DE10123183A1 - Modifizierte Amplifikationsprimer und ihre Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gestaltung modifizierter Amplifikationsprimer und auf Verwendungen von modifizierten Amplifikationsprimern bei der Strangverdrängungsamplifikation (SDA; strand displacement amplification), thermofilen Strangverdrängungsamplifikation (tSDA) oder Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA, und gegebenenfalls unter Verwendung einer mikroelektronischen Matrix.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gestaltung modifizierter Amplifika­ tionsprimer und auf Verwendungen von modifizierten Amplifikationsprimern bei der Strangverdrängungsamplifikation (SDA; strand displacement amplification), thermophilen Strangverdrängungsamplifikation (tSDA) oder Echtzeit-Fluores­ zenz-tSDA, und gegebenenfalls unter Verwendung einer mikroelektronischen Matrix.

Die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ist ein isothermes in-vitro- Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, das auf der Fähigkeit eines Restriktions­ enzyms beruht, an ihrer Erkennungssequenz einen Einzelstrangbruch in den unmodifizierten Strang eines hemiphosphorthioatierten Nucleinsäureduplexes einzufügen. Eine DNA-Polymerase wird verwendet, um vom 3'-Ende des Einzel­ strangbruchs her zu verlängern und den stromabwärts gelegenen DNA-Strang von der Matrize zu verdrängen. Das verdrängte Produkt wird in den anschließen­ den SDA-Runden als Matrize verwendet. Für SDA sind vier Primer erforderlich. Zwei Primer binden an jeden DNA-Strang. Primer 1 (Amplifikationsprimer, AP) trägt eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym (z. B. BsoBI von Bacillus stearothermophilus), auf die unmittelbar eine targetspezifische Sequenz mit einer Länge von 15-20 Nucleotiden folgt. In der 5'-Richtung von der Erken­ nungsstelle für das Restriktionsenzym befindet sich eine kurze Sequenz (18-24 Nucleotide), die als flankierende Sequenz für die Erkennungsstelle des Restrikti­ onsenzyms verwendet wird. Primer 2 (Bumperprimer, BP) hybridisiert an das Target stromaufwärts des AP. Eine Verlängerung ab dem BP bewirkt eine Ver­ drängung des AP-Verlängerungsprodukts vom Target. Viele aufeinanderfolgende SDA-Runden führen zu einer exponentiellen targetspezifischen Amplifikation.

Bei AP-Gestaltungen des Standes der Technik wurde eine nichttargetspezifische Sequenz 5' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms als 5'-flankierende Sequenz verwendet, und eine targetspezifische Sequenz wurde 3' von der Er­ kennungsstelle des Restriktionsenzyms verwendet. In den anfänglichen SDA- Runden wird die Primer-Target-Hybridisierung durch den targetspezifischen Teil des AP angetrieben. Da SDA bei einer mäßig hohen Temperatur (50-60°C) durchgeführt wird, ist für eine stabile targetspezifische Hybridisierung und eine effiziente Amplifikation eine angemessen lange targetspezifische Sequenz erfor­ derlich. Längere targetspezifische Sequenzen 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms führen jedoch zu einem höheren Potential für Primerwech­ selwirkungen und zur Erzeugung von Primer-Dimer-(PD)-Amplifikationsproduk­ ten. Die PD-Amplifikation ist einer der Hauptgründe für die unspezifische Ampli­ fikation bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (J. Brownie et al., 1997, Nuc­ leic Acids Res. 25: 3235-3241). Die Situation kann bei SDA schlechter sein, da (1) bei der SDA gewöhnlich höhere Primerkonzentrationen verwendet werden als bei der PCR, wodurch das Potential für Primerwechselwirkungen und PD- Amplifikation erhöht wird, (2) sobald ein PD zwischen AP-Sequenzen 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms gebildet wurde, das Produkt von der PD exponentiell amplifiziert wird, da es an beiden Enden eine zum Einzelstrang­ bruch befähigte Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms enthält, und (3) PD- Amplifikationen vorzugsweise amplifiziert werden können, da die PD- Amplifikationsprodukte kürzer sind als die targetspezifischen Amplifikationspro­ dukte.

Diese Probleme werden bei Multiplex-Nucleinsäureamplifikationen noch schlim­ mer, da mehr Amplifikationsprimer in einer einzigen Amplifikationsreaktion vor­ handen sind. Wie bereits beschrieben, gibt es bei der SDA ein höheres Potential für eine Konkurrenz zwischen unspezifischen Amplifikationen und targetspezifi­ schen Amplifikationen als bei der PCR. Aus diesen Gründen gibt es keine Veröf­ fentlichung, die eine Coamplifikation mehrerer DNA-Targets mit Multiplex- Primersätzen beschreibt. Walker et al. (1994, Nucleic Acids Research 22: 2670-­ 2677; US-Patent Nr. 5,422,252) beschrieben SDA-Primer, die zum Amplifizieren von Multiplex-DNA-Targets gestaltet sind, indem man nach der Addition gemein­ samer primerwirksamer Sequenzen an die 5'-Enden jeder Primersequenz ein einziges Primerpaar verwendet, um Primerwechselwirkungen und PD- Amplifikationen zu minimieren.

Die optimale DNA für Nucleinsäurehybridisierung und -sequenzierung ist ein­ zelsträngige DNA (ssDNA). Zur Zeit werden vier Verfahren verwendet, um ssDNA zu erhalten: (1) Denaturierung doppelsträngiger DNA (dsDNA); (2) asymmetri­ sche Polymerase-Kettenreaktion (PCR); (3) Exonuclease-Verdau des phosphory­ lierten Strangs von dsDNA; und (4) die Affinitätsbindung von einem der DNA- Stränge an eine unlösliche Matrix (U. B. Gyllensten und H. A. Erlich, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7652-7656; L. G. Mitchell und C. R. Merril, 1989, Anal. Biochem. 17: 239-242; H. Rehbein et al., 1998, Electrophoresis 8-9: 1381-1384; J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Bei der asymmetrischen PCR ist einer der Primer nur in einer begrenzten Menge vorhanden und wird während der anfänglichen PCR-Cyclen vollständig aufgebraucht. In den anschlie­ ßenden Cyclen ist nur noch der häufige Primer vorhanden, was dazu führt, dass ein Überschuss von einem Strang erzeugt wird. Die Verwendung des Prinzips der asymmetrischen PCR zur Erzeugung von ssDNA bei der SDA wurde ohne Erfolg versucht.

Obwohl SDA wichtige Verwendungen gefunden hat, gibt es Probleme, die mit der oben beschriebenen ursprünglichen Primergestaltung verbunden sind. Um es noch einmal zusammenzufassen: Ein Problem besteht darin, dass die Amplifika­ tion nicht sehr effizient ist. Die geringere Effizienz von SDA mit der ursprüngli­ chen Primergestaltung resultiert in erster Linie aus einer geringeren Hybridisie­ rungseffizienz, da die SDA bei einer relativ hohen Temperatur mit Primern durchgeführt wird, bei denen nur die 3'-Enden targetspezifische Sequenzen sind. Ein zweites Problem ist die Bildung von PD-Produkt und die Amplifikation dieses PD-Produkts. Diese tritt auf, weil die letzten Nucleotide des 3-Endes des einen Amplifikationsprimers, die eine Homologie zu irgendeiner Sequenz am 3'-Ende eines anderen Amplifikationsprimers (oder von sich selbst) und nicht nur zu den letzten Nucleotiden dieses Primers aufweisen, ein Primer-Dimer-Produkt bilden können, und dieses Produkt kann exponentiell amplifiziert werden. Diese Primer- Dimer-Bildung bei der SDA steht im Gegensatz zu der bei der PCR, welche für eine Primer-Dimer-Amplifikation eine Primerhomologie zwischen den letzten Nucleotiden an den 3'-Enden beider Primer erfordert.

Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die SDA zu verbessern, die Multiplexamplifikation zu verbessern und die Erzeugung von einzelsträngiger DNA mittels SDA durch Veränderungen in der Gestaltung der SDA-Primer zu ermöglichen. Die Empfindlichkeit, Spezifität und Ausbeute der Targetamplifikati­ on wurden dank der neuen Primergestaltung der vorliegenden Erfindung erhöht, bei der am 5'-Ende der Primer eine targetspezifische Sequenz verwendet wird. Neben einer Verbesserung der SDA ist die neue Primergestaltung auch für die SDA-Multiplexanalyse und für die SDA-Erzeugung von einzelsträngiger DNA geeignet.

Die Primergestaltung der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Verbesserungen gegenüber der Standard-SDA-Primergestaltung. In beiden Formaten enthalten die SDA-Primer targetspezifische und nichttargetspezifische Sequenzen (siehe Fig. 1A und 1B). Bei der Standardgestaltung befinden sich die targetspezifi­ schen Sequenzen 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms. Es wurde gezeigt, dass Primer-Primer-Wechselwirkungen zwischen den 3'-Enden verschie­ dener Primer zur Erzeugung von unspezifischen Amplifikationsprodukten führen können. Um solche Wechselwirkungen bei der Standardgestaltung zu minimie­ ren, ist es vorteilhaft, die targetspezifischen Bereiche von Primern so kurz wie möglich zu gestalten, während man die geeigneten T_m-Merkmale in Bezug auf die Hybridisierung an eine Targetsequenz beibehält. Da die SDA bei einer erhöh­ ten Temperatur (50-65°C) durchgeführt wird, ist es entscheidend, die tar­ getspezifischen Bereiche so zu gestalten, dass sie eine ausreichende Länge be­ sitzen, um eine effiziente Hybridisierung mit dem Target zu ermöglichen. Die Primergestaltung der vorliegenden Erfindung überwindet diese Beschränkungen durch die Verwendung von langen targetspezifischen Sequenzen, die sich 5' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms befinden. Die erhöhte Länge der targetspezifischen Sequenz erlaubt eine effiziente Hybridisierung mit dem Target bei erhöhten Temperaturen, ohne zur Bildung unspezifischer Produkte beizutra­ gen. Bei der neuen Gestaltung werden kurze Sequenzen 3' von der Erkennungs­ stelle des Restriktionsenzyms verwendet, was die Bildung unspezifischer Produk­ te minimiert.

Die folgenden Ausdrücke sind hier wie folgt definiert:
Ein Amplifikationsprimer ist ein Primer für die Amplifikation einer Targetsequenz durch Verlängerung des Primers nach der Hybridisierung mit der Targetsequenz. Amplifikationsprimer können eine Länge zwischen etwa 10-75 Nucleotiden, vor­ zugsweise etwa 15-50 Nucleotiden, haben. Die Gesamtlänge eines Amplifikati­ onsprimers für die SDA beträgt typischerweise etwa 25-50 Nucleotide. Her­ kömmlicherweise hybridisiert das 3'-Ende eines SDA-Amplifikationsprimers (die targetbindende Sequenz) spezifisch mit der Targetsequenz. Die targetbindende Sequenz hat eine Länge von etwa 10-25 Nucleotiden und verleiht dem Amplifika­ tionsprimer Hybridisierungsspezifität. Der SDA-Amplifikationsprimer umfasst weiterhin eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease 5' von der targetbindenden Sequenz. Die Erkennungsstelle gehört zu einer Restriktionsen­ donuclease, die einen Einzelstrangbruch in dem einen Strang eines DNA-Duplex erzeugt, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert ist, wie es von G. Walker et al. beschrieben ist (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396, und 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696). Die Nucleotide 5' von der Erkennungsstelle der Restriktionsendonuclease (der Schwanz) fungieren als Polymerase-Reprimer­ stelle, wenn der Rest des Amplifikationsprimers während der SDA gespalten und verdrängt wird. Die Reprimerfunktion der Schwanznucleotide hält die SDA- Reaktion aufrecht und erlaubt die Synthese mehrerer Amplikons aus einem ein­ zigen Targetmolekül. Der Schwanz hat typischerweise eine Länge von etwa 10-25 Nucleotiden. Seine Länge und Sequenz sind im allgemeinen nicht entschei­ dend und können routinemäßig ausgewählt und modifiziert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde der Amplifikationsprimer jedoch so modifiziert, dass der Schwanz ebenfalls eine targetbindende Sequenz enthält. Da die target­ bindende Sequenz 3' der Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease ein Teil des Primers ist, der seine Targetspezifität bestimmt, besteht der Amplifikati­ onsprimer bei Amplifikationsverfahren, die keine speziellen Sequenzen an den Enden des Targets erfordern, im allgemeinen im wesentlichen nur aus dieser 3'- targetbindenden Sequenz. Zum Beispiel werden bei der Amplifikation einer Tar­ getsequenz gemäß der Erfindung unter Verwendung der Polymerase-Ketten­ reaktion (PCR) Amplifikationsprimer eingesetzt, die aus den 3'-targetbindenden Sequenzen der hier beschriebenen Amplifikationsprimer bestehen. Bei Amplifika­ tionsverfahren, die außer der spaltbaren Erkennungsstelle der Restriktionsendo­ nuclease und dem SDA-Schwanz noch andere spezielle Sequenzen erfordern, die an das Target angehängt sind (z. B. einen RNA-Polymerase-Promotor für die self­ sustained sequence replication (3SR), die nucleic acid sequence-based amplifica­ tion (NASBA) oder das transcription-based amplification system (TAS)), kann die erforderliche spezielle Sequenz unter Verwendung von Routineverfahren für die Herstellung von Oligonucleotiden mit der targetbindenden Sequenz verknüpft werden, ohne die Hybridisierungsspezifität des Primers zu verändern.

Ein Bumperprimer oder externer Primer ist ein Primer, der bei isothermen Ampli­ fikationsreaktionen verwendet wird, um Primerverlängerungsprodukte zu ver­ drängen. Der Bumperprimer assoziiert mit einer Targetsequenz stromaufwärts des Amplifikationsprimers, so dass bei der Verlängerung des Bumperprimers der stromabwärts gelegene Amplifikationsprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt werden.

Die Ausdrücke "Target" oder "Targetsequenz" beziehen sich auf Nucleinsäurese­ quenzen, die amplifiziert werden sollen. Dazu gehören die ursprüngliche zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz, der komplementäre zweite Strang der ursprünglichen zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz sowie beide Stränge einer Kopie der ursprünglichen Sequenz, die durch die Amplifikationsreaktion erzeugt wird. Diese Kopien dienen als amplifizierbare Targets aufgrund der Tat­ sache, dass sie Kopien der Sequenz enthalten, mit der die Amplifikationsprimer hybridisieren.

Kopien der Targetsequenz, die während der Amplifikationsreaktion erzeugt wer­ den, werden als Amplifikationsprodukte, Amplimere oder Amplikons bezeichnet.

Der Ausdruck "Verlängerungsprodukt" bezieht sich auf die Kopie einer Targetse­ quenz, die durch Hybridisierung eines Primers und Verlängerung des Primers durch Polymerase unter Verwendung der Targetsequenz als Matrize erzeugt wird.

Der Ausdruck "artspezifisch" bezieht sich auf den Nachweis, die Amplifikation oder Oligonucleotid-Hybridisierung einer Organismenart oder einer Gruppe ver­ wandter Arten, ohne dass ein wesentlicher Nachweis, eine wesentliche Amplifika­ tion oder Oligonucleotid-Hybridisierung anderer Arten derselben Gattung oder von Arten einer anderen Gattung erfolgt.

Der Ausdruck "Assaysonde" bezieht sich auf jedes Oligonucleotid, das verwendet wird, um den Nachweis oder die Identifikation einer Nucleinsäure zu erleichtern. Detektorsonden, Detektorprimer, Abfangsonden, Signalprimer und Reporterson­ den, wie sie unten beschrieben sind, sind Beispiele für Assaysonden.

Der Ausdruck "Amplikon" bezieht sich auf das Produkt der Amplifikationsreakti­ on, das durch die Verlängerung von einem der beiden oder beiden Partnern eines Paars von Amplifikationsprimern erzeugt wird. Ein Amplikon kann expo­ nentiell amplifizierte Nucleinsäuren enthalten, wenn beide verwendeten Primer mit einer Targetsequenz hybridisieren. Alternativ dazu können Amplikons auch durch lineare Amplifikation erzeugt werden, wenn einer der verwendeten Primer nicht mit einer Targetsequenz hybridisiert. Dieser Ausdruck wird hier also gene­ risch verwendet und impliziert nicht die Anwesenheit von exponentiell amplifi­ zierten Nucleinsäuren.

Eine mikroelektronische Matrix (oder elektronische Mikromatrix) ist eine Vorrich­ tung mit einer regelmäßigen Anordnung von elektronisch selbstadressierbaren mikroskopischen Plätzen. Jeder mikroskopische Platz enthält eine darunterlie­ gende arbeitende Gleichstrommikroelektrode auf einem Substrat. Die Oberfläche jedes Mikroplatzes weist eine Permeationsschicht für den freien Transport kleiner Gegenionen sowie eine Befestigungsschicht für die kovalente Kupplung spezifi­ scher bindender Entitäten auf.

Eine Matrix ist eine Anordnung von Plätzen auf der Vorrichtung. Die Plätze kön­ nen in zweidimensionalen Matrizen, dreidimensionalen Matrizen oder anderen Matrixformaten angeordnet sein. Die Zahl der Plätze kann in einem Bereich von mehreren bis zu wenigstens Hunderttausenden liegen.

Die elektronische Adressierung (oder das Targeting) ist die Platzierung geladener Moleküle auf spezifischen Teststellen. Da DNA eine starke negative Ladung hat, kann sie elektronisch zu einem Bereich mit positiver Ladung bewegt werden. Eine Teststelle oder eine Reihe von Teststellen auf dem Mikrochip wird mit einer positiven Ladung elektronisch aktiviert. Eine Lösung von DNA-Sonden wird auf den Mikrochip aufgebracht. Die negativ geladenen Sonden bewegen sich schnell zu den positiv geladenen Stellen, wo sie sich konzentrieren und chemisch an diese Stelle gebunden werden. Dann wird der Mikrochip gewaschen, und eine weitere Lösung von bestimmten DNA-Sonden kann hinzugefügt werden. Stelle für Stelle und Reihe für Reihe kann eine Matrix spezifisch gebundener DNA- Sonden auf dem Mikrochip zusammengesetzt oder adressiert werden. Aufgrund der Fähigkeit, Abfangsonden elektronisch zu spezifischen Stellen zu adressieren, ermöglicht das System die Herstellung von speziell angepassten Matrizen durch die Platzierung von spezifischen Abfangsonden auf einem Mikrochip. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "elektronisch adressierbar" auf die Fähigkeit eines Mikrochip, Stoffe wie Nucleinsäuren und Enzyme und andere Amplifikationskomponenten durch elektronische Vorspannung der Abfangstellen des Chips auf dem Mikrochip von einer Position zu einer anderen zu lenken. "Elektronische Vorspannung" soll bedeuten, dass die elektronische Ladung an einer Abfangstelle oder einer anderen Position auf dem Mikrochip zwischen einer positiven und einer negativen Nettoladung manipuliert werden kann, so dass Moleküle in Lösung und in Kontakt mit dem Mikrochip zu einer Position auf dem Mikrochip hin oder von dieser weg oder von einer Position zu einer anderen ge­ lenkt werden können.

Bei der elektronischen Konzentration und Hybridisierung wird Elektronik verwen­ det, um Targetmoleküle zu einer oder mehreren Teststellen (oder Abfangstellen) auf dem Mikrochip zu bewegen und dort zu konzentrieren. Die elektronische Konzentration von Proben-DNA an jeder Teststelle fördert die schnelle Hybridi­ sierung von Proben-DNA mit komplementären Abfangsonden. Im Gegensatz zum passiven Hybridisierungsvorgang hat der elektronische Konzentrierungsvorgang den deutlichen Vorteil, die Hybridisierungsgeschwindigkeit erheblich zu be­ schleunigen. Um ungebundene oder unspezifisch gebundene DNA von jeder Stelle zu entfernen, wird die Polarität oder Ladung der Stelle zu negativ umge­ kehrt, wodurch ungebundene oder unspezifisch gebundene DNA von den Ab­ fangsonden weg zurück in die Lösung gedrängt wird. Da die Testmoleküle au­ ßerdem über der Teststelle elektronisch konzentriert sind, ist eine niedrigere Konzentration an Ziel-DNA-Molekülen erforderlich, was die ansonsten für die Probenvorbereitung vor dem Test erforderliche Zeit und Arbeit reduziert. Der Ausdruck "Abfangstelle" bezieht sich auf eine spezifische Position auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip, in der die elektronische Vorspannung eingeleitet wird und wo Moleküle, wie Nucleinsäuresonden und Targetmoleküle, durch diese Vorspannung angezogen oder adressiert werden.

Elektronische Stringenzkontrolle ist die Umkehrung des elektrischen Potentials, um ungebundene und unspezifisch gebundene DNA als Teil des Hybridisierungs­ verfahrens schnell und leicht zu entfernen. Elektronische Stringenz liefert eine Qualitätskontrolle für den Hybridisierungsvorgang und gewährleistet, dass alle gebundenen Paare von DNA wirklich komplementär sind. Die Präzision, Kontrolle und Genauigkeit der Plattformtechnologie erlaubt über die Verwendung der kon­ trollierten Abgabe von Strom beim elektronischen Stringenzvorgang den Nach­ weis von einzelnen Punktmutationen, einzelnen Basenfehlpaarungen oder ande­ ren genetischen Mutationen, die bei mehreren diagnostischen und Forschungs­ anwendungen erhebliche Folgen haben können. Elektronische Stringenz wird ohne die aufwendige Verarbeitung und Handhabung erreicht, die sonst erforder­ lich ist, um dieselben Ergebnisse mit herkömmlichen Verfahren zu erzielen. Im Gegensatz zu passiven Matrizen ist diese Technologie sowohl für kurze als auch für lange einzelsträngige DNA-Fragmente geeignet. Die Verwendung längerer Sonden erhöht die Gewissheit, dass die DNA, die mit der Abfangsonde hybridi­ siert, das richtige Target ist. Elektronische Stringenzkontrolle reduziert die erfor­ derliche Anzahl von Sonden und damit von Teststellen auf dem Mikrochip im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Matrizen. Dagegen sind herkömmliche passive Hybridisierungsverfahren schwierig zu steuern und erfordern mehr Replikanten jeder möglichen Basenpaarung, so dass korrekte Paarungen positiv identifiziert werden können.

Elektronisches Multiplexen ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Tests von einer einzigen Probe. Elektronisches Multiplexen wird durch die Fähigkeit erleichtert, einzelne Teststellen unabhängig voneinander anzusteuern (zum Ad­ ressieren von Abfangsonden oder Abfangmolekülen und für die Konzentration von Testprobemolekülen), was die gleichzeitige Verwendung biochemisch nicht miteinander verwandter Moleküle auf demselben Mikrochip erlaubt. Stellen auf einer herkömmlichen DNA-Matrix können nicht einzeln angesteuert werden, und daher müssen dieselben Verfahrensschritte mit der gesamten Matrix durchge­ führt werden. Die Verwendung von Elektronik bei dieser Technologie liefert eine erhöhte Vielseitigkeit und Flexibilität gegenüber solchen herkömmlichen Metho­ den.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gestaltung modifizierter Amplifika­ tionsprimer und auf Verwendungen von modifizierten Amplifikationsprimern bei der Strangverdrängungsamplifikation (SDA), thermophilen Strangverdrängungs­ amplifikation (tSDA) oder Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA, und gegebenenfalls unter Verwendung einer mikroelektronischen Matrix.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die SDA-Amplifika­ tionsprimer so gestaltet, dass sie targetspezifische Sequenzen sowohl 5' als auch 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms enthalten. Die Verwendung von targetspezifischen Sequenzen 5' und 3' von der Erkennungsstelle des Re­ striktionsenzyms erhöht die Effizienz der targetspezifischen Hybridisierung. Diese Gestaltung ermöglicht eine Längenreduktion des 3'-targetspezifischen Teils des AP, was die Wahrscheinlichkeit von Primerwechselwirkungen senkt. Mit Primern, die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet sind, nimmt die Spezifität, Emp­ findlichkeit und Ausbeute der SDA zu, und PD-Amplifikationen nehmen ab im Vergleich zu SDA unter Verwendung der Standard-Primergestaltung. Nach 10 min SDA-Reaktion bei 60°C wurden targetspezifische Amplifikationsprodukte von 10 Kopien Target-DNA nachgewiesen. Die maximale Amplifikation von 10 Kopien Matrize wurde nach 30 min SDA erreicht.

In einer zweiten Ausführungsform sind unter Verwendung von Amplifikati­ onsprimern, die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet sind, Multiplex- SDA-Amplifikationen möglich. Multiplex-Amplifikation ist eine Strategie, um zwei oder mehr Targetsequenzen gleichzeitig zu amplifizieren. Jede Amplifikations­ reaktion ist spezifisch, aber in einer einzigen Reaktionsmischung wird mehr als ein Target amplifiziert. Unter Verwendung der gemäß der vorliegenden Erfindung gestalteten Primer und durch Anpassen der Primerkonzentrationen für jede Mat­ rize wurden nur 10 Kopien jeder Matrize coamplifiziert und nachgewiesen. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform werden amplifizierte Produk­ te unter Verwendung einer mikroelektronischen Matrix nachgewiesen. Das ge­ samte Verfahren von der Amplifikation bis zum Nachweis dauerte ungefähr 2 h. Die Kombination von Geschwindigkeit, Einfachheit und Empfindlichkeit der SDA- Amplifikation und des Nachweises auf einer mikroelektronischen Matrix liefern ein Verfahren zum Nachweis klinischer bakterieller Erreger und anderer Krank­ heiten.

In einer dritten Ausführungsform können gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltete Primer verwendet werden, um durch SDA einzelsträngige DNA zu erzeugen. Insbesondere wurde gefunden, dass in einer SDA bei Verwendung von Amplifikationsprimern, die nur drei Basenpaare (bp) targetspezifische Sequenz auf der 3'-Seite der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms aufweisen, kein targetspezifisches Produkt erzeugt werden konnte. Die Verwendung gleicher Stoffmengen eines gemäß der vorliegenden Erfindung gestalteten Amplifikati­ onsprimers und eines gemäß der vorliegenden Erfindung gestalteten Primers, der auf der 3'-Seite der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms nur 3 bp auf­ weist (blockierender Primer genannt), zur Bindung an den einen DNA-Strang sowie eines regulären Amplifikationsprimers zur Bindung an den anderen DNA- Strang bei der SDA-Amplifikation erzeugt ssDNA. Der blockierende Primer wurde verwendet, um mit dem regulären Amplifikationsprimer um das Target zu kon­ kurrieren, so dass die beiden Stränge Target-DNA ungleich stark amplifiziert werden. Dieses Verfahren liefert einzelsträngige DNA, die für die Hybridisierung und Sequenzierung von Nucleinsäuren verwendet werden kann.

In einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Amplifika­ tionsprimer zur Verwendung mit anderen Amplifikationsverfahren so gestaltet, dass sie targetspezifische Sequenzen 5' und 3' von einer nichttargetspezifischen Sequenz enthalten.

In einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Amplifika­ tionsprimer zur Diskriminierung zweier nahe verwandter Sequenzen so gestaltet, dass er in der 3'-targetspezifischen Sequenz eine bis mehrere Fehlpaarungen enthält (in Bezug auf das Target).

SEQ ID NO: 1-4 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als Primer (1-2) und Bumper (3-4) für die Amplifikation des yst-Gens von Yersinia enterocolitica ver­ wendet werden und die gemäß der herkömmlichen SDA-Primergestaltung gestal­ tet wurden. SEQ ID NO: 5-10 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als Pri­ mer für die Amplifikation des yst-Gens verwendet werden und die gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gestaltet wurden. SEQ ID NO: 11 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Abfangsonde für das yst-Gen verwen­ det wird. SEQ ID NO: 12 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Reporter­ sonde für das yst-Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 13 ist die Sequenz eines Oligonucleotids des femA-Gens von Staphylococcus aureus, die als unspezifische Abfangsonde verwendet wird. SEQ ID NO: 14 und 15 sind Sequenzen von Oligo­ nucleotiden, die als Primer für die Amplifikation des yst-Gens verwendet werden und die gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ges­ taltet wurden. SEQ ID NO: 16-19 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als Primer (16-17) und Bumper (18-19) für die Amplifikation des Gens für das shi­ gaartige Toxin I (SLTI) von Escherichia coli verwendet werden und die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet wurden. SEQ ID NO: 20 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Abfangsonde für das SLTI-Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 21 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Reportersonde für das SLTI-Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 22-25 sind Sequenzen von Oligonuc­ leotiden, die als Primer (22-23) und Bumper (24-25) für die Amplifikation des invA-Gens von Salmonella enterica verwendet werden und die gemäß der vorlie­ genden Erfindung gestaltet wurden. SEQ ID NO: 26 ist die Sequenz eines Oligo­ nucleotids, das als Abfangsonde für das invA-Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 27 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Reportersonde für das invA- Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 28 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Primer gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird. SEQ ID NO: 29 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Abfangsonde für das yst-Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 30 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als Reportersonde für das yst-Gen verwendet wird. SEQ ID NO: 31-34 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als Primer für die Amplifikation des sodB-Gens von Campylobacter verwendet werden und die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet wurden. SEQ ID NO: 35-38 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als Primer für die Amplifikation des SLTII- Gens von E. coli verwendet werden und die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet wurden. SEQ ID NO: 39-42 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als Primer für die Amplifikation des ipaH-Gens von Shigella verwendet werden und die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet wurden.

Die Fig. 1A und 1B zeigen einen Vergleich der Standard-Amplifikations­ primer-(AP)-Gestaltung (Fig. 1A) mit der neuen AP-Gestaltung (Fig. 1B). Die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BsoBI ist mit einem schattierten Halbkreis markiert. In beiden Gestaltungen wird eine targetspezifische Sequenz am 3'-Ende der BsoBI-Erkennungsstelle verwendet. Eine nichttargetspezifische Sequenz (Standard-AP-Gestaltung, Fig. 1A) oder eine targetspezifische Se­ quenz (die neue AP-Gestaltung, Fig. 1B) wird am 5'-Ende der BsoBI-Er­ kennungsstelle verwendet.

Fig. 2 zeigt den Einfluss der neu gestalteten BP und AP auf die SDA. Genomische DNA von Yersinia enterocolitica wurde als Matrize verwendet. 1*: ystAP1₅, ystAP1_A, ystBP1₅ und ystBP2_A wurden als Primersatz verwendet. 2*: ystAP1₅, ystAP2_A, ystBP1_S und ystBP2_A wurden als Primersatz verwendet. 3*: ystAP1_S, ystAP1_A, ystBP1₅ und ystBP1_A wurden als Primersatz verwendet. ystAP1₅, ystAP1_A, ystBP1₅ und ystBP1_A wurden gemäß dem ursprünglichen SDA-Verfahren gestaltet. ystAP2_A und ystBP2_A wurden nach dem hier beschriebenen Verfahren gestaltet. NT: negative Kontrolle ohne Matrize. M: Molekulargewichtsmarker. Die targetspezi­ fischen Produkte hatten 111 bp (ohne Einzelstrangbruch) und 87 bp (mit Einzel­ strangbruch).

Fig. 3 vergleicht SDA-Ergebnisse vom Primersatz mit der ursprünglichen Gestal­ tung mit den Ergebnissen von den Primersätzen mit der neuen Gestaltung der vorliegenden Erfindung. Genomische DNA von Y. enterocolitica wurde als Matrize verwendet. 1*: Der ursprüngliche Primersatz (ystAP1_S, ystAP1_A, ystBP1_S und ystBP1_A) wurde für die SDA verwendet. 2*: Ein neu gestalteter Primersatz gemäß der vorliegenden Erfindung (ystAP2_S, ystAP2_A, ystBP2_S und ystBP2_A) wurde für die SDA verwendet. 3*: Ein neu gestalteter Primersatz gemäß der vorliegenden Erfin­ dung (ystAP3_S, ystAP3_A, ystBP2_S und ystBP2_A) wurde für die SDA verwendet. NT: negative Kontrolle ohne Matrize. M: Molekulargewichtsmarker.

Die Fig. 4A-4B zeigen den zeitlichen Verlauf der SDA-Reaktion. Die SDA wurde bei 60°C während verschiedener Zeitspannen, die angegeben sind, durchgeführt. Genomische DNA von Y. enterocolitica wurde als Matrize verwendet, und die neu gestalteten Primer gemäß der vorliegenden Erfindung (ystAP3_S, ystAP3_A, ystBP2_S und ystBP2_A) wurden als Primersatz verwendet. Fig. 4A: Von jedem Zeitpunkt wurden 5 µl Probe verwendet, um eine Elektrophorese auf einem nichtdenaturie­ renden Gel durchzuführen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidi­ umbromid angefärbt. Fig. 4B: Ein Chipassay wurde verwendet, um die Spezifität von SDA-Produkten nachzuweisen. NT¹: Negative Kontrolle ohne Matrize und ohne Fremd-DNA. NT²: Negative Kontrolle ohne Matrize und mit 0,5 µg genomischer DNA aus Kalbsthymus. M: Molekulargewichtsmarker.

Die Fig. 5A-5B zeigen SDA-Ergebnisse von einer Primergestaltung gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei der Primer 3' von der BsoBI-Erkennungsstelle 6 Nucleotide mit nichttargetspezifischer Sequenz und 6 Nucleotide mit targetspezifischer Sequenz umfasst. Fig. 5A: Gelelektrophorese- Ergebnisse für yst. Fig. 5B: Chipnachweisergebnisse für yst.

Die Fig. 6A-6D zeigen den Nachweis von SDA-Produkten aus der Amplifikation einer einzelnen Matrize in Triplex-Primersätzen. Alle drei Primersätze (SLTI + invA + yst) waren in den Standardkonzentrationen vorhanden (AP/BP 500 nM/50 nM). Für SLTI wurde genomische E.-coli-Matrize verwendet, für invA wurde S. enterica, und für yst wurde Y. enterocolitica verwendet. Fig. 6A: Gelelektrophorese- Ergebnisse für SLTI. Die Pfeile geben die erwarteten Banden für das amplifizierte Produkt an (mit und ohne Einzelstrangbruch), M ist ein Molekulargewichtsmarker. Fig. 6B: Chipnachweisergebnisse für SLTI. Fig. 6C: Chipnachweisergebnisse für yst. Fig. 6D: Chipnachweisergebnisse für invA. Die Zahlen über den Signalbalken sind das Verhältnis von spezifischen zu unspezifischen Signalen.

Fig. 7 zeigt den Nachweis von SDA-Produkten aus Coamplifikationen mit drei Matrizen in Triplex-Primersätzen. Die Bedingungen waren dieselben wie in den Fig. 6A-6D, außer dass die Primerkonzentrationen wie folgt waren. Für SLTI- Primersätze war AP/BP 200 nM/20 nM. Für yst-Primersätze war AP/BP 400 nM/40 nM. Für invA-Primersätze wurden die Standardkonzentrationen (AP/BP 500 nM/ 50 nM) verwendet.

Die Fig. 8A-8B zeigen den Nachweis von SDA-Produkten für die Erzeugung von einzelsträngiger DNA. Genomische DNA von Yersinia enterocolitica wurde als Matri­ ze verwendet. Fig. 8A: Nachweisergebnisse von der passiven Hybridisierung mit yst-Antisense-Abfangsonde (ystC_A) und yst-Antisense-Reportersonde (ystR_A) bzw. yst-Sense-Abfangsonde (ystC_S) und yst-Sense-Reportersonde (ystR_S). Fig. 8B: Ergebnisse aus dem elektronischen Hybridisierungsnachweis für entsalzte und denaturierte Proben mit ystC_A-Abfangsonde und ystR_A-Reportersonde. PT: reguläre SDA.

Strangverdrängungsamplifikation ist eine in-vitro-Nucleinsäure-Amplifikations­ technik, die bei 60°C in 15 min das 10¹⁰-fache des Amplifikationsprodukts er­ zeugen kann (C. A. Spargo et al., 1996, Mol. Cell. Probes 7: 247-256). Primer­ wechselwirkungen und PD-Amplifikationen sind die Hauptkonkurrenzreaktionen targetspezifischer Amplifikationen. Einige der PD-Amplifikationsprodukte wurden sequenziert, und die Ergebnisse zeigten, dass einige der Produkte von 2- oder 3- bp-Primerwechselwirkungen stammten. Primerwechselwirkungen können mini­ miert werden, indem man den Bereich des zu amplifizierenden Targets sorgfältig auswählt. Wegen anderer Einschränkungen funktioniert diese Strategie nicht immer. Bei der Gestaltung von Multiplex-SDA-Primern wird dies noch schwieri­ ger, da mehr Primer beteiligt sind. Bei der früher veröffentlichten SDA- Primergestaltung hängt die Primer-Target-Hybridisierung von der Wechselwir­ kung zwischen dem targetspezifischen Teil des AP und dem Target ab. Der Be­ reich 5' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms nimmt an dieser spezi­ fischen Hybridisierung nicht teil. Die einzige Funktion dieses Teils besteht darin, eine flankierende Sequenz für die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms zu liefern (G. T. Walker, 1993, PCR Methods Appl. 3: 1-6).

Die Tatsache, dass die AP-Sequenz 5' von der Erkennungsstelle des Restriktions­ enzyms nicht an der exponentiellen Primer-Dimer-Amplifikation beteiligt ist, wurde zur Gestaltung neuer Amplifikationsprimer verwendet, um die Spezifität, Empfindlichkeit und Ausbeute der SDA zu verbessern. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die targetspezifische Sequenz (z. B. 1 bis 50 Nucleotide, vorzugs­ weise 10 bis 40 Nucleotide, besonders bevorzugt 15 bis 30 Nucleotide) in diesem Teil des Amplifikationsprimers verwendet, um eine flankierende Sequenz um die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms herum zu erhalten. Diese Sequenz ist auch an der spezifischen Primer-Target-Hybridisierung bei den anfänglichen SDA-Runden beteiligt. Diese Primergestaltung zieht auch Nutzen aus der Tatsa­ che, dass ein Teil der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms (z. B. 5 bp von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms, wenn BsoBI die verwendete Restriktionsendonuclease ist) bei der SDA in die gespaltene verdrängte Matrize eingebaut wird. APs mit kürzeren Sequenzen (z. B. 5 bis 30 Nucleotide, vorzugs­ weise 6 bis 20 Nucleotide, besonders bevorzugt 9 bis 12 Nucleotide) 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms werden so gestaltet, dass die Primer­ wechselwirkungen zwischen diesen Teilen reduziert werden. Eine erhöhte Spezi­ fität, Empfindlichkeit und Ausbeute werden mit Primern erreicht, die gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet sind, obwohl eine kürzere 3'-Sequenz verwen­ det wird. Vermutlich ist die Konkurrenz zwischen targetspezifischer Amplifikation und matrizenunabhängiger unspezifischer Amplifikation in den anfänglichen SDA-Runden ein wichtiger Faktor, der das Ergebnis der gesamten SDA- Amplifikation bestimmt. Eine stärkere Primer-Target-Hybridisierung und weniger Primerwechselwirkungen in diesen SDA-Runden erhöht definitiv die Spezifität und Empfindlichkeit der Gesamtreaktionen. Von 10 Kopien DNA-Matrize wird nach 30 Minuten SDA bei 60°C eine große Menge Amplifikationsprodukte er­ zeugt. Dieses Ergebnis bedeutet, dass die gesamte Amplifikation tatsächlich zugunsten der spezifischen Amplifikation verläuft. Außerdem erleichtert die Primergestaltung der vorliegenden Erfindung die Primergestaltung für Multiplex- SDA wesentlich, da kürzere Sequenzen 3' von der Restriktionsstelle benötigt werden.

Es hat sich außerdem gezeigt, dass eine nichttargetspezifische Sequenz 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms neben der targetspezifischen Se­ quenz eingebaut werden kann, ohne die Amplifikationsreaktion zu beeinträchti­ gen. In dieser Ausführungsform umfasst die nichttargetspezifische Sequenz 1 bis 40 Nucleotide, vorzugsweise 5 bis 30 Nucleotide, besonders bevorzugt 10 bis 20 Nucleotide, und befindet sich zwischen der Erkennungsstelle des Restriktionsen­ zyms und der 3'-targetspezifischen Sequenz.

Gelelektrophorese ist ein schnelles Verfahren, um die Größen von amplifizierten Produkten sichtbar zu machen, aber sie kann die Spezifität dieser Produkte nicht bestätigen. Der Chipassay unter Verwendung mikroelektronischer Matrizen ist ein schnelles und empfindliches Nucleinsäure-Nachweissystem. Der Chipassay kann verwendet werden, um ein targetspezifisches Produkt zu identifizieren. Es dauert weniger als 1 Stunde, bis das System das gesamte Nachweisverfahren abgeschlossen hat. Durch die Kombination von Geschwindigkeit, Einfachheit und Empfindlichkeit haben das SDA-System und der Chipassay das Potential, ein Verfahren zum Nachweis klinischer bakterieller Erreger zu sein, da derzeitige Diagnoseverfahren auf Kulturbasis zum Nachweis bakterieller Erreger aufgrund der extrem langsamen Wachstumsrate bestimmter Pathogene mehrere Tage bis einige Wochen erfordern (C. A. Spargo et al., 1993, Mol. Cell. Probes 7: 395-404).

Multiplexamplifikation ist eine Strategie zur Verwendung mehrerer Sätze von Amplifikationsprimern, um eine oder mehrere Targetsequenzen in einer einzigen Reaktion zu amplifizieren. Jede Amplifikationsreaktion ist spezifisch, aber es wird mehr als ein Target in einer einzigen Reaktionsmischung amplifiziert. Durch Verwendung der gemäß der vorliegenden Erfindung gestalteten Primer (d. h. Primer mit einer Targetsequenz 5' von der Erkennungsstelle des Restriktionsen­ zyms und kürzeren Targetsequenzen 3' von der Erkennungsstelle des Restrikti­ onsenzyms) und durch Einstellen der Primerkonzentrationen für jede Matrize konnten bereits nur 10 Kopien von jeder Matrize coamplifiziert und nachgewie­ sen werden. Primerkonzentrationen werden empirisch unter Verwendung kon­ ventioneller Techniken bestimmt. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausfüh­ rungsform werden amplifizierte Produkte mit Hilfe einer mikroelektronischen Matrix nachgewiesen. Das gesamte Verfahren von der Amplifikation bis zur De­ tektion dauerte ungefähr 2 h. Die Kombination von Geschwindigkeit, Einfachheit und Empfindlichkeit der SDA-Amplifikation und des Nachweises auf einer mikro­ elektronischen Matrix liefern ein Verfahren zum Nachweis klinischer bakterieller Erreger und anderer Krankheiten. Die Primergestaltung der vorliegenden Erfin­ dung kann also verwendet werden, um bei der SDA zwei oder drei oder mehr Targetsequenzen mit einer ähnlichen Empfindlichkeit wie bei der Multiplex-PCR zu amplifizieren.

Die optimale DNA für die Nucleinsäurehybridisierung und -sequenzierung ist einzelsträngige DNA. Im Verlaufe der Gestaltung verbesserter Primer für die Amplifikation durch SDA hat sich gezeigt, dass bei der SDA kein targetspezifi­ sches Produkt erzeugt werden konnte, wenn man Amplifikationsprimer verwen­ det, die nur drei Basenpaare (bp) targetspezifische Sequenz auf der 3'-Seite der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms aufweisen. Diese Tatsache ist für die Erzeugung einzelsträngiger DNA durch SDA von Nutzen. Insbesondere wird bei der SDA einzelsträngige DNA erzeugt, indem man folgendes verwendet: (1) gleiche molare Mengen von (a) einem regulären Amplifikationsprimer, der ge­ mäß der vorliegenden Erfindung gestaltet ist, und (b) einem Primer, der gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet ist und nur 3 Nucleotide targetspezifische Sequenz 3' von der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms aufweist (blockie­ render Primer genannt), zur Bindung an den einen DNA-Strang und (2) einen regulären Amplifikationsprimer, der gemäß der vorliegenden Erfindung gestaltet ist, zur Bindung an den anderen DNA-Strang. Der blockierende Primer wurde verwendet, um mit dem regulären Amplifikationsprimer um das Target zu kon­ kurrieren, so dass die beiden Stränge der Target-DNA ungleich amplifiziert wer­ den.

Die bevorzugten Verfahren bestehen in der Verwendung von SDA, tSDA oder ho­ mogener Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA. Diese Verfahren sind dem Fachmann von Literaturstellen bekannt wie dem US-Patent Nr. 5,547,861, US-Patent Nr. 5,648,211, US-Patent Nr. 5,846,726, US-Patent Nr. 5,919,630, US-Patent Nr. 5,928,869, US-Patent Nr. 5,935,791 und US-Patent Nr. 6,054,279, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Die Verwendung mikroelektronischer Matri­ zen für die Analyse von Nucleinsäuren ist dem Fachmann von Literaturstellen bekannt wie dem US-Patent Nr. 5,605,662 und US-Patent Nr. 5,632,957 sowie den PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 96/01836 und WO 97/12030.

Da Nucleinsäuren keine vollständige Komplementarität erfordern, um zu hybridi­ sieren, sollte man sich darüber im Klaren sein, dass die Sonden- und Primerse­ quenzen bis zu einem gewissen Grad modifiziert sein können, ohne ihre Eignung als SDA-Sonden und -Primer zu verlieren. Zum Beispiel befindet sich bei der Primergestaltung der vorliegenden Erfindung die Erkennungsstelle der Restrikti­ onsendonuclease zwischen dem 5'-targetbindenden Teil und dem 3-targetbin­ denden Teil des AP und kann an der Hybridisierung mit der Targetnucleinsäure beteiligt sein oder auch nicht. Wie in der Technik bekannt ist, kann eine Hybridi­ sierung von komplementären und partiell komplementären Nucleinsäuresequen­ zen durch Einstellung der Hybridisierungsbedingungen unter Erhöhung oder Erniedrigung der Stringenz erhalten werden (d. h. Einstellung des Hybridisie­ rungs-pH, der Temperatur oder des Salzgehalts des Puffers). Solche kleineren Modifikationen der Primer- und Sondensequenzen sowie alle notwendigen Ein­ stellungen der Hybridisierungsbedingungen erfordern nur Routineversuche, die der Fachmann leicht durchführen kann.

Die unter Verwendung der hier offenbarten Primer erzeugten Amplifikationspro­ dukte können anhand einer charakteristischen Größe nachgewiesen werden, zum Beispiel auf Polyacrylamid- oder Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid angefärbt sind. Alternativ dazu können amplifizierte Targetsequenzen mittels einer Assay­ sonde nachgewiesen werden, bei der es sich um ein Oligonucleotid handelt, das mit einem nachweisbaren Marker markiert ist. In einer Ausführungsform kann wenigstens eine markierte Assaysonde zum Nachweis amplifizierter Targetse­ quenzen durch Hybridisierung (eine Detektorsonde), durch Hybridisierung und Verlängerung, wie es von Walker et al. beschrieben wurde (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696) (ein Detektorprimer), oder durch Hybridisierung, Verlänge­ rung und Umwandlung in eine doppelsträngige Form, wie es in der EP 0 678 582 beschrieben wurde (ein Signalprimer), verwendet werden. Vorzugsweise wird die Assaysonde so ausgewählt, dass sie mit einer Sequenz im Target hybridisiert, die sich zwischen den Amplifikationsprimern befindet, d. h. es sollte sich um eine interne Assaysonde handeln. Alternativ dazu kann auch ein Amplifikationsprimer oder dessen targetbindende Sequenz als Assaysonde verwendet werden. Die Amplifikation und/oder Detektion kann auf einer mikroelektronischen Matrix erfolgen.

Der nachweisbare Marker der Assaysonde ist eine Struktureinheit, die entweder direkt oder indirekt als Hinweis auf die Gegenwart der Targetnucleinsäure nach­ gewiesen werden kann. Für einen direkten Nachweis des Markers können Assay­ sonden mit einem Radioisotop markiert sein und durch Autoradiographie nach­ gewiesen werden, oder sie können mit einer Fluoreszenz-Struktureinheit mar­ kiert sein und durch Fluoreszenz nachgewiesen werden, wie in der Technik be­ kannt ist. Alternativ dazu können die Assaysonden auch indirekt nachgewiesen werden, indem man sie mit einem Marker markiert, der zusätzliche Reagentien erfordert, um nachweisbar zu sein. Zu den indirekt nachweisbaren Markern ge­ hören zum Beispiel chemilumineszierende Mittel, Enzyme, die sichtbare Reakti­ onsprodukte erzeugen, sowie Liganden (z. B. Haptene, Antikörper oder Antige­ ne), die durch Bindung an markierte spezifische Bindungspartner (z. B. Antikör­ per oder Antigene/Haptene) nachgewiesen werden können. Liganden sind auch geeignet, um das ligandmarkierte Oligonucleotid (die Abfangsonde) auf einer festen Phase zu immobilisieren und so seinen Nachweis zu erleichtern. Zu den besonders gut geeigneten Markern gehören Biotin (nachweisbar durch Bindung an markiertes Avidin oder Streptavidin) sowie Enzyme wie Meerrettich-Per­ oxidase oder Alkalische Phosphatase (nachweisbar durch Hinzufügen von En­ zymsubstraten, so dass farbige Reaktionsprodukte entstehen). Verfahren zur Addition solcher Marker an oder zum Einbau solcher Marker in Oligonucleotide sind in der Technik wohlbekannt, und alle diese Verfahren sind für die Verwen­ dung in der vorliegenden Erfindung geeignet.

Beispiele für spezielle Nachweisverfahren, die eingesetzt werden können, sind ein Chemilumineszenzverfahren, bei dem amplifizierte Produkte unter Verwen­ dung einer biotinylierten Abfangsonde und einer enzymkonjugierten Detektor­ sonde nachgewiesen werden, wie es im US-Patent Nr. 5,470,723 beschrieben ist. Nach der Hybridisierung dieser beiden Assaysonden mit verschiedenen Stel­ len im Assaybereich der Targetsequenz (zwischen den Bindungsstellen für die beiden Amplifikationsprimer) wird der Komplex mit Hilfe der Abfangsonde auf einer streptavidinbeschichteten Mikrotiterplatte abgefangen, und das chemilumi­ neszente Signal wird entwickelt und in einem Luminometer abgelesen. Als weite­ re Alternative für den Nachweis von Amplifikationsprodukten kann bei der SDA- Reaktion ein Signalprimer mitverwendet werden, wie er in EP 0 678 582 be­ schrieben ist. In dieser Ausführungsform werden markierte sekundäre Amplifika­ tionsprodukte während der SDA in einer targetamplifikationsabhängigen Weise erzeugt und können mittels des assoziierten Markers als Hinweis auf die Tar­ getamplifikation nachgewiesen werden.

Wegen der kommerziellen Zweckmäßigkeit können Amplifikationsprimer für den spezifischen Nachweis und die Identifizierung von Nucleinsäuren in Form eines Kits verpackt sein, Typischerweise enthält ein solcher Kit wenigstens ein Paar Amplifikationsprimer. Reagentien zur Durchführung einer Nucleinsäureamplifika­ tionsreaktion können den targetspezifischen Amplifikationsprimern ebenfalls zugegeben werden, zum Beispiel Puffer, zusätzliche Primer, Nucleotidtriphospha­ te, Enzyme usw. Die Komponenten des Kits sind zusammen in einem gemeinsa­ men Behälter verpackt, der gegebenenfalls auch Anweisungen zur Durchführung einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren enthält. Weitere wahlfreie Komponenten können ebenfalls in dem Kit enthalten sein, z. B. ein mit einem Marker markiertes Oligonucleotid, das sich zur Verwendung als Assaysonde eignet, und/oder Reagentien oder Mittel zum Nachweis des Markers.

Die targetbindenden Sequenzen der Amplifikationsprimer verleihen den Oligo­ nucleotiden Artspezifität der Hybridisierung und verleihen der Amplifikations­ reaktion daher Artspezifität. Die targetbindenden Sequenzen der Amplifikati­ onsprimer der Erfindung eignen sich also auch für andere Nucleinsäure- Amplifikationsvorschriften, wie PCR, herkömmliche SDA (ein Reaktionsschema, das im wesentlichen dasselbe ist wie bei tSDA, aber unter Verwendung von me­ sophilen Enzymen bei niedrigerer Temperatur durchgeführt wird), 3SR, NASBA und TAS. Insbesondere können die targetbindenden Sequenzen der Erfindung für jede Amplifikationsvorschrift eingesetzt werden, die eine cyclische spezifische Hybridisierung von Primern mit der Targetsequenz, eine Verlängerung der Primer unter Verwendung der Targetsequenz als Matrize und eine Abtrennung oder Verdrängung der Verlängerungsprodukte von der Targetsequenz verwenden. Für Amplifikationsverfahren, die keine speziellen nichttargetbindenden Sequenzen erfordern (z. B. PCR), können die Amplifikationsprimer auch nur aus den target­ bindenden Erkennungssequenzen der Amplifikationsprimer bestehen, wobei die Stelle für die Restriktionsendonuclease durch irgendeine nichttargetspezifische Sequenz ersetzt ist. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung werden Amplifikationsprimer bereitgestellt, die eine 5'-targetbindende Sequenz - nicht­ targetbindende Sequenz - 3'-targetbindende Sequenz umfassen.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die obigen Primer, die für Nicht-SDA-Amplifikationsreaktionen geeignet sind, wobei einer der Primer eine bis mehrere Fehlpaarungen (in Bezug auf das Target) im 3'- targetspezifischen Bereich aufweist, z. B. 1 bis 10 Nucleotide, vorzugsweise 1 bis 3 Nucleotide. Diese modifizierten Primer sind für eine Fehlpaarungsamplifikation und -detektion geeignet (SNP-Assay) (S. S. Sommer et al., 1989, Mayo Clin. Proc. 64: 1361-1372).

Weitere Sequenzen, wie sie für die Durchführung einer ausgewählten Amplifika­ tionsreaktion erforderlich sind, können gegebenenfalls zu den hier offenbarten targetbindenden Sequenzen hinzugefügt werden, ohne die Artspezifität des Oli­ gonucleotids zu verändern. Für andere Amplifikationsreaktionen (z. B. 3SR, NASBA und TAS) können die Amplifikationsprimer aus der targetbindenden Se­ quenz und zusätzlichen Sequenzen, die für die ausgewählte Amplifikationsreakti­ on erforderlich sind (z. B. für die SDA erforderlichen Sequenzen, wie sie oben beschrieben sind, oder einem Promotor, der durch RNA-Polymerase erkannt wird, für 3SR), bestehen. Bei der Anpassung der targetbindenden Sequenzen der Erfindung an andere Amplifikationsverfahren als SDA werden Routineverfahren zur Herstellung von Amplifikationsprimern, wie chemische Synthese, und die wohlbekannten strukturellen Anforderungen an die Primer der ausgewählten Amplifikationsreaktion eingesetzt. Die targetbindenden Sequenzen der Erfindung können daher bei einer Vielzahl von Amplifikationsreaktionen leicht an die Y.- enterocolitica-spezifische Targetamplifikation und -detektion angepasst werden, wobei man nur Routineverfahren für die Herstellung, Durchmusterung und Opti­ mierung verwendet.

Bei der SDA sind die Bumperprimer für die Artspezifität wesentlich, da sie die Funktion haben, die stromabwärts befindlichen artspezifischen Amplifikations­ primerprodukte vom Target zu verdrängen. Die Bumperprimer müssen mit dem Target stromaufwärts von den Amplifikationsprimern hybridisieren, so dass sie bei Verlängerung den Amplifikationsprimer und sein Verlängerungsprodukt ver­ drängen. Die besondere Sequenz des Bumperprimers ist daher im allgemeinen nicht entscheidend und kann von jeder stromaufwärts gelegenen Targetsequenz abgeleitet sein, die ausreichend nahe bei der Bindungsstelle des Amplifikati­ onsprimers liegt, um eine Verdrängung des Verlängerungsprodukts des Amplifi­ kationsprimers bei der Verlängerung des Bumperprimers zu ermöglichen. Gele­ gentliche Fehlpaarungen mit dem Target in der Bumperprimersequenz oder ein bestimmtes Maß an Kreuzhybridisierung mit Nichttargetsequenzen beeinträchti­ gen die Amplifikationseffizienz im allgemeinen nicht, solange der Bumperprimer noch in der Lage ist, mit der spezifischen Targetsequenz zu hybridisieren.

Bei Amplifikationsreaktionen unter Verwendung der Primer der Erfindung kann Thymin eingebaut werden, wie es von Walker et al. gelehrt wird (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696), oder TTP kann in der Reaktion vollständig oder partiell durch 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat ersetzt werden, so dass die Kreuzkontamination anschließender Amplifikationsreaktionen reduziert wird, wie es z. B. in EP 0 624 643 gelehrt wird. dU (Uridin) wird in Amplifikationsprodukte eingebaut und kann durch Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) herausgeschnitten werden. Durch diese abasischen Stellen wird das Amplifikationsprodukt in an­ schließenden Amplifikationsreaktionen unamplifizierbar. Vor der Durchführung der anschließenden Amplifikation kann UDG durch Uracil-DNA-Glycosylase-Inhibitor (UGI) inaktiviert werden, um ein Herausschneiden von dU aus neu gebildeten Amplifikationsprodukten zu verhindern.

SDA ist ein isothermes Verfahren der Nucleinsäureamplifikation, bei dem die Ver­ längerung von Primern, die Erzeugung eines Einzelstrangbruchs an einer hemimo­ difizierten Erkennungs-/Spaltungsstelle einer Restriktionsendonuclease, die Ver­ drängung einzelsträngiger Verlängerungsprodukte, die Assoziation von Primern mit den Verlängerungsprodukten (oder der ursprünglichen Targetsequenz) und die anschließende Verlängerung der Primer erfolgen gleichzeitig in der Reaktionsmi­ schung. Dies steht im Gegensatz zur PCR, bei der die Schritte der Reaktion als Ergebnis der Temperaturcycluseigenschaft der Reaktion in diskreten Phasen oder Cyclen erfolgen. SDA beruht auf 1) der Fähigkeit einer Restriktionsendonuclease, einen Einzelstrangbruch im unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorothioat- Form ihrer doppelsträngigen Erkennungs-/Spaltungsstelle zu erzeugen, und 2) der Fähigkeit bestimmter Polymerasen, die Replikation am Einzelstrangbruch einzulei­ ten und die stromabwärts gelegenen Verlängerungsprodukte zu verdrängen. Nach einer anfänglichen Inkubation bei erhöhter Temperatur (etwa 95°C), um dop­ pelsträngige Targetsequenzen für die Assoziation der Primer zu denaturieren, er­ folgen die anschließende Polymerisation und Verdrängung neu synthetisierter Stränge bei einer konstanten Temperatur. Die Erzeugung jeder neuen Kopie der Targetsequenz besteht aus fünf Schritten: 1) Bindung von Amplifikationsprimern an eine ursprüngliche Targetsequenz oder ein zuvor polymerisiertes, verdrängtes einzelsträngiges Verlängerungsprodukt, 2) Verlängerung der Primer durch eine Polymerase ohne 5'→3'-Exonuclease-Funktion, die ein α-Thiodesoxynucleosid­ triphosphat (α-Thio-dNTP) einbaut, 3) Erzeugung eines Einzelstrangbruchs in einer hemimodifizierten doppelsträngigen Erkennungsstelle, 4) Dissoziation des Restrik­ tionsenzyms von dem Einzelstrangbruch und 5) Verlängerung vom 3'-Ende des Einzelstrangbruchs her durch die Polymerase ohne 5'→3'-Exonuclease-Funktion unter Verdrängung des stromabwärts befindlichen, neu synthetisierten Stranges. Die Erzeugung von Einzelstrangbrüchen, Polymerisation und Verdrängung erfolgen gleichzeitig und kontinuierlich bei einer konstanten Temperatur, da die Verlänge­ rung ausgehend von dem Einzelstrangbruch eine andere spaltbare Restriktionsstel­ le regeneriert. Wenn ein Paar von Amplifikationsprimern verwendet wird, von de­ nen jeder mit einem der beiden Stränge einer doppelsträngigen Targetsequenz hybridisiert, verläuft die Amplifikation exponentiell. Der Grund dafür ist, dass der Sense- und der Antisense-Strang in anschließenden Amplifikationsrunden als Mat­ rizen für den entgegengesetzten Primer dienen. Wenn ein einzelner Amplifikati­ onsprimer verwendet wird, erfolgt die Amplifikation linear, da nur ein Strang als Matrize für die Primerverlängerung dient. Beispiele für Restriktionsendonucleasen, die einen Einzelstrangbruch in ihren doppelsträngigen Erkennungs-/Spaltungsstel­ len erzeugen, wenn ein α-Thio-dNTP eingebaut wird, sind HincII, HindII, AvaI, NciI und Fnu4HI. Alle diese Restriktionsendonucleasen und andere, die die erforderliche spaltende Wirkung haben, sind zur Verwendung in der herkömmlichen SDA geeig­ net. Sie sind jedoch relativ thermolabil und verlieren oberhalb von etwa 40°C ihre Aktivität.

Targets für die Amplifikation durch SDA können hergestellt werden, indem man größere Nucleinsäuren durch Restriktion mit einer Endonuclease fragmentiert, welche die Targetsequenz nicht schneidet. Es wird jedoch allgemein bevorzugt, dass Targetnucleinsäuren mit ausgewählten Restriktionsendonuclease-Erken­ nungs-/Spaltungsstellen für die Erzeugung des Einzelstrangbruchs in der SDA- Reaktion so erzeugt werden, wie es von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696) und im US-Patent Nr. 5,270,184 (auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird) beschrieben ist. Kurz gesagt, wenn die Targetsequenz doppel­ strängig ist, werden vier Primer damit hybridisiert. Zwei der Primer (S₁ und S₂) sind SDA-Amplifikationsprimer, und zwei (B₁ und B₂) sind externe oder Bum­ perprimer. S₁ und S₂ binden an entgegengesetzte Stränge von doppelsträngigen Nucleinsäuren, die die Targetsequenz flankieren. B₁ und B₂ binden an die Target­ sequenz 5' (d. h. stromaufwärts) von S₁ bzw. S₂. Dann wird die Polymerase ohne Exonucleasefunktion verwendet, um in Gegenwart von drei Desoxynucleosidtri­ phosphaten und wenigstens einem modifizierten Desoxynucleosidtriphosphat (z. B. 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat), "dATPαS") alle vier Primer gleichzeitig zu verlängern. Die Verlängerungsprodukte von S₁ und S₂ werden dabei durch die Verlängerung von B₁ und B₂ von der ursprünglichen Targetse­ quenzmatrize verdrängt. Die verdrängten einzelsträngigen Verlängerungspro­ dukte der Amplifikationsprimer dienen als Targets für die Bindung der entgegen­ gesetzten Amplifikations- und Bumperprimer (z. B. bindet das Verlängerungspro­ dukt von S₁ an S₂ und B₂). Der nächste Cyclus der Verlängerung und Verdrän­ gung führt zu zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten mit hemimodifi­ zierten Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Spaltungsstellen an jedem Ende. Diese sind geeignete Substrate für die Amplifikation durch SDA. Wie bei der SDA finden die einzelnen Schritte der Targeterzeugungsreaktion gleichzeitig und kontinuierlich statt, wobei Targetsequenzen mit den Erkennungs-/Spaltungsse­ quenzen an den Enden entstehen, welche für die Erzeugung des Einzelstrang­ bruchs durch das Restriktionsenzym bei der SDA erforderlich sind. Da alle Kom­ ponenten der SDA-Reaktion bereits in der Targeterzeugungsreaktion vorhanden sind, treten automatisch und kontinuierlich erzeugte Targetsequenzen in den SDA-Cyclus ein und werden amplifiziert.

Zur Verhinderung einer Kreuzkontaminierung einer SDA-Reaktion durch die Amplifikationsprodukte einer anderen kann dUTP anstelle von dTTP in SDA- amplifizierte DNA eingebaut werden, ohne die Amplifikationsreaktion zu hem­ men. Dann können die uracilmodifizierten Nucleinsäuren spezifisch erkannt und durch Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) inaktiviert werden. Wenn daher dUTP in einer früheren Reaktion in SDA-amplifizierte DNA eingebaut wird, können alle anschließenden SDA-Reaktionen vor der Amplifikation von doppel­ strängigen Targets mit UDG behandelt werden, und jede dU-haltige DNA aus früher amplifizierten Reaktionen wird unamplifizierbar gemacht. Die in der an­ schließenden Reaktion zu amplifizierende Target-DNA enthält kein dU und wird durch die UDG-Behandlung nicht beeinträchtigt. Dann kann UDG vor der Amplifi­ kation des Targets durch Behandlung mit UGI gehemmt werden. Alternativ dazu kann UDG auch thermisch inaktiviert werden. In der tSDA kann die höhere Tem­ peratur der Reaktion selbst (≧ 50°C) gleichzeitig verwendet werden, um UDG zu inaktivieren und das Target zu amplifizieren.

SDA erfordert eine Polymerase, der die 5'→3'-Exonuclease-Aktivität fehlt, die die Polymerisation an einem Einzelstrangbruch in doppelsträngigen Nucleinsäuren einleitet und den Strang stromabwärts des Einzelstrangbruchs verdrängt, wäh­ rend sie einen neuen komplementären Strang erzeugt und dabei den nicht ge­ brochenen Strang als Matrize verwendet. Die Polymerase muss verlängern, in­ dem sie Nucleotide an eine freie 3'-OH-Gruppe addiert. Um die SDA-Reaktion zu optimieren, ist es auch wünschenswert, dass die Polymerase hochgradig prozes­ siv ist, um die Länge der Targetsequenz, die amplifiziert werden kann, zu maxi­ mieren. Hochgradig prozessive Polymerasen können neue Stränge mit erhebli­ cher Länge polymerisieren, bevor sie abdissoziieren und die Synthese des Ver­ längerungsprodukts beenden. Die Verdrängungswirkung ist für die Amplifikati­ onsreaktion wesentlich, da sie das Target für die Synthese weiterer Kopien ver­ fügbar macht und das einzelsträngige Verlängerungsprodukt erzeugt, an das bei exponentiellen Amplifikationsreaktionen ein zweiter Amplifikationsprimer hybri­ disieren kann. Die einzelstrangspaltende Wirkung des Restriktionsenzyms ist ebenfalls von großer Wichtigkeit, da diese Einzelstrangbrüche die Reaktion fort­ bestehen lassen und die Einleitung anschließender Runden der Targetamplifika­ tion ermöglichen.

tSDA wird im wesentlichen als herkömmliche SDA durchgeführt, wie sie von Wal­ ker et al. beschrieben ist (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396, und 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696), wobei die gewünschte thermostabile Polymerase und thermostabile Restriktionsendonuclease verwendet wird. Selbst­ verständlich wird die Temperatur der Reaktion auf die höhere Temperatur einge­ stellt, die für die verwendeten Enzyme geeignet ist, und die Erkennungs-/Spal­ tungsstelle der HincII-Restriktionsendonuclease wird durch die geeignete Erken­ nungs-/Spaltungsstelle der Restriktionsendonuclease für die ausgewählte thermo­ stabile Endonuclease ersetzt. Ebenfalls im Gegensatz zu Walker et al. kann der praktische Anwender die Enzyme schon vor dem anfänglichen Denaturierungs­ schritt mit in das Reaktionsgemisch aufnehmen, wenn sie bei der Denaturierungs­ temperatur ausreichend stabil sind. Bevorzugte Restriktionsendonucleasen für die Verwendung bei der tSDA sind BsrI, BstNI, BsmAI, BslI und BsoBI (New England BioLabs) und BstOI (Promega). Die bevorzugten thermophilen Polymerasen sind Bca (Panvera) und Bst (New England BioLabs).

Homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA ist eine Modifikation der tSDA. Sie ver­ wendet Detektoroligonucleotide, um ein reduziertes Fluoreszenzquenchen in einer targetabhängigen Weise zu erzeugen. Die Detektoroligonucleotide enthal­ ten ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar, das so miteinander verknüpft ist, dass in Abwesenheit des Targets ein Fluoreszenzquenchen erfolgt. Die Entfaltung oder Linearisierung einer intramolekular basengepaarten Sekundärstruktur im Detek­ toroligonucleotid in Gegenwart des Targets erhöht den Abstand zwischen den Farbstoffen und reduziert das Fluoreszenzquenchen. Die Entfaltung der basenge­ paarten Sekundärstruktur beinhaltet typischerweise eine intermolekulare Basen­ paarung zwischen der Sequenz der Sekundärstruktur und einem komplementä­ ren Strang, so dass die Sekundärstruktur wenigstens zum Teil zerstört wird. Sie kann in Gegenwart eines komplementären Stranges ausreichender Länge voll­ ständig linearisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich eine Erkennungsstelle einer Restriktionsendonuclease (RERS) zwischen den bei­ den Farbstoffen, so dass eine intermolekulare Basenpaarung zwischen der Se­ kundärstruktur und einem komplementären Strang die RERS ebenfalls dop­ pelsträngig und durch eine Restriktionsendonuclease spaltbar bzw. an einem Strang spaltbar macht. Durch die Spaltung bzw. den Einzelstrangbruch durch die Restriktionsendonuclease werden der Donor- und der Akzeptorfarbstoff auf ge­ trennte Nucleinsäurefragmente aufgeteilt, was weiter zu einem reduzierten Quenchen beiträgt. In beiden Ausführungsformen wird eine damit einhergehende Änderung eines Fluoreszenzparameters (z. B. eine Erhöhung der Donorfluores­ zenzintensität, eine Abnahme der Akzeptorfluoreszenzintensität oder ein Fluo­ reszenzverhältnis vor und nach der Entfaltung) als Hinweis auf die Anwesenheit der Targetsequenz überwacht. Die Überwachung einer Änderung in der Donor­ fluoreszenzintensität ist bevorzugt, da diese Änderung typischerweise größer ist als die Änderung der Akzeptorfluoreszenzintensität. Andere Fluoreszenzparame­ ter, wie eine Änderung in der Fluoreszenzlebensdauer, können ebenfalls über­ wacht werden.

Ein Detektoroligonucleotid für die homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA ist ein Oligonucleotid, das sowohl einen einzelsträngigen 5'- oder 3'-Abschnitt, der mit der Targetsequenz hybridisiert (die targetbindende Sequenz), als auch eine in­ tramolekular basengepaarte Sekundärstruktur neben der targetbindenden Se­ quenz umfasst. Die Detektoroligonucleotide der Erfindung umfassen weiterhin ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar, das mit dem Detektoroligonucleotid verknüpft ist, so dass die Donorfluoreszenz gelöscht wird, wenn die Sekundärstruktur in­ tramolekular basengepaart ist und die Entfaltung oder Linearisierung der Sekun­ därstruktur zu einer Abnahme des Fluoreszenzquenchens führt. Die Spaltung eines Oligonucleotids bezieht sich auf die Spaltung der Phosphodiesterbindungen beider Stränge eines DNA-Duplex oder die Spaltung der Phosphodiesterbindung einer einzelsträngigen DNA. Dies steht im Gegensatz zum Einzelstrangbruch, was sich auf die Spaltung der Phosphodiesterbindung von nur einem der beiden Stränge in einem DNA-Duplex bezieht.

Die Detektoroligonucleotide der Erfindung für die homogene Echtzeit-Fluores­ zenz-tSDA umfassen eine Sequenz, die unter den ausgewählten Reaktionsbedin­ gungen für die Primerverlängerung oder -hybridisierung eine intramolekular basengepaarte Sekundärstruktur bildet. Die Sekundärstruktur befindet sich ne­ ben der targetbindenden Sequenz des Detektoroligonucleotids, so dass wenigs­ tens ein Teil der targetbindenden Sequenz einen einzelsträngigen 3'- oder 5'- Schwanz bildet. Der hier verwendete Ausdruck "neben der targetbindenden Se­ quenz" bedeutet, dass die gesamte oder ein Teil der targetbindenden Sequenz in einem 5'- oder 3'-Schwanz, der für die Hybridisierung mit dem Target zur Verfü­ gung steht, einzelsträngig zurückbleibt. Das heißt, die Sekundärstruktur umfasst nicht die gesamte targetbindende Sequenz. Ein Teil der targetbindenden Se­ quenz kann an der intramolekularen Basenpaarung in der Sekundärstruktur beteiligt sein, sie kann die Gesamtheit oder einen Teil einer ersten Sequenz beinhalten, die an der intramolekularen Basenpaarung in der Sekundärstruktur beteiligt ist, sie kann die Gesamtheit oder einen Teil einer ersten Sequenz bein­ halten, die an der intramolekularen Basenpaarung in der Sekundärstruktur beteiligt ist, aber vorzugsweise nicht in ihre komplementäre Sequenz hineinragt. Wenn die Sekundärstruktur zum Beispiel eine Stamm-Schleifen-Struktur ist (z. B. eine "Haarnadel") und die targetbindende Sequenz des Detektoroligonucleotids als einzelsträngiger 3'-Schwanz vorliegt, kann die targetbindende Sequenz sich auch durch den gesamten oder einen Teil des ersten Arms des Stammes sowie gegebenenfalls durch die gesamte oder einen Teil der Schleife erstrecken. Die targetbindende Sequenz erstreckt sich jedoch vorzugsweise nicht in den zweiten Arm der Sequenz, die an der intramolekularen Basenpaarung im Stamm beteiligt ist. Das heißt, es ist wünschenswert, zu vermeiden, dass beide Sequenzen an der intramolekularen Basenpaarung in einer Sekundärstruktur beteiligt sind, die zur Hybridisierung mit dem Target befähigt ist. Fehlpaarungen im intramolekular basengepaarten Teil der Sekundärstruktur des Detektoroligonucleotids können die Größe der Fluoreszenzänderung in Gegenwart des Targets reduzieren, sind jedoch akzeptabel, wenn es auf die Assayempfindlichkeit nicht ankommt. Fehl­ paarungen in der targetbindenden Sequenz des einzelsträngigen Schwanzes sind ebenfalls akzeptabel, können jedoch in ähnlicher Weise die Assayempfindlichkeit und/oder -spezifität reduzieren. Es ist jedoch ein Merkmal der vorliegenden Er­ findung, dass eine perfekte Basenpaarung sowohl in der Sekundärstruktur als auch in der targetbindenden Sequenz die Reaktion nicht beeinträchtigen. Perfek­ te Paarungen in den an der Hybridisierung beteiligten Sequenzen verbessern die Assayspezifität ohne negative Auswirkungen auf die Reaktionskinetik.

Wenn man sie zu der Amplifikationsreaktion gibt, werden die Detektoroligonuc­ leotid-Signalprimer der Erfindung durch Hybridisierung und Verlängerung, wie es oben beschrieben ist, in die doppelsträngige Form umgewandelt. Durch die Strangverdrängung durch die Polymerase wird außerdem die Sekundärstruktur entfaltet oder linearisiert und durch Synthese eines komplementären Stranges in die doppelsträngige Form umgewandelt. Falls ein RERS vorhanden ist, wird es ebenfalls doppelsträngig und durch die Restriktionsendonuclease spaltbar bzw. an einem Strang spaltbar. Wenn die Sekundärstruktur durch die strangverdrän­ gende Aktivität der Polymerase entfaltet oder linearisiert wird, nimmt der Ab­ stand zwischen dem Donor- und dem Akzeptorfarbstoff zu, wodurch das Quen­ chen der Donorfluoreszenz reduziert wird. Die damit verbundene Änderung der Fluoreszenz entweder des Donor- oder des Akzeptorfarbstoffs kann als Hinweis auf eine Amplifikation der Targetsequenz überwacht oder nachgewiesen werden. Die Spaltung oder der Einzelstrangbruch des RERS erhöht die Größe der Fluores­ zenzänderung im allgemeinen noch weiter, indem zwei getrennte Fragmente des doppelsträngigen sekundären Amplifikationsprodukts erzeugt werden, an die jeweils einer der beiden Farbstoffe geknüpft ist. Diese Fragmente können frei in die Reaktionslösung diffundieren, was den Abstand zwischen den Farbstoffen des Donor/Akzeptor-Paars weiter erhöht. Eine Erhöhung der Donorfluoreszenzinten­ sität oder eine Abnahme der Akzeptorfluoreszenzintensität kann als Hinweis darauf nachgewiesen und/oder überwacht werden, dass eine Amplifikation des Targets stattfindet oder stattgefunden hat, aber andere Fluoreszenzparameter, die durch die Nähe des Donor/Akzeptor-Farbstoffpaars beeinflusst werden, kön­ nen ebenfalls überwacht werden. Eine Änderung der Fluoreszenzintensität des Donors oder Akzeptors kann auch als Änderung eines Verhältnisses von Donor- und/oder Akzeptorfluoreszenzintensität nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann eine Änderung der Fluoreszenzintensität nachgewiesen werden als a) Erhö­ hung des Verhältnisses der Donorfluorophor-Fluoreszenz nach der Linearisierung oder Entfaltung der Sekundärstruktur und der Donorfluorophor-Fluoreszenz im Detektoroligonucleotid vor der Linearisierung oder Entfaltung oder b) Senkung des Verhältnisses der Akzeptorfarbstoff-Fluoreszenz nach der Linearisierung oder Entfaltung und der Akzeptorfarbstoff-Fluoreszenz im Detektoroligonucleotid vor der Linearisierung oder Entfaltung.

Daraus geht hervor, dass die Detektoroligonucleotide der Erfindung neben der SDA auch zur Verwendung als Signalprimer bei anderen Primerverlängerungs- Amplifikationsverfahren (z. B. PCR, 3SR, TMA oder NASBA) angepasst werden können. Zum Beispiel können die Verfahren zur Verwendung bei der PCR ange­ passt werden, indem man PCR-Amplifikationsprimer bei der PCR verwendet sowie eine strangverdrängende DNA-Polymerase, der die 5'→3'-Exonuclease- Aktivität fehlt (z. B. Sequencing Grade Taq von Promega oder exo⁻ Vent oder exo⁻ Deep Vent von New England BioLabs). Die Detektoroligonucleotid-Signalprimer hybridisieren mit dem Target stromabwärts von den PCR-Amplifikationsprimern, werden verdrängt und doppelsträngig gemacht, im wesentlichen so, wie es für die SDA beschrieben wurde. Bei der PCR kann gegebenenfalls jedes beliebige RERS zur Verwendung im Detektor-Oligonucleotid ausgewählt werden, da typi­ scherweise keine modifizierten Desoxynucleosidtriphosphate vorhanden sind, die anstelle einer Spaltung des RERS einen Einzelstrangbruch induzieren könnten. Da thermische Cyclen ein Merkmal der Amplifikation durch PCR sind, wird die Restriktionsendonuclease für die Endpunktbestimmung der Amplifikation vor­ zugsweise nach dem letzten Cyclus der Primerassoziation und -verlängerung bei niedriger Temperatur hinzugefügt. Während der Amplifikation könnte jedoch auch eine thermophile Restriktionsendonuclease vorhanden sein, die während der Hochtemperaturphasen der PCR-Reaktion aktiv bleibt, so dass man einen Echtzeitassay erhält. Wie bei SDA-Systemen reduziert die Trennung des Farb­ stoffpaars das Fluoreszenzquenchen, wobei eine Änderung eines Fluoreszenzpa­ rameters, wie der Intensität, als Hinweis auf die Amplifikation des Targets dient.

Die Fluoreszenzänderung, die aus der Entfaltung oder Linearisierung der Detek­ toroligonucleotide resultiert, kann an einem ausgewählten Endpunkt der Reakti­ on nachgewiesen werden. Da linearisierte Sekundärstrukturen jedoch gleichzeitig mit der Hybridisierung oder Primerverlängerung erzeugt werden, kann die Fluo­ reszenzänderung auch überwacht werden, während die Reaktion abläuft, d. h. in "Echtzeit". Dieses homogene Echtzeit-Assayformat kann verwendet werden, um halbquantitative oder quantitative Informationen über die ursprünglich vorhan­ dene Menge des Targets zu erhalten. Zum Beispiel ist die Geschwindigkeit, mit der sich die Fluoreszenzintensität während der Entfaltungs- oder Linearisierungs­ reaktion ändert (entweder als Teil der Targetamplifikation oder in Nachweisver­ fahren ohne Amplifikation), ein Hinweis auf die ursprünglichen Targetmengen. Als Ergebnis erreicht die Donorfluoreszenz schneller einen ausgewählten Schwel­ lenwert (d. h. kürzere Zeit bis zur Positivität), wenn mehr ursprüngliche Kopien der Targetsequenz vorhanden waren. Die Abnahme der Akzeptorfluoreszenz weist in ähnlicher Weise eine kürzere Zeit bis zur Positivität auf, welche nachge­ wiesen wird als die Zeit, die zum Erreichen eines ausgewählten Minimalwertes erforderlich ist. Außerdem ist die Geschwindigkeit der Änderung der Fluores­ zenzparameter im Verlaufe der Reaktion größer bei Proben, die größere An­ fangsmengen an Target enthalten, als bei Proben, die kleinere Anfangsmengen an Target enthalten (d. h. erhöhte Steigung der Fluoreszenzkurve). Diese oder andere Messungen, die in der Technik bekannt sind, können als Hinweis auf die Gegenwart des Targets oder als Hinweis auf eine Amplifikation des Targets vor­ genommen werden. Die Anfangsmenge an Target wird typischerweise durch Vergleich der experimentellen Ergebnisse mit Ergebnissen für bekannte Target­ mengen bestimmt.

Assays auf die Anwesenheit einer ausgewählten Targetsequenz gemäß den Ver­ fahren der Erfindung können in Lösung oder auf einer festen Phase durchgeführt werden. Homogene Echtzeit- oder Endpunktassays, bei denen das Detektoroli­ gonucleotid als Primer fungiert, werden typischerweise in Lösung durchgeführt. Hybridisierungsassays unter Verwendung der Detektoroligonucleotide der Erfin­ dung können ebenfalls in Lösung durchgeführt werden (z. B. als homogene Echt­ zeitassays), sind jedoch auch besonders gut für Festphasenassays für den Echt­ zeit- oder Endpunktsnachweis eines Targets geeignet. Bei einem Festphasenas­ say können Detektoroligonucleotide über interne oder terminale Marker unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren auf der festen Phase (z. B. Kügelchen, Membranen oder dem Reaktionsgefäß) immobilisiert werden. Zum Beispiel kann ein biotinmarkiertes Detektoroligonucleotid auf einer avidinmodifi­ zierten festen Phase immobilisiert werden, wo es eine Fluoreszenzänderung erzeugt, wenn es unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen dem Target ausgesetzt wird. Auf diese Weise erleichtert der Abfang des Targets die Abtren­ nung des Targets aus der Probe und erlaubt die Entfernung von Substanzen in der Probe, die den Nachweis des Signals oder andere Aspekte des Assays stören können. Ein Beispiel für ein Festphasensystem, das verwendet werden kann, ist eine elektronische Mikromatrix, d. h. ein aktives programmierbares elektroni­ sches Matrixhybridisierungssystem.

Eine vereinfachte Version des aktiven programmierbaren elektronischen Matrix­ hybridisierungssystems zur Verwendung mit dieser Erfindung wird wie folgt be­ schrieben. Im allgemeinen trägt ein Substrat eine Matrix von elektronisch adres­ sierbaren Mikroplätzen. Über den einzelnen Elektroden ist eine Permeations­ schicht angeordnet. Die Permeationsschicht erlaubt den Transport von relativ kleinen geladenen Entitäten durch die Schicht, verhindert jedoch, dass große geladene Entitäten, wie DNA, direkt mit den Elektroden in Kontakt kommen. Die Permeationsschicht vermeidet den elektrochemischen Abbau, der bei einem direkten Kontakt mit den Elektroden in der DNA erfolgen würde. Sie dient wei­ terhin dazu, die starke unspezifische Adsorption von DNA an Elektroden zu ver­ meiden. Über der Permeationsschicht befinden sich Befestigungsbereiche, die spezifische Bindungsstellen für Targetmaterialien liefern.

Im Betrieb umfasst ein Reservoir denjenigen Raum oberhalb der Befestigungsbe­ reiche, der die gewünschten (sowie unerwünschten) Materialien für den Nach­ weis, die Analyse oder Verwendung enthält. Geladene Entitäten, wie geladene DNA, befinden sich innerhalb des Reservoirs. In einem Aspekt umfasst das akti­ ve programmierbare Matrixsystem ein Verfahren zum Transportieren des gela­ denen Materials zu einem der spezifischen Mikroplätze. Wenn er aktiviert ist, erzeugt ein Mikroplatz den freifeldelektrophoretischen Transport jeder geladenen funktionalisierten spezifischen Bindungsentität zur Elektrode hin. Wenn man zum Beispiel eine Elektrode positiv machen würde und eine zweite Elektrode negativ, würden zwischen den beiden Elektroden elektrophoretische Kraftlinien verlaufen. Die Linien der elektrophoretischen Kraft bewirken den Transport von geladenen Bindungsentitäten, die eine negative Nettoladung tragen, zur positiven Elektrode hin. Geladene Materialien mit einer positiven Nettoladung bewegen sich unter der elektrophoretischen Kraft zur negativ geladenen Elektrode hin. Wenn die Bindungsentität mit der negativen Nettoladung, die funktionalisiert wurde, als Ergebnis ihrer Bewegung unter der elektrophoretischen Kraft mit der Befesti­ gungsschicht in Kontakt kommt, wird die funktionalisierte spezifische Bindungs­ entität kovalent an die Befestigungsschicht gebunden, die der ersten Elektrode entspricht.

Elektrophoretischer Transport resultiert allgemein aus dem Anlegen einer Span­ nung, die ausreicht, um eine Elektrolyse und einen Ionentransport innerhalb des Systems zu ermöglichen. Es resultiert elektrophoretische Mobilität, und ein Strom fließt durch das System, wie etwa durch Ionentransport durch die Elektro­ lytlösung. Auf diese Weise kann über den Stromfluss der Ionen ein vollständiger Stromkreis gebildet werden, wobei der Rest des Stromkreises durch die her­ kömmlichen elektronischen Komponenten, wie die Elektroden und die gesteuerte Schaltung, vervollständigt wird. Für eine wässrige Elektrolytlösung, die her­ kömmliches Material, wie Natriumchlorid, Natriumphosphat, Puffer und ionische Spezies, enthält, ist die Spannung, die eine Elektrolyse und einen Ionentransport induziert, zum Beispiel größer oder gleich ungefähr 1,2 Volt.

Es ist möglich, die Befestigungsschichten, die keiner Reaktion unterliegen, zu schützen, indem man ihre entsprechenden Elektroden negativ macht. Dies führt zu elektrophoretischen Kraftlinien, die aus solchen Befestigungsbereichen her­ vorkommen. Die elektrophoretischen Kraftlinien dienen dazu, negativ geladene Bindungsentitäten von der Nichtreaktanten-Befestigungsschicht weg und zur Befestigungsschicht, die der ersten Elektrode entspricht, hinzutreiben. Auf diese Weise wird um die Befestigungsschichten herum, von denen man wünscht, das sie zu diesem Zeitpunkt nichtreaktiv gegenüber den geladenen Molekülen sind, ein "Kraftfeld"-Schutz gebildet.

Ein in hohem Maße vorteilhaftes Ergebnis dieses Systems besteht darin, dass geladene Bindungsmaterialien in Bereichen in der Nachbarschaft der Signalbe­ festigungsschichten hochgradig konzentriert werden können. Wenn ein einzelner Mikroplatz zum Beispiel positiv geladen ist und die übrigen Mikroplätze negativ geladen sind, werden die Linien der elektrophoretischen Kraft einen Transport der Bindungsentitäten mit der negativen Nettoladung zu dem positiv geladenen Mikroplatz hin bewirken. Auf diese Weise kann ein Verfahren zum Konzentrieren und Umsetzen von Analyten oder Reaktanten an jedem speziellen Mikroplatz auf der Vorrichtung erreicht werden. Nach der Befestigung der spezifischen Bin­ dungsentitäten an der Befestigungsschicht kann die darunterliegende Mikro­ elektrode weiterhin in einem Gleichstrommodus betrieben werden. Dieses ein­ zigartige Merkmal erlaubt es, relativ verdünnte geladene Analyten oder Reaktan­ tenmoleküle, die sich frei in Lösung befinden, schnell zu jedem spezifischen Mikroplatz, der auf der entgegengesetzten Ladung wie die Analyten- oder Reak­ tantenmoleküle gehalten wird, zu transportieren, dort zu konzentrieren und seriell oder parallel umzusetzen. Diese Fähigkeit, verdünnte Analyten- oder Reaktantenmoleküle an ausgewählten Mikroplätzen zu konzentrieren, beschleu­ nigt die Reaktionsgeschwindigkeiten an diesen Mikroplätzen stark.

Nachdem die gewünschte Reaktion beendet ist, kann das Potential der Elektrode umgekehrt werden, so dass eine elektrophoretische Kraft in der Richtung entsteht, die der früheren anziehenden Kraft entgegengerichtet ist. Auf diese Weise können unspezifische Analyten oder nicht umgesetzte Moleküle von dem Mikroplatz ent­ fernt werden. Spezifische Analyten oder Reaktionsprodukte können von jedem Mikroplatz freigesetzt und für die weitere Analyse zu anderen Plätzen transportiert, an anderen adressierbaren Plätzen gespeichert oder vollständig aus dem System entfernt werden. Durch diese Entfernung oder Dekonzentration von Materialien durch Umkehrung des Feldes wird die Diskriminierungsfähigkeit des Systems er­ höht, da, dies zu einer Entfernung unspezifisch gebundener Materialien führt. Durch Steuerung der Menge der jetzt abstoßenden elektrophoretischen Kraft auf unspezi­ fisch gebundene Materialien auf der Befestigungsschicht kann eine elektronische Stringenzkontrolle erreicht werden. Indem man das elektrische Potential an der Elektrode anhebt, so dass ein ausreichendes Feld entsteht, um partiell hybridisierte DNA-Sequenzen zu entfernen und dadurch eine Identifizierung einzelner fehlge­ paarter Hybridisierungen zu erlauben, können Punktmutationen identifiziert wer­ den.

Operationen an den verschiedenen Befestigungsschichten können parallel oder seriell durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine Reaktion zuerst an einer ers­ ten Befestigungsschicht erfolgen, wobei man sich die gezeigten Potentiale zu Nutze macht. Das Potential an einer ersten Elektrode kann umgekehrt, d. h. negativ ge­ macht, werden, und das Potential an der benachbarten zweiten Elektrode kann positiv gemacht werden. Auf diese Weise erfolgt eine serielle Reaktion. Materialien, die nicht spezifisch an die erste Befestigungsschicht gebunden wurden, würden durch die elektrophoretische Kraft zur Befestigungsschicht transportiert. Auf diese Weise wird der Konzentrationsaspekt ausgenutzt, um hohe Konzentrationen an dieser speziellen Befestigungsschicht zu erhalten, die dann der positiven elek­ trophoretischen Kraft ausgesetzt ist. Als nächstes können die konzentrierten Mate­ rialien zu einer benachbarten oder einer anderen Befestigungsschicht bewegt wer­ den. Alternativ dazu kann der Schutz von mehreren Befestigungsschichten in dem Sinne aufgehoben werden, dass es ein elektrophoretisches Nettokraftfeld gibt, das aus der Elektrode hervorkommt und durch die Befestigungsschicht hinaus in das Reservoir verläuft. Durch Aufheben des Schutzes der mehrfachen Befestigungs­ schicht werden Multiplexreaktionen durchgeführt. Jede einzelne Stelle kann im wesentlichen dadurch als getrenntes biologisches "Reagenzglas" dienen, dass sich die besondere Umgebung, die durch eine gegebene Befestigungsschicht angespro­ chen wird, von den Umgebungen der anderen Befestigungsschichten unterscheiden kann.

In einer Ausführungsform enthält die Permeationsschicht Avidin, und einer der SDA-Primer enthält Biotin. Nach der Amplifikation werden die Amplikons elektro­ nisch auf der Matrix adressiert und binden an das Avidin. Dann werden eine oder mehrere markierte Detektorsonden hinzugefügt und mit den Amplikons hybridisie­ ren gelassen. Dann wird die Anwesenheit hybridisierter Detektorsonden nachge­ wiesen. In einer zweiten Ausführungsform werden eine oder mehrere Abfangson­ den so gestaltet, dass sie mit der amplifizierten Nucleinsäure hybridisieren. Jede Abfangsonde enthält Biotin und ist auf eine Matrix entweder gebunden oder elekt­ ronisch adressiert und gebunden, wobei die Permeationsschicht Avidin enthält. Dann werden die Amplikons elektronisch auf die Matrix adressiert und hybridisie­ ren mit den Abfangsonden. Dann werden eine oder mehrere markierte Detektor­ sonden hinzugefügt und mit den Amplikons hybridisieren gelassen. Dann wird die Anwesenheit hybridisierter Detektorsonden nachgewiesen.

Weitere Einzelheiten zu der elektronischen Mikromatrix und damit verbundenen Systemen sind beschrieben von Heller et al. (1997, US-Patent Nr. 5,605,662; 1997, US-Patent Nr. 5,682,957; 1997, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/12030) und Sosnowski et al. (1998, PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/10273), auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Außerdem sind Techniken, die SDA und elektronische Mikromatrizen verwenden, einschließlich mehrerer Assayformate in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung Serial No. 09/290,632, eingereicht am 12. April 1999, offenbart, worauf hier aus­ drücklich Bezug genommen wird. In einer Ausführungsform, die in dieser Anmel­ dung beschrieben ist, wird ein Sandwichassay verwendet, bei dem eine ein­ zelsträngige Abfangsonde elektronisch auf der Matrix abgeschieden wird und dazu dient, einen Strang eines geladenen Moleküls, wie einer Targetnucleinsäure oder eines Amplikons davon, abzufangen. Eine Vielzahl verschiedener Moleküle, wie Nucleinsäureabfangsonden, kann elektronisch auf verschiedenen Feldern der Mat­ rix abgeschieden werden. Vorzugsweise wird die Hybridisierung des Targetmole­ küls oder des Amplikons mit der Abfangsonde elektronisch durchgeführt. Nach dem Abfang des geladenen Moleküls an den Abfangstellen kann das abgefangene Mole­ kül mit einer markierten Reportersonde nachgewiesen werden, die an das abge­ fangene Molekül bindet.

In einer zweiten Ausführungsform, die in dieser Anmeldung beschrieben ist, wird auf der Mikromatrix eine elektronische Amplifikation durchgeführt. In dieser Aus­ führungsform wird die Targetnucleinsäure elektronisch in der Nähe verankerter Primer konzentriert, die sich an einer Abfangstelle befinden und bei einem SDA- oder anderen Amplifikationsverfahren verwendet werden. Elektronische Hybridisie­ rung wird verwendet, um die Matrizenmoleküle mit den verankerten SDA-Primern zu hybridisieren. Dann werden die Mikrochips mit einer SDA-Reaktionsmischung inkubiert, die die SDA-Komponenten außer der Matrize und den Amplifikationspri­ mern enthält. Nachdem die Reaktion abgebrochen wurde, werden die Produkte denaturiert, und der Mikrochip wird mit Reportersonden inkubiert, um die Anwe­ senheit von Targetnucleinsäure nachzuweisen. Diese Ausführungsformen zeigen, dass (a) die Amplifikation auf einer elektronischen Mikromatrix mit anschließender Analyse durchgeführt werden kann oder (b) die Amplifikation in Lösung durchge­ führt und dann die Analyse auf einer elektronischen Mikromatrix durchgeführt werden kann.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der hier beschrie­ benen Erfindung. Wie der Fachmann erkennen wird, sind verschiedene Änderungen und Modifikationen möglich, die im Umfang der beschriebenen Erfindung liegen.

Beispiel 1 Analyse der Primergestaltung bei SDA-Amplifikationen 1. Materialien

K₂HPO₄ (pH 7,6), MgOAc, Desoxynucleotid-5'-triphosphat (dATP, dGTP, dTTP), 2'- Desoxycytosin-5'-O-(1-thiotriphosphat) (dCTPαS), Trehalose, BSA, Restriktionsen­ zym BsoBI, exo^-Bst-DNA-Polymerase, genomische DNA von Yersinia enterocolitica (Typ 3, Stamm 89A7489) und genomische DNA aus humaner Placenta wurden großzügigerweise von Becton Dickinson (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD, USA) bereitgestellt. Genomische DNA aus Kalbsthymus wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. Alle Oligonucleotide wurden von Synthetic Genetics (San Diego, CA, USA) synthetisiert und sind in Tabelle 1 zusammenge­ fasst. Die APs wurden durch PAGE gereinigt, und andere Oligonucleotide wurden durch HPLC gereinigt. Reporteroligonucleotidsonden wurden mit einem 5'-Amin synthetisiert und bei Nanogen mit Bodipy Texas Red (BTR) konjugiert. Abfangson­ den wurden am 5'-Ende biotinyliert, Nichtdenaturierende Gele (10% Acrylamid- TBE-Gel) wurden von Novex (San Diego, CA, USA) bezogen. Der DNA- Molekulargewichtsmarker VIII wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA) bezogen. Die Micro-Bio-Spin-Chromatographiesäule wurde von Bio-Rad (Her­ cules, CA, USA) bezogen. Oligo Primer Analysis Software Version 5.0 wurde von Wojcinch Rychlik National Biosciences (Plymouth, MN) bezogen.

Tabelle 1

Oligonucleotide

AP: Amplifikationsprimer; BP: Bumperprimer; C: Abfangsonde; R: Reportersonde; S: Sense; A: Antisense; die BsoBI-Erkennungsstelle ist halbfett gedruckt.

2. Strangverdrängungs-Amplifikationsreaktionen

Genomische DNA von Y. enterocolitica wurde seriell in 100 ng/µl genomischer DNA aus Kalbsthymus oder genomischer DNA aus humaner Placenta verdünnt. Die Endkonzentration von fremdgenomischer DNA betrug 0,5 µg pro Reaktion. Die Amplifikationsreaktionen wurden unter den von Spargo et al. (1993, Mol. Cell. Probes 10: 247-256) beschriebenen Bedingungen mit einigen Modifikationen durchgeführt. SDA-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt mit einer Endkonzentration von 9,75 mM MgOAc, jeweils 1,4 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTPαS, 35 mM K₂HPO₄, 4 µg BSA, 1,8% (Gew./V) Trehalose, jeweils 500 nM APs, jeweils 50 nM BPs, 1,8 E BsoBI und 3,8 E exo^-Bst. Vor der Zugabe des Enzymgemischs (10 µl, die 1,8 E BsoBI, 3,8 E exo^-Bst, 9% (Gew./V) Trehalo­ se, 2 µg BSA und 87,5 mM K₂HPO_{4< 24793 00070 552 001000280000000200012000285912468200040 0002010123183 00004 24674/SUB< enthielten) wurde das unvollständige Reakti­ onsgemisch (40 µl), das verschiedene Mengen genomischer Target-DNA enthielt, 5 min lang auf 95°C erhitzt, um die Matrize zu denaturieren, und anschließend 2 min lang auf 60°C erhitzt, um die Primer mit den Matrizen zu assoziieren. Nach der Zugabe des Enzymgemischs wurde das Reaktionsgemisch 30 min lang bei 60°C inkubiert und dann 1-2 min lang auf Eis gehalten, um die Reaktion abzubre­ chen. 3. Nachweis von SDA-Produkten Nach der SDA wurden 5 µl der Amplifikationsreaktion auf einem 10%igen denatu­ rierenden Gel laufen gelassen und durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Spezifität der Produkte wurde unter Verwendung von elektronischer Hybridisierung mit biotinylierten Abfangsonden nachgewiesen, die sich auf einer Mikroelektrodenmatrix befanden (Sosnowski et al., 1997, Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 94: 1119-1123). Für den Mikroelektrodenmatrixassay (Chipassay) wurde die Probe zuerst entsalzt, wobei Micro-Bio-Spin-Chromatographiesäulen nach der im Handbuch des Herstellers beschriebenen Vorgehensweise verwendet wurden. L- Histidin (50 mM) wurde als Austauschpuffer verwendet. Ein Aliquot der entsalzten Probe (20 µl) wurde zur Denaturierung der DNA 5 min lang in siedendem Wasser erhitzt und bis zur Verwendung auf Eis gelegt. Die denaturierte Probe wurde elekt­ ronisch zu vorbestimmten Feldern adressiert, und die Felder wurden mit 50 mM L- Histidin gewaschen. In 1 × STE gelöste, BTR-markierte Reportersonde wurde bei 22°C 5 min lang mit den Targets hybridisiert. Nach dem Waschen mit STE wurde die Kartusche gescannt, und die Ergebnisse wurden aufgezeichnet. 4. Ergebnisse Der in diesem Beispiel verwendete ursprüngliche yst-Primersatz (ystAP1S, ystAP1A, ystBP1S und ystBP1A; Tabelle 1) ist einer der empfindlichsten Primersätze, die zur Verwendung im Standard-SDA-Verfahren gestaltet wurden. Es gab keine vorher­ sagbaren 3'-Endwechselwirkungen zwischen diesen beiden APs. Sowohl der ur­ sprüngliche Primersatz als auch die neu gestalteten Primersätze amplifizieren einen ähnlichen Targetbereich, um die Variation zu minimieren, die durch das Amplifizie­ ren verschiedener Targetsequenzen verursacht werden kann. Dieselben Reporter- und Abfangsonden wurden für Chipassays verwendet. Wenn APs nach dem hier beschriebenen Verfahren gestaltet wurden, beobachtete man vermehrte targetspe­ zifische Amplifikationen und verminderte matrizenunabhängige, unspezifische Amplifikationen im Vergleich zu Ergebnissen vom ursprünglichen Primersatz (Fig. 3). Um zu zeigen, dass die erhöhte Empfindlichkeit und Spezifität auf die Verwen­ dung neuer APs und nicht auf die Verwendung neuer BPs zurückzuführen waren, wurde zuerst einer der ursprünglichen BPs durch einen der neuen BPs ersetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass es keine wesentlichen Unterschiede in der SDA- Produktausbeute zwischen diesen beiden BPs gab (Fig. 2, 3* im Vergleich zu 1*). Um zu sehen, ob die beobachtete Verbesserung auf die Längenunterschiede der amplifizierten Produkte zurückzuführen waren, wurde das Verfahren durchgeführt, indem man einen der ursprünglichen BPs und APs durch einen der neuen BPs bzw. APs ersetzte. Amplifizierte Produkte aus dieser Substitution haben genau die glei­ chen Längen wie die ursprünglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass mit dem substi­ tuierten Primersatz mehr targetspezifische Produkte erzeugt wurden (Fig. 2, 2* im Vergleich zu 1*). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse sind die erhöhte Empfindlichkeit, Spezifität und Ausbeute anscheinend auf die Verwendung des neuen Schemas für die AP-Gestaltung zurückzuführen. Da der 3'-Teil von APs an Primerwechselwirkungen und exponentiellen PD-Ampli­ fikationen beteiligt ist, war es wünschenswert, die Länge dieses Teils zu minimie­ ren und so die Wahrscheinlichkeit von Primerwechselwirkungen und unspezifischen PD-Amplifikationen zu reduzieren. Es wurden APs gestaltet, die dieselbe Sequenz 5' von der BsoBI-Erkennungssequenz aufweisen, aber unterschiedliche Längen an den 3'-Enden haben. Die Ergebnisse zeigten, dass effiziente targetspezifische Amplifikationen ab einer Länge des 3'-Endteils von 12 bis 9 bp erhalten wurden (Fig. 3). Die Effizienz war vermindert, wenn APs mit einer Länge des 3'-Endteils von 6 bp verwendet wurden. Es war nicht überraschend, dass die Ampifikationsef­ fizienz bei dem Primersatz ystAP3S und ystAP3A höher war als bei dem Primersatz ystAP2S und ystAP2A, da es eine 2-bp-Primer-3'-Endwechselwirkung zwischen ystAP2S und ystAP2A gibt und es laut Vorhersage durch die Oligo-Software keine vorhersagbare 3'-Endwechselwirkung zwischen ystAP3S und ystAP3A gibt. SDA unter Verwendung von Primern, die mit dem oben beschriebenen Verfahren gestaltet wurden, wurde auch mit SDA verglichen, bei dem Primer mit Standard­ gestaltung für das sodB-Gen von Campylobacter, das shigaartige Toxin I von E. coli und invA von Salmonella verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse waren den hier gezeigten Ergebnissen sehr ähnlich. Der zeitliche Verlauf der SDA- Reaktion wurde ebenfalls getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass ausgehend von 10 Targetkopien nach nur 10 min SDA bei 60°C nachweisbare targetspezifische Amplifikationsprodukte erhalten wurden. Die Produkte erreichten ihr Maximum in 25-30 min (Fig. 4). Nachweisbare targetspezifische Produkte wurden auch ausge­ hend von 5 Kopien Targetmatrize erhalten. Genomische DNA aus Kalbsthymus oder genomische DNA aus humaner Placenta wurden als Fremd-DNA verwendet, um klinische Proben nachzubilden. Es gab eine starke Bande vom Amplifikati­ onsprodukt bei etwa 115 bp bei der negativen Kontrolle ohne Matrize, wenn ge­ nomische DNA aus Kalbsthymus in dieser negativen Kontrolle vorhanden war (Fig. 4A). Diese Bande trat auch auf, wenn eine geringere Targetkopienzahl mit dem Primersatz ystAP3S und ystAP3A verwendet wurde (Fig. 3). Die Ergebnisse von Chipassays zeigten, dass das Produkt von dieser Bande den targetspezifischen Nachweis nicht störte (Fig. 4B). Vermutlich stammte das Produkt von unspezifi­ schen Wechselwirkungen und Amplifikationen zwischen Hintergrund-DNA und dem verwendeten Primersatz. Gemäß der obigen Beschreibung wurden Primer gestaltet, die außerdem eine nichttargetspezifische Sequenz 3' von der BsoBI-Stelle zwischen der BsoBI-Stelle und der 3'-targetspezifischen Sequenz enthielten. Die Amplifikationsprimer ystAP5S und ystAP5A enthielten 6 Nucleotide nichttargetspezifische Sequenz und 6 Nucleo­ tide targetspezifische Sequenz 3' von der BsoBI-Stelle. Diese Primer haben die folgenden Sequenzen, wobei die BsoBI-Erkennungsstelle halbfett gedruckt ist, die statistische Sequenz unterstrichen ist und die targetspezifische (bindende) Se­ quenz kursiv gedruckt ist: ystAP5S-AATgCTgTCTTCATTTggAgC CTCgggAggTCCAACAgT (SEQ ID NO: 14) ystAP5A-CggCTggTggCAACggAggATCTCgggTgCTCgTgTATA (SEQ ID NO : 15) SDA unter Verwendung dieser Amplifikationsprimer mit Bumperprimern (ystBP2S und ystBP2A) wurde durchgeführt, und die Ergebnisse sind in den Fig. 5A (Gelelektrophorese) und 5B (Chipnachweis) gezeigt. Im Vergleich zu SDA unter Verwendung von Amplifikationsprimern ohne die 3'-nichttargetspezifische Sequenz zeigte sich, dass bei jeder SDA-Reaktion dieselben Ergebnisse erhalten wurden. Beispiel 2 Multiplex-DNA-Amplifikation und -Nachweis 1. Materialien K2HPO4 (pH 7,6), MgOAc, dATP, dGTP, dTTP, 2'-Desoxycytosin-5'-O-(1-thio­ triphosphat) (dCTPαS), Trehalose, BSA, Restriktionsenzym BsoBI, DNA-Polymerase exo-Bst, genomische DNA von Yersinia enterocolitica (Typ 3, Stamm 89A7489), genomische DNA von Salmonella enterica (ATCC 10749), genomische DNA von E. coli (ATCC 43890) und genomische DNA aus humaner Placenta wurden großzügi­ gerweise von Becton Dickinson (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD, USA) bereitgestellt. Oligonucleotide wurden von Synthetic Genetics (San Die­ go, CA, USA) synthetisiert und sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Amplifikati­ onsprimer (APs) wurden durch PAGE gereinigt, und andere Oligonucleotide wurden durch HPLC gereinigt. Reportersonden wurden mit einem 5'-Amin synthetisiert und mit Bodipy Texas Red (BTR) konjugiert. Abfangsonden wurden am 5'-Ende biotiny­ liert. Micro-Bio-Spin-Chromatographiesäulen wurden von Bio-Rad (Hercules, CA, USA) bezogen. Nichtdenaturierende Gele (10% Acrylamid-TBE-Gele) wurden von Novex (San Diego, CA, USA) bezogen. Der DNA-Molekulargewichtsmarker VIII wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA) bezogen. AP: Amplifikationsprimer; BP: Bumperprimer; C: Abfangsonde; R: Reportersonde; S: Sense; A: Antisense; die BsoBI-Erkennungsstelle ist halbfett gedruckt. 2. Strangverdrängungsamplifikation SDA-Amplifikationsreaktionen wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Be­ dingungen durchgeführt. Kurz gesagt, die Standard-SDA-Reaktion wurde in einem Volumen von 50 µl durchgeführt mit einer Endkonzentration von 9,75 mM MgOAc, jeweils 1,4 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTPαS, 35 mM K2HPO4 (pH 7,6), 4 µg BSA, 1,8% (Gew./V) Trehalose, 500 nM von jedem AP, 50 nM von jedem Bumperprimer (BP), 1,8 E BsoBI, 3,8 E exo^-Bst und unterschiedliche Mengen genomischer Target- DNA. Die Konzentration der Target-DNA wurde bestimmt, indem man die Extinkti­ on bei A260 maß, und die DNA wurde in 100 ng/µl genomischer DNA aus humaner Placenta verdünnt. Bei jeder SDA-Reaktion wurde genomische DNA aus humaner Placenta (0,5 µg) als fremdgenomische DNA verwendet, um klinische Proben nach­ zubilden. Vor der Zugabe des Enzymgemischs (10 µl, die 1,8 E BsoBI, 3,8 E exo⁻ ^-Bst, 9% (Gew./V) Trehalose, 2 µg BSA und 87,5 mM K2HPO4 enthielten) wurde das unvollständige Reaktionsgemisch (40 µl, die alle anderen SDA-Komponenten ent­ hielten), 5 min lang auf 95°C erhitzt, um die Matrizen zu denaturieren, und an­ schließend 2 min lang bei 60°C inkubiert, um die Primer mit den Matrizen zu asso­ ziieren. Dann wurde das auf Raumtemperatur befindliche Enzymgemisch zu dem unvollständigen Reaktionsgemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min lang bei 60°C inkubiert und dann 1-2 min lang auf Eis gehalten, um die Reaktion abzubrechen. 3. Nachweis von SDA-Produkten Nach der SDA-Reaktion wurden die SDA-Produkte nach Elektrophorese auf einem nichtdenaturierenden Acrylamidgel durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht, wobei die endgültige Bestätigung durch elektronische Hybridisierung mit einer Mikroelektrodenmatrix von Nanogen erfolgte, auf die biotinylierten targetspe­ zifischen Abfangsonden immobilisiert waren, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Eine nichttargetspezifische biotinylierte Sonde (femA-Gen von Staphylococcus aureus) wurde ebenfalls als negative Kontrolle auf der Matrix immobilisiert. Für den Chipassay wurden Aliquote von SDA-Proben zuerst entsalzt, wobei Micro-Bio- Spin-Chromatographiesäulen nach der im Handbuch des Herstellers beschriebenen Vorgehensweise verwendet wurden. L-Histidin (50 mM) wurde als Austauschpuffer verwendet. Die entsalzte Probe (20 µl) wurde zur Denaturierung der DNA 5 min lang in siedendem Wasser erhitzt und bis zur Verwendung auf Eis gelegt. Die dena­ turierten Proben wurde elektronisch 30 s lang mit 400 nA/Feld zu vorbestimmten Feldern adressiert. BTR-markierte Reportersonde (500 nM in 1 × STE) wurde zu der Kartusche gegeben und bei 22°C 5 min lang mit DNA-Proben hybridisiert. Nach mehrmaligem Waschen mit 0,2 × STE wurde die Kartusche nach Fluoreszenz ges­ cannt, und die Ergebnisse wurden aufgezeichnet. 4. Ergebnisse Multiplex-Amplifikation ist eine Strategie, um gleichzeitig zwei oder mehr Target­ sequenzen zu amplifizieren. Jede Amplifikationsreaktion ist spezifisch, aber in einer einzigen Reaktionsmischung wird mehr als ein Target amplifiziert. Bei der Multiplex-Amplifikation ist die Amplifikationseffizienz jeder Matrize verschieden, und einige Produkte werden mit höherer Effizienz erzeugt als andere. Es ist schwierig, Multiplex-Matrizen zu coamplifizieren, ohne einige der Bedingungen anzupassen, insbesondere wenn die eingesetzten Targetkopienzahlen klein sind (Chamberlain & Chamberlain, 1994, in The Polymerase Chain Reaction, Multis et al. (Hrsg.), Birkhäuser, Boston, S. 38-46). Eines der effektivsten Verfahren besteht darin, die Konzentration jedes Primersatzes einzustellen. Zuerst wurde die Amplifi­ kationseffizienz jeder Matrize in Triplex-Primersätzen mit den Standard-Primer­ konzentrationen getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass SLTI am effizientesten amplifiziert wurde, und invA am wenigsten effizient (Fig. 5). Es gibt mehrere mögliche Gründe für die Effizienzvariationen. Erstens ist die Schmelztemperatur (Tm) für jeden Primersatz unterschiedlich. Zweitens ist es möglich, dass Bst-DNA- Polymerase dCsTP nicht so effizient einbaut wie natives dCTP, so dass ein unter­ schiedlicher Prozentanteil von C in den Matrizen zu einer unterschiedlichen Amplifi­ kationseffizienz führt. Drittens steht die Effizienz einer SDA in engem Zusammen­ hang mit der Größe des Amplikons; die Amplifikationseffizienz nimmt für jede Zunahme der Targetlänge von 50 bp um das 5- bis 100fache ab (Walker, 1993, PCR-Verfahren und Anwendungen 3: 1-6). Die Länge des Amplikons ohne Einzel­ strangbruch beträgt 93 bp für SLTI, 96 bp für yst und 103 bp für invA. Viertens sind die Primerwechselwirkungen für jeden einzelnen Primersatz unterschiedlich. Auf der Basis der SDA-Ergebnisse einer Monoplex-Amplifikation in Triplex- Primersätzen wurden mehrere Primerkonzentrationen für die Coamplifikationen getestet, indem man die Primerkonzentration für invA unverändert ließ und die Primerkonzentrationen für yst und SLTI änderte. Eine äquivalente Coamplifikation von zwei oder drei Targets wurde am besten erreicht, wenn die AP/BP- Konzentrationen auf 400 nM/40 nM für yst und auf 200 nM/20 nM für SLTI redu­ ziert wurden. Andere Reaktionsparameter wurden nicht angepasst, da wir mit diesen Reaktionsparametern konsistente Ergebnisse erhielten, um mehrere ver­ schiedene Targetgene von verschiedenen Organismen von Bakterien bis zum Men­ schen zu amplifizieren. Mit den oben beschriebenen Primerkonzentrationen wurden alle drei Matrizen sehr gut coamplifiziert, und targetspezifische Signale wurden bereits für 10 Kopien des eingesetzten Targets nachgewiesen (Fig. 7). Außerdem wurde festgestellt, dass bei Triplex-Primersätzen die Fluoreszenzsignale für jedes Target bei Coamplifikationen mit drei Matrizen stärker waren als bei Coamplifikati­ onen mit zwei Matrizen. Anhand der Gelelektrophorese zeigte sich, dass es bei der Amplifikationsreaktion mit drei Matrizen weniger Hintergrundbanden gab als bei der Amplifikationsreaktion mit zwei Matrizen. Der Grund dafür ist vermutlich, dass bei den Amplifikationsreaktionen mit drei Matrizen mehr Primer für die targetspezi­ fischen Amplifikationen verwendet werden und daher weniger freie Primer für Primerwechselwirkungen und PD-Amplifikationen übrig blieben. Wenn zwei Matri­ zen in Triplex-Primersätzen amplifiziert wurden, blieben mehr freie Primer für eine unspezifische Amplifikation übrig. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es durch die Gestaltung von Primern zur Vermeidung von Primerwechselwirkungen und durch die Anpassung der Pri­ merkonzentrationen möglich ist, drei oder noch mehr Targetsequenzen bei der SDA zu amplifizieren und ohne Einstellung anderer Reaktionsparameter eine ähnli­ che Empfindlichkeit wie bei der Multiplex-PCR zu erreichen. Beispiel 3 Erzeugung von ssDNA durch SDA 1. Materialien K2HPO4 (pH 7,6), MgOAc, dATP, dGTP, dTTP, 2'-Desoxycytosin-5'-O-(1-thio­ triphosphat) (dCTPαS), Trehalose, BSA, Restriktionsenzym BsoBI, DNA-Polymerase exo^-Bst, genomische DNA von Yersinia enterocolitica und genomische DNA aus humaner Placenta wurden großzügigerweise von Becton Dickinson (Becton Dickin­ son Microbiology Systems, Sparks, MD, USA) bereitgestellt. Primer wurden mit den hier beschriebenen Verfahren gestaltet. Oligonucleotide wurden von Synthetic Genetics (San Diego, CA, USA) synthetisiert und sind in Tabelle 3 zusammenge­ fasst. Alle Amplifikationsprimer wurden durch PAGE gereinigt, und andere Oligo­ nucleotide wurden durch HPLC gereinigt. Reportersonden wurden mit einem 5'- Amin synthetisiert und mit Bodipy Texas Red (BTR) konjugiert. Abfangsonden wurden am 5'-Ende biotinyliert. Micro-Bio-Spin-Chromatographiesäulen wurden von Bio-Rad (Hercules, CA, USA) bezogen. AP: Amplifikationsprimer; BP: Bumperprimer; C: Abfangsonde; R: Reportersonde; S: Sense; A: Antisense; die BsoBI-Erkennungsstelle ist halbfett gedruckt. 2. Strangverdrängungs-Amplifikationsreaktionen Die Amplifikationsreaktionen wurden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedin­ gungen durchgeführt. Kurz gesagt, die SDA-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl durchgeführt mit einer Endkonzentration von 9,75 mM MgOAc, jeweils 1,4 mM dATP, dGTP, dTTP und dCTPαS, 35 mM K2HPO4 (pH 7,6), 4 µg BSA, 1,8% (Gew./V) Trehalose, 500 nM Amplifikationsprimer 1 (ystAP3S), 250 nM Amplifikati­ onsprimer 2 (ystAP3A), 250 nM blockierender Primer (ystAP4A), jeweils 50 nM Bumperprimer, 1,8 E Restriktionsenzym BsoBI, 3,8 E exo^-Bst-DNA-Polymerase und verschiedene Kopien von genomischer DNA von Y. enterocolitica, die in 100 ng/µl genomischer DNA aus humaner Placenta verdünnt war. Die Endkonzentration an genomischer DNA aus humaner Placenta betrug 0,5 µg pro Reaktion. Diese Kom­ ponenten wurden in zwei Mischungen aufgeteilt. Mischung 1 (40 µl, die MgOAc, dNTPs, Matrizen, Primer, die Hälfte des BSA sowie K2HPO4 enthielten) wurde 5 min lang auf 95°C erhitzt, um die Matrize zu denaturieren, und anschließend 2 min lang auf 60°C erhitzt, um die Primer mit den Matrizen zu assoziieren; dann wur­ den 10 µl Mischung 2 (die die übrigen SDA-Komponenten enthielt) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min lang bei 60°C inkubiert und dann 1-2 min lang auf Eis gehalten, um die Reaktion abzubrechen. 3. Nachweis von SDA-Produkten SDA-Produkte wurden unter Verwendung von passiver oder elektronischer Hybridi­ sierung mit auf Mikroelektrodenmatrizen befindlichen biotinylierten Abfangsonden nachgewiesen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Kurz gesagt, die biotinmarkier­ te targetspezifische Abfangoligonucleotidsonde und die nichttargetspezifische Son­ de wurden elektronisch zu vorbestimmten Feldern adressiert. Aliquote von SDA- Proben wurden entsalzt, wobei Micro-Bio-Spin-Chromatographiesäulen nach der im Handbuch des Herstellers beschriebenen Vorgehensweise verwendet wurden. L- Histidin (50 mM) wurde als Austauschpuffer verwendet. Für die passive Target­ hybridisierung wurden nicht entsalzte, nicht denaturierte SDA-Proben (20 µl) in die Kartusche geladen und 20 min lang bei 37°C passiv mit Sonden hybridisiert. Für die elektronische Hybridisierung wurden entsalzte Proben zuerst durch 5 min Erhit­ zen in siedendem Wasser denaturiert. Die Proben wurden elektronisch zu vorbe­ stimmten Feldern adressiert. Die Felder wurden mit 50 mM L-Histidin gewaschen. BTR-markierte Reportersonde wurde passiv mit der DNA hybridisiert. Nach Wa­ schen mit STE wurde die Kartusche nach Fluoreszenz gescannt, und die Ergebnisse wurden aufgezeichnet. 4. Ergebnisse Wenn ssDNA erzeugt wurde, sollten Signale nur dann nachgewiesen werden, wenn für einen einzelnen Strang der amplifizierten DNA spezifische Reporter- und Ab­ fangsonden verwendet wurden, um SDA-Produkte mit passiver Hybridisierung nachzuweisen. Es sollten keine Signale nachgewiesen werden, wenn Reporter- und Abfangsonde für einen anderen Strang verwendet wurden. Das in diesem Beispiel beschriebene Experiment war so gestaltet, dass Sense-ssDNA entstand. Die Er­ gebnisse zeigten, dass Signale nachgewiesen wurden, wenn Antisense-Reporter­ sonde und Antisense-Abfangsonde verwendet wurden (Fig. 8A). Ausgehend von Sense-Reportersonde und Sense-Abfangsonde wurden keine Signale nachgewie­ sen. Diese Ergebnisse zeigten, dass nach diesem Verfahren ssDNA erhalten wurde. Schwache Signale wurden auch ausgehend von regulärer SDA mit einer eingesetz­ ten Targetkopienzahl von 10² nachgewiesen (Fig. 8A). Vermutlich waren die aus­ gehend von der regulären SDA gefundenen schwachen Signale auf eine leicht ungleichmäßige Amplifikation der beiden Stränge zurückzuführen. Die elektroni­ sche Hybridisierung wird durch Salzkonzentrationen in Proben beeinflusst. Für die elektronische Hybridisierung ist eine Entsalzung der Probe erforderlich. Wenn bei der elektronischen Hybridisierung entsalzte Proben verwendet wurden, waren die Signale stärker im Vergleich zu den Ergebnissen der passiven Hybridisierung (Fig. 8B); dies bedeutet, dass ein Teil der amplifizierten DNA in doppelsträngiger Form vorlag, obwohl die absoluten Signalzahlen wegen unterschiedlicher Kartuschen und unterschiedlicher Hybridisierungsbedingungen zuweilen irreführend sein können. Selbst bei elektronischer Hybridisierung waren ausgehend von asymmetrischen SDA-Produkten erhaltene Signale stärker als die ausgehend von regulären SDA- Produkten erhaltenen Signale, da unter unseren Hybridisierungsbedingungen ein bestimmter Prozentanteil der denaturierten DNA zurück zu dsDNA assoziiert und bei asymmetrischer SDA weniger dsDNA erzeugt wurde. Unter Verwendung der­ selben Prinzipien zur Erzeugung von ssDNA für den Sense-Strang des yst-Gens und des E.-coli-SLTI-Gens wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass dieses Beispiel ein einfaches SDA- Verfahren zur Herstellung von ssDNA beschreibt. Eine Optimierung von Bedingun­ gen für individuelle DNA-Matrizen war nicht erforderlich. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um nachweisbare Mengen von ssDNA für einen Chipassay zu erzeugen. Dieses Verfahren liefert mehr Informationen, um ein total integriertes Instrument zu erreichen, das zur Durchführung von Amplifikation und Nachweis befähigt ist. Beispiel 4 Primer für die SSDA-Amplifikation Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Primer für das sodB-Gen von Campylo­ bacter, das Gen für das shigaartige Toxin II (SLTII) von E. coli und das ipaH-Gen von Shigella gestaltet. Diese Primer sind in Tabelle 4 aufgeführt. Unter Verwen­ dung dieser Primer wurden erfolgreiche SDA-Amplifikationen durchgeführt. AP: Amplifikationsprimer; BP: Bumperprimer; C: Abfangsonde; R: Reportersonde; S: Sense; A: Antisense; die BsoBI-Erkennungsstelle ist halbfett gedruckt.}

Claims (24)

1. Oligonucleotid, das sich für eine Primerverlängerungsreaktion eignet und eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'-targetbindende Sequenz aufweist.

2. Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei die 5'-targetbindende Sequenz 1 Nucleotid bis 50 Nucleotide umfasst.

3. Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei die 3'-targetbindende Sequenz 5 Nucleotide bis 30 Nucleotide umfasst.

4. Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei die nichttargetbindende Sequenz 1 Nucleotid bis 30 Nucleotide umfasst.

5. Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Primerverlängerungsreaktion eine Strangverdrängungsamplifikation ist und die nichttargetbindende Se­ quenz eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym ist, in der während der Strangverdrängungsamplifikation durch ein Restriktionsenzym ein Ein­ zelstrangbruch erzeugt wird.

6. Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei 1 Nucleotid bis 10 Nucleotide in der 3'-targetbindenden Sequenz Fehlpaarungen sind.

7. Paar von Amplifikationsprimern, umfassend:

• a) einen ersten Primer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nicht­ targetbindende Sequenz und eine 3'-targetbindende Sequenz um­ fasst; und
• b) einen zweiten Primer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'-targetbindende Sequenz umfasst.

8. Kit, umfassend:

• a) das Paar von Amplifikationsprimern gemäß Anspruch 7; und
• b) ein oder mehrere Detektoren, die in der Lage sind, ein amplifiziertes Produkt nachzuweisen.

9. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Target­ nucleinsäure in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte um­ fasst:

• a) Behandeln der Probe mit einem Paar von Nucleinsäureprimern in einer Primerverlängerungsreaktion, wobei ein erster Primer eine 5'- targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'-targetbindende Sequenz umfasst und ein zweiter Primer eine 5'- targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'-targetbindende Sequenz umfasst; und
• b) Nachweisen eines gegebenenfalls vorhandenen amplifizierten Nuclein­ säureproduktes; wobei der Nachweis des amplifizierten Produkts die Anwesenheit der Tar­ getnucleinsäure anzeigt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die 3'-targetbindenden Sequenzen Fehlpaarungen umfassen.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Primerverlängerungsreaktion eine Strangverdrängungsamplifikation ist und die nichttargetbindende Sequenz eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym ist, in der während der Strangverdrängungsamplifikation durch ein Restriktionsenzym ein Einzel­ strangbruch erzeugt wird.

12. Verfahren zum Amplifizieren einer Targetnucleinsäuresequenz einer Tar­ getnucleinsäure, umfassend:

• a) Hybridisieren folgender Substanzen mit der Nucleinsäure:
  • 1. ein erster Amplifikationsprimer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'- targetbindende Sequenz umfasst; und
  • 2. ein zweiter Amplifikationsprimer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'- targetbindende Sequenz umfasst; und
• b) Verlängern des hybridisierten ersten und zweiten Amplifikationspri­ mers an der Targetnucleinsäuresequenz in einer Primerverlänge­ rungsreaktion, wodurch die Targetnucleinsäuresequenz amplifiziert wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die 3'-targetbindenden Sequenzen Fehlpaarungen umfassen.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12, das weiterhin das Nachweisen der ampüfi­ zierten Targetnucleinsäure durch Hybridisierung mit einer Detektorsonde umfasst.

15. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Primerverlängerungsreaktion eine Strangverdrängungsamplifikation ist und die nichttargetbindende Sequenz eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym ist, in der während der Strangverdrängungsamplifikation durch ein Restriktionsenzym ein Einzel­ strangbruch erzeugt wird.

16. Verfahren zur Erzeugung von einzelsträngiger DNA in einer Primerverlän­ gerungsreaktion, umfassend:

• a) Hybridisieren folgender Substanzen mit der Nucleinsäure:
  • 1. ein erster Amplifikationsprimer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'- targetbindende Sequenz umfasst; und
  • 2. ein zweiter Amplifikationsprimer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'- targetbindende Sequenz umfasst, wobei die 3'-targetbindende Sequenz aus 2 bis 7 Nucleotiden der 3'-targetbindenden Se­ quenz des ersten Primers besteht; und
  • 3. ein dritter Amplifikationsprimer, der eine 5'-targetbindende Sequenz, eine nichttargetbindende Sequenz und eine 3'- targetbindende Sequenz umfasst; und
• b) Verlängern des hybridisierten ersten, zweiten und dritten Amplifikati­ onsprimers an der Targetnucleinsäuresequenz in einer Primerverlän­ gerungsreaktion, wodurch die zu der Targetnucleinsäuresequenz komplementäre einzelsträngige DNA amplifiziert wird.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Primerverlängerungsreaktion eine Strangverdrängungsamplifikation ist und die nichttargetbindende Sequenz eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym ist, in der während der Strangverdrängungsamplifikation durch ein Restriktionsenzym ein Einzel­ strangbruch erzeugt wird.

18. DNA-Molekül, das ein Oligonucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausge­ wählt ist, die aus Oligonucleotiden mit den SEQ ID NO: 1-42 besteht.

19. DNA-Molekül gemäß Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid aus der Grup­ pe ausgewählt ist, die aus Oligonucleotiden mit den SEQ ID NO: 1, 2, 5-8, 14-17, 22, 23, 28, 31, 32, 35, 36, 39 und 40 besteht.

20. DNA-Molekül gemäß Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid aus der Grup­ pe ausgewählt ist, die aus Oligonucleotiden mit den SEQ ID NO: 3, 4, 9, 10, 18, 19, 24, 25, 33, 34, 37, 38, 41 und 42 besteht.

21. DNA-Molekül gemäß Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid aus der Grup­ pe ausgewählt ist, die aus Oligonucleotiden mit den SEQ ID NO: 11, 20, 26 und 29 besteht.

22. DNA-Molekül gemäß Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid aus der Grup­ pe ausgewählt ist, die aus Oligonucleotiden mit den SEQ ID NO: 12, 21, 27 und 30 besteht.

23. DNA-Molekül gemäß Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid aus der Grup­ pe ausgewählt ist, die aus Oligonucleotiden mit der SEQ ID NO: 13 be­ steht.

24. DNA-Molekül gemäß Anspruch 19, wobei eine Erkennungsstelle CTCGGG für ein Restriktionsenzym durch eine nichttargetbindende Sequenz ersetzt ist.