DE4431269A1 - Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren - Google Patents
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nuklein
säuren durch Hybridisierung einer Sondennukleinsäure mit einer Zielnukleinsäure,
Abbau des hybridisierten Teils der Sondennukleinsäure und Nachweis des Spaltpro
dukts, sowie ein hierfür geeignetes Set von Reagenzien.
Die Nukleinsäurehybridisierung hat aufgrund ihrer Spezifität in molekularen Analysen
weite Verbreitung gefunden. Eine Vielzahl unterschiedlicher Amplifikationsmethoden
wurden mit der Zielsetzung entwickelt, die oft nicht ausreichende Sensitivität kon
ventioneller Detektionsverfahren zum Nachweis der Sondenmoleküle zu steigern. Da
bei wurden sowohl Verfahren eingesetzt die auf einer Vermehrung der Zielsequenz
beruhten, aber auch solche, die auf einer Zielsequenz-spezifischen Signalverstärkung
beruhen. Ein Beispiel der Vermehrung der Zielsequenz ist die in EP-A-0 200 362 be
schriebene Polymerasekettenreaktion, in der die beiden Stränge der Zielnukleinsäure in
einer in-vitro Replikationsreaktion amplifiziert werden. Die Temperatur der Reaktion
wird zyklisch verändert, um eine doppelsträngige Zielnukleinsäure zu denaturieren, die
Hybridisierung mit Initiatormolekülen und die anschließende DNA-Synthese zu er
möglichen und diese Schritte zu wiederholen.
Für die Vermehrung von Zielsequenzen wurden jedoch auch in-vitro Transkriptionen
verwendet. Ein Beispiel für eine solche Reaktion ist in WO 88/10315 beschrieben. Bei
dieser Amplifikation werden ebenfalls zwei Primer eingesetzt, von denen jedoch einer
eine Promotersequenz enthält. Die Primer sind zu unterschiedlichen Strängen der zu
amplifizierenden Sequenz komplementär. In EP-A-0 329 822 ist eine Weiterentwick
lung dieses Verfahrens beschrieben, bei der die durch Transkription des als Zwischen
produkt entstandenen doppelsträngigen Nukleinsäureprodukts entstandenen Ribo
nukleinsäuren im Hybrid abgebaut werden, um die erneute Hybridisierung der neu
synthetisierten DNA mit einem promoterhaltigen Primermolekül zu ermöglichen.
Durch den Abbau der ursprünglich gebildeten Transkripte wird es möglich, aus jedem
gebildeten RNA Molekül erneut eine doppelsträngige promoterhaltige Nukleinsäure zu
bilden, die für einen erneuten Transkriptionsstart verwendet werden kann.
Im Gegensatz zu den vorangehend geschilderten Methoden dient die Zielsequenz-spe
zifische Signalverstärkung nicht zur Vermehrung der nachzuweisenden Nukleinsäure,
sondern hat nur ihre spezifische Identifizierung zum Ziel. Um dies zu erreichen, wird
ein Signal in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Zielsequenz verstärkt. Eine solche
Methode ist in WO 89/09284 und WO 89/10415 beschrieben. In dieser sogenannten
Cycling-Probe-Reaktion (CPR) wird ein markiertes, chimäres DNA-RNA-DNA-
Sondenmolekül eingesetzt, das mit einem Ziel-DNA-Molekül hybridisiert. Durch die
Hybridisierung entsteht ein RNA-DNA-Hybrid, das ein Substrat für die RNAse H dar
stellt. Da dieses Enzym spezifisch den RNA Anteil des RNA-DNA-Hybrides abbaut,
wird das Sondenmolekül gespalten und die entstehenden Fragmente disoziieren auf
grund der geringeren Schmelztemperatur von der Zielsequenz ab. Daraufhin kann das
Zielmolekül mit einem weiteren Sondenmolekül hybridisieren und der Zyklus wird
wiederholt. Die Fragmente des Sondenmoleküls werden über die daran befindliche
Markierung nachgewiesen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung war es, die Empfindlichkeit von Verfahren zu
erhöhen, bei denen eine Zielnukleinsäure mit einem Sondenmolekül hybridisiert wird
und der Abbau des Sondenmoleküls zur Bestimmung der Zielnukleinsäure verwendet
wird.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum empfindlichen Nachweis einer
Zielnukleinsäure A durch
- - Hybridisierung der Zielnukleinsäure A mit einer Sondennukleinsäure B, die mindestens einen mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden Teil B1 und einen nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden nukleinsäurespezifischen Teil B2 enthält,
- - Spaltung der Sondennukleinsäure B im Teil B1,
- - Hybridisierung eines Spaltproduktes B′ der Sondennukleinsäure B, welches den nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden Teil B2 enthält, mit einer Ma trizennukleinsäure C, die einen mit dem Spaltprodukt im Teil B2 hybridisierbaren Teil C2 und einen nicht mit dem Teil B1 der Sondennukleinsäure hybridisier baren Teil C1 enthält, und
- - Bestimmung des Hybrids aus Spaltprodukt B′ und Matrizennukleinsäure C,
sowie ein Reagenzkit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Nachweis einer Zielnukleinsäure A. Diese
Zielnukleinsäure kann beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise Nukleinsäuren
viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sie können in Lösung, Suspension aber
auch an Festkörpern fixiert oder in zellhaltigen Medien, Zellabstrichen, fixierten
Zellen, Gewebsschnitten oder fixierten Organismen vorliegen. Bevorzugt liegen die
Nukleinsäuren in Lösung vor.
Üblicherweise beginnen Nachweisverfahren mit einem Schritt zur Verfügbarmachung
der Analytnukleinsäure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Ver
änderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturverände
rungen (Einfrieren/Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedin
gungen (osmotischer Druck), Einwirkung von Detergentien, chaotropen Salzen oder
Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen) allein oder in Kombination zur Freisetzung der
Nukleinsäuren beitragen. Da das erfindungsgemäße Verfahren sehr empfindlich und
selektiv ist, können auch kleine Nukleinsäuremengen in Anwesenheit anderer Stoffe,
beispielsweise Proteinen, Zellen, Zellfragmenten, aber auch nicht nachzuweisender
Nukleinsäuren nachgewiesen werden.
Geeignete Zielnukleinsäuren sind beispielsweise Ribonukleinsäuren und Deoxyribo
nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren können auch modifiziert sein, beispielsweise durch
vorher vorgenommene Bearbeitungsschritte. Solche Bearbeitungsschritte können bei
spielsweise einen Verdau von Nukleinsäuren, z. B. durch ein Restriktionsenzym bein
halten. Besonders bevorzugt als Zielnukleinsäure ist Deoxyribonukleinsäure (DNA).
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungs
form von auf einem Hybridisierungsereignis beruhenden Test, im Speziellen der ziel
sequenzspezifischen Signalverstärkung. Auf Hybridisierungsereignisse beruhende
Tests sind die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäure
diagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im folgenden nicht ausgeführt
sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D.
Hames und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation
Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hbyridisation) und 4 (Quantitative
Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Edt. F.M. Ausubel et
al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Edt. J. Sambrook et al., CSH,
1989, Bezug genommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die Herstellung von
markierten Nukleosidtriphosphaten, wie sie in EP-A-0 324474 beschrieben sind, die
chemische Synthese von modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden, die
Spaltung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsenzymen, die Auswahl von Hybridi
sierungsbedingungen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die vom
Ausmaß der Komplentarität zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäuren, deren
GC-Gehalt und deren Länge abhängt, sowie die Bildung von Nukleinsäuren aus
Nukleosidtriphosphaten mit Hilfe von Polymerasen, gegebenenfalls unter Verwendung
von sogenannten Primern.
Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder
indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise
radioaktive (³²P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen oder Metallatome. Indirekt
nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame
Verbindungen, wie Antikörper, Antigene, Haptene oder Enzyme oder enzymatisch ak
tive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionsse
quenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, da mit ihnen markierte Nu
kleosidtriphosphate im allgemeinen besonders gut als Substrate von Polymerasen ein
setzbar sind und eine anschließende Reaktion mit einem markierten Antikörper gegen
das Hapten oder das haptenisierte Nukleosid leicht vorgenommen werden kann. Solche
Nukleosidtriphosphate sind beispielsweise Brom-Nukleosidtriphosphate oder Digoxi
genin-, Digoxin-, Biotin- oder Fluorescein-gekoppelte Nukleosidtriphosphate. Als be
sonders geeignet haben sich die in EP-A-0 324474 genannten Steroide und deren
Detektion erwiesen. Für deren Inkorporation in Nukleinsäuren wird hiermit auf die EP-
A-0 324474 verwiesen.
Als Sondennukleinsäuren B sind Moleküle geeignet, die zwei miteinander verbundene
Teile B1 und B2 enthalten. Teil B1 ist dadurch charakterisiert, daß er mit der Ziel
nukleinsäure bzw. einem Teil davon hybridisieren kann. Dazu ist dieser Teil ausrei
chend komplementär. Darüberhinaus muß der Teil B1 gespalten werden können, wenn
er in mit der Zielnukleinsäure hybridisierter Form vorliegt. Unter Spaltung ist hierbei
die Aufteilung des Teiles B1 in zwei oder mehr nicht mehr aneinander gebundene
Teile zu verstehen, wobei die Zielnukleinsäure nicht gespalten wird. Teil B1 kann da
her z. B. ribonukleotidische oder abasische Sequenzen enthalten. In einem bevorzugten
Fall enthält Teil B1 zwei oder mehr über die in Nukleinsäuren übliche Weise mitein
ander verknüpfte Monoribonukleotideinheiten, während der hierzu komplementäre
Teil der Zielnukleinsäure eine Deoxyribonukleinsäure darstellt. In diesem Fall kann
eine Spaltung der Sondennukleinsäure B im Teil B1 dadurch geschehen, daß das ge
bildete Hybrid mit RNAse H, in Kontakt gebracht wird. Im Falle der Anwesenheit
abasischer Sequenzen kann der Abbau mittels AP-Endonuklease geschehen.
Dabei wird mindestens ein Teil des hybridisierbaren Teiles B1 verdaut. Dadurch bildet
sich ein Spaltprodukt B′, welches den nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden
Nukleinsäure selektiven Teil B2, sowie eventuelle Teile des ursprünglich mit der Ziel
nukleinsäure hybridisierten Teiles B1 enthält.
Die Bedingungen für die Hybridisierungen der Zielnukleinsäure mit der Sonden
nukleinsäure werden vorzugsweise so gewählt, daß gerade noch eine selektive Hybri
disierung der Sondennukleinsäure mit der Zielnukleinsäure stattfindet, eine unselektive
Hybridisierung der Sondennukleinsäure mit anderen, nicht nachzuweisenden Nuklein
säuren der Probe gerade nicht mehr stattfindet. Die durch die Spaltung der Sonden
nukleinsäure entstehenden Bruchstücke, darunter auch das Spaltprodukt B′, sind kürzer
als die ursprüngliche Sondennukleinsäure und werden unter den gewählten Bedingun
gen daher kein stabiles Hybrid mehr mit der Zielnukleinsäure bilden können. Unter
den gewählten Bedingungen werden sie daher die Zielnukleinsäure A freigeben.
Durch Spaltung der Sondennukleinsäure können auch unterschiedliche Bruchstücke B′
entstehen, welche entweder nur den Teil B2 alleine enthalten oder aber zusätzlich noch
Reste des Teils B1. Dies hängt von den jeweils verwendeten Bedingungen ab.
Unter einem Nukleinsäure-spezifischen Teil einer Nukleinsäure wird im Folgenden
eine Sequenz verstanden, die mit einer anderen Sequenz als der Zielnukleinsäure
hybridisieren kann, wobei unter den gewählten Bedingungen eine spezifische
Hybridisierung stattfindet, d. h. keine für das Gesamtverfahren relevante
Hybridisierung mit weiteren unbeteiligten in der Reaktionsmischung vorhandenen
Nukleinsäuren stattfindet. Typische Nukleinsäure-spezifische Teile sind Teil B2 der
Sondennukleinsäure und Teil C2 der Matrizennukleinsäure.
Der nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierende, Nukleinsäure-spezifische Teil B2
der Sondennukleinsäure muß die Bedingung erfüllen, daß er unter den Bedingungen
des zielsequenzspezifischen Abbaus des Teiles B1 nicht abgebaut wird. Außerdem soll
er mit dem später definierten Matrizenoligonukleotid hybridisieren können. Die
Sequenz des Teils B2 kann prinzipiell frei gewählt werden. Hierbei ist jedoch zu be
rücksichtigen, daß die Hybridisierung des Spaltprodukts B′ mit dem
Matrizenoligonukleotid durch eine Komplementarität mit der Zielnukleinsäure
erschwert wird, wodurch voraussichtlich die Sensitivität gegenüber dem optimalen Fall
erniedrigt ist. Darüberhinaus sollte darauf geachtet werden, daß das Sondenmolekül
nicht zur Bildung partieller Doppelstränge neigt. B2 kann ebenfalls eine
Ribonukleinsäure, Deoxyribonukleinsäure oder modifizierte Nukleinsäure sein. Für
den Fall, daß der hybridisierbare Teil B1 eine Ribonukleinsäure enthält und die
Spaltung mittels einer RNAse vorgenommen wird, stellt Teil B2 bevorzugt keine unter
diesen Bedingungen spaltbare Ribonukleinsäure dar, bevorzugt stellt er
Deoxyribonukleinsäure dar. B2 kann jedoch auch eine so modifizierte Ribonuklein
säure sein, daß sie nicht mehr von einer RNAse gespalten werden kann. Eine weitere
Möglichkeit ist die Verwendung von Nukleinsäureanalogen, die zwar noch die Hybri
disierungseigenschaften einer Nukleinsäure aufweisen, jedoch kein Phosphat-Zucker-
Kettenanteil haben. Hierfür sind insbesondere PNA-Moleküle der WO 92/20702 oder
WO 86/05518 geeignet. Die Bedingung, daß dieser Anteil nicht mit der Zielnuklein
säure hybridisieren soll, bezieht sich insbesondere auf die während der Hybridisierung
der Sondennukleinsäure mit der Zielnukleinsäure angelegten Bedingungen. Bevorzugt
wird der Teil B2 so gewählt, daß er auch nicht mit nicht nachzuweisenden Nuklein
säuren der Probe hybridisiert. Teil B2 soll jedoch eine Sequenz beinhalten, die mit der
Matrizennukleinsäure C hybridisieren kann. Die Bedingungen der Hybridisierungen
der Zielnukleinsäure mit der Sondennukleinsäure und der Matrizennukleinsäure mit
dem Spaltprodukt B′ können unabhängig gewählt werden.
Die erfindungsgemäße Matrizennukleinsäure C enthält einen Teil C2, der mit dem
Spaltprodukt B′ und insbesondere dessen nukleinsäurespezifischen Teil B2 oder einem
Teil davon und gegebenenfalls eventuell noch vorhandener Reste von B1 hybridisieren
kann. Als Matrizennukleinsäure C sind alle Moleküle geeignet, die eine solche Hybri
disierung erlauben, d. h. Nukleinsäuren, die aus den natürlichen Nukleotidbausteinen
aufgebaut sind, jedoch auch Nukleinsäureanaloge, die aus nicht natürlich vor
kommenden Bausteinen aufgebaut sind oder solche Bausteine enthalten. Darüber
hinaus sollte die Matrizennukleinsäure stabil gegenüber Abbau unter den
gewählten Bedingungen sein. Für den Fall, daß die Spaltung der Sondennukleinsäure
mit RNAse vorgenommen wird, handelt es sich bei der Matrizennukleinsäure
besonders bevorzugt um Deoxyribonukleinsäure. Neben dem Teil C2 weist die
Matrizennukleinsäure einen Teil C1 auf, der nicht mit dem Teil B1 bzw. noch
vorhandenen Resten des Teils B1 der Sondennukleinsäure hybridisieren kann.
Besonders bevorzugt bildet dieser Teil C1 auch mit nicht nachzuweisenden Nu
kleinsäuren in der Probe und der Zielnukleinsäure selbst keine unter den gewählten
Bedingungen stabilen Hybride aus. Bevorzugt liegt der Teil C1 in 5′-Richtung, gesehen
vom Teil C2.
Die Matrizennukleinsäure bzw. der nukleinsäurespezifische Teil B2 werden bevorzugt
so gewählt, daß das 5′-Ende des Spaltprodukts B′ bzw. der Sondennukleinsäure im
hybridisierten Zustand nicht über das 3′-Ende der Matrizennukleinsäure hinausragt,
wenn in einer nachgeschalteten Reaktion der Einbau von Desoxynukleotiden
nachgewiesen wird. Dies soll eine enzymatische Verlängerung der
Matrizennukleinsäure verhindern. Denselben Effekt kann man erreichen, indem die
Matrizennukleinsäure an ihrem 3′-Ende gegen enzymatische Verlängerung geschützt
ist, z. B. durch Einsatz eines nicht verlängerbaren Mononukleotids.
In jedem Fall sollte gewährleistet sein, daß das oder die Spaltprodukte B′ mit der
Matrizennukleinsäure derartig hybridisieren können, daß B′ auch an dem durch
Spaltung entstandenen Ende mit der Matrizennukleinsäure hybridisiert und ein Teil C1
der Matrizennukleinsäure im hybridisierten Zustand noch über das durch Spaltung
entstandene Ende des Spaltprodukts B′ hinausragt.
In einem anschließenden Schritt wird das Hybrid aus Spaltprodukt B′ und Matrizen
nukleinsäure C bestimmt, wobei die Bestimmung so durchgeführt wird, daß eventuell
gebildete Hybride aus ungespaltener Sondennukleinsäure B und Matrizennukleinsäure
C nicht bestimmt werden.
Eine dieser Möglichkeiten beruht darauf, daß das Spaltprodukt B′ unter Verwendung
der Matrizennukleinsäure C verlängert wird, während die ungespaltene
Sondennukleinsäure B nicht verlängert wird. Dies beruht auf der oben beschriebenen
strukturellen Eigenschaft der Matrizennukleinsäure, nicht mit dem Teil B1 der
Sondennukleinsäure zu hybridisieren, während das Spaltprodukt B′ mit der
Matrizennukleinsäure hybridisiert. Spaltprodukt B′ hybridisiert insbesondere an der
Spaltstelle, (am 3′-Ende von B′) mit C. Da das Ende der Matrizennukleinsäure über das
Ende des Spaltprodukts hinaussteht, kann in einer Verlängerungsreaktion ein
Nukleinsäureteil, welcher zu dem entsprechenden Teil der Matrizennukleinsäure C
komplementär ist, angehängt werden. Für eine solche Verlängerungsreaktion existieren
eine Reihe von Möglichkeiten. Eine dieser Möglichkeiten ist das Anhängen von
Mononukleotiden mit Hilfe einer DNA-Polymerase. In einem bevorzugten Fall sind
die eingesetzten Mononukleosidtriphosphate markiert, z. B. gemäß EP-A-0 324 474.
Wenn die Mononukleosidtriphosphate nicht markiert sind, kann die Bildung des
Verlängerungsprodukts beispielsweise über eine Auftrennung mit Gelelektrophorese
nachgewiesen werden. In einer besonderen Ausführungsform können auch zwei
unterschiedliche Markierungen eingebaut werden. Dann kann über eine Markierung
eine Immobilisierung der gebildeten Verlängerungsprodukte und über die andere
Markierung ein Nachweis durchgeführt werden. Hierfür sind beispielsweise die in
(EP-A-0 437 774) beschriebene Bedingungen möglich.
In einer weiteren Ausführungsform dient Spaltprodukt B′ als Primer in einer Poly
merasekettenreaktion. Die Sondennukleinsäure B kann in ungespaltenem Zustand nicht
als Primer fungieren. Hierbei ist das Templat der PCR die Matrizennukleinsäure C. Bei
Verwendung zweier verschiedener Sondennukleinsäuren B, das heißt wenn diese an
verschiedene Bereiche zueinander komplementärer Zielnukleinsäure hybridisieren,
können beide Primer einer PCR erzeugt werden.
Eine weitere Möglichkeit, das Spaltprodukt B′ zu verlängern, ist mittels der Ligase
Reaction möglich. Hierzu wird ein Oligonukleotid zugesetzt, welches mit der
Matrizennukleinsäure so hybridisiert, daß zwischen dem hybridisierten Spaltprodukt B′
und diesem Oligonukleotid ein Nick verbleibt, welcher mit Hilfe einer Ligase ge
schlossen werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Teil C1 der Matrizen
nukleinsäure eine Transkriptions- oder Replikations-initiierende Sequenz. Bevorzugt
enthält C1 eine Promotersequenz. Durch die matrizenkontrollierte Verlängerung des
Spaltprodukts B′ wird ein funktioneller, vollständiger Promotor gebildet. Nach Initiie
rung einer Transkription, die nur stattfinden kann, wenn die Verlängerung tatsächlich
stattgefunden hat, kann die Entstehung von Spaltprodukten und somit der Anwesenheit
der Zielnukleinsäure nachgewiesen werden. Hierzu wird die Reaktionsmischung mit
allen für die Transkription erforderlichen Reagenzien versetzt, wozu eine auf den Pro
motor abgestimmte RNA Polymerase, z. B. T7 RNA Polymerase sowie Ribo
nukleosidtriphosphate, von denen ein Teil bevorzugt eine Markierung trägt, gehören.
Die Anwesenheit der Transkripte kann dann zum Nachweis der Zielnukleinsäure
verwendet werden. Reagenzien, wie sie für eine Transkription erforderlich sind, sind
beispielsweise der EP-A-0 329 822 zu entnehmen. Bei der nachgeschalteten
Transkription wird im Vergleich mit der ersten Ausführungsform eine höhere
Sensitivität erreicht.
Die Temperatur des erfindungsgemaßen Verfahrens wird so gewählt, daß die Aktivi
täten der eingesetzten Enzyme möglichst optimal sind und gleichzeitig die Hybridisie
rungsbedingungen ausreichende Spezifität erlauben. Bei der Verwendung nicht
thermostabiler RNAse ist beispielsweise ein Temperaturbereich zwischen 30° und 60°,
besonders bevorzugt 42° zweckmäßig. Bei Einsatz einer thermostabilen RNAse sind
höhere Temperaturen möglich. Für die Verlängerungsreaktion richtet sich die Tempe
ratur ebenfalls nach dem für die Verlängerung eingesetzten Enzym. Dabei ist bei der
Verwendung von thermostabilen Enzymen, z. B. Taq-DNA-Polymerase ein Bereich
zwischen 50° und 80° bevorzugt und besonders bevorzugt ca. 60-70°. Bei Verwendung
eines transkribierenden Enzyms richtet sich die optimale Temperatur ebenfalls nach
der Aktivität des Enzyms, z. B. für T3, T7 und SP6-Polymerase zwischen 25° und 45°,
besonders bevorzugt 37°. Durch Erhöhung der Aufenthaltswahrscheinlichkeit der
Enzyme an den Reaktionsorten dürfte es möglich sein, die Umsatzraten zu steigern und
somit die erforderliche Reaktionszeit zu senken oder die Sensitivität zu erhöhen.
Die Matrizennukleinsäure kann auch ein circuläres Molekül darstellen. Für diesen Fall
ist die Verwendung eines Verlängerungsenzyms mit Strangverdrängungsaktivität be
vorzugt.
Die hohe Flexibilität und mögliche Doppelmarkierung ermöglichen die Anwendung
des Verfahrens auf Teststreifen oder den Nachweis über Kopplung an Beads und deren
Nachweis in Durchflußcytometrie oder Kapillarelektrophorese.
In einer möglichen Ausführungsform enthält ein Teil der Matrizennukleinsäure eine
Sequenz, die als Matrize für die Synthese einer replizierbaren RNA dient, z. B. MDV 1
RNA oder kürzere Sequenzen.
Die Sondennukleinsäure und die Matrizennukleinsäure können nach prinzipiell be
kannten Verfahren hergestellt werden, sobald die Sequenz ihrer Teile festgelegt ist. Für
den bevorzugten Fall, daß es sich um Oligonukleotide mit einer Länge von weniger als
100 Mononukleotidbausteinen handelt, ist die Synthese nach geläufigen chemischen
Verfahren (z. B. Festphasensynthese analog Merrifield) bevorzugt. Dies ermöglicht
auch die einfache Synthese gemischter Oligonukleotide (RNA/DNA-Chimäre). Für
größere Nukleinsäuren sind rekombinante Herstellverfahren oder
chemisch/enzymatische Verfahren, wie in EP-A-325970 beschrieben, bevorzugt. Teil
B1 ist bevorzugt 12-35, Teil B2 bevorzugt 15-50, Teil C1 bevorzugt 10-100 und Teil
C2 15-50 Nukleotide lang.
Fig. 1 zeigt eine erste Ausführungsform der Erfindung, die auf dem Einbau nicht
radioaktiv markierter Deoxyribonukleotidtriphosphate durch eine DNA Polymerase
beruht.
Fig. 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform, bei der das Matrizenoligonukleotid
eine Promotorsequenz enthält, die zu einem funktionellen Promotor gemacht wird und
anschließende Transkription.
In Fig. 3 ist die Sensitivität des Verfahrens nach Fig. 1 in Abhängigkeit von der
Menge der Sondennukleinsäure und bei einer Menge von 10 pmol Matrizennuklein
säure pro Ansatz dargestellt.
In Fig. 4 bis 6 ist die Spezifität eines Nachweises von DNA-Sequenzen im Verfahren
gemäß Fig. 1 in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur der Hybridisierungs-
und Abbaureaktion gezeigt (42°C, 50°C und 56°C).
In Fig. 7 ist die Sensitivität des Nachweises gemäß dem Verfahren von Fig. 2 darge
stellt.
Die in den Figuren gezeigten Schritte können nacheinander unter Zugabe der jeweils
benötigten Reagenzien durchgeführt werden. Alle benötigten Komponenten können
bei entsprechendem Design der Komponenten jedoch auch schon zu Beginn der
Reaktion zugesetzt werden, so daß der Prozeß simultan abläuft.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform (Fig. 1) wird eine Probe, die eine Ziel-
DNA enthält, mit einem chimären RNA-DNA- oder DNA-RNA-DNA-Sondenmolekül
versetzt, so daß eine Hybridisierung stattfindet. Durch RNAse H wird der Zielsequenz
spezifische RNA-Anteil der Sonde abgebaut. Danach wird das Matrizenoligonukleotid
unter Einstellen geeigneter Hybridisierungsbedingungen zusammen mit einer DNA
Polymerase und unmarkierten und markierten Deoxyribonukleosidtriphosphate
zugegeben. Der Einbau markierter Mononukleotide kann beispielsweise nach Ab
trennung der Nukleinsäuren von den nicht umgesetzten markierten Deoxyribo
nukleosidtriphosphaten nachgewiesen werden. Die Verwendung zweier unterschied
lich markierter Nukleotide ermöglicht den direkten festphasengebundenen Nachweis.
Wenn in der Probe keine Ziel-DNA enthalten ist, hybridisiert das Matrizenoligo
nukleotid nur mit dem chimären RNA-DNA-Sondenmolekül. Eine Verlängerung des
Sondenmoleküls kann nicht stattfinden, da das 3′-Ende nicht mit dem Matrizenoligo
nukleotid hybridisiert.
In einer zweiten, bevorzugten Ausführungsform (Fig. 2) wird ebenfalls zunächst die
Probe mit der Ziel-DNA mit dem chimären RNA-DNA-Sondenmolekül oder DNA-
RNA-DNA-Sondenmolekül zur Hybridisierung gebracht. Nach Abbau des Ziel
sequenz-spezifischen RNA-Anteils durch RNAse H wird das Spaltprodukt mit einem
Oligonukleotid zur Hybridisierung gebracht, welches an seinem 5′-Ende über das Ende
des Spaltprodukts hinausragt und eine einzelsträngige Promotorsequenz enthält. Durch
Zugabe einer DNA Polymerase und Deoxyribonukleotidtriphosphaten wird das 3′-
Ende des Spaltproduktes so verlängert, daß sich ein funktioneller Promotor bildet. Die
entstandene doppelsträngige Nukleinsäure wird einer Transkription durch RNA
Polymerase und Nukleosidtriphosphate unterzogen. Promoter-Sequenzen sind dem
Fachmann für verschiedene Polymerasen bekannt (z. B. Nucl. Acids. Res. 12, 7035-
7056 (1984)).
In einer dritten Ausführungsform (Fig. 8) sind die Sondennukleinsäure und die
Matrizennukleinsäure keine getrennten Moleküle sondern miteinander verknüpft. Hier
zu wird ein Ende der Matrizennukleinsäure an das von B1 wegzeigende Ende des Teils
B2 der Sondennukleinsäure so angehängt, daß Teil C2 mit Teil B2 unter Bildung einer
Haarnadelstruktur hybridisieren kann, und die Teile B1 und C1 die Enden des Haar
nadelmoleküls darstellen. Die Verknüpfung der Teile B2 und C2 kann beliebig ge
schehen, beispielsweise durch kovalente Verknüpfung, bevorzugt durch Mono
nukleotideinheiten, z. B. Oligo-dA. Damit sich die Haarnadelstruktur bilden kann ist es
empfehlenswert, zwischen den miteinander hybridisierbaren Teilen C2 und B2 einen
Linker, der 3 bis 20 Nukleotide oder Äquivalente bevorzugt. Für den Fall, daß B2 am
5′-Ende des Sondenmoleküls lokalisiert ist, findet die Verknüpfung zwischen dem 5′-
Ende von B2 und dem 3′-Ende von C2 statt. Diese Ausführungsform hat den Vorteil,
daß durch die räumliche Nähe der miteinander hybridisierenden Teile der
Sondennukleinsäure und der Matrizennukleinsäure eine Erhöhung der Reaktions
geschwindigkeit erreicht werden kann.
Die in Fig. 8 geschilderte Ausführungsform ist analog auch auf Fig. 2 zu übertragen
(Generation eines Promotors).
Ein Vorteil des erfindungsgemaßen Verfahrens ist es, daß die Sondennukleinsäure B
keine Markierung enthalten muß. Dies erleichtert die Synthese der Sondennuklein
säure, führt jedoch auch dazu, daß ein Hintergrundsignal über diese Markierungen in
einer späteren Nachweisreaktion nicht auftreten kann. Bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren wird nicht eine Zielsequenz amplifiziert. Daher kann die Gefahr der
Kontamination mit amplifizierten Molekülen aus vorangegangenen Versuchen ausge
schlossen werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dient das Produkt des
letzten Teilschrittes nicht als Substrat für die erste Teilreaktion. Aus diesem Grund ist
der Ablauf der Reaktion leichter kontrollierbar. Dadurch, daß die Amplifikation im
wesentlichen linear ist, ist eine quantitative Auswertung erleichtert. Zum anderen ist
die Gefahr falsch positiver Ergebnisse durch Kreuzkontamination ursprünglich nega
tiver Proben mit geringen Mengen wirklich positiver Proben gegenüber den exponen
tiellen Amplifikationssystemen vermindert. Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt
keine Gerätschaften für eine zyklische Variation der Inkubationstemperatur. Das er
findungsgemäße Verfahren ist auch insofern flexibel, als durch Einsatz zweier unter
schiedlicher nicht radioaktiver Markierungen gemäß EP-A-0437774 sowohl eine
Wandbindung als auch ein Nachweis der Produkte möglich ist. Da im erfindungsge
mäßen Verfahren der weitere Ablauf der Teilreaktionen von der spezifischen Hybridi
sierung des Sondenmoleküls mit der Zielsequenz unbedingt abhängig ist, können keine
Hintergrundsignale durch unspezifische Bindung oder durch Persistenz nicht hybri
disierter Sondenmoleküle entstehen, wie sie beispielsweise bei Amplifikation mit Hilfe
replizierbarer Ribonukleinsäuresequenzen (Qβ-Replikation) auftreten. Im Gegensatz
zu Verfahren, bei denen zwei oder mehr Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz in
einem Ansatz zur Reaktion gebracht werden, kann eine unspezifische Reaktion der
Oligonukleotide miteinander (wie z. B. Primer-Dimere in der PCR) beim
erfindungsgemäßen Verfahren nahezu ausgeschlossen werden. Das erfindungsgemäße
Verfahren kann bei nicht stringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt
werden. Dadurch wird der Nachweis von verwandten Sequenzen möglich. Die
Durchführung unter sehr stringenten Bedingungen ermöglicht den Nachweis von
Punktmutationen. Dadurch, daß der Nachweis im erfindungsgemäßen Verfahren nicht
über den Nachweis eines markierten verkürzten Sondenmoleküls neben den
ursprünglich eingesetzten markierten Sondenmolekülen ablaufen muß, wird die
Verwendung gelelektrophoretischer Methoden zur Trennung dieser Sequenzen
vermieden. Dadurch wird das Verfahren automatisierbar und somit für die
Routineanalytik einsetzbar.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung des oben
genannten Nachweisverfahrens. Dieser Kit enthält die Sondennukleinsäure B und ge
trennt oder im gleichen Behälter die Matrizennukleinsäure C. Bevorzugt enthält das
Reagenzkit außerdem Puffer für die Durchführung der Hybridisierungs- und Abbau
reaktion bzw. der Verlängerungsreaktion. Besonders bevorzugt enthält der Kit nach
weisbar markierte Mononukleosidtriphosphate. Soweit die Reagenzien auf zwei ver
schiedene Behälter aufgeteilt sind, enthält der erste Behälter bevorzugt die Sonden
nukleinsäure, ein Enzym für die Durchführung der Abbaureaktion sowie geeignete
Puffer. Im zweiten Behälter befinden sich dann die Matrizennukleinsäure, sowie
mindestens ein Enzym für die Durchführung der Verlängerungsreaktion mit Mono
nukleosidtriphosphaten, sowie einen geeigneten Puffer.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Im Folgenden werden in Oligonukleotiden Großbuchstaben für Deoxyribonukleotid
einheiten und Kleinbuchstaben für Ribonukleotideinheiten verwendet.
1 pmol, 10 pmol oder 100 pmol des RNA-DNA-Sondenmoleküls (LPR03_19R:
5′-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagauc-3′ (SEQ.ID.NO. 1)
oder
LPR03_25R:
5′-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagaucucaauc-3′ (SEQ. ID NO. 2) wurden mit jeweils unterschiedlichen Mengen der nachzuweisenden DNA (DHBV1 : 5′-GATTGAGATCTTCTGCGACGCGGCGGT-3′ (SEQ. ID. NO. 3)) in einem Volumen von 10 µl bei 42°C für 3 h in Puffer P2 (10 mM Hepes, 1mM MgCl₂, pH 8,0) unter Zusatz von 3 µg RSA, 20 U RNasin und 4 U RNase H inkubiert. Dann wurden 10 pmol des Matrizenoligonukleotides TAQ (5′-ATTCCATGATTCATTGATTATTGTCGCGGCGGTGAGTCGT ATTACTTCCAGTCCGATC-3′ (SEQ. ID. NO 4)) zugegeben, der Ansatz für 1 min auf 100°C erhitzt und sofort auf Eis abgekühlt. Für die Auffüllreaktion wurden die An sätze mit 2 µl Taq-Puffer (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 mg/ml Gelatine), der Nukleotid-Mischung 1_3 (je 1 µM dATP, dGTP, dCTP, DIG- dUTP (Boehringer Mannheim) und BIO-dUTP (Boehringer Mannheim)), 20 U RNasin, 1 U Taq-DNA-Polymerase und H₂O auf 20 µl aufgefüllt und bei 60°C für 15 min inkubiert.
5′-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagauc-3′ (SEQ.ID.NO. 1)
oder
LPR03_25R:
5′-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagaucucaauc-3′ (SEQ. ID NO. 2) wurden mit jeweils unterschiedlichen Mengen der nachzuweisenden DNA (DHBV1 : 5′-GATTGAGATCTTCTGCGACGCGGCGGT-3′ (SEQ. ID. NO. 3)) in einem Volumen von 10 µl bei 42°C für 3 h in Puffer P2 (10 mM Hepes, 1mM MgCl₂, pH 8,0) unter Zusatz von 3 µg RSA, 20 U RNasin und 4 U RNase H inkubiert. Dann wurden 10 pmol des Matrizenoligonukleotides TAQ (5′-ATTCCATGATTCATTGATTATTGTCGCGGCGGTGAGTCGT ATTACTTCCAGTCCGATC-3′ (SEQ. ID. NO 4)) zugegeben, der Ansatz für 1 min auf 100°C erhitzt und sofort auf Eis abgekühlt. Für die Auffüllreaktion wurden die An sätze mit 2 µl Taq-Puffer (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 mg/ml Gelatine), der Nukleotid-Mischung 1_3 (je 1 µM dATP, dGTP, dCTP, DIG- dUTP (Boehringer Mannheim) und BIO-dUTP (Boehringer Mannheim)), 20 U RNasin, 1 U Taq-DNA-Polymerase und H₂O auf 20 µl aufgefüllt und bei 60°C für 15 min inkubiert.
Für den Nachweis wurden die Reaktionsansätze mit Puffer D (10 mM HEPES
(pH 8,0), 30 mM NaCl, 1 mM MnCl₂ auf je 210 µl verdünnt. Die BIO-DIG-markier
ten Syntheseprodukte wurden in einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte
(MTP) immobilisiert (TRSA-SA-MTP, Firma MicroCoat), indem je zwei mal 100 µl
des mit Puffer D verdünnten Reaktionsansatzes in die Vertiefungen einer mit Wasch
puffer (0,5% (V/V) Tween 20 in PBS ("phosphate buffered saline")) vorgewaschenen
SA-MTP pipettiert wurden. Die MTP wurde unter Schütteln (Well-Warm1, Fa. Denley
Instruments GmbH) für 1 h bei 37°C inkubiert.
Die MTP mit den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen wurde fünfmal mit je
200 µl Waschpuffer gewaschen. Dann wurden je 100 µl der Konjugatverdünnung
(polyklonale <DIG<-S-Fab-PODpoly-Konjugate (Boehringer Mannheim GmbH),
200 mU/ml in Konjugatpuffer (100 mM Na-Phosphat (pH 7,5), 0,9% (G/V) NaCl,
1% (G/V) Ralufon F4J oder RSA Fraktion V; der Konjugatpuffer wurde mit DEPC
behandelt, sterilfiltriert (0,2 µm-Filter, Nalgene) und bei 4°C aufbewahrt)) zugegeben
und erneut unter denselben Bedingungen inkubiert.
Ungebundene Konjugatmoleküle wurden durch fünfmaliges Waschen entfernt. Pro
Vertiefung wurden nun 100 µl der Substratlösung (2,2′-azino-di-[3-ethylbenzthiazolin
sulfat(6)] ABTS) zugegeben. Die Farbreaktion erfolgte bei 37°C unter Schütteln. Die
"Optische Dichte" des umgesetzten ABTS bei 405 nm wurde nach kurzem Schütteln
der MTP unmittelbar vor der Messung mittels eines ELISA-Readers (SLT) gegen den
Referenzfilter von 492 nm gemessen und nach Abzug des Nullwertes (nur ABTS) die
Mittelwerte der Doppelbestimmungen ermittelt (SLT Easy-Base Version 4.01).
Zur Ermittlung der Sensitivität des Verfahrens wurde im oben geschilderten Reak
tionsansatz die Matrizennukleinsäure in einer Konzentration von 10 pmol eingesetzt.
Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt. Die Kurven in Abb. 3 führten zu dem
Ergebnis, daß unter den gewählten Reaktionsbedingungen (10 pmol Matrizen
oligonukleotid, Menge an RNase H, Inkubationsvolumen, Inkubationstemperatur usw.)
der sensitivste Nachweis mit 10 pmol des Sondenmoleküls erzielt wurde. Der Einsatz
von nur 1 pmol Sondennukleinsäure begrenzt wahrscheinlich den ersten Teilschritt der
Reaktion, die Hybridisierung- und Abbaureaktion. Werden 100 pmol
Sondennukleinsäure eingesetzt, können nicht alle abgebauten Sondenmoleküle mit
einem Matrizenoligonukleotid hybridisieren und dadurch verlängert werden. Es läßt
sich also festhalten, daß unter den gewählten Bedingungen die größte Sensitivität mit
10 pmol Sondennukleinsäure pro Ansatz erreicht wurde und daß unter diesen
Bedingungen 10 amol Zielnukleinsäure nachgewiesen werden konnten. Diese
Nachweisgrenze liegt um etwa den Faktor 10 niedriger als in der Methode gemäß WO
89/10415, in der unter äquivalenten Bedingungen 0,1 fmol der Zielnukleinsäure
detektiert wurden.
Zur Beschreibung der Temperaturabhängigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens von
Beispiel 1 wurden pro Ansatz 10 pmol Sondennukleinsäure eingesetzt und in Gegen
wart von je 0,01 amol bis 100 amol Zielnukleinsäure mit RNAse H bei 42°C (Fig. 4),
50°C (Fig. 5) bzw. 56°C (Fig. 6) inkubiert. Die sich anschließende Auffüllreaktion
fand in allen Fällen bei 60°C statt. Die Messung erfolgte nach 30minütiger Inkubation
mit ABTS. Ms Sondennukleinsäure wurde HBV 1 bzw.
MM 1 DHBV 1 (5′-GATTGAGATCTTATGCGACGCGGCGGT-3′, SEQ. ID. No. 7)
(eine Basenfehlpaarung) bzw. MM 3 DHBV 1 (5′-GATTGAGATCTCACG
CGACGCGGCGGT-3′, SEQ. ID. No. 8) (drei Basenfehlpaarungen) eingesetzt. Bei
einer Inkubationstemperatur der Abbaureaktion von 42°C führte der Versuch zu fast
identischen Kurvenverläufen und somit zu einer geringen Sequenzspezifität des erfin
dungsgemäßen Verfahrens. Die Erhöhung der Stringenz durch die Anhebung der Inku
bationstemperatur auf 50°C ergab für den Nachweis des perfekt komplementären
Oligonukleotids die HBV 1 und des eine Basenfehlpaarung ausbildenden Oligo
nukleotids ähnliche Kurvenverläufe, allerdings mit einem Sensitivitätsverlust gegen
über der Inkubationstemperatur von 42°C. Der Grund hierfür lag in dem weniger voll
ständigen Abbau des RNA-Anteils. Deutlich geringere Signale erzeugte das drei
Basenfehlpaarungen ausbildenden Oligonukleotid, was auf die geringere Hybridisie
rungsrate unter den stringenteren Bedingungen zurückzuführen war. Die größte Spezi
fität wurde bei einer Inkubationstemperatur von 56°C erreicht. Hier riefen 100 amol
DHBV 1 ein deutliches Signal hervor, 100 amol MM 1 DHBV 1 führten zu einem
niedrigeren Wert der optischen Dichte und 100 amol MM 3 DHBV 1 ließen sich nicht
nachweisen. Damit ist gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein
sequenzspezifischer Nachweis von Nukleinsäuren möglich ist. In 3×3 Serien wurden
10 pmol Sondennukleinsäure mit unterschiedlichen Mengen (0,01 amol bis 100 amol)
der perfekt komplementären Zielnukleinsäure DHBV 1, der eine zentrale Basenfehl
paarung ausbildenden Zielnukleinsäure MM 1 HBV 1 und der drei zentrale Basenfehl
paarungen ausbildenden Zielnukleinsäure MM 3 DHBV 1 eingesetzt. Die ersten drei
Serien wurden bei 42°C, die zweiten bei 50°C und die dritten bei 56°C inkubiert. Als
Negativkontrollen dienten jeweils Ansätze ohne Zielnukleinsäure. Die Auffüllreaktion
fand in allen Fällen bei 60°C statt. Die in der sich anschließenden Nachweisreaktion in
einer mit Streptavidin gecoateten Mikrotiterplatte gemessenen Werte sind in Fig. 4
bis 6 graphisch dargestellt.
Je 10 pmol RDCPTAQ
(5′-ATGATAGTTGATGATAGTTGGATATcgccgccuggcagaagauc-3′ (SEQ. ID.
NO. 5)) wurden mit unterschiedlichen Mengen DHBV1 (5′-GATTGAGATCTTCT
GCGACGCGGCGGT-3′ (SEQ. ID. NO. 5)), 0,01 amol bis 10 fmol) in einem
Volumen von 10 µl mit RNase H für 1 h bei 42°C Puffer P2 (10 mM Hepes, 1 mM
MgCl₂, pH 8,0) unter Zusatz von 3 µg RSA, 20 U RNasin und 4 U RNase H inkubiert.
Als Negativkontrollen diente ein Ansatz ohne DHBV1. Dann wurde jeder Ansatz mit
10 pmol QAT2
(5′-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGA
TATCCAACTATCATCAACTATCAT-3′ (SEQ. ID. NO. 6)), 2 µl Taq-Puffer (10 mM
Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 mg/ml Gelatine) und je 1 mM dATG,
dGTP, dCTP und dTTP versetzt und die Taq-DNA-Polymerase-katalysierte Auffüll
reaktion für 15 min bei 60°C unter Erhöhung des Reaktionsvolumens auf 20 µl durch
geführt. Anschließend wurden je 3 µl Transkriptionspuffer (40 mM Tris pH 7,9, 6 mM
MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM Spermidin), 20 U RNasin, 0,5 µl 1% Triton X-100 und
500 U T7-RNA-Polymerase zugesetzt und als Nukleotidmischung die Mischung CP1
mit DIG- und BIO-UTP eingesetzt (9,84 µM ATP, 4,92 µM GTP, 2,46 µM CTP, 3,28
µM UTP, 820 nM DIG-UTP und 820 nM BIO-UTP); das Gesamtvolumen betrug nun
30 µl. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 2 h. Für die Detektionsreaktion wurden alle
Ansätze mit Puffer D auf 210 µl verdünnt und je zweimal 100 µl in die Vertiefungen
einer SA-MTP pipettiert. Der Nachweis erfolgte mittels <DIG<-PODpoly und ABTS
(Boehringer Mannheim) wie in Beispiel 1 beschrieben; die gemessenen Werte sind in
Fig. 7 graphisch dargestellt.
Wie aus dem Kurvenverlauf hervorgeht, konnten unter den gewählten Reaktionsbe
dingungen 1 amol der Zielsequenz DHBV 1 nachgewiesen werden. Diese Nachweis
grenze liegt um etwa den Faktor 10 niedriger als in dem Verfahren unter Einbau
markierter Desoxyribonukleotide (Beispiel 1), in dem unter äquivalenten Bedingungen
10 amol der Zielnukleinsäure detektiert wurden.
Claims (9)
1. Verfahren zum empfindlichen Nachweis einer Ziel-Nukleinsäure A durch
- - Hybridisierung der Zielnukleinsäure A mit einer Sondennukleinsäure B, die einen mit der Zielnukleinsäure hybridisierbaren Teil B1 und einen möglichst nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden nukleinsäurespezifischen Teil B2 enthält,
- - Spaltung der Sondennukleinsäure B im Teil B1,
- - Hybridisierung eines Spaltproduktes B′ der Sondennukleinsäure, welches den nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden Teil B2 enthält, mit einer Matrizennukleinsäure C, die einen mit dem Spaltprodukt im Teil B2 hybridisierbaren Teil C2 und einen nicht mit dem Teil B1 der Sondennukleinsäure hybridisierbaren Teil C1 enthält und
- - Bestimmung des Hybrids aus Spaltprodukt B′ und Matrizennukleinsäure C.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Spaltprodukt B′
unter Verwendung der Matrizennukleinsäure C verlängert wird, während die
Sondennukleinsäure nicht verlängert wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrizennuklein
säure C in Teil C1 eine Promotorsequenz enthält.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verlängerung
unter Verwendung nicht-radioaktiver markierter Mononukleotide geschieht.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil C1 in 5′-
Richtung vom Teil C2 gelegen ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrizennuklein
säure an ihrem 3′-Ende gegen Verlängerung geschützt ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das 5′-Ende des
Spaltprodukts B′ bzw. der Sondennukleinsäure im hybridisierten Zustand nicht
über das 3′-Ende der Matrizennukleinsäure hinausragt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielnukleinsäure
nach Spaltung der Sondennukleinsäure erneut mit einem Sondennukleinsäure
molekül hybridisiert wird.
9. Reagenzkit zum Nachweis einer Zielnukleinsäure enthaltend
- - eine Sondennukleinsäure B, die einen mit der Zielnukleinsäure hybridisierbaren Teil B1 und einen nicht mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden nukleinsäurespezifischen Teil B2 enthält,
- - eine Matrizennukleinsäure C, die einen mit der Sondennukleinsäure in Teil B2 hybridisierenden Teil C2 und
- - einen nicht mit Teil B1 der Sondennukleinsäure hybridisierbaren Teil C1 enthält,
- - ein Enzym zur matrizenabhängigen Synthese von Nukleinsäuren und
- - geeignete Puffer.
Priority Applications (12)
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IL11456495A IL114564A (en) | 1994-07-16 | 1995-07-12 | Method for the sensitive detection of nucleic acids |
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Cited By (1)
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EP0718408A2 (de) * | 1994-11-23 | 1996-06-26 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren |
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1995
- 1995-07-11 DE DE59509680T patent/DE59509680D1/de not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0718408A2 (de) * | 1994-11-23 | 1996-06-26 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren |
EP0718408A3 (de) * | 1994-11-23 | 1998-04-01 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren |
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DE59509680D1 (de) | 2001-11-15 |
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