に結合またはそれと会合したオリゴヌクレオチドプロー ブの一部であり、そして直接または間接に検出することができる。標識はオリゴ ヌクレオチドプライマーの一部でもよい。標識は、信号発生により直接検出する ことができるレポーター分子、レポーター分子を含んでいる同族への後からの結 合により間接的に検出し得る特異的に検出し得る特異的結合メンバ ー、増幅もしくはリゲーションのための鋳型を提供できるオリゴヌクリオチドプ ライマー、またはレプレッサータンパクのためのようなリガンドとして作用でき る特異的ポリヌクレオチド配列もしくは認識配列を含み、後の二つの場合はオリ ゴヌクレオチドプライマーまたはレプレッサータンパクはレポーター分子を持っ ているかまたは持つことができるであろう。一般に検出し得る任意のレポーター 分子を使用することができる。レポーター分子は放射性もしくは非放射性、通常 非放射性であることができ、そして酵素のような触媒、触媒をコードするポリヌ クレオチド、プロモーター、染料、蛍光分子、化学発光剤、補酵素、酵素基質、 放射性基、小有機分子、増幅可能なポリヌクレオチド配列、染料、触媒または他 の検出し得る基でさらに標識できるもしくはできないラテックスもしくは炭素粒 子のような粒子、金属ゾル、クリスタライト、リポソーム、細胞等であることが できる。レポーター基はフルオレセインのような蛍光基、ルミノールのような化 学発光基、遅延蛍光によって検出できるＮ−（ヒドロキシエチル）エチレンジア ミントリ酢酸のようなテルビウムキレーター等であることができる。 標識は信号発生システムの一メンバーであり、そして単独で、または信号発生 システムの他のメンバーと共同して検出可能信号を発生する。先に述べたように 、レポーター分子はヌクレオチド配列へ直接結合することができるか、またはヌ クレオチド配列へ結合されるｓｂｐメンバーへ相補的なｓｂｐメンバーへの結合 によってヌクレオチド配列へ結合することができる。特定の標識またはレポータ ー分子の例およびそれらの検出は、１９９０年７月１９日に出願された米国特許 出願Ｎｏ．０７／５５５，３２３に見ることができ、 その適切な開示を参照としてここに取入れる。 信号発生システム 信号発生システムは一つ以上の成分を持つことができ 、少なくと一つの成分は標識である。信号発生システムは、サンプル中の標的ポ リヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド検体の存在もしくは量に関する信号 を発生する。信号発生システムは測定可能信号を発生するのに必要なすべての試 薬を含んでいる。レポーター分子がヌクレオチド配列へ接合していないときは、 レポーター分子は、通常ヌクレオチド配列へ結合もしくはその一部であるｓｂｐ へ相補的なｓｂｐメンバーへ結合される。信号発生システムの他の成分はデベロ ッパー溶液へ含めることができ、そして基質、エンハンサー、アクチベーター、 化学発光化合物、助因子、阻害剤、スキャベンジャー、金属イオン、信号発生物 質の結合に必要な特異結合物質等を含むことができる。信号発生システムの他の 成分は補酵素、酵素製品と反応する物質、他の酵素および触媒等でよい。信号発 生システムは、電磁線の使用により、望ましくは目視により外部手段により検出 し得る信号を提供する。信号発生システムは、その適切な開示を参照としてここ に取入れる、１９９０年７月１９日出願の米国特許出願No.０７／５５５，３２ ３にもっと詳しく記載されている。 ３分子複合体 標的ポリヌクレオチド配列の増幅生産物の１本鎖へ二つの オリゴヌクレオチドプローブの結合により、本方法によって生成する複合体。そ のような複合体は、３分子、すなわち二つのオリゴヌクレオチドプローブと、そ のような増幅生産物の１本鎖を含んでいる点において３分子である。 補助材料 本発明に従って実施される方法およびアッセイに は種々の補助材料がしばしば使用されるであろう。例えば、アッセイ媒体中に緩 衝液が通常存在するであろう。アッセイ媒体およびアッセイ成分のための安定剤 も同様である。しばしばこれら添加剤に加え、アルブミンのようなタンパク、ホ ルムアミドのような有機溶媒、４級アンモニウム塩、デキストランサルフェート のようなポリカチオン、界面活性剤、特に非イオン界面活性剤、結合エンハンサ ー例えばポリエチレングリコール等も含めることができる。 上に述べたように、本発明の一面は、例えば上昇温度の使用を必要とする核酸 増幅反応の生産物のような標的ポリヌクレオチド配列の検出を提供する。増幅が 使用される時、増幅および検出に必要なすべての試薬は増幅前に反応混合物に含 まれることができ、そして増幅後検出前に反応容器を開く必要がない。このため 汚染が避けられる。非常に少なくとも、標識を含んでいる複合体を増幅後そして 分離ステップまたは反応容器を開くことなしに形成することができ、そしてその 後もし必要ならば信号発生システムの他のメンバーを添加することができる。 単一反応容器中の試薬の組合せは、もし望むならば標的ポリヌクレオチド配列 を増幅しそのコピーを形成する条件へ服される。試薬は、増幅後だけコピーとハ イブリダイズし、そして増幅の間はコピー中に実質上取込まれない少なくとも二 つのポリヌクレオチドプローブを含んでいる。少なくとも一方のプローブは少な くとも二つの非隣接配列を有する。加えて、少なくとも一方のプローブは標識を 含んでいる。次に増幅生産物の１本鎖への両方のプローブの結合によってコピー が検出される。コピーの存在は標的ポリヌクレオチド配列の存在を指示する。 上に述べたように、増幅反応の生産物（アンプリコン）の１本鎖へ結合するこ とができる二つのオリゴヌクレオチドプローブが本発明の方法に使用される。 そのようなプローブの少なくとも一方は、アンプリコンの二つの配列（標的配 列）へ結合する二つの配列（認識配列）を有していることにおいてループ状であ り、この場合認識配列は、（ｉ）非隣接であり、かつ標的ポリヌクレオチド配列 上の隣接もしくは非隣接部位へ結合するか、または（ii）隣接し、かつ標的ポリ ヌクレオチド配列の非隣接部位へ結合する。そのようなオリゴヌクレオチドの他 方は線状もしくはループ状でよい。 増幅がＤＮＡポリメラーゼを使用する時、好ましくはオリゴヌクレオチドプロ ーブの両方は可能性ある増幅の妨害を避けるため３’末端においてブロックされ る。この目的で認識配列の３’末端は、例えば３’−リン酸エステル、３’末端 ジデオキシ、非塩基リボリン酸エステルのような非天然基、またはポリマーもし くは表面、または鎖延長を阻止する他の手段のような、鎖延長を行わない基によ ってブロックすることができる。代わりに、アンプリコンへハイブリダイズしな いポリヌクレオチドが３’末端へ接続される。そのような末端基は固相合成の間 に３’末端へ導入することができ、または後で修飾することができる基を導入す ることができる。例えば、３’末端へデキストランを導入するため、リボヌクレ オチドを３’末端において導入し、次に過ヨウ素酸塩で酸化し、次に生成したジ アルデヒドをホウ素水素化物およびアミノデキストランによって還元的アミノ化 することができる。上の修飾を実施するための詳細はこの分野で良く知られてお り、ここでくり返す必要はないであろう 。 本発明に従ったオリゴヌクレオチドプローブの望ましい特徴の例が、例示のた めそして限定でなく図１〜５に記載されている。本発明に従ったオリゴヌクレオ チドプローブの一具体例が図１に示されている。この具体例においては、オリゴ ヌクレオチドプローブＯＰ１は認識配列Ｓ１およびＳ２を有し、この場合Ｓ１お よびＳ２の遠方端は連結されており、すなわちＳ２の３’末端はＬ１によってＳ １の５’末端へ連結されている（ここでは“ノットプローブ”ともいう）。Ｓ１ およびＳ２は、Ｓ１の３’末端がＳ２の５’末端へ隣接するようにアンプリコン の１本鎖へ結合する。この具体例においては認識配列はＴＳ１を含んでアンプリ コンの１本鎖の隣接部位へ結合する。 配列Ｓ１およびＳ２は、アンプリコンの１本鎖上の異なる部位へ結合する認識 配列である。これらの配列は比較的短く、通常長さにおいて約８ないし２５ヌク レオチド、好ましくは長さ１０ないし２０ヌクレオチドである。Ｓ１およびＳ２ は、ＴＳ１結合しない基Ｌ１によって連結され、それ故相互から該基によって分 離されている。Ｌ１は一以上の修飾ヌクレオチドを含むことができるヌクレオチ ドの配列であり得る。代わりに、Ｌ１はポリエチレングリコール、ポリアルキリ デンリン酸エステル、ポリペプチド等を含むことができる。Ｌ１は図５に示すよ うに結合手でも良い。図１〜４に図示した具体例においては、そのような連結基 は通常少なくとも６ないし３００以上の原子、好ましくは２０ないし１８０原子 の鎖である。通常、連結基の５’末端を認識配列の一方の３’末端へ、そしてそ の３’末端を他方の５’末端へ接続するのが好都合である。しかし ながら連結基を認識配列の両端へ接続する必要はない。基Ｌ１の主な機能は認識 配列を一所に連結することである。 上で記載するように本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプローブの設計は 、両方の認識配列が増幅生産物への結合に関与するためのそのような生産物の認 識の高いレベルを許容する。加えて、認識配列は１本鎖へ比較的低温度において 結合し、それ故通常上昇温度において実施される増幅プロセスを妨害しない。線 状オリゴヌクレオチド、すなわち一つの相補配列へ結合する一つだけの認識配列 を有するプローブの場合、高い温度での結合および増幅の妨害を回避するため長 さは比較的短く、通常２５オリゴヌクレオチド未満である。上に記載したように 、線状プローブは、ＤＮＡポリメラーゼを使用する増幅操作に使用する時線状プ ローブの鎖延長を防止するためその３’末端において通常ブロックされる。線状 プローブは、標的ポリヌクレオチド配列へハイブリダイズする配列および標識と して役立つ配列を含む。後者の配列は線状プローブの５’もしくは３’末端であ ることができる。 本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの他の一具体例が図２に示されてい る。この具体例では、オリゴヌクレオチドプローブＯＰ２は認識部位Ｓ’１およ びＳ’２を有し、ここでＳ’１およびＳ’２の遠方端が連結、すなわちＳ’１の ５’末端がＬ２によってＳ’２の３’末端へ連結されている。Ｓ’１およびＳ’ ２は、それぞれＳ’１およびＳ’２の結合部位に対応するＴＳ２およびＴＳ’２ よりなる標的ポリヌクレオチド配列を有するアンプリコンの１本鎖へ結合する。 見られるように、ＴＳ２およびＴＳ’２はＯＰ２へハイブリダイズしない配列Ｌ Ｐ１によって分離されている。この具体 例においては、認識配列はアンプリコンの１本鎖の非隣接部位へ結合する。 本発明の他の具体例が図３に図解されており、ここではオリゴヌクレオチドプ ローブＯＰ３は相互に隣接しない二つの配列Ｓ１およびＳ２を持っている。図３ のこの具体例では、Ｓ１およびＳ２の根本端が一所に連結、すなわちＳ２の５’ 末端およびＳ１および３’末端がＬ３によって接続されている。認識配列はＴＳ １を含んでいるアンプリコンの１本鎖上の隣接部位へ結合する。 本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの他の一具体例が図４に示されてい る。この具体例では、オリゴヌクレオチドプローブＯＰ４は認識配列Ｓ’１およ びＳ’２を有し、ここでＳ’１およびＳ’２の遠方端が連結、すなわちＳ’２の ５’末端がＳ’１の３’末端へＬ４によって連結されている。Ｓ’１およびＳ’ ２は、それぞれＳ’１およびＳ’２に相当するＴＳ２およびＴＳ’２よりなる標 的ポリヌクレオチド配列を有するアンプリコンの１本鎖へ結合する。見られるよ うに、ＴＳ２およびＴＳ’２はＯＰ４へハイブリダイズしない配列ＬＰ１によっ て分離されている。この具体例では、認識部位はアンプリコンの１本鎖の非隣接 部位へ結合する。 本発明によるオリゴヌクレオチドの他の一具体例が図５に示されている。この 具体例では、オリゴヌクレオチドプローブＯＰ５は、線状ではあるが全体の配列 Ｓに対応する認識配列Ｓを有するアンプリコンの１本鎖へ結合する認識配列Ｓを 有する。見られるように、ＴＳ３およびＴＳ’３はＯＰ５へハイブリダイズしな い配列ＬＰ２によって分離されている。この具体例では、ＯＰ５はアンプリコン の１本鎖上の非隣接部位へ結合し、これら部位はＯＰ５の結合のた めに隣接になり、このことはＴＳ３およびＴＳ’３に関するＳの組成に基づく。 上に述べたように、本発明においては二つのオリゴヌクレオチドプローブがア ンプリコンの１本鎖へ結合のために使用される。本発明のこの局面の種々の具体 例が例示のためそして限定でなく図６−９に図解されている。当業者はここに含 まれる教示に従ってオリゴヌクレオチドプローブの多数の組合せを使用できるこ とを認識するであろう。図６に図解した具体例においては、ＯＰ１（図１）が線 状オリゴヌクレオチドプローブ（ＬＯＰ１）と共に使用される。ＯＰ１は標的ポ リヌクレオチド配列ＴＳのアンプリコンの１本鎖の一部分ＰＴＳ１へ結合し、そ してＬＯＰ１はＯＰ１が結合する部分以外の、ＴＳを含有する１本鎖の一部分Ｐ ＴＳ２へ結合する。図６に示すように、ＰＴＳ２はＰＴＳ１の５’末端側に横た わるが、しかし二つのオリゴヌクレオチドプローブの結合の相対的位置は任意で ある。一般に、標的ポリヌクレオチド配列を含んでいる１本鎖上の二つの結合部 位は相互に０ないし２０００ヌクレオチド、好ましくは２０ないし１０００ヌク レオチドによって分離されている。 図７に示す他の具体例においては、使用される二つのオリゴヌクレオチドプロ ーブはＯＰ１（図１）およびＯＰ３（図３）である。ＯＰ１はＴＳを含んでいる １本鎖の部分ＰＴＳ１へ結合し、そしてＯＰ３はＴＳを含んでいる同じ１本鎖の 部分ＰＴＳ２’へ結合する。 図８は本発明による他の一具体例を図解し、ここではＰＯ１およびＯＰ４（図 ４）がオリゴヌクレオチドプローブとして使用される。ＴＳを含んでいるアンプ リコンの同じ１本鎖内にＰＴＳ１および ＰＴＳ２”が存在する場合、ＯＰ１はＰＴＳ１とハイブリダイズし、そしてＯＰ ３はＰＴＳ２”とハイブリダイズする。 本発明による具体例の他の例が図９に示されている。ＴＳを含んでいる１本鎖 のＰＴＳ１’へ結合するＯＰ４（図４）と、ＴＳを含んでいるアンプリコンの同 じ１本鎖のＰＴＳ２”’へ結合するＯＰ５（図５）とが本発明に従って二つのオ リゴヌクレオチドプローブとして使用される。 例証としてそして限定でなく、本発明に従った増幅の一具体例の一例が図１０ に図解されている。本発明は核酸の増幅のための先に述べた他の方法への用途を 有する。図１０に示した増幅方法（ＡＳＰＰ）は、単一のオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いる上に記載した方法（１９８９年１月１９日および１９８９年８ 月２９日に出願された米国特許出願Ｎｏｓ．０７／２９９，２８２および０７／ ３９９，７９５および１９９３年１０月２０日に出願された米国特許出願Ｎｏ． ０８／１４０，３６９、これらの適切な開示を参照としてここに取入れる）であ る。図１０に示した具体例では、標的ポリヌクレオチド配列を含有する疑いのあ るサンプルは、適当な媒体中で、オリゴヌクレオチドプライマーＰＰ１と、四つ の普通のヌクレオシド三リン酸と、ヌクレオチドポリメラーゼ（ＮＰ）と、ＯＰ １およびＯＰ３と組合わされる。この組合せは最初ＴＳを増幅するための条件下 で処理される。このため組合せは温度サイクリングへ服される。通常ＡＳＰＰ増 幅の実施においては媒体は２ないし３温度の間をサイクルされる。この増幅方法 のための温度は、一般に約６０ないし９９℃，もっと普通には約６０ないし９５ ℃の範囲である。正確の温度は塩濃度、ｐＨ，使用した溶媒、標的ポリヌクレオ チド配列の長さおよび組成、およびオリゴヌクレオチドプライマーに応じて変動 できる。約６０ないし７５℃の相対的に低い温度が延長ステップのために使用さ れ、変性およびハイブリダイゼーションは約８０ないし９９℃の温度において実 施することができる。増幅においてＰＰ１はＴＳへ結合し、そしてＴＳに対し相 補的なストランド（ＥＰＰ１）を生産するようにＴＳに沿って延長される。温度 サイクリングの結果として発生するその後の変性、ハイブリダイゼーションおよ び延長は、図１０に見られるようにＴＳの相補体（ＥＰＰＩ）とＴＳのコピー（ ＥＰＰ２）を得る。 本方法の一部としての増幅の実施においては、水性媒体が採用される。他の極 性共溶媒、通常アルコール、エーテル等が含む炭素数１〜６、もっと普通には１ 〜４の酸化有機溶媒も使用し得る。通常これらの共溶媒は、もし使用するならば 、約７０重量％未満、もっと普通には約３０重量％未満で存在する。 媒体のｐＨは、通常約４．５ないし９．５、もっと普通には約５．５ないし８ ．５、そして好ましくは約６〜８の範囲内である。増幅一般のため、ｐＨおよび 温度は、内部でハイブリダイズした配列の解離、オリゴヌクレオチドプライマー の標的ポリヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーション、プライマーの延長、 および延長されたプライマーの解離が同時に、または逐次起こるように選定され る。 所望のｐＨを達成しそしてそのｐＨを測定の間維持するため、種々のバッファ ーを使用することができる。例示的なバッファーは、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸 塩、トリス、バルビタール等である。使用する特定のバッファーは本発明にとっ て重要でないが、しかし個 々の方法において一つのバッファーは他のものより好ましいことがある。 増幅は標的ポリヌクレオチド配列のコピーの望む数を生産するのに十分な時間 実施される。これは例えばポリヌクレオチド検体のアッセイのような、増幅が実 施される目的に依存する。一般に、この方法を実施する時間は１サイクルあたり 約１ないし１０分であり、そして１から２００以上、通常５ないし８０，しばし ば１０〜６０の任意のサイクル数を使用することができる。便宜上、時間および サイクル数を最小にすることが通常望ましい。一般に増幅の与えられた程度のた めの時間は、例えば反応混合物の体積および反応容器の熱容量を減らすことによ って短縮できる。一般に、方法全体を実施するための時間は約２０ないし２００ 分であろう。便宜上、時間を最小にすることが通常望ましいであろう。 ヌクレオチドポリメラーゼの濃度は通常実験的に決定される。好ましくは、濃 度のそれ以上の増加が増幅時間を５倍以上、好ましくは２倍短縮しないことに十 分な濃度が使用される。主な制限因子は一般に試薬のコストである。 コピーすべき標的ポリヌクレオチド配列の量は、サンプル中１または２分子程 低くすることができるが、しかし一般にサンプル中１０ないし１０¹⁰，もっと普 通には約１０³ないし１０⁸分子、好ましくはサンプル中少なくとも１０^-21Ｍ， そして１０^-10ないし１０^-19Ｍ，もっと普通には１０^-14ないし１０^-19Ｍを変動 し得る。オリゴヌクレオチドプライマーの量は少なくとも望むコピーの数と同じ であり、通常サンプルが１〜１，０００ｍＬである場合１０^-13ないし１０^-8モ ル／サンプルであろう。通常プライマーは少な くとも１０^-9Ｍ，好ましくは１０^-7Ｍ，そしてもっと好ましくは少なくとも１０^-6 Ｍにおいて存在する。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、 標的ポリヌクレオチド配列の濃度より実質上過剰であり、少なくとも１０００倍 、もっと好ましくは少なくとも１０００倍大きい。媒体中のヌクレオシド三リン 酸の濃度は広く変動することができ、好ましくはこれら試薬は過剰量で存在する 。ヌクレオシド三リン酸は通常１０^-6ないし１０^-2Ｍ，好ましくは１０^-5ないし １０^-3Ｍで存在する。 組合せを形成するための種々の試薬の組合せ順序も変動し得る。増幅が使用さ れない時は、標的ポリヌクレオチド配列がオリゴヌクレオチドプローブと組合わ される。通常混合物は標的を変性するように加熱され、そしてそこでの温度はプ ローブの標的との結合を許容するように調節される。ＤＮＡポリメラーゼを用い る増幅が必要な時は、一般に標的ポリメクレオチド配列はそのような配列を含む サンプル、またはそのような配列を得るように処理されたポリヌクレオチド検体 から得られる。一般に標的ポリヌクレオチド配列は、あらかじめつくったヌクレ オチド三リン酸とヌクレオチドポリメラーゼの組合せと合併される。オリゴヌク レオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブはあらかじめつくった組 合せへ含めることができ、または後で添加しても良い。しかしながら、上に記載 したすべての試薬が増幅のスタート前に組合わされる限り、上のすべての同時添 加、および段階的もしくは逐次添加を採用し得る。 一般に延長されたプライマーのコピーの数は、少なくとも指数１０²，好まし くは指数１０⁴，もっと好ましくは１０⁶以上増加させることが望ましい。 次に媒体は標的ポリヌクレオチド標的の存在を決定するために検査される。本 発明によれば、二つのオリゴヌクレオチドプローブ、反応媒体中に既に存在する 図１０のＯＰ１およびＯＰ３が測定に使用される。このため反応媒体は、二つの オリゴヌクレオチドプローブがアンプリコンＥＰＰ２の同じストランドへ結合す ることを許容する条件へ服される。通常、反応媒体の温度の単なる低下がオリゴ ヌクレオチドプローブの設計のためアンプリコンへのオリゴヌクレオチドプロー ブの結合を許容するであろう選定される温度はオリゴヌクレオチドプローブおよ びアンプリコンのヌレクオチド配列の構造に依存する。一般に、本発明のこの局 面のための温度は５５℃以下、好ましくは３５ないし５０℃である。プローブお よびアンプリコンの構造は実験的に決定される温度の選定に影響する。一般に、 認識配列が短い程、ハイブリダイゼーションのためより低い温度の使用を許容す る。オリゴヌクレオチドプローブの比較的高濃度の使用は、標的のその相補スト ランドへのハイブリダイゼーションと、そしてＤＮＡポリメラーゼが存在する場 合、アンプリコンに沿ったオリゴヌクレオチドプライマーの鎖延長と競合するよ りも、本方法の検出部の間プローブの標的ポリヌクレオチド配列へのハイブリダ イゼーションの達成を助ける。しかしながら、あまり高い濃度のオリゴヌクレオ チドプローブは、過剰の変調されない信号の発生により、または結合プローブを 捕獲するように設計された結合物質の飽和によってプローブの検出の妨害を発生 し得る。それ故、高いプローブ濃度におけるより効率的でない検出に比較して相 対的に低プローブ濃度が使用される時の競合的標的ハイブリダイゼーションおよ びプライマー延長の効果をバランスさせる最適濃度が選定されなけ ればならない。そのような最適濃度は通常実験的に決定される。一般に、オリゴ ヌクレオチドプローブの濃度は相当に変動することができ、通常０．０１ｎＭな いし１０ｎＭ，好ましくは１ｎＭないし１００ｎＭの範囲内である。 プローブに相補的なアンプリコン上の配列がプライマー結合部位から比較的遠 方であること、通常少なくとも５０，好ましくは少なくとも８０，もっと好まし くは少なくとも１５０ヌクレオチド遠方であることを確実にすることにより、オ リゴヌクレオチドプローブの結合と鎖延長との一層効果的な競合を達成すること も本発明の範囲内である。加えて、標的ポリヌクレオチド配列の２本鎖の再ハイ ブリダイゼーションとの競合は、アンプリコンに対するオリゴヌクレオチドプロ ーブの結合速度を増加するようにループ状プローブのリンカーの長さを最適化す ることによって最小にすることができる。本発明のこの局面における最適化は再 び実験的に行われる。この方法のこの部分の間鎖延長がオリゴヌクレオチドプロ ーブの結合と競合し得る場合、必ずしも必要ではないが、この方法に使用するオ リゴヌクレオチドプローブの他方の結合部位の３’である標的配列上の部位へ結 合するため、上の図１および２に例示したノットタイプのオリゴヌクレオチドプ ローブを使用することが好ましい。そのような状況においては他方プローブは上 の図１〜５に例示したタイプの任意のプローブでよい。 標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖へハイブリダイズした二つのオリゴヌクレ オチドプローブの検出は、めいめいのプローブについて少なくとも一つの標識を 使用することによって達成される。一般に各プローブは、標的ポリヌクレオチド 配列の１本鎖へハイブリダ イズしたプローブの検出を容易化する少なくとも一つの標識を含有する。標識お よび信号発生システムの他の試薬は、標的ポリペプチド配列の増幅に使用される 上昇温度において安定でなければならない。信号の検出は用いられる信号発生シ ステムの性格に依存するであろう。もしレポーター分子が酵素であるならば、信 号発生システムの追加のメンバーは酵素基質などを含むであろう。酵素反応の生 成物は、好ましくは化学発光、生成物、または蛍光もしくは非常光染料であり、 そのどれも分光測光的に検出することができ、または他の分光測定的もしくは電 気測定的手段によって検出できる生成物である。もし標識が蛍光分子であるなら ば、媒体は照射され、そして蛍光が測定されることができる。標識が放射性基で あるならば、媒体は放射能カウントを測定するためカウントされることができる 。 本発明の一面において、標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖へのオリゴヌクレ オチドプローブの結合の検出は、プローブへ直接結合した検出し得るレポーター 分子であることができる、またはプローブへ接続したｓｂｐメンバーに相補的な ｓｂｐメンバーへ結合されることができる、少なくとも一つの懸濁し得る粒子を 使用することによって達成される。そのような粒子は、例えば凝集、電気泳動分 離または磁気分離により、バルク溶液から結合した標的ポリヌクレオチド配列の 分離手段として役立つ。標識した第２のプローブ、または増幅の間アンプリコン 中へ一体化される標識は、検出を容易化するため溶液の小区域に分離または濃縮 される信号発生システムの一部である。この特定の具体例に使用し得る典型的な 標識は蛍光標識、特に光増感剤および化学発光オレフィンを含んでいる粒子（そ の開示を参照として取入れる１９９２年７月３１日に出願された米国特許出願Ｎ ｏ．０７／９２３，０６９を見よ）および電気発光標識である。 好ましくは、粒子自体が分離なしで機能できる信号発生システムの一部として 役立つことができる。例えば、測定は蛍光によって検出されるビーズ凝集によっ て達成することができる。他のアプローチにおいては、第２のプローブまたはア ンプリコンが、やはり信号発生システムの一部であり、そして均質アッセイ検体 方法を提供するため粒子と協力して信号を発生し得る第２の標識を担持すること ができる。標識の種々の組合せが、この目的に使用でき、制限は標識は増幅のた め温度サイクリンが使用される時の上昇温度に対して安定でなければならないこ とである。このため、例えば粒子は単なるラテックス粒子であることができ、ま たは光増感剤、化学発光剤、蛍光剤、染料などを含んでいる粒子でも良い。第２ の標識は、結合した時信号を発生もしくは変調するように相互作用する信号発生 システムのメンバーへ結合しなければならないがまたは結合することができる。 典型的な粒子／標識ペアは、（１）染料クリスタライトと蛍光標識、この場合は 結合は蛍光消光を生ずる；（２）二つのラテック粒子、これらの会合は光拡乱ま たは比濁法によって検出される；（３）光の吸収できる第１の粒子と、第１の粒 子からエネルギーを受取る時蛍光を発生する第２の標識粒子、および（４）ここ に参照としてその開示を取入れる、“誘発したルミネッセンスを利用するアッセ イ方法”と題する、１９９１年５月２２日に出願された米国特許出願Ｎｏ．０７ ／７０４，５６９に述べられている誘発ルミネセンスイムノアッセイに記載され ているような、光増感剤を 組み込んだ粒子と、化学発光剤を組み込んだ標識粒子である。 上のアプローチのどれにおいても、増幅後混合物へ化学試薬を添加する必要は ない。 概略して、本発明に適用される誘発ルミネンセンスアッセイを用いる検出は、 一方の標識部分として光増感剤を、他方の標識部分として化学発光化合物を使用 することを含む。もし標的が存在すれば、光増感剤および化学発光化合物は密な 近接にもたらされる。光増感剤シングレット酸素を発生し、そして二つの標識が 密な近接にある時化学発光化合物を活性化する。活性化された化学発光剤はその 後光を発生する。発生した光の量は生成した複合体の量に関係している。本発明 に適当した時の例証のため、粒子中へ組み込むことによりまたはそれへ接続する ことによるように粒子と会合した化学発光化合物を含んでいる粒子が採用される 。粒子は、通常プローブの二つの認識配列を連結する連結基中に、本発明のオリ ゴヌクレオチドプローブの一つへ取り入れた相補配列と共に、それへ接続したヌ クレオチド配列を有する。それへ会合した光増感剤を有する他の粒子が使用され る。これらの粒子は、化学発光粒子へ接続したものとは異なる取り付けたヌクレ オチド配列を有する。相補配列は本発明のプローブの他方に取り入れられる。３ 分子複合体を形成し、そしてプローブおよび粒子上の相補的ヌクレオチド配列に よりプローブへ粒子が結合することを許容するように媒体が本発明に従って処理 されたならば、媒体は励起状態において酸素をシングレット状態へ励起すること ができる光増感剤を励起するため光で照射される。粒子セットの一つの化学発光 化合物は、今や標的ヌクレオチドの存在のため光増感剤への密な近接にあるため 、シングレット酸素によっ て活性化され、ルミネッセンスを発する。媒体は次にルミネセンスもしくは発光 された光の存在および／または量について検査され、その存在は３分子複合体の 存在に関係づけられる。後者の存在は標的ポリヌクレオチドの存在および／量を 指示する。 本発明の他の一具体例が図１１に図解されている。この具体例においてはＰＣ Ｒによる増幅が例証としてそして限定でなく選択される。ＰＣＲにより増幅すべ き標的ポリヌクレオチド配列相補ストランド（２本鎖ポリヌクレオチド検体のた めのＴＳ１およびＴＳ２）を有する核酸もしくは標的ポリヌクレオチドを含有す る疑いのあるサンプルは、二つの異なるオリゴヌクレオチドプライマー（ＯＰＰ １およびＯＰＰ２）と、ヌクレオチドポリメラーゼ（ＮＰ）と、ヌクレオシド三 リン酸（ＮＴＰ’Ｓ）とそして二つのオリゴヌクレオチドプローブ（ＯＰ１およ びＯＰ４）と組合わされる。この組合せは最初ＴＳ１およびＴＳ２の増幅するた めの条件下で処理される。このため組合せは温度サイクリングへ服される。通常 ＰＣＲによる増幅の実施においては、媒体は変性、プライマーの変性ストランド へのハイブリダイゼーション、および該ストランドに沿ったプライマーの延長を 得るため２または３温度の間をサイクルされる。ＰＣＲ増幅のための温度は、前 に温度サイクリングについて詳しく記載したように、一般に約６０ないし９５℃ ，もっと普通には約６０ないし９５℃の範囲である。増幅においてＯＰＰ１およ びＯＰＰ２はそれらのそれぞれのストランドＴＳ１およびＴＳ２へ結合し、ＴＳ の多数コピーを生産するようにＴＳ１およびＴＳ２に沿って延長される。分子Ｅ ＯＰＰ１およびＥＯＰＰ２はそれぞれプライマーＯＰＰ２およびＯＰＰ１のため の鋳型として役立つ。 コピーの所望の数が発生したならば、媒体はアンプリコンの存在を決定するた めに検査される。本発明によれば、反応媒体中に既に存在する二つのオリゴヌク レオチドプローブ、図１１のＯＰ１およびＯＰ２が決定のために使用される。こ のため反応媒体は、二つのオリゴヌクレオチドプローブの両方のＴＳの同じスト ランド、ＴＳ１かＴＳ２のいずれかへの結合を許容する条件へ服される。従って 例えばＴＳ２の多数のストランドは各自、ＰＴＳ’１およびＰＴＳ’３において 各ストランドへそれぞれ結合したＯＰ１およびＯＰ４を有する。前に述べたよう に、通常反応混合物の単なる温度低下がオリゴヌクレオチドプローブのアンプリ コンへの結合を許容するであろう。図１１の具体例においては、ＯＰ１およびＯ Ｐ２は各自それぞれリンカー部分Ｌ３およびＬ４中にオリゴヌクレオチド標識（ それぞれＯＬ１およびＯＬ２）を含む。ＯＬ１の相補体であるオリゴヌクレオチ ドＣＯＬ１、およびＯＬ２の相補体であるオリゴヌクレオチドＣＯＬ２も、当初 からまたは増幅およびＯＰ１とＯＰ２への結合の後に増幅混合物中に含められる 。ＣＯＬ１およびＣＯＬ２のそれぞれは、個々にまたは相互に協力して信号を発 生するレポーター基それぞれＬ１およびＬ２を含んでいる。ＴＳ２に対するＯＰ １およびＯＰ４の結合は信号の検出によって決定される。一代替具体例において は、ＯＰ１は光増感剤を含んでいるラテックス粒子のような粒子へ結合され、そ してＯＰ４は化学発光化合物を含んでいる粒子へ結合され、そして検出は前に述 べた誘発ルミネセンスアッセイを用いて達成された。従ってＯＰ１およびＯＰ４ のＴＳ２とのハイブリダイゼーション後、反応媒体は照射され、信号が検出され る。この態様においてポリヌクレオチド検体のためのアッセイは均 質的に実施される。光増感剤および化学発光化合物、それに粒子、照射および光 検出の説明は、全体を参照としてここに取り入れる１９９１年５月２２日に出願 された米国特許出願Ｎｏ．０７／７０４，５６９に、例えば３７−８０頁に記載 されている。 ポリヌクレオチド検体がＲＮＡの場合、それは二つのオリゴヌクレオチドの直 接の結合により検出することができ、またはそれは最初にプライマーと逆トラン スクリプターゼによるＤＮＡへの変換することができ、または前に述べたように 使用するヌクレオチドポリメラーゼが逆トランスクリプターゼであることができ る。 ポリヌクレオチド検体の検出に使用される時の本発明方法の実施においては、 媒体、ｐＨ、温度および時間に前記記載したとおりであることができる。種々の 試薬の濃度は一般にポリヌクレオチド検体の関心ある濃度範囲によって決定され るが、試薬各自の最終濃度は関心ある範囲にわたってアッセイの感度を最適化し 、そして信頼し得る対照を提供するように通常実験的に決定される。アッセイ中 の他の試薬の濃度は増幅方法について前に述べたのと同じ原理に従って決定され る。主な配慮は、ポリヌクレオチド検体配列に関心して延長されたプライマーの コピーの十分な数が生産され、そのためそのようなコピーが容易に検出でき、そ してポリヌクレオチド検体の正確な測定を提供することである。 本発明の一面は、１本鎖標的ヌクレオチド配列（標的配列）とその相補配列（ 相補配列）よりなる少なくとも一つの２本鎖ポリヌクレオチドを検出するための 方法である。そのような２本鎖ポリヌクレオチドの一つ以上を含有する疑いある サンプルは、適当な媒体中で各標的配列部分およびその相補配列へ、プライマー の標的配列お よびその相補配列へのハイブリダイゼーションおよびそれらに沿ったプライマー の延長のための条件下におけるハイブリダイジングが可能なオリゴヌクレオチド プライマーと組合わされる。プライマーは、一つのプライマーから形成された延 長生産物がその相補体から解離される時、、他のプライマーの延長生産物の形成 のための鋳型として役立ち、このため標的ポリヌクレオチド配列の増幅が得られ るように選定される。媒体中へやはり含められるのは、ヌクレオチドポリメラー ゼと、ヌクレオシド三リン酸と、Ｓ１およびＳ２配列の一方の３’末端が配列の 他方の５’末端へ連結されているヌクレオチド配列Ｓ１およびＳ２を有する第１ のオリゴヌクレオチドプローブと、そしてＳ３およびＳ４配列の一方の３’末端 が配列の他方の５’末端へ連結されている第２のオリゴヌクレオチドプローブで ある。第１および第２のプローブは標的ポリヌクレオチドへ、またはプライマー 延長産物へ増幅の間実質上ハイブリダイズせず、そして増幅を実質上妨害しない 。増幅後第１および第２のプライマーはプライマー延長産物の１本鎖の各自へハ イブリダイズする。プローブの一方または双方はプライマー延長産物へハイブリ ダイズしたプローブの検出を容易化とする置換分を含んでいる。この方法は、プ ライマー延長産物をそれらのそれぞれの鋳型から解離して１本鎖分子を生産し、 上で生産した１本鎖分子を鋳型として生産した１本鎖を用いてプライマー延長産 物が生成され、もし存在すれは標的配列および相補配列の増幅が得られるような 条件のもとで、前記したプライマーで処理することを含む。プライマーで処理す ることを含む。プライマー延長産物の存在はプローブによって検出され、その存 在は標的ポリヌクレオチドの存在に関連される。上の方法において、 Ｓ１の３’末喘はＳ２の５’末端へ連結することができ、またはＳ３の３’末端 はＳ４の５’末端へ連結することができる。検出のためプローブの一方は粒子へ 会合させることができ、そして検出はそのような粒子の凝集を検出することより なる。 他の具体例において、標的ヌクレオチドの標的配列を検出する方法は、（１） 標的配列であって、そして各端において少なくとも部分的に相補的な第１および 第２のフキンキング配列によってフランキングされている配列を有する１本鎖ポ リヌクレオチドと、（２）その少なくとも１０塩基部分が３’末端において１本 鎖ポリヌクレオチドの３’末端にある第１および第２のフランキング配列のメン バーへハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプライマーと、（３）ヌクレオ シド三リン酸と、（４）ヌクレオチドポリメラーゼと、（５）Ｓ１およびＳ２配 列の一方の３’末端が配列の他方の５’末端へ連結されているヌクレオチド配列 Ｓ１およびＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブと、そして（６）Ｓ ３およびＳ４配列の一方の３’末端が配列の他方の５’末端へ連結されているヌ クレオチド配列Ｓ３およびＳ４を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブとの 組合せを準備することを含む。この組合せは、（１）１本鎖ポリヌクレオチドを 相補配列から解離し、（２）１本鎖ポリヌクレオチドの３’末端のフランキング 配列へオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズし、（３）オリゴヌクレ オチドプライマーを１本鎖ポリヌクレオチドに沿って第１の延長されたオリゴヌ クレオチドプライマーを提供するように延長し、（４）第１の延長されたオリゴ ヌクレオチドプライマーと１本鎖ポリヌクレオチドとを解離し、（５）第１の延 長されたオリゴメクレオチドプライマー をオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズし、（６）オリゴヌクレオチ ドプライマーを第１の延長されたオリゴヌクレオチドプライマーに沿って第２の 延長されたオリゴヌクレオチドプライマーを提供するように延長し、（７）第２ の延長されたオリゴヌクレオチドプライマーを第１の延長されたオリゴヌクレオ チドプライマーから解離し、そして（８）ステップ（５）ないし（７）をくり返 すための条件下でインキュベートされる。第１のオリゴヌクレオチドプローブお よび第２のオリゴヌクレオチドプローブは増幅を妨害せず、そして好ましくは標 的配列または延長されたオリゴヌクレオチドプライマーへハイブリダイズしない 。増幅後、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ延長された オリゴヌクレオチドプライマーの１本鎖へハイブリダイズする。プローブの一方 または双方は延長されたオリゴヌクレオチドプライマーへハイブリダイズしたプ ローブの検出を容易化する置換分を有する。延長されたオリゴヌクレオチドプラ イマーの存在がプローブによって検出され、その存在は標的ポリヌクレオチドの 存在に関係づけられる。プローブおよび条件は上記のように変動することができ る。 便宜のため、本発明に使用される試薬のあらかじめ決められた量は包装された 組合せにおいてキットとして提供することができる。キットは、包装された組合 せ中に、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列へ結合することができる少なくとも一 つのオリゴヌクレオチドプライマーと、該配列の存在の関数としてオリゴヌクレ オチドプライマーを修飾することができる酵素を含んでいる標的ポリヌクレオチ ド配列の増幅を実施するための試薬、（ｂ）増幅産物の一本鎖へ結合することが できる少なくとも二つのオリゴヌクレオチドプローブ であって、該プローブの少なくとも一つは（ｉ）非隣接でありかつ該１本鎖上の 隣接もしくは非隣接部位へ結合することができるか、または（ii）該１本鎖上の 非隣接部位へ結合できる二つの配列を有する前記オリゴヌクレオチドプローブを 含んでいる。少なくとも一方のプローブは標識を含んでいるか、または各プロー ブが標識を含むことができる。このキットはまた、（ｃ）ヌクレオシド三リン酸 、および（ｄ）ヌクレオチドポリメラーゼを含むことができる。キットはまた、 第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことができ、この場合は標的配列に 沿った一方のプライマーの延長産物は他方のプライマーの延長のための鋳型とし て役立つように二つのプライマーが関連している。さらにキットは、各プローブ 上の標識へ結合することができる粒子を含むことができ、この場合標識は認識配 列であることができる。 上のキットはさらに、例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオ キシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ） 、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のようなヌクレオシド三リン酸 を包装された組合せ中に含むことができる。キットはさらに、信号発生システム のメンバーと、そしてそのあるものは上の試薬の一つ以上を含んでもよい種々の 緩衝媒体を含むことができる。 標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の増幅および検用に使用す るためのキットは、包装された組合せ中、（ａ）標的ポリヌクレオチドへハイブ リダイズでき、かつ延長されたオリゴヌクレオチドプライマーを生産するように 標的ポリヌクレオチド配列に沿って延長できるオリゴヌクレオチドプライマー、 （ｂ）ヌクレ オシド三リン酸、（ｃ）ヌクレオチドポリメラーゼ、（ｄ）ヌクレオチド配列Ｓ １およひＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、（ｅ）ヌクレオチド 配列Ｓ３およびＳ４を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ここで 第１および第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方を含む配列は、それらが 非隣接であるかおよび／または延長されたオリゴヌクレオチドプライマーもしく はそれに対する相補配列上のそれらがハイブリダイズする部位が非隣接であるよ うに連結されており、そしてそれらは増幅の間延長されたオリゴヌクレオチドプ ライマーへ実質上ハイブリダイズせず、（ii）増幅後第１および第２のオリゴヌ クレオチドプローブは延長されたオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその相 補配列へハイブリダイズすることができ、そして（iii）プローブの一方もしく は双方は延長されたオリゴヌクレオチドプライマーもしくはその相補配列へハイ ブリダイズしたプローブの検出を容易化する標識を含んでいるという性質をプロ ーブが持っている。 標的ポリヌクレオチド配列の検出のためのキットの他の一具体例は、包装され た組合せにおいて、標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するための試薬と、 そして標的ポリヌクレオチド配列の増幅産物へ結合することができる二つの標識 したオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。プローブの少なくとも一方は、 非隣接であり、かつ増幅産物の１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合できる 二つの配列を持っている。 キット中の種々の試薬の相対量は、本発明方法の間生起すること要する反応を 実質上最適化し、そしてアッセイの感度および対照の信頼性を実質上最適化する 試薬濃度を提供するように広く変動する ことができる。適切な状況のもとでは、キット中の一以上の試薬は補助剤を含ん でいる乾燥粉末、通常凍結乾燥した粉末として提供することができ、これは溶解 した時本発明による方法もしくはアッセイを実施するための適切な濃度を有する 試薬溶液を提供する。各試薬は別々の容器に包装することができ、または一部の 試薬は交差反応性および貯蔵寿命が許容する場合単一容器中に合併することがで きる。キットは、上に記載した本発明による方法の説明書を含んでもよい。 実施例 本発明は以下の例証実施例によってさらに実証される。温度は摂氏（℃）であ り、部およびパーセントは特記しない限り重量による。特記しない限り、以下の 実施例に使用されるオリゴヌクレオチドは自動シンセサイザーを用いる合成によ り製造され、そしてゲル電気泳動またはＨＰＬＣにより精製された。 ここでは以下の略語が使用される。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ，Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌ，ＭＤ．より、１０×溶液 ＤＴＴ：ジチオスレイトール，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏより ＨＰＬＬ：高速液体クロマトグラフィー ＤＰＰ：４，７−ジフェニルフエナントロリン，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩより Ｅｕ（ＴＴＡ）₃：ユウロピウムトリス−３−（２−チエノイル） −１，１，１−トリフルオロアセトネート ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン ＥＬＩＳＡ：酵素連結免疫吸着体アッセイ、“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙ”，Ｅｄｗａｒｄ Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８０）に記載されている。 ｂｐ：塩基対 ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ Ｆａｂ：抗体の抗原結合フラグメント ｄｄｃ：ジデオキシシチジン ｇ：グラム ｍｍｏｌ：ミリモル ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド ＴＨＦ：テトラヒドロフラン ＬＳＩＭＳ：高速イオン衝撃質量分析 ＮＭＲ：核磁気共鳴分析 ＴＭＳＣ１：デトラメチルシリルクロライド ＥＤＡＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド 塩酸塩 ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸 ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート スルホ−ＳＭＣＣ：４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ キシレート ＴＣＥＰ：トリス−カルボキシエチルホスフィン 実施例１Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ２ ＤｎａＪ遺伝子配列の増幅産物の均質検出 Ｅ．Ｃｏｌｉ ケノムからのＤｎａＪ遺伝子配列の一部分の増幅の均質検出の 種々のモードを実施した。種々の検出モードは新規なオリゴヌクレオチドプロー ブと、光増感剤と、使用した特異性標識へ結合することができる化学発光剤粒子 を使用した。結合した染料ジオクタデコニルベンザルアクリダンを有し固定化したｄＴ４０ オリゴヌクレオチドを有する化学発光剤粒子 染料ジオクタデコニルベンザルアクリダンを製造しそして１９９４年８月２３ 日に発行された米国特許Ｎｏ．５，３４０，７１６（１７１６特許）のカラム５ １，３−１９行およびカラム４８，２４−４５行（参照としてここに取り入れる ）の記載と同様な態様でラテックス粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）中へ加えた。オリゴ ヌクレオチドｄＴ４０（配列ＩＤ番号Ｎｏ．１）（Ｏｌｉｇｏ Ｅｔｃ，Ｉｎｃ ．，Ｏｒｅｇｏｎ）は以下の方法で上の粒子の表面に固定化した。 アミノデキストラン（５００ｍｇ）をスルホ−ＳＭＣＣ（１５７ｍｇ，１０ｍ Ｌ Ｈ₂Ｏ）との反応によって部分的にマレイミド化した。スルホ−ＳＭＣＣを アミノデキストラン溶液（０．０５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄，ｐＨ７．５，４０ｍＬ中） へ加え、混合物を１．５時間インキュベートした。次に反応混合物をＭＥＳ／Ｎ ａＣｌ（２×２Ｌ，１０ｍＭ ＭＥＳ，１０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０，４℃ ）に対して透析した。マレイミド化したデキストランを１５，０００ｒｐｍにお いて１５分間遠心し、次にＭＥＳバッファー（ｐ Ｈ６．０）中のイミダゾール（１．０Ｍ溶液７ｍＬ）で処理し、そして攪拌した この溶液へ染色した化学発光剤粒子（１０ｍｇ／ｍＬの１０ｍＬ）を加えた。１ ０分間攪拌後、懸濁液をＥＤＡＣ（１０ｍＭ，ｐＨ６．０ＭＥＳ中７ｍｍｏｌ） で処理し、懸濁液を３０分間攪拌した。この時間後、ＳｕｒｆａｃｔＡｍｐｓ^TM （Ｐｉｅｒｃｅ）Ｔｗｅｅｎ−２０（１０％，０．７８０ｍＬ）を最終濃度０． １％に反応混合へ添加した。次に粒子を１５，０００ｒｐｍにおいて４５分間遠 心し、上清を捨てた。ペレットをＭＥＳ／ＮａＣｌ（ｐＨ６．０，１０ｍＭ，１ ００ｍＬ）中に超音波により再懸濁した。１５，０００ｒｐｍ，４５分の遠心、 次に上清除去後ペレット再懸濁は２回行った。マレイミド化したデキストラン化 学発光剤粒子は１０ｍｇ／ｍＬ懸濁液として水中に貯蔵した。 アミノ−ｄＴ（４０）は、標準的固相フォスフォラミダイト法（Ｏｉｌｉｇｎ ｕｃｌｅｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ ａｃｈ（１９８４），Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘ ｆｏｒｄを見よ）を使用してＭｉｌｌｉｇｅｎ ＤＮＡシンセサイザー（モデル ＃８７５０）上で調製した。プロトロールは、概略して（ａ）固相支持体へ結合 したヌクレオシド上の５’−ジメトキシトリチル基のジクロル酢酸による除去、 （ｂ）触媒としてテトラゾールを使用し、５’−ヒトロキシ保護基（好ましくは ジメトキシトリチル）および３’−ヒドロキシ保護基（好ましくはＮ，Ｎ−ジイ ソプロピルフォスフォラミダイト）を含んでいる入って来るヌクレオシドのカッ プリング、（ｃ）酢酸無水物によるキャッピング、および（ｄ）ホスファイトト リエステルをポスフェートトリエステルヘ変換するヨウ素酸化より なっていた。合成終了後、（ａ）合成したポリヌクレオチドを支持体から開裂し 、（ｂ）フォホリル保護基（β−シアノエチル）を除去し、（ｃ）塩基保護基を 除去するためアンモニウムハイドロオキサイドを使用した。水中のアミノ−ｄＴ （４０）（１８０ｍＬ，５０ｍｍｏｌ）を９．２のｐＨを与えるように０．２５ Ｍホウ砂（５０ｍＬ）で処理した。ＳＰＤＰ（ＤＭＦ中５０ｍｇ／ｍＬ）を０， １０，２０および３０分に４回（合計３３．８ｍｍｏｌ）加えた。反応混合物を ２時間静置した。氷冷エタノール（２．１ｍＬ）を加え、生成物を一夜フリーザ ー中に放置した。濁った生成混合物を２本のエッペンドルフ試験管に分割し、最 高速度で１０分遠心した。上清を注意深く除去し，ペレットを水４００ｍＬに溶 解した。この溶液へ２．５Ｍアセテートバッファ（２０ｍＬ，２．５Ｍ，ｐＨ５ ．３）を加えた。 蒸留水中のＴＣＥＰ（１０ｍＬ，２０ｍＭ）を加え、室温で２０分間還元の進 行を許容した。無水エタノール（１．２ｍＬ）を加え、反応混合物を２時間フリ ーザーに置いた。反応混合物をコールドルーム中全速で遠心し、沈澱したｄＴ（ ４０）−ＳＨオリゴヌクレオチドをペレットとして除去した。ペレットをＥＤＴ Ａ２０ｍＭを含有する５ＯｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄バッファー（ｐＨ６．８５）２０ ０ｍＬに溶解した。溶液を脱気し、アルゴン下に保った。次にこの溶液をマレイ ミド化デキストラン化学発光剤粒子（１４．２ｍｇ／１．５ｍＬ）（上で調製し た）へ加え、そして反応混合物を一夜静置した。混合物を１５，０００ｒｐｍで １時間遠心し、上清を捨てた。ペレットを水（２ｍＬ）中に再懸濁し、１５，０ ００ｒｐｍで１時間遠心した。上清を捨て、ペレットを水（２ｍＬ）に再懸濁 した。最終遠心後、ｄＴ（４０）化学発光剤粒子は水２ｍＬ中に懸濁液として貯 蔵した。 結合したクロロフィル／スクアレートを有しそして表面に固定化したストレプ トアビジンを有する光増感剤粒子 ラッテックス粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）をそれへクロロフィル−ａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎ ｙ）と、テトラブチルスクアレート（Ｓａｎｄｓ，Ｊｕｐｉｔａｒ，ＦＬ）を結 合するように以下の方法で処理した。 クロロフィル−ａ（２．０ｍＭ）とテトラブチルスクアレート（４．０ｍＭ） のベンジルアルコール中の染料混合物を調製した。エチレングリコール（８０ｍ Ｌ）を１２５ｍＬエーレンマイヤーフラスコに入れ、研究室ホットプレート上で １２５℃へ温めた。ベンジルアルコール中の染料混合物（８ｍＬ）を加えた直後 、ラテックスストック懸濁液（１０％固形分１０ｍＬ）を加えた。加熱を止め、 フラスコおよびその中味を室温へ放冷した。冷後、混合物を等体積のエタノール で希釈し、直ちに１５，０００ｒｐｍにおいて２時間遠心した。青緑色の上清を 捨て、ペレットをエタノール５０ｍＬに超音波下再懸濁した。懸濁液を１５，０ ００ｒｐｍで１時間遠心し、薄青色の上清を捨てた。ペレットを５０％水性エタ ノール（５０ｍＬ）中に超音波下再懸濁し、粒子を分散した。遠心を１５，００ ０ｒｐｍで１時間くり返し、上清を傾斜した。ペレットを水中に超音波下再懸濁 した。最終遠心後、粒子は水中に最終体積２０ｍＬへ再懸濁した。 ストレプトアビジン（Ａａｓｔｏｎ Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌ ｅｙ ＭＡ）を以下の方法で上のラテックス粒子の表面上に固定化した。 ラテックス粒子の懸濁液（１０ｍｇ／ｍＬの１ｍＬ）を０℃へ冷したＥＤＡＣ 溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ，０．０２Ｍリン酸塩バッファ，ｐＨ６．０の１ｍＬ中 ）へ加えた。懸濁液をアルゴン下３０分攪拌した。この時間後、懸濁液を約０℃ 以下に保つホウ酸塩バッファー（０．２Ｍ，ｐＨ９．０）中へ滴下した。懸濁液 を１時間攪拌し、室温まで温まることを許容した。水（１ｍＬ）を加え、混合物 を１５，０００ｒｐｍにおいて１時間遠心した。上清を捨て、ペレットを超音波 により水（４ｍＬ）に懸濁し、１５，０００ｒｐｍにおいて３０分間最終遠心後 、得られたペレットを水（５ｍＬ）に懸濁した。これはストレプトアビジン−ラ テックス粒子２ｍｇ／ｍＬを与えた。 Ｃ−２８チオキセンは以下のように調製した。 乾燥ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の４−ブロムアニリン（３０ｇ，１７４ｍｍｏｌ ）の溶液へ、１−ブロムテトラデカン（８９．３ｍＬ，３６６ｍｍｏｌ）と、Ｎ ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６２．２ｍＬ，３５７ｍｍｏｌ）を加えた 。反応溶液を９０℃においてアルゴン下で９０℃に加熱し、次に室温へ冷却した 。この反応溶液へ１−ブロムテトラデカン（４５ｍＬ，１８４ｍｍｏｌ）および Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３１ｍＬ、１７８ｍｍｏｌ）を再び加え 、反応混合物を９０℃において１５時間加熱した。冷後反応溶液を減圧濃縮し、 残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（４００ｍＬ）で希釈した。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液は１Ｎ ＮａＯＨ 水溶液（２×），水および食塩水で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、減圧濃縮して 暗褐色 オイル（約１０ｇ）を得た。ヘキサンで溶出するＷａｔｅｒｓ ５００プレップ ＬＣシステムによるシリカゲル上の調製カラムクロマトグラフィーは、主として 生成物（４−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジ−（Ｃ₁₄Ｈ₂₂）−アニリンと、少量成分１−ブ ロムテトラデカンを含有する黄色オイルを与えた。後者の化合物は真空蒸留（ｂ ｐ１０５−１１０℃，０．６ｍｍ）により混合物から除去され、生成物５０．２ ｇ（５１％）を褐色オイルとして残した。乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のマグネシ ウム細片（９ ６０ｇ，３９５ｍｍｏｌ）へ、アルゴン下、ＴＨＦ（２５０ｍＬ ）中の上の置換アニリン生産物（４４．９ｇ，７９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した 。グリニヤー試薬の生成を開始するため沃素結晶数個を加えた。反応混合物が熱 くなり還流し始めた時、滴下速度を緩和な還流を保つように調節した。添加終了 後、混合物をさらに１時間還流へ加熱した。冷却した上清溶液をカニューレで滴 下漏斗へ移し、−３０℃においてアルゴン下、ＴＨＦ（３００ｍＬ），中のフェ ニルグリオキザール（１１．７ｇ，８７ｍｍｏｌ）へ滴下（２．５時間にわたり ）した。反応混合物を１時間にわたって０℃へゆっくりあたため、さらに３０分 間攪拌した。得られた混合物を氷水（８００ｍＬ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ） の混合物中へ注いだ。有機相を分離し、水相を酢酸エチルで抽出（２×）した。 合併した有機相を水（２×）、食塩水で洗い、ＭｇＳＯ₄上で乾燥した。溶媒の 蒸発は暗緑色油状液として粗製物４８．８ｇを与えた。この液体とのフラッシュ ラカムクロマトグラフイー（ヘキサンの勾配溶出、１．５：９８．５，３：９７ ，５：９５酢酸エチル：ヘキサン）は、ベンゾイン生産物（ＬＳＩＭＳ，Ｃ₄₂Ｈ₆₅ ＮＯ₂）２４．７ｇ（５０％）を与えた。〔Ｍ−Ｈ〕⁺６１８．６ ，¹Ｈ ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）は期待したベンゾイン産物と一致し た。乾燥トルエン（５００ｍＬ）中の上のベンゾイン産物（２４．７ｇ，４０ｍ ｍｏｌ）の溶液へ、２−メルカプトエタノール（２５ｇ，３２０ｍｍｏｌ）およ びＴＭＳＣｌ（１００ｍＬ，７８８ｍｍｏｌ）を順次加えた。反応溶液を還流下 ２３時間アルゴン下で加熱し、室温へ冷却した。これへ追加のＴＭＳＣｌ（５０ ｍＬ，３９４ｍｍｏｌ）を加え、反応溶液をさらに１時間還流下加熱した。得ら れた溶液を冷却し、２．５Ｎ ＮａＯＨ冷水溶液で塩基性とし、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽 出（３×）した。合併した有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（２×）および食塩 水で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、、減圧濃縮して褐色油状液を得た。Ｗａｔｅ ｒｓ ５００プレップＬＣシステムの使用によるシリカゲル上の調製カラムクロ マトグラフィー（ヘキサンによる勾配溶出，１：９９，２：９８酢酸エチル：ヘ キサン）はオレンジ黄色オイル（ＬＳＩＭＳ，Ｃ₄₄Ｈ₇₁ＮＯＳ）としてＣ−２８ チオキセン１５．５ｇ（６０％）を与えた。〔Ｍ−Ｈ〕⁺６６１．６，¹Ｈ ＮＭ Ｒ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）は期待したＣ−２８チオキセン産物、２−（４ −（Ｎ，Ｎ−ジ−（Ｃ₁₄Ｈ₂₉）−アニリノ）−３−フェニルチオキセンに一致し た。 ケイ素テトラ−ｔ−ブチルフタロシアニンは以下のように調製した。 新たにカットしたナトリウム金属（５．０ｇ，２０８ｍｍｏｌ）を、マグネチ ックスターラー、還流コンデンサー、乾燥チューブおよびガス泡立て管を備えた ２リットル３頚フラスコ中の無水エーテル３００ｍＬへ加えた。ナトリウムが完 全に溶解した後、漏斗を使 って４−ｔ−ブチル−１，２−ジシアノベンゼン（３８．６４ｇ，２１０ｍｍｏ ｌ，ＴＣＩ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ ＯＲから）を加えた。混 合物は透明になり、温度は約５０℃へ昇温した。この時点で無水アンモニアの連 続流をガラス管を通じて反応混合物へ１時間導入した。次に反応混合物を還流下 ４時間加熱し、この間アンモニアガス流は続けた。反応の途中で固体が沈澱し始 めた。得られた懸濁液を蒸発乾固（自家用真空）し、残渣を水（４００ｍＬ）に 懸濁し、濾過した。固体を乾燥（６０℃，自家真空、Ｐ₂Ｏ₅）した。生成物の収 量（１，３−ジイミノイソインドリン４２．２ｇ）は殆ど定量的であった。この 物質はさらに精製することなく次の工程で用いた。コンデンサーおよび乾燥チュ ーブを備えた１リットル３頚フラスコへ上の生成物（１８ｇ，８９ｍｍｏｌ）と キノリン（２００ｍＬ，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を加えた。四塩化ケイ素（１１ｍＬ，９５ｍｍｏｌ， Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を攪拌した溶液へシリン ジを用いて１０分を要して加えた。添加終了後、反応混合物を油浴中１８０〜１ ８５℃へ１時間加熱した。反応混合物が室温へ冷却するのを許容し、反応混合物 を酸性化（ｐＨ５−６）するため濃ＨＣｌを注意深く加えた。暗褐色反応混合物 を冷却し、濾過した。固体を水１００ｍＬで洗い、乾燥（自家真空、６０℃，Ｐ₂ Ｏ₅）した。固体物質を１リットル丸底フラスコけへ入れ、濃硫酸（５００ｍＬ ）を攪拌しながら加えた。混合物を６０℃で４時間攪拌し、次に砕いた氷（２０ ００ｇ）で注意深く希釈した。得られた混合物を濾過し、固体を水１００ｍＬで 洗い、乾燥した。暗青色の固体を１リットル丸底フラスコへ移 し、濃アンモニア水（５００ｍＬ）を加え、混合物を加熱し、還流下２時間攪拌 し、室温へ冷却し、濾過した。固体を水５０ｍＬで洗い、真空下（自家真空，６ ０℃，Ｐ₂Ｏ₅）乾燥し、暗青色固体として生成物、ケイ素テトラ−ｔ−ブチルフ タロシアニン１２ｇを得た。マグネチックスターラーおよび還流コンデンサーを 備えた１リットル３頚フラスコ中の上の生成物１２ｇへ、３−ピコリン（１２ｇ ，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）と、トリ−ｎ−ブチル アミン（無水，４０ｍＬ）と、トリ−ｎ−ヘキシルクロロシラン（１１．５ｇ） を加えた。混合物を還流下１．５時間加熱し、室温へ冷却した。ピコリンは高真 空下（約１ｍｍＨｇのオイルポンプ）乾固へ留去した。残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶か し、シリカゼルカラム（ヘキサン）を使用して精製し、暗青色固体として純粋な 生産物、ジー（トリ−ｎ−ヘキシルシリル）−ケイ素テトラ−ｔ−ブチルフタロ シアニン１０ｇを得た。ＬＳＩＭＳ：〔Ｍ−Ｈ〕⁺１３６４．２，吸収スペクト ル・メタノール：６７４ｎｍ（ε１８０，０００）：トルエン：６７８ｎｍ，¹ Ｈ ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：δ：−２．４（ｍ，１２Ｈ），−１ ．３（ｍ，１２Ｈ），０．２−０．９（ｍ，５４Ｈ），１．８（ｓ，３６Ｈ）， ８．３（ｄ，４Ｈ）および９．６（ｍ，８Ｈ）は上の期待した生成物と一致した 。 実施例１Ａ ５’−ビオチン標識プライマーおよびプローブのＬセグメント中の特異性レポ ーター配列を用いる増幅産物の検出 Ｅ．ｃｏｌｉのＤｎａＪ遺伝子（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｈｉｌｌ ＭＤから）以 下のプライマーペアを使用してＰＣＲによって増幅し た。 前記プライマー： （配列ＩＤ Ｎｏ．２）（６４１において３’末端結合）（Ｏｌｉｇｏ Ｅｔｃ ，．Ｉｎｃ．） 後方プライマー： （配列ＩＤ Ｎｏ．３）（１０１８において５’末端結合） ノットプローブＰ３０２：オリゴヌクレオチドプローブ（ここでは“ノットプロ ーブ”と呼び、数字はヌクレオチド中ノットプローブの３’末端と標的アンプリ コンの間の距離を意味する。） Ｐ３０２の配列 （配列ＩＤ Ｎｏ．４）；ノット−Ｎ１５−Ｌ２５−Ｎ１５（Ｄ２０） 増幅混合物は、総体積１００μＬ中、２００ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄ ＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃ ａｔａＷａｙ ＮＪ）と、Ｐｆｕポリメラーゼ５単位（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ（Ａ）と、増幅バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ Ｈ８．８，５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．１％ Ｔｒｉｔｏ ｎ Ｘ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），７．５ ｍＭ ＤＴＴ）と、各プライマー１μＭを含有していた。混合物はまたノットプ ローブＰ３０２を２００μＭ含有していた。増幅および増幅産物と内部プローブ の検出し得る複合体の形成はパーキンエルマーサイクラー中の熱サイクリングに より以下のように実施された。９４℃（５分），９４℃（１分），７２℃（２分 ）の４サイクル；９４℃（５分），５５℃（１０分）。熱サイクリングのの終わ りに、増幅混合物１０μｌは、染料ジオタデコニルベンザルアクリダンを結合し そして表面にｄＴ４０を固定した化学発光剤粒子（前に記載したようにして調製 ）６μｇと、そしてクロロフィル／スクアレートを結合しそして表面にストレプ トアビジンを固定した光増感剤粒子（前記したように調製）８μｇを含んでいる 検出バッファ−４０μｌ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ8.8，５０ｍＭ Ｋ Ｃｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１ｍｇ／ｍｌ デキストラン５００Ｋ，１ｍｇ／ｍ ｌ ＢＳＡ，３００ｍＭ ＮａＣｌ）と混合される。反応混合物を室温で４５分 間インキュベートし、該当する結合パートナーの結合を許容した。次に反応混合 物を１５０ワットキセノンランプで１秒の照射および１秒の待機時間の１０サイ クルで照射し、化学発光信号を読み取った。増幅産物の形成を指示する二つの標 識の会合をこのようにして信号の測定によって決定した。得られた結果を表１に 要約する。 実施例１Ｂ 増幅産物の検出に対するノットプローブ中のＬセグメントの長さの影響 Ｅ．ｃｏｌｅ Ｋ１２ ＤｎａＪ遺伝子配列の増幅条件および増幅産物の検出 条件は、ノットプローブのＬセグメント（二つの認識発列間のリンカー配列とし て定義される）の長さの系統的変更を除いて、実施例１Ａの記載と同じであった 。実施例１Ｂにおいて使用した三つのノットプローブは規定したＬセグメント長 さを除いてノットプローブＰ３０２と同様であり、ノットプローブＰＡ：Ｌ２５ ，ノットプローブＰＢ：Ｌ２０およびノットプローブＰＣ：Ｌ１５であった。 得られた結果を表２に要約する。 この実施例において、増幅産物の検出の感度においてＬセグメントの長さの増 加につれて少しの改善が示された。 実施例１Ｃ 信号発生に対する増幅の程度すなわち増幅サイクルの数の影響 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤｎａＪ遺伝子配列の増幅および増幅産物の検出の条 件は、以下の熱サイクリングのプロフィルを除いて実施例１Ａの記載と同じであ った。使用した熱サイクリング：９４℃（１分）；７２℃（２．５分）をそれぞ れ３０サイクルおよび３５サイクル；９４℃（１分）；５５℃（１０分）化学発 光は実施例１Ａのように決定した。 得られた結果を表３に示す。 観察した化学発光はアンプリコン濃度の増加につれて増加した。 実施例１Ｄ 二つのノットプローブを使用する増幅産物の検出 反応は実施例１Ａのように実施された。増幅混合物は二つのノットプローブ、 Ｐ３０２とＰ１４３（ノット−Ｎ１５−Ｌ２４−Ｎ１５（Ｄ１５） を含んでいた。ノットプローブの濃度は、アンプリコン検出可能性に対するプロ ーブ濃度の影響を評価するため異なる反応混合物毎に変えた。プローブの最終濃 度は３００，２００，１００，５０または２５ｎＭであった。これらの実験のた め、光増感剤粒子は、ストレプトアビジンの代わりに、（ＧＡＴＴＡ）７（配列 ＩＤ Ｎｏ．６）（Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅ ｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ ＴＸ）を光増感剤粒子表面に固定化し たことを除き、上に示したのと同様な方法で調製された。ｄＴ４０を固定化した 化学発光粒子は上に同じであった。以下の熱サイクリングプロフィルが採用され た。９４℃（５分）；９４℃（１分）；７２℃（２．５分）を３６サイクル；９ ４℃（５分）；４３℃（１０分）粒子のオリゴヌクレオチドのアンプリコン上の それらのそれぞれの配列への結合および化学発光信号の検出および測定のための 条件は実施例１Ａと同じであった。 結果を表４に要約する。 見られるように、アンプリコン検出可能性は最適範囲ではあるがある程度プロ ーブ濃度に依存し、信号発生はプローブ濃度に強く依存しなかった。プローブが それらの３’末端においてブロックされていない限り、これらは増幅産物へのハ イブリダイゼーションの後延長されることができる。後の実施例では、３’−ブ ロックプローブおよびエキソポリメラーゼが使用された。これらの条件下では、 ポリメラーゼはハイブリダイズ産物上で延長できない。 実施例１Ｅ 各種プローブを使用する増幅産物の検出 ＤｎａＪ Ｅ．Ｃｏｌｉ遺伝子の増幅を前の実施例と同じ条件で実施した。使 用した二つのプローブは、これらのプローブがアンプリコン（４５５ｂｐ）の５ ’末端からそれぞれ１４３塩基および３０２塩基へハイブリダイズすることを示 すために、Ｐ１４３およびＰ３０２と命名された。種々のＰ１４３プローブ、す なわちノットプローブＰ１４３，オメガプローブＰ１４３および線状プローブＰ １４３はそれらの３’末端において共通の１５塩基長配列を持っていた。同様に Ｐ３０２プローブ、すなわちノットプローブＰ３０２ 、オメガプローブＰ３０２および線状プローブＰ３０２は３’末端に共通の１５ 塩基を持っていた。Ｐ１４３プローブは共通の認識配列（Ｌセグメント中の）の ５’末端に（ＣＴＡＡＴＣ）４オリゴヌクレオチド標識を持ち、そしてＰ３０２ プローブは共通の認識配列（Ｌセグメント中の）５’末端にｄＡ２５オリゴヌク レオチド標識を持っていた。異なるプローブは、第２の１５塩基認識配列の存在 および標的アンプリコンへハイブリダイズした時この認識配列の位置に関して構 造上違っていた。ノットプローブについては、第２の認識配列は、第１の認識配 列よりもアンプリコンの５’末端へより近く結合することができた。オメガプロ ーブは第１の認識配列よりもアンプリコンの３’末端へより近く結合することが できる第２の１５塩基長さの認識配列を持っていた。線状プローブは単一の認識 配列だけを持っていた。 使用したプローブは以下の配列を持っていた。 ノットＰ３０２（ノット−Ｎ１５−Ｌ２４−Ｎ１５（Ｄ２０）前出）： ノットＰ１４３（ノット−Ｎ１５−Ｌ２４−Ｎ１５（Ｄ１５））： オメガＰ３０２（オメガ−Ｎ１５−Ｌ２５−Ｎ１５（Ｄ２０））： オメカＰ１４３（オメガ−Ｎ１５−Ｌ２４−Ｎ１５（Ｄ１４））： 線状Ｐ３０２（線状−Ｎ１５−Ｌ２５）： 線状Ｐ１４３（線状−Ｎ１５−Ｌ２４）： プローブは種々の組合せで使用した。ノットおよび線状プローブが使用される 場合には、これらプローブは増幅前に反応混合物へ添加された。線状プローブが 使用される場合には増幅の終わりに添加された。アンプリコンのプローブの結合 は、混合物を９４℃〜５分加熱し、３８℃で１０分インキュベートすることによ って達成された。使用した粒子は固定化した（ＧＡＴＴＡＧ）７を有する光増感 剤粒子と、固定化したｄＴ４０を有する化学発光剤粒子であり、その両方は以前 のように調製した。粒子を増幅混合物の部分標本と混合し、室温で４５分間イン キュベートした。化学発光信号は以前の実施例のように測定された。 表５は使用したプローブの種々の組合せを示す。 この実験のセットにおいて、組合せ１〜３は１０標的ＤＮＡ分子の検出に適し 、、そして組合せ４〜７は前増幅サンプル中の１０⁴標的ＤＮＡ分子の検出に適 していた。 実施例１Ｆ ３’−ブロックノットプローブを使用するＰＣＲおよびＡＳＰＰ増幅産物の検 出 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤｉａＪ遺伝子配列を以下の二つの異なる操作によっ て増幅した。 前出のＳａｉｋｉに記載のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、および前出米国 特許出願Ｎｏ．０８／１４０，３６９記載のＡＳＰＰ（単一ポリヌクレオチドプ ライマーを使用する増幅），これら文献の適切な開示を参照としてここに取り入 れる。 ＰＣＲ増幅において以下のプライマーが使用された。 前方ＰＣＲプライマー： （３’末端が位置１８９において結合）（Ｏｌｉｇｏ Ｅｔｃ．Ｉｎｃ） 逆ＰＣＲプライマー： （３’末端が位置１１９において結合） 以下のオリゴヌクレトチドがＡＳＰＰにおいて使用された。ＡＳＰＰは単一プ ライマーと、この単一ストランドの５’末端へ近い位置において同じ標的ストラ ンドへプライマーとして結合することができるストランドスイッチオリゴヌクレ オチド（ＳＳＯ）を使用した。 単一プライマー： （３’末端が位置１８９において結合）（Ｏｉｌｇｏ Ｅｔｃ．Ｉｎｃ．） ＳＳＯ： （３’末端が位置７２６において結合） 増幅反応混合物の組成は以前の実施例に記載した組成と同様であった。（ＣＴ ＡＡＴＣ）４標識を有する３’−ｄｄｃ−ブロックノットプローブＰ４８４ Ｎ １５−Ｌ２４−Ｎ１５（Ｄ８）を前述したように調製し、表６に示した濃度にお いて増幅混合物中へ含めた。ノットプローブは以下の配列を有していた。 （＊＝フォスフォロチオエート）（チオ修飾結合の配置までは自動ＤＮＡシンセ サイザーを使用し、次に０．１Ｍテトラエチルチウラムジサルファーイド（Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ） により人手による酸化を実施 し、もし残っていれば残りの塩基をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎ ｃ．Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｎｏ．５８，Ｆｅｂｒａｒｙ １９９１のプ ロトコールに従って普通のカップリング条件下で加えて調製） これら増幅反応のための熱サイクリングプロフィルは以下のとおりであった。 ９４℃（５分），９４℃（０．５分），６６℃（１時間），７２℃（２分），４ ４サイクル；９４℃（５分），４３℃（１０分） 増幅産物の検出のため使用した粒子は、固定した（ＧＴＡＡＴＧ）７を有する 化学発光剤粒子（Ｃ−２８チオキセン、ＤＰＰ／Ｅｕ（ＴＴＡ）３で染色）と、 ストレプトアビジンを固定した光増感剤粒子（クロロフィル−ａ／スクアレート で染色）であった。 化学発光剤粒子は以下のようにして調製した。ＤＰＰ／Ｅｕ（ＴＴＡ）₃は、 乾燥トルエン５０ｍｌ中でＥｕ（ＴＴＡ）₃・Ｈ₂Ｏの８．６９ｇ（Ｋｏｄａｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ，１０ｍｍｏｌ ）と、１，１０−フェナントロリン１．８ｇ（１０ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ） を混合し、油浴中１時間加熱することによって製造した。減圧下トルエンを除去 した。着色した固体灰物をトルエン１０ｍｌから結晶化し、ＤＰＰ／Ｅｕ（ＴＴ Ａ）₃１０ｇを得た。吸収スペクトル：２７０ｎｍ（２０，０００），３４０ｎ ｍ（６０，０００）（トルエン）：ＩＲ（ＫＢｒ）：ｃｍ^-1：３４４０（ｓ）， １６００（ｓ），１５４０（ｓ），１，４００（ｓ），１３００（ｓ） 洗浄した１７５ｎｍカルボキシレート修飾ラテックスの２０％懸濁液（４００ ｍｇ）を攪拌棒を備えた２５ｍＬ丸底フラスコ中でエ トキシエタノール３ｍＬで希釈した。丸底フラスコを次に１０５℃の油浴へ入れ 、１０分間攪拌した。次にＣ−２８チオキセン３．３ｍＭおよびＥｕ（ＴＴＡ）₃ ＤＰＰ１５．５ｍＭを加え、ビーズをさらに５分間攪拌した。この時点で０． １Ｎ ＮａＯＨ １．０ｍＬを５分間でゆっくり加えた。添加の全期間、油浴温 度は１０５℃に保った。油浴温度をゆっくり２時間にわたって室温へ下降するの を許容した。冷後混合物をエタノール２０ｍＬで希釈し、遠心（１２，５００ｒ ｐｍ，３０分）した。上清を捨て、ペレットを超音波によりエタノール中に再懸 濁した。遠心をくり返し、ペレットを水に再懸濁し、遠心をくり返した。ペレッ トを水性エタノール５ｍＬ中に最終体積４０ｍＬに再懸濁した。 光増感剤粒子は前に記載したのと同様に調製した。 適切な結合パートナーの結合のためのアッセイインキュベーションおよび化学 発光信号の測定は以前の実施例記載のとおりであった。 得られた結果を表６に要約する。 実施例２ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＢＣＧ）（ＩＳ６１１０）遺伝子配列の増幅 産物の均質検出 実施例２Ａ 二つのノットプローブを用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＢＣＧ）ゲノ ムＤＮＡの単一チューブ増幅および検出 Ｃ．Ｇｒｅｅｎ，ＳＲＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒ ｋ ＣＡから得たＭ．ｔｅｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＢＣＧ）ゲノム標的配列のＡ ＳＰＰ増幅は、２２塩基長さプライマーおよび６７塩基長さストランドスイッチ オリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を使用して実施された。得られた増幅産物は４９ ５塩基対長さであった。増幅は二つの３’−ブロックノットプローブ（標準技術 によって調製した３’−ヒドロキシルをプロピル基でブロック）と、後で詳しく 説明する対応する粒子の存在下で実施された。 プライマー： ＳＳＯ：プローブＡ（Ｐ２７４）：ノット−Ｎ（１９）−Ｌ（２３）−Ｎ（１９）（Ｄ４ ） ブロックした３’−スペーサーＣ３ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡから）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９） プローブＢ（Ｐ３０８）：ノット−Ｎ（２０）−Ｌ（２３）−Ｎ（２１）（Ｄ１ ０） ブロックした３’−スペーサーＣ３ ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０） ｄＮＴＰｓ：デオキシヌクレオチド三リン酸 ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ（Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ） １×バッファーＢ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣ ｌ，４．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．２ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（Ｇｌｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ） ポリメラーゼ：組換えエキソＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ） 化学発光剤粒子： 化学発光染料Ｃ−２６チオキセンおよびＥｕ（ＴＴＡ）₃ＤＰＰを結合し、５ ’末端を通じｄ（ＧＡＴＴＡＧ）７オリゴヌクレオチドを共有結合した、前に記 載したように調製したラテックス粒子。Ｃ−２６チオキセンは以下のように調製 した。 ５−ブロムバレリアン酸エチルをＮ−エチルアニリンと縮合し、生成物をキルス マイヤー・ハーク合成（ＤＭ／ＰＯＣｌ₃）によりアルデヒドヘ変換した。この アルデヒドのベンズアルデヒドとのベンゾイン縮合生成物を水酸化カリウムおよ びジフェニルフォスフォリ ルアジト（ＤＰＰＡ）で加水分解した。この生成物のＣ−２６チオキセンへの変 換はメルカプトエタノールおよびＴＭＳＣｌとの縮合によって実施された。 光増感剤粒子： 上に記載したように調製した、染料ケイ素テトラ−ｔ−ブチルフタロシアニン を有し、５’末端へ共有結合したｄＴ（４０）オリゴヌクレオチド（０ｌｉｇｏ Ｅｔｃ．Ｉｎｃ）を有する光増感剤粒子。 二つのノットプローブは、それぞれその５’末端から１８２および１７３塩基 であるアンプリコン上の配列へ結合した３’末端を持っていた。増幅の増加した 特異性のため、良く知られたＨｏｔ Ｓｔａｒｔ １００^TM反応チューブ（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用するホットスタート技術が使用された。これは、ポリメラーゼおよ びサンプル以外のすべての反応成分を５０μｌの総体積に合併し、この液層をワ ックスでシールすることにより得られた。（混合物へ１個のワックスビードを加 え、チューブを７０℃へ２分加熱し、室温へ冷却して固化させ、液層（下層）を シールした。）反応開始に先立って、ＤＮＡポリメラーゼを総体積５０μｌへサ ンプルと混合し、混合物を反応混合物へ添加した。この二つの液体成分の混合は 熱サイクリングへ服されることによって得られた。種々の成分の最終濃度は以下 のとおりであった。 プライマー０．５μＭ，ＳＳＯ ２５ｎＭ，プローブ１２．５ｎＭ；アクセプタ ー粒子５．０μｇ；光増感剤粒子２．５μｇ；ｄＮＴＰｓ ２００μＭ；バッフ ァーＢ １ｘ；ポリメラーゼ５単位 以下の熱サイクリングプロフィルが使用された。９５℃（２分）；９５℃（１／ ４分），６８℃（１分），７２℃（１分）×４２サイクル；７２℃（５分），９ ５℃（２分），５０℃（１５分），３７℃（３０分）この最後のサイクルは後記 のように変更された。実施例２ＡＩおよび２ＡIIは上のように実施された。実施 例２ＡIIIおよび２ＡIVにおいては、最後のサイクルは以下のようであった。７ ２℃（５分），９５℃（２分），室温（２時間），３７°Ｃ（３０分） 実施例２ＡＶにおいては最後のサイクルは以下のようであった。７２℃（５分 ），９５℃（２分），室温（１８時間），３７℃（３０分） 化学発光信号は、１秒照射（＞６３５ｎｍ）および１秒読取り（５８０−６３ ０ｎｍ）の３サイクルによって得た。 得られた結果を表７に要約する。 実施例２Ｂ 二つのノットプローブもしくはノットプローブと尾部プローブの組合せによる Ｍ．ｔｕｂｅｒｏｃｕｌｏｓｉｓ（ＢＣＧ）標的配列（１Ｓ６１１０）の増幅お よび検出 この実施例に使用した標的ＤＮＡ配列は、前の実施例２Ａに記載したのと同様 に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｏｃｕｉｏｓｉｓ標的配列（１Ｓ６１１０）によって生成さ れたアンプリコンであった。このアンプリコンはゲル電気泳動によって精製され 、そして規定した分子数を含む希釈液が以下の実験に使用された。このため標的 ＤＮＡ配列はステム−ループｄｓ ＤＮＡであり、これは単一プライマーによっ て増幅された。バッファー組成、プライマー、ＰｆｕポリメラーゼおよびｄＮＴ Ｐｓは前の実施例２Ａと同じであった。Ｐ８５尾部鎖状プローブ（Ｎ１８−Ｌ２ ０）は以下のとおりであった。 プローブＰ２０８ノットおよびＰ２７４ノットは前の実施例２Ａと同じであった 。 増幅混合物は表８に規定するように、各自１０．８ｎＭの最終濃度において二 つのプローブと、そして両方とも上で調製した二つの検出粒子、（ＧＡＴＴＡＧ ）７を有する化学発光剤粒子およびｄ（Ａ）４０を有する光増感剤粒子を含んで いた。標的ＤＮＡありまたはなしのサンプルの希釈液を反応混合物へ加えた。増 幅および検出可能な複合体の形成は以下の熱サイクリングによって実施された。 ９５℃（２分），９５℃（１５秒），６８℃（１分），７２℃（１分）×３９サ イクル：９５℃（１５秒），６８°Ｃ（１分），７２℃（５分），室温（１４時 間）；３７℃（３０分） このサイクリングの後、化学発光を前の実施例２Ａによって読み取った。結果 を表８に要約する。 見られるように、上のプローブのすべての組合せが定義した標的 ＤＮＡ配列の検出に適していた。 実施例２Ｃ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡ（ＩＳ６１１０）の増幅および二 つの３’−ブロックプローブを用いるＥＬＩＳＡ検出 ＡＳＰＰによる増幅はノットプローブの存在下Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ゲノムＤＮＡ（ＩＳ６１１０）（標的ＤＮＡ）に実施された。得られたＡＳＰＰ アンプリコンは６５０ｂｐであり、そして前の実施例のようにＭ．ｔｕｂｅｒｃ ｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡから誘導された。以下は使用したプライマーノットプ ローブのための配列および構造情報である。 プライマー： ノットＰ４９９：（Ｎ（１５）−Ｌ（２４）−Ｎ（１５））５’−ビオチン−３ ’−リン酸（Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎ ｖｉｌｌｅ ＯＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３） ノットＰ３０６（Ｎ（１５）−Ｌ（２４）−Ｎ（１５））５’−ジゴキシン−： ３’−リン酸（Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏ ｎｖｉｌｌｅ ＯＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４） 増幅は、バッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８，５０ｍＭ Ｋ Ｃｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，７．５ｍＭ ＤＴＴおよび０．１％ Ｔｒｉｔ ｏｎ Ｘ−１００）中、０．５ｍＭプライマー、各ノットプローブＰ４９９およ びノットプローブＰ３０６ ２５ｍＭ，各ｄＮＴＰｓ ２００μＭ，エキソ^-Ｐ ｆｕ ５単位を有する反応混合物中で実施された。全体の反応混合物は５０μｌ であった。混合物は以下の熱サイクリングヘ服される。９５℃（４分），９４℃ （３０秒），７０℃（１分），７２℃（２分）×４０サイクル；９５℃（４分） ，４５℃（１５分） 増幅混合物の１０μｌ部分標本を増幅産物の存在についてＥＬＩＳＡにより分 析した。アッセイは、ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレー ト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉ Ｌ）と、抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント−ＰＯＤ接合体（酵素接合体）（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａ ｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）を使用した。一方はビオチンで標識し、他方はジゴキシ ンで標識した二つのノットプローブ４９９および３０６の増幅産物の１本鎖への 結合は、二つの標識ビオチンおよびジゴキシンの会合をもたらし、それは固定化 したストレプトアビジンへの結合と、酵素接合体によるジゴキシン標識の検出に よって検出することができる。 ＥＬＩＳＡプロトコールは以下のとおりであった。 １．ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイターウエルを０．０５％Ｔｗ ｅｅｎ３０を加えたリン酸塩バッファーｐＨ７．５の ３００μｌで１回洗浄した。 ２．サンプルバッファー（３％ ＢＳＡ，１００μｇ／ｍｌ子牛胸線ＤＮＡ，３ ００ｍＭ ＮａＣｌ，２５％ウシ胎児血清，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０，すべて リン酸塩バッファーｐＨ７．５中）９０μｌを各ウエルへ加えた。 ３．増幅反応混合物１０μｌを各ウエルへ加え、プレートを３７℃で１時間イン キュベートした。 ４．ウエルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸塩バッファー（１． ７ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄，５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７． ４，Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ ＭＩ）（２５０μｌ ）で４回洗った。 ５．サンプルバッファー中の酵素接合体１００μｌを各ウエルへ加え、プレート を３７℃で１時間インキュベートした。 ６．ウエルをステップ４のように洗った。 ７．ＴＭＢペルオキシド基質溶液（テトラメチルベンジリジン，Ｋｉｒｋｅｇａ ａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）１００μｌを 各ウエルヘ加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。 ８．発色を４５０ｎｍにおいて読み取った。 反応あたり標的ＤＮＡ約１００分子の不存在下または存在下得られた結果を表 ９に要約する。 上の議論は本発明に含まれるメカニズムに関していくつかの理論を含んでいる 。本発明は記載した結果を達成することが証明されているので、これらの理論は 本発明を少しでも限定すると解してはならない。 上の説明および実施例はその好ましい具体例を含めて本発明を完全に開示する 。分子生物学および関連する科学のような分野における当業者に自明な記載した 方法の修飾は以下の請求の範囲の範囲内であることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リウ，イエン ピン アメリカ合衆国95014カリフォルニア、キ ューパーチノ、サンセットスプリングコー ト11525 (72)発明者 パテル，ラジェシュ ディー アメリカ合衆国94555カリフォルニア、フ レモント、ノースウィンドテラス34270 (72)発明者 カーン，ヌリス アメリカ合衆国940306カリフォルニア、パ ロアルト、ラモナストリート2876 (72)発明者 リン，クレア アメリカ合衆国94303カリフォルニア、パ ロアルト、コロラドアベニュー914 (72)発明者 ローズ，サミュエル ジェイ アメリカ合衆国94022カリフォルニア、ロ スアルトス、カシタウエイ505

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）組合せにおいて、（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含有する疑 いのある媒体、（ii）前記標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するために必 要なすべての試薬、そして（iii）前記増幅の産物の１本鎖へ結合することがで きる二つのオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プローブの少なくとも一 方は（ｉ）非隣接でありかつ前記１本鎖の隣接もしくは非隣接部位へ結合するこ とができるか、または（ii）前記１本鎖の非隣接部位へ結合することができる二 つの配列を有する、二つのオリゴヌクレオチドプローブを用意し、 （ｂ）前記組合せを前記標的ポリヌクレオチドの増幅のための条件へ服せしめ 、 （ｃ）ステップ（ｂ）の後前記組合せを前記プローブが前記１本鎖の一つへハ イブリダイズし、３分子複合体を形成する条件へ服せしめ、そして （ｄ）前記複合体を検出する、 ことを含む標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそして検出する方法。 ２． 前記試薬は、前記標的ポリヌクレオチド配列へ結合することができる二 つのオリゴヌクレオチドと、そして前記標的ポリヌクレオチド配列の存在の関数 として前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一方を修飾することができる酵素を 含んでいる請求項１の方法。 ３． 前記試薬は、前記標的ポリヌクレオチド配列へ結合しそし てそれに沿って延長されることができるオリゴヌクレオチドプライマーと、ヌク レオチドポリメラーゼと、そしてヌクレオシド三リン酸を含んでいる請求項１の 方法。 ４． 前記試薬は、（ｉ）各自それぞれ前記標的ポリヌクレオチド配列および 前記ポリヌレクオチド配列に対して相補的な配列へ結合しそしてそれに沿って延 長されることができる二つのオリゴヌクレオチドプライマーと、（ii）ヌクレオ チドポリメラーゼと、そして（iii）ヌクレオシド三リン酸を含んでいる請求項 １の方法。 ５． 各プローブは標識を含み、そして前記組合せは前記標識へ結合すること ができる粒子をさらに含み、そして前記検出は前記粒子の凝集を検出することを 含む請求項１の方法。 ６． （ａ）組合せにおいて、標的ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレ オチド検体を含有している疑いのあるサンプルと、前記ポリヌクレオチド検体を 増幅して前記標的ポリヌクレオチド配列のコピーを生産するための試薬と、ヌク レオチド配列Ｓ１およびＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび ヌクレオチド配列Ｓ３およびＳ４を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブで あって、これらプローブの少なくとも一方を含んでいる配列は（ｉ）それらが非 隣接でかつ前記コピーのストランドの一つ上の隣接もしくは非隣接剖位へ結合で きるか、または（ii）それらがハイブリダイズする前記コピーのストランドの一 方の上の部位が非隣接であるように連結されており、そして前記プローブは（ｉ ）前記増幅の間前記コピーへ実質上ハイブリダイズせず、そして（ii）増幅後前 記プローブの両方は前記コピーのストランドの一方へハイブリダイズでき、そし て（iii）前記プローブの各自は前記ストランドへハイ ブリダイズした前記プローブの検出を容易化する標識を含んでいる前記二つのオ リゴヌクレオチドを用意し、 （ｂ）前記組合せを前記ポリヌクレオチド検体の増幅のための条件へ服せしめ 、 （ｃ）ステップ（ｂ）の後、前記組合せを前記プローブが前記ストランドの一 方へハイブリダイズして３分子複合体を形成する条件へ服せしめ、そして （ｄ）前記複合体を検出すること、 を含んでいるポリヌクレオチド検体の標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそして 検出するための方法。 ７． 前記Ｓ１の３’末端は前記Ｓ２の５’末端へ１ないし２００原子の鎖を 含んでいる連結基によって連結されている請求項６の方法。 ８． 前記鎖は１ないし４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含ん でいる請求項７の方法。 ９． 前Ｓ１の３’末端は前記Ｓ２の５’末端へ連結基によって連結されてお り、前記Ｓ３の３’末端は前記Ｓ４の５’末端へ連結基によって連結されており 、前記連結基の各自は０ないし４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを 含んでいる請求項６の方法。 １０． 前記複合体の検出は前記複合体の粒子への会合を含んでいる請求項６ の方法。 １１． 前記検出は前記粒子の凝集を検出することを含む請求項１０の方法。 １２． 前記標識は認識配列である請求項６の方法。 １３． 前記連結基の少なくとも一部分は認識配列である請求項７の方法。 １４． 前記Ｓ１は前記コピー上の前記Ｓ２のハイブリダイゼーション部位の ５’末端に横たわる前記コピー上の部位へハイブリダイズし、前記Ｓ１の３’末 端は前記Ｓ２の５’末端へ連結されている請求項６の方法。 １５． 前記Ｓ１およびＳ２はヌクレオチド連結基によって連結されており、 前記Ｓ３およびＳ４はヌクレオチド連結基によって連結されている請求項６の方 法。 １６． 前記連結基は認識配列を含んでいる請求項１５の方法。 １７． 前記組合せは前記認識配列に対して相補的であるオリゴヌクレオチド Ｎ１およびＮ２を含み、前記Ｎ１およびＮ２は各自レポーター基で標識されてい る請求項１６の方法。 １８． 前記Ｎ１はそれへ会合した光増感剤を有する粒子へ会合しており、そ して前記Ｎ２はそれへ会合した化学発光化合物を有する粒子へ会合している請求 項１７の方法。 １９． 当該方法のために必要なすべての試薬が最初に標的ポリヌクレオチド と組合わされる、標的ポリヌクレオチド配列を含んでいる標的ポリヌクレオチド を検出する方法であって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドが２本鎖である時前記標的ポリヌクレオチド を１本鎖に解離し、 （ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを前記１本鎖の各自へハイブリダイズし 、 （ｃ）前記１本鎖の各自へハイブリダイズした前記プライマーを １本鎖に沿って延長して前記標的ポリヌクレオチド配列のコピーを生産し、 （ｄ）前記コピーを１本鎖に解離し、 （ｅ）前記１本鎖の一方へ、二つのオリゴヌクレオチドプローブであって、こ れらプローブの少なくとも一方は前記１本鎖の一方へハイブリダイズする二つの 配列を含み、これら二つの配列は（ｉ）非隣接でありかつ前記１本鎖上の隣接も しくは非隣接部位へ結合できるか、または（ii）これら配列がハイブリダイズす る前記１本鎖上の部位が非隣接である、前記二つのプローブをハイブリダイズし 、 （ｆ）前記プローブの前記１本鎖への結合を検出し、その存在を前記標的ポリ ヌクレオチドの存在に関連させる、 ことを含む前記方法。 ２０． 前記プローブの各自は標識を含んでいる請求項１９の方法。 ２１． 前記プローブの少なくとも一方は粒子へ結合もしくは結合されること ができる請求項１９の方法。 ２２． 前記プローブの各自は前記１本鎖へハイブリダイズする二つの配列を 含み、これら配列および／またはこれら配列がハイブリダイズする前記１本鎖上 の前記部位は非隣接である請求項１９の方法。 ２３． 前記プローブの各自は認識配列を含んでいる請求項１９の方法。 ２４． 前記検出は前記認識配列へのオリゴヌクレオチドＮ１およびＮ２の結 合を含み、前記Ｎ１は第１の標識へ結合され、前記Ｎ ２は第２の標識へ結合されている請求項２３の方法。 ２５． 前記第１の標識は光増感剤を含んでいる請求項２４の方法。 ２６． 前記粒子は光増感剤を含んでいる請求項２１の方法。 ２７． 前記粒子はルミネセンス化合物を含んでいる請求項２１の方法。 ２８． 標的ポリヌクレオチドの標的配列（“標的配列”）の検出方法であっ て、 （ａ）前記標的配列を、 （ｉ）前記標的配列の３’末端へ第１のオリゴヌクレオチドプライマー（“ 第１のプライマー”）をハイブリダイズするステップ、 （ii）ポリメラーゼおよびヌクレオテド三リン酸の存在下、前記第１のプラ イマーを少なくとも前記標的配列に沿って延長して延長された第１のプライマー を生産するステップであって、前記第１のプライマーは（ｉ）前記延長された第 １のプライマーか、または（ii）前記標的配列に対して相補的なポリヌクレオチ ド（“相補ポリヌクレオチド”）へハイブリダイズできそしてそれに沿って延長 されることができる第２のプライマー（“第２のプライマー”）の延長から得ら れる延長された第２のプライマーへハイブリダイズしそして延長されることがで きる、前記ステップ、 （iii）前記延長された第１のプライマーを前記標的配列から解離するステ ップ、 （iv）前記延長された第１のプライマーの３’末端へ前記第１もしくは第２ のプライマーをハイブリダイズするステップ、 （ｖ）前記第１もしくは第２のプライマーを前記延長された第１のプライマ ーに沿って延長するステップ、 （vi）前記延長された第１のプライマーまたは延長された第２のプライマー を前記延長された第１のプライマーから解離するステップ、 （vii）前記延長された第１のプライマーまたは延長された第２のプライマ ーへ前記第１のプライマーをハイブリダイズするステップ、 （viii）ステップ（ｖ）ないし（vi）をくり返すステップをふくむ方法によ って前記標的配列を増幅するステップ、および （ｂ）前記延長された第１のプライマーおよび／または延長された第２のプラ イマーを、ヌクレオチド配列Ｓ１およひＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチド プローブと、ヌクレオチド配列Ｓ３およびＳ４を有する第２のオリゴヌクレオチ ドプローブとによって検出するステップを含み、ここでこれらのプローブの少な くとも一方を含んでいる配列は、その二つの配列が（ｉ）非隣接でありかつ前記 延長されたプライマーの一つの上の隣接もしくは非隣接部位へ結合することがで きるか、または（ii）前記延長されたプライマーの一つの上の非隣接部位へ結合 するように連結されており、そして前記プローブは（Ａ）前記増幅の間存在し、 （Ｂ）前記ステップ（ａ）の増幅間前記延長された第１および／または第２のプ ライマーへ実質上ハイブリダイズせず、（Ｃ）前記ステップ（ａ）の増幅を妨害 せず、（Ｄ）前記ステップ（ａ）の後前記プローブの両方は前記延長された第１ および／または第２のプライマーの一つへハイブリダイズして３分子複合体を形 成することができ、そして（Ｅ）前記プ ローブの一方または両方は前記延長された第１および／または第２のプライマー へハイブリダイズした前記プローブの検出を容易化する標識を含んでいることを 特徴とする前記方法。 ２９． ステップ（ｖ）ないし（vii）のくり返しはくり返した温度サイクリ ングによって達成される請求項２８の方法。 ３０． 前記標的ポリヌクレオチドはＤＮＡである請求項２８の方法。 ３１． 前記第１のプライマーのみが使用され、そして前記標的配列はその５ ’末端において前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記標的配列の３’ 末端の配列へハイブリダイズすることができる少なくとも１０塩基配列を含んで いる請求項２８の方法。 ３２． 前記第１および第２のプライマーは異なっており、そして前記延長さ れた第１のプライマーは前記第２のプライマーの鋳型であり、前記延長された第 ２のプライマーは前記第１のプライマーの鋳型である請求項２８の方法。 ３３． 前記Ｓ１の３’末端は前記Ｓ２の５’末端へ０ないし４０ヌクレオチ ドもしくはヌクレオチドアナログを含んでいる連結基によって結合されている請 求項２８の方法。 ３４． 前記Ｓ１の３’末端は前記Ｓ２の５’末端へ連結基によって連結され 、前記Ｓ３の３’末端は前記Ｓ４の５’末端へ連結基によって連結され、前記連 結基の各自は０ないし４０ヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログを含んで いる請求項２８の方法。 ３５． 前記複合体の検出は前記複合体の粒子との会合を含む請求項２８の方 法。 ３６． 前記検出は前記粒子の凝集の検出を含んでいる請求項３ ５の方法。 ３７． 前記標識は認識配列である請求項２８の方法。 ３８． 前記プローブの少なくとも一方を含んでいる配列は連結基によって連 結されており、前記連結基の少なくとも一部分は認識配列を含んでいる請求項２ ８の方法。 ３９． 前記ステップ（ｂ）の検出は前記認識配列に対し相補的なヌクレオチ ドＮ１およびＮ２の使用を含み、前記Ｎ１およびＮ２は各自レポーター分子で標 識されている請求項３８の方法。 ４０． 前記Ｎ１は会合した光増感剤を有する粒子へ会合しており、前記Ｎ２ は会合した化学発光化合物を有する粒子へ会合している請求項３９の方法。 ４１． 包装された組合せにおいて、 （ａ）標的ポリヌクレオチド配列へ結合することができる二つのオリゴヌクレ オチドと、前記配列の存在の関数として前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一 方を修飾することができる酵素を含んでいる、前記標的ポリヌクレオチド配列の 増幅を実施するための試薬、および （ｂ）前記増幅の産物の１本鎖へ結合することができる二つのオリゴヌクレオ チドプローブであって、前記プローブの少なくとも一方は（ｉ）非隣接でありか つ前記１本鎖の隣接もしくは非隣接部位へ結合することができるか、または（ii ）前記１本鎖上の非隣接部位へ結合できる二つの配例を有し、各プローブは標識 を含んでいる二つのプローブ を含んでいる標的ポリヌクレオチド配列の増幅および検出に使用するためのキッ ト。 ４２． 前記プローブの各自上の標識へ結合することができる粒子を含んでい る請求項４１のキット。 ４３． 前記標識は認識配列である請求項４１のキット。 ４４． 前記プローブの一方へ結合した、もしくは結合することができる粒子 を含んでいる請求項４１のキット。 ４５． 前記プローブの他方へ結合した、もしくは結合することができる第２ の粒子を含んでいる請求項４４のキット。 ４６． 前記試薬は、 （ａ）ヌクレオチド三リン酸 （ｂ）オリゴヌクレオチドプライマー、および （ｃ）ヌクレオチドポリメラーゼ を含んでいる請求項４１のキット。 ４７． 標的ポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の増幅および検出 に使用するためのキットであって、 （ａ）前記標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズすることができ、かつ前記 標的ポリヌクレオチド配列に沿って延長することができるオリゴヌクレオチドプ ライマー、 （ｂ）ヌクレオシド三リン酸、 （ｃ）ヌクレオチドポリメラーゼ、 （ｄ）ヌクレトチド配列Ｓ１およびＳ２を有する第１のオリゴヌクレオチドプ ローブ、および （ｅ）ヌクレオチド配列Ｓ３およびＳ４を有する第２のヌクレオチドプローブ を包装された組合せ中に含み、 前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも 一方を含んでいる配列は、（ｉ）それらは非隣接であり、かつ延長されたオリゴ ヌクレオチドプライマーもしくはそれに対する相補配列上の隣接もしくは非隣接 部位へハイブリダイズできるか、または（ii）延長されたオリゴヌクレオチドプ ライマーもしくはそれに対する相補配列上のそれらがハイブリダイズする部位か 非隣接であるように連結されており、そして前記プローブは、（ｉ）それらは前 記増幅の間前記延長されたオリゴヌクレオチドプライマーへ実質上ハイブリダイ ズせず、（ii）前記増幅の後、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプロー ブは前記延長されたオリゴヌクレオチドプライマーもしくはそれに対する相補配 列へハイブリダイズでき、そして（iii）前記プローブの一方または両方は前記 延長されたオリゴヌクレオチドプローブもしくはそれに対する相補配列へハイブ リダイズした前記プローブの検出を容易化する標識を含んでいるという特徴を有 している、前記キット。 ４８． 前記Ｓ１の３’末端は前記Ｓ２の５’末端へヌクレオチド連結基によ って連結されている請求項４７のキット。 ４９． 前記プローブの一方は粒子へ会合している請求項４７のキット。 ５０． 前記標識は認識配列である請求項４７のキット。 ５１． 前記ヌクレオチド連結基の少なくとも一部分は認識配列である請求項 ４８のキット。 ５２． 前記Ｓ１の３’末端は前記Ｓ２の５’末端へヌクレオチド連結基によ って連結されており、前記Ｓ３の３’末端は前記Ｓ４の５’末端へヌクレオチド 連結基によって連結されている請求項４７のキット。 ５３． 前記連結基は認識配列を含んでいる請求項５２のキット。 ５４． 前記認識配列に対し相補的なヌクレオチドＮ１およびＮ２を含み、前 記Ｎ１およびＮ２は各自レポーター分子で標識されている請求項５３のキット。 ５５． 前記Ｎ１は会合した光増感剤を有する粒子へ会合し、前記Ｎ１は会合 した化学発光化合物を有する粒子へ会合している請求項５４のキット。 ５６． 第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいる請求項４７のキッ ト。 ５７． 前記粒子は前記プローブへ結合しているか、または結合することがで きる請求項４９のキット。 ５８． 包装された組合せにおいて、標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施 するための試薬と、前記標的ポリヌクレオチド配列の増幅産物へ結合することが できる二つの標識したオリゴヌクレオチドプローブとを含み、前記プローブの少 なくとも一方は非隣接であり、かつ前記増幅産物の１本鎖上の隣接もしくは非隣 接部位へ結合することができる二つの配列を有する、標的ポリヌクレオチド配列 の検出のためのキット。 ５９． （ａ）組合せにおいて、標的ポリヌクレオチド配列を有する標的ポリ ヌクレオチドを含有している疑いのあるサンプルと、前記標的ポリヌクレオチド 配列を増幅してそのコピーを生産するための試薬と、第１のオリゴヌクレオチド プローブと第２のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プローブは、（ｉ ）前記増幅の間前記コピーへ実質上ハイブリダイズせず、（ii）前記増幅を妨害 せず、そして（iii）前記増幅の後、前記プローブの両方は前記コピーのストラ ンドの一つへハイブリダイズすることができ、そして前記プローブの少なくとも 一方は粒子へ会合している前記プローブを用意し、そして （ｂ）前記組合せを、前記コピーを生産するように前記標的ポリヌクレオチド 配列を増幅するための条件へ服させ、 （ｃ）その後前記組合せを、前記プローブの両方が前記ストランドの一つへハ イブリダイズしそして前記粒子の凝集を生ずる条件へ服させ、 （ｄ）前記凝集の存在は前記標的ポリヌクレオチド配列の存在を指示する、前 記凝集を検出する、 ことを含む標的ポリヌクレオチド配列を増幅しそして検出するための方法。 ６０． （ａ）標的ポリヌクレオチド配列を、前記標的ヌクレオチド配列の同 じストランドへ結合して３分子複合体を形成することができる二つのプローブで あって、前記プローブの少なくとも一方は非隣接でありそして前記標的ポリヌク レオチド配列の１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合することができる二つ の配列を有する二つのプローブと組合せること、および （ｂ）前記３分子複合体を検出すること を含む標的ヌクレオチド配列を検出する方法。 ６１． （ａ）標的ポリヌクレオチド配列を含有している疑いのあるサンプル を、前記標的ポリヌクレオチド配列の同じストランドへ結合することができる二 つのプローブであって、前記プローブの各自は粒子へ結合しているかまたは結合 することができる前記二つ のプローブと組合せるステップ、および （ｂ）前記粒子の会合を検出することによって前記ポリヌクレオチド配列を検 出するステップを含み、前記プローブの少なくとも一方は非隣接であってそして 前記標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合する ことができる二つの配列を有するプローブである、標的ポリヌクレオチド配列を 検出する方法。 ６３． 標的ポリヌクレオチド配列を検出するための試薬であって、前記標的 ポリヌクレオチド配列の１本鎖へ結合することができる二つのオリゴヌクレオチ ドプローブよりなり、前記プローブの一方は、非隣接でありそして前記標的ポリ ヌクレオチド配列の１本鎖上の隣接もしくは非隣接部位へ結合できるか、または （ii）前記標的ポリヌクレオチド配列の１本鎖上の非隣接部位へ結合できる二つ の配列を有している、前記試薬。