JP3360977B2 - 核酸の高感度検出方法 - Google Patents
核酸の高感度検出方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プローブ核酸を標
的核酸とハイブリダイズさせ、プローブ核酸のハイブリ
ダイズした部分を消化し、次いで、切断生成物を検出す
ることによる核酸の高感度検出方法に関する。
的核酸とハイブリダイズさせ、プローブ核酸のハイブリ
ダイズした部分を消化し、次いで、切断生成物を検出す
ることによる核酸の高感度検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸のハイブリダイゼーションは、その
特異性のために、分子分析において一般的な手段となっ
た。プローブ分子を検出するために、慣用の検出方法の
しばしば不充分な感度を増加させることを目的として、
多くの様々な増幅方法が研究された。この目的のために
使用された方法は、標的配列そのものの増幅または標的
配列特異的シグナル増幅に基づいていた。このような標
的配列増幅の例として、標的核酸の二本の鎖をin vitro
複製反応で増幅するというＥＰ−Ａ−０ ２００３６２
に開示されているポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。
該反応温度は、二本鎖標的核酸を変性させ、開始分子と
ハイブリダイズさせ、ＤＮＡ合成をさせ、次いで、これ
らの工程を繰り返すことができるように、サイクルにお
いて変えられる。
特異性のために、分子分析において一般的な手段となっ
た。プローブ分子を検出するために、慣用の検出方法の
しばしば不充分な感度を増加させることを目的として、
多くの様々な増幅方法が研究された。この目的のために
使用された方法は、標的配列そのものの増幅または標的
配列特異的シグナル増幅に基づいていた。このような標
的配列増幅の例として、標的核酸の二本の鎖をin vitro
複製反応で増幅するというＥＰ−Ａ−０ ２００３６２
に開示されているポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。
該反応温度は、二本鎖標的核酸を変性させ、開始分子と
ハイブリダイズさせ、ＤＮＡ合成をさせ、次いで、これ
らの工程を繰り返すことができるように、サイクルにお
いて変えられる。
【０００３】しかしながら、標的配列の増幅は、in vit
ro転写によっても行われた。かかる反応の例は、ＷＯ
８８／１０３１５に開示されている。この増幅におい
て、一方がプロモーター配列を含有する２つのプライマ
ーが使用される。これらのプライマーは、増幅されるべ
き配列の異なる鎖と相補的である。ＥＰ−Ａ−０ ３２
９ ８２２には、中間生成物である二本鎖核酸生成物を
転写させて、リボ核酸を生成し、該リボ核酸をそれらの
ハイブリッド形で消化して、新しく合成されたＤＮＡを
プロモーター含有プライマー分子とハイブリダイズさせ
るというこの方法の改良が開示されている。最初に形成
された転写物を消化することにより、このようにして形
成されたＲＮＡ分子の各々からもう１つの二本鎖プロモ
ーター含有核酸を形成することができる。次いで、これ
らの核酸は、別の転写開始のために使用することができ
る。
ro転写によっても行われた。かかる反応の例は、ＷＯ
８８／１０３１５に開示されている。この増幅におい
て、一方がプロモーター配列を含有する２つのプライマ
ーが使用される。これらのプライマーは、増幅されるべ
き配列の異なる鎖と相補的である。ＥＰ−Ａ−０ ３２
９ ８２２には、中間生成物である二本鎖核酸生成物を
転写させて、リボ核酸を生成し、該リボ核酸をそれらの
ハイブリッド形で消化して、新しく合成されたＤＮＡを
プロモーター含有プライマー分子とハイブリダイズさせ
るというこの方法の改良が開示されている。最初に形成
された転写物を消化することにより、このようにして形
成されたＲＮＡ分子の各々からもう１つの二本鎖プロモ
ーター含有核酸を形成することができる。次いで、これ
らの核酸は、別の転写開始のために使用することができ
る。
【０００４】前記方法とは反対に、標的配列特異的シグ
ナル増幅は、標的核酸を増幅させないが、それらの特異
的同定に使用される。これを行うために、シグナルは、
標的配列の存在に依存して増幅される。この種の方法
は、ＷＯ ８９／０９２８４およびＷＯ ８９／１０４１
５に開示されている。このサイクリングプローブ反応
（ＣＰＲ）は、標的ＤＮＡ分子とハイブリダイズされる
標識されたキメラＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプローブ分子
を使用する。このハイブリダイゼーションの結果は、Ｒ
ＮＡｓｅ Ｈに対する基質として供されるＲＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッドである。この酵素は、ＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドのＲＮＡ部分を特異的に消化するので、プロ
ーブ分子は、切断され、得られたフラグメントは、低融
点のために標的配列から分離する。次いで、標的分子
は、もう１つのプローブ分子とハイブリダイズすること
ができ、該サイクルは、繰り返される。プローブ分子の
フラグメントは、それに付着する標的を介して検出され
る。
ナル増幅は、標的核酸を増幅させないが、それらの特異
的同定に使用される。これを行うために、シグナルは、
標的配列の存在に依存して増幅される。この種の方法
は、ＷＯ ８９／０９２８４およびＷＯ ８９／１０４１
５に開示されている。このサイクリングプローブ反応
（ＣＰＲ）は、標的ＤＮＡ分子とハイブリダイズされる
標識されたキメラＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプローブ分子
を使用する。このハイブリダイゼーションの結果は、Ｒ
ＮＡｓｅ Ｈに対する基質として供されるＲＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッドである。この酵素は、ＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドのＲＮＡ部分を特異的に消化するので、プロ
ーブ分子は、切断され、得られたフラグメントは、低融
点のために標的配列から分離する。次いで、標的分子
は、もう１つのプローブ分子とハイブリダイズすること
ができ、該サイクルは、繰り返される。プローブ分子の
フラグメントは、それに付着する標的を介して検出され
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、標的核酸が
プローブ分子とハイブリダイズされ、プローブ分子の消
化を使用して標的核酸を測定する方法の感度を増加させ
ることを目的とするものである。
プローブ分子とハイブリダイズされ、プローブ分子の消
化を使用して標的核酸を測定する方法の感度を増加させ
ることを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的核酸Ａ
を、該標的核酸とハイブリダイズすることができる部分
Ｂ１および好ましくは該標的核酸とハイブリダイズしな
い核酸特異的部分Ｂ２を含有するプローブ核酸Ｂとハイ
ブリダイズさせ、該プローブ核酸Ｂを部分Ｂ１中で切断
し、標的核酸とハイブリダイズしない部分Ｂ２を含有す
るプローブ核酸の切断生成物Ｂ'を、部分Ｂ２おいて切
断生成物とハイブリダイズすることができる部分Ｃ２お
よびプローブ核酸の部分Ｂ１とハイブリダイズしない部
分Ｃ１を含有するマトリックス核酸Ｃとハイブリダイズ
させ、次いで、切断生成物Ｂ'およびマトリックス核酸
Ｃのハイブリッドを測定することを特徴とする標的核酸
Ａの高感度検出方法、およびこの方法を実施するための
試薬キットを提供するものである。
を、該標的核酸とハイブリダイズすることができる部分
Ｂ１および好ましくは該標的核酸とハイブリダイズしな
い核酸特異的部分Ｂ２を含有するプローブ核酸Ｂとハイ
ブリダイズさせ、該プローブ核酸Ｂを部分Ｂ１中で切断
し、標的核酸とハイブリダイズしない部分Ｂ２を含有す
るプローブ核酸の切断生成物Ｂ'を、部分Ｂ２おいて切
断生成物とハイブリダイズすることができる部分Ｃ２お
よびプローブ核酸の部分Ｂ１とハイブリダイズしない部
分Ｃ１を含有するマトリックス核酸Ｃとハイブリダイズ
させ、次いで、切断生成物Ｂ'およびマトリックス核酸
Ｃのハイブリッドを測定することを特徴とする標的核酸
Ａの高感度検出方法、およびこの方法を実施するための
試薬キットを提供するものである。
【０００７】本発明の方法は、標的核酸Ａを検出するの
に適する。この標的核酸は、例えば、ウイルス性、細菌
性または細胞性の核酸などのいずれの望まれる起源のも
のであってもよい。それらは、溶液、懸濁液中に存在す
ることができるが、固体支持体に固定されているか、細
胞含有培地、細胞学的塗抹標本、固定細胞、組織切片ま
たは固定微生物中に存在してもよい。好ましくは、該核
酸は、溶液中に存在する。
に適する。この標的核酸は、例えば、ウイルス性、細菌
性または細胞性の核酸などのいずれの望まれる起源のも
のであってもよい。それらは、溶液、懸濁液中に存在す
ることができるが、固体支持体に固定されているか、細
胞含有培地、細胞学的塗抹標本、固定細胞、組織切片ま
たは固定微生物中に存在してもよい。好ましくは、該核
酸は、溶液中に存在する。
【０００８】通常、検出方法の第１工程は、対応する試
薬を用いて標的核酸を利用可能にすることである。これ
は、pＨ（塩基性）の変化、加熱、極度の温度変化（冷
凍／解凍）を繰り返すこと、生理学的増殖条件（浸透
圧）を変化させること、核酸を放出させるための単独ま
たは混合した界面活性剤、カオトロピック塩または酵素
（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ）の影響を含む。本
発明方法は、非常に高感度かつ選択的であるので、例え
ばタンパク、細胞、細胞フラグメントなどの他の物質の
存在下で、また、非標的核酸の存在下でも、少量の核酸
を検出することも可能である。
薬を用いて標的核酸を利用可能にすることである。これ
は、pＨ（塩基性）の変化、加熱、極度の温度変化（冷
凍／解凍）を繰り返すこと、生理学的増殖条件（浸透
圧）を変化させること、核酸を放出させるための単独ま
たは混合した界面活性剤、カオトロピック塩または酵素
（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ）の影響を含む。本
発明方法は、非常に高感度かつ選択的であるので、例え
ばタンパク、細胞、細胞フラグメントなどの他の物質の
存在下で、また、非標的核酸の存在下でも、少量の核酸
を検出することも可能である。
【０００９】好適な標的核酸としては、例えば、リボ核
酸またはデオキシリボ核酸が挙げられる。核酸は、例え
ば前処理工程において、修飾されてもよい。かかる処理
工程としては、例えば制限酵素による、核酸の消化が挙
げられる。特に好ましい標的核酸は、デオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）である。
酸またはデオキシリボ核酸が挙げられる。核酸は、例え
ば前処理工程において、修飾されてもよい。かかる処理
工程としては、例えば制限酵素による、核酸の消化が挙
げられる。特に好ましい標的核酸は、デオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）である。
【００１０】本発明の方法は、ハイブリダイゼーショ
ン、特に、標的配列特異的シグナル増幅に基づく試験の
特別な具体例である。ハイブリダイゼーションに基づく
試験の原理は、核酸診断用薬の分野における専門家に知
られている。実験の詳細は、以下に説明しない限り、
「ニュークリイック・アシッド・ハイブリダイゼーショ
ン」（Ｎucleic acid hybridization）ビー・ディ・ヘ
イムズ（Ｂ.Ｄ.Ｈames）およびエス・ジェイ・ヒギンズ
（Ｓ.Ｊ.Ｈiggins）編、アイアールエル・プレス（ＩＲ
Ｌ Ｐress）、１９８６、例えば、第１章（ハイブリダ
イゼーション・ストラテジー（Ｈybridization Ｓtrate
gy））、第３章（クォンティテイティブ・アナリシス・
オブ・ソリューション・ハイブリダイゼーション（Ｑua
ntitative Ａnalysis of Ｓolution Ｈybridizatio
n））および第４章（クォンティテイティブ・フィルタ
ー・ハイブリダイゼーション（Ｑuantitative Ｆilter
Ｈybridization））、カレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐrotocols
in Ｍolecular Ｂiology）、エフ・エム・オーズベル
（Ｆ.Ｍ.Ａusubel）ら編、ジェイ・ウィリィ・アンド・
サン（Ｊ.Ｗiley and Ｓon）、１９８７、およびモレキ
ュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）、ジェ
イ・サンブルーク（Ｊ.Ｓambrook）ら、ＣＳＨ、１９８
９の全内容を参照する。他の公知の方法としては、ＥＰ
−Ａ−０ ３２４ ４７４に開示されているような標識ヌ
クレオシド三リン酸の調製、修飾および非修飾オリゴヌ
クレオチドの化学合成、核酸の制限酵素による切断、ハ
イブリダイズされるべき核酸間の相補性の程度に依存す
る特異性を達成するためのＧＣ含量および長さについて
のハイブリダイゼーション条件の選択、ならびに、ポリ
メラーゼの助けおよび所望によりいわゆるプライマーの
使用によるヌクレオシド三リン酸からの核酸の合成が挙
げられる。
ン、特に、標的配列特異的シグナル増幅に基づく試験の
特別な具体例である。ハイブリダイゼーションに基づく
試験の原理は、核酸診断用薬の分野における専門家に知
られている。実験の詳細は、以下に説明しない限り、
「ニュークリイック・アシッド・ハイブリダイゼーショ
ン」（Ｎucleic acid hybridization）ビー・ディ・ヘ
イムズ（Ｂ.Ｄ.Ｈames）およびエス・ジェイ・ヒギンズ
（Ｓ.Ｊ.Ｈiggins）編、アイアールエル・プレス（ＩＲ
Ｌ Ｐress）、１９８６、例えば、第１章（ハイブリダ
イゼーション・ストラテジー（Ｈybridization Ｓtrate
gy））、第３章（クォンティテイティブ・アナリシス・
オブ・ソリューション・ハイブリダイゼーション（Ｑua
ntitative Ａnalysis of Ｓolution Ｈybridizatio
n））および第４章（クォンティテイティブ・フィルタ
ー・ハイブリダイゼーション（Ｑuantitative Ｆilter
Ｈybridization））、カレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐrotocols
in Ｍolecular Ｂiology）、エフ・エム・オーズベル
（Ｆ.Ｍ.Ａusubel）ら編、ジェイ・ウィリィ・アンド・
サン（Ｊ.Ｗiley and Ｓon）、１９８７、およびモレキ
ュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）、ジェ
イ・サンブルーク（Ｊ.Ｓambrook）ら、ＣＳＨ、１９８
９の全内容を参照する。他の公知の方法としては、ＥＰ
−Ａ−０ ３２４ ４７４に開示されているような標識ヌ
クレオシド三リン酸の調製、修飾および非修飾オリゴヌ
クレオチドの化学合成、核酸の制限酵素による切断、ハ
イブリダイズされるべき核酸間の相補性の程度に依存す
る特異性を達成するためのＧＣ含量および長さについて
のハイブリダイゼーション条件の選択、ならびに、ポリ
メラーゼの助けおよび所望によりいわゆるプライマーの
使用によるヌクレオシド三リン酸からの核酸の合成が挙
げられる。
【００１１】本発明に係る標識としては、直接または間
接的に検出可能な基Ｌが挙げられる。直接的に検出可能
な基としては、例えば、放射性（32Ｐ）の、着色され
た、または蛍光性の基または金属原子が挙げられる。間
接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハ
プテンまたは酵素などの免疫学的または酵素学的に活性
な化合物、または、酵素学的に活性な部分酵素が挙げら
れる。これらは、次の反応または反応シーケンスで検出
される。特に好ましいものは、ハプテンである。ハプテ
ンがヌクレオシド三リン酸上で標識として使用される場
合、それらは、一般に、ポリメラーゼの基質として、お
よび、ハプテンまたはハプテン化ヌクレオシドに対する
標識抗体との次反応について、特に好適である。かかる
ヌクレオシド三リン酸としては、例えば、ブロミウムヌ
クレオシド三リン酸またはジゴキシゲニン−、ジゴキシ
ン−、ビオチン−またはフルオレセイン−結合ヌクレオ
シド三リン酸が挙げられる。ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７
４に記載されているステロイドおよびそれらの検出が特
に好適である。核酸の取込みについてのさらなる詳細に
ついては、ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４を参照のこと。
接的に検出可能な基Ｌが挙げられる。直接的に検出可能
な基としては、例えば、放射性（32Ｐ）の、着色され
た、または蛍光性の基または金属原子が挙げられる。間
接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハ
プテンまたは酵素などの免疫学的または酵素学的に活性
な化合物、または、酵素学的に活性な部分酵素が挙げら
れる。これらは、次の反応または反応シーケンスで検出
される。特に好ましいものは、ハプテンである。ハプテ
ンがヌクレオシド三リン酸上で標識として使用される場
合、それらは、一般に、ポリメラーゼの基質として、お
よび、ハプテンまたはハプテン化ヌクレオシドに対する
標識抗体との次反応について、特に好適である。かかる
ヌクレオシド三リン酸としては、例えば、ブロミウムヌ
クレオシド三リン酸またはジゴキシゲニン−、ジゴキシ
ン−、ビオチン−またはフルオレセイン−結合ヌクレオ
シド三リン酸が挙げられる。ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７
４に記載されているステロイドおよびそれらの検出が特
に好適である。核酸の取込みについてのさらなる詳細に
ついては、ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４を参照のこと。
【００１２】可能なヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）
は、リボ（ｒＮＴＰ）またはデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（ｄＮＴＰ）である。
は、リボ（ｒＮＴＰ）またはデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（ｄＮＴＰ）である。
【００１３】プローブ核酸Ｂについて可能な分子は、お
互いに結合している２つの部分Ｂ１およびＢ２を含有す
るものである。部分Ｂ１は、標的核酸または少なくとも
その一部とハイブリダイズすることができるという点が
特徴付けられる。この部分は、これを達成するのに充分
に相補的である。さらにまた、部分Ｂ１は、標的核酸と
ハイブリダイズした形で存在する場合、切断しなければ
ならない。これに関係して、該切断は、部分Ｂ１の、も
はやお互いに結合していない２つ以上の部分への分離で
あると解されるが、一方、標的核酸は、切断されない。
したがって、部分Ｂ１は、リボヌクレオチドまたは非塩
基性（abasic）配列を含有する。好ましくは、部分Ｂ１
は、慣用手段でお互いに結合している２つ以上のモノリ
ボヌクレオチド単位を含有するが、一方、それに相補的
である標的核酸の当該部分は、デオキシリボ核酸であ
る。この場合、プローブ核酸Ｂの部分Ｂ１における切断
は、形成されたハイブリッドをＲＮＡｓｅと接触させる
ことで行うことができる。非塩基性配列が存在する場
合、消化は、ＡＰエンドヌクレアーゼによって行うこと
ができる。
互いに結合している２つの部分Ｂ１およびＢ２を含有す
るものである。部分Ｂ１は、標的核酸または少なくとも
その一部とハイブリダイズすることができるという点が
特徴付けられる。この部分は、これを達成するのに充分
に相補的である。さらにまた、部分Ｂ１は、標的核酸と
ハイブリダイズした形で存在する場合、切断しなければ
ならない。これに関係して、該切断は、部分Ｂ１の、も
はやお互いに結合していない２つ以上の部分への分離で
あると解されるが、一方、標的核酸は、切断されない。
したがって、部分Ｂ１は、リボヌクレオチドまたは非塩
基性（abasic）配列を含有する。好ましくは、部分Ｂ１
は、慣用手段でお互いに結合している２つ以上のモノリ
ボヌクレオチド単位を含有するが、一方、それに相補的
である標的核酸の当該部分は、デオキシリボ核酸であ
る。この場合、プローブ核酸Ｂの部分Ｂ１における切断
は、形成されたハイブリッドをＲＮＡｓｅと接触させる
ことで行うことができる。非塩基性配列が存在する場
合、消化は、ＡＰエンドヌクレアーゼによって行うこと
ができる。
【００１４】ハイブリダイズ可能な部分Ｂ１の少なくと
も一部は、消化される。この結果、標的核酸とハイブリ
ダイズしない核酸選択的部分Ｂ２、および、可能であれ
ば、標的核酸と初期にハイブリダイズされた部分Ｂ１の
一部を含有する切断生成物Ｂ'が生じる。
も一部は、消化される。この結果、標的核酸とハイブリ
ダイズしない核酸選択的部分Ｂ２、および、可能であれ
ば、標的核酸と初期にハイブリダイズされた部分Ｂ１の
一部を含有する切断生成物Ｂ'が生じる。
【００１５】標的核酸のプローブ核酸とのハイブリダイ
ゼーションのための条件は、好ましくは、プローブ核酸
を標的核酸と特異的ハイブリダイズさせるように選択さ
れるが、プローブ核酸の、試料中の検出されるべきでは
ない別の核酸との非特異的ハイブリダイゼーションは、
防止される。切断生成物Ｂ'を含むプローブ核酸の切断
により生じたフラグメントは、オリジナルプローブ核酸
よりも短く、もはや、選択された条件下で標的核酸と安
定なハイブリッドを形成することができない。故に、そ
れらは、選択された条件下で標的核酸Ａを放出する。
ゼーションのための条件は、好ましくは、プローブ核酸
を標的核酸と特異的ハイブリダイズさせるように選択さ
れるが、プローブ核酸の、試料中の検出されるべきでは
ない別の核酸との非特異的ハイブリダイゼーションは、
防止される。切断生成物Ｂ'を含むプローブ核酸の切断
により生じたフラグメントは、オリジナルプローブ核酸
よりも短く、もはや、選択された条件下で標的核酸と安
定なハイブリッドを形成することができない。故に、そ
れらは、選択された条件下で標的核酸Ａを放出する。
【００１６】プローブ核酸を切断することにより、部分
Ｂ２だけまたは部分Ｂ１の残存物も含有する種々のフラ
グメントＢ'が生じることがある。これは、適用された
条件に依存する。
Ｂ２だけまたは部分Ｂ１の残存物も含有する種々のフラ
グメントＢ'が生じることがある。これは、適用された
条件に依存する。
【００１７】核酸の核酸特異的部分は、選択された条件
下で特異的ハイブリダイゼーションにより生じる、標的
核酸とは別の配列とハイブリダイズすることができる配
列であると解される、すなわち、当該方法に関する反応
混合物中に存在する別の核酸とのハイブリダイゼーショ
ンはない。典型的な核酸特異的部分は、プローブ核酸の
部分Ｂ２およびマトリックス核酸の部分Ｃ２である。
下で特異的ハイブリダイゼーションにより生じる、標的
核酸とは別の配列とハイブリダイズすることができる配
列であると解される、すなわち、当該方法に関する反応
混合物中に存在する別の核酸とのハイブリダイゼーショ
ンはない。典型的な核酸特異的部分は、プローブ核酸の
部分Ｂ２およびマトリックス核酸の部分Ｃ２である。
【００１８】標的核酸とハイブリダイズしないプローブ
核酸の核酸特異的部分Ｂ２は、部分Ｂ１の標的配列特異
的消化に適用する条件下では消化されないという条件を
満足しなければならない。さらにまた、それは、以下に
説明するマトリックスオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズできなければならない。部分Ｂ２の配列は、主とし
て、所望により選択される。考慮しなければならないこ
とは、切断生成物Ｂ'のマトリックスオリゴヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションが標的核酸との相補性を
有する場合、より困難になるということである。これ
は、最適な場合と比較して、感度を減少させる。さらに
また、プローブ分子が部分二本鎖を形成しようとするこ
とは回避されるべきである。Ｂ２は、リボ核酸、デオキ
シリボ核酸または修飾核酸であってもよい。ハイブリダ
イズ可能な部分Ｂ１がリボ核酸を含有し、切断がＲＮＡ
ｓｅによって行われる場合、部分Ｂ２は、好ましくは、
好ましい方法でこれらの条件下で切断することができる
リボ核酸ではなく、デオキシリボ核酸である。しかしな
がら、Ｂ２は、もはやＲＮＡｓｅによって切断すること
ができないように修飾されているリボ核酸でもある。も
う１つのオプションは、核酸のハイブリダイゼーション
特性を示すが、もはやリン酸−糖鎖部分を有しない核酸
類似体の使用である。この目的に特に好適なものは、Ｗ
Ｏ ９２／２０７０２またはＷＯ ８６／０５５１８に開
示されているＰＮＡ分子である。この部分が標的核酸と
ハイブリダイズしない条件は、特に、プローブ核酸の標
的核酸とのハイブリダイゼーションに適用する条件に関
連している。好ましい方法では、部分Ｂ２は、試料中の
検出されるべきではない核酸とハイブリダイズしないよ
うに選択される。しかしながら、部分Ｂ２は、マトリッ
クス核酸Ｃとハイブリダイズすることができる配列を含
有すべきである。標的核酸のプローブ核酸とのハイブリ
ダイゼーションおよびマトリックス核酸の切断生成物
Ｂ'とのハイブリダイゼーションのための条件は、所望
により選択することができる。
核酸の核酸特異的部分Ｂ２は、部分Ｂ１の標的配列特異
的消化に適用する条件下では消化されないという条件を
満足しなければならない。さらにまた、それは、以下に
説明するマトリックスオリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズできなければならない。部分Ｂ２の配列は、主とし
て、所望により選択される。考慮しなければならないこ
とは、切断生成物Ｂ'のマトリックスオリゴヌクレオチ
ドとのハイブリダイゼーションが標的核酸との相補性を
有する場合、より困難になるということである。これ
は、最適な場合と比較して、感度を減少させる。さらに
また、プローブ分子が部分二本鎖を形成しようとするこ
とは回避されるべきである。Ｂ２は、リボ核酸、デオキ
シリボ核酸または修飾核酸であってもよい。ハイブリダ
イズ可能な部分Ｂ１がリボ核酸を含有し、切断がＲＮＡ
ｓｅによって行われる場合、部分Ｂ２は、好ましくは、
好ましい方法でこれらの条件下で切断することができる
リボ核酸ではなく、デオキシリボ核酸である。しかしな
がら、Ｂ２は、もはやＲＮＡｓｅによって切断すること
ができないように修飾されているリボ核酸でもある。も
う１つのオプションは、核酸のハイブリダイゼーション
特性を示すが、もはやリン酸−糖鎖部分を有しない核酸
類似体の使用である。この目的に特に好適なものは、Ｗ
Ｏ ９２／２０７０２またはＷＯ ８６／０５５１８に開
示されているＰＮＡ分子である。この部分が標的核酸と
ハイブリダイズしない条件は、特に、プローブ核酸の標
的核酸とのハイブリダイゼーションに適用する条件に関
連している。好ましい方法では、部分Ｂ２は、試料中の
検出されるべきではない核酸とハイブリダイズしないよ
うに選択される。しかしながら、部分Ｂ２は、マトリッ
クス核酸Ｃとハイブリダイズすることができる配列を含
有すべきである。標的核酸のプローブ核酸とのハイブリ
ダイゼーションおよびマトリックス核酸の切断生成物
Ｂ'とのハイブリダイゼーションのための条件は、所望
により選択することができる。
【００１９】本発明のマトリックス核酸Ｃは、切断生成
物Ｂ'、および、特に、その核酸特異的部分Ｂ２または
その一部、および所望により存在するＢ１の残存部とハ
イブリダイズすることができる部分Ｃ２を含有する。マ
トリックス核酸Ｃについて好適な分子は、この種のハイ
ブリダイゼーションを行わせしめる全てのもの、すなわ
ち、天然ヌクレオチド成分からなる核酸であるが、しか
しながら、天然ではない成分からなるかまたはかかる成
分を含有する核酸類似体も可能である。さらにまた、マ
トリックス核酸は、選択された条件下での消化に対して
安定であるべきである。プローブ核酸の切断がＲＮＡｓ
ｅを用いて行われる場合、特に好ましいマトリックス核
酸は、デオキシリボ核酸である。マトリックス核酸は、
部分Ｃ２に加えて、部分Ｂ１またはプローブ核酸の部分
Ｂ１の存在する残存部とハイブリダイズすることができ
ない部分Ｃ１も有する。特に好ましい方法では、この部
分Ｃ１は、選択された条件下で、試料中の検出されるべ
きではない核酸または標的核酸自体と安定なハイブリッ
ドを形成しない。部分Ｃ１が部分Ｃ２から始まって５'
方向にあるのが好ましい。
物Ｂ'、および、特に、その核酸特異的部分Ｂ２または
その一部、および所望により存在するＢ１の残存部とハ
イブリダイズすることができる部分Ｃ２を含有する。マ
トリックス核酸Ｃについて好適な分子は、この種のハイ
ブリダイゼーションを行わせしめる全てのもの、すなわ
ち、天然ヌクレオチド成分からなる核酸であるが、しか
しながら、天然ではない成分からなるかまたはかかる成
分を含有する核酸類似体も可能である。さらにまた、マ
トリックス核酸は、選択された条件下での消化に対して
安定であるべきである。プローブ核酸の切断がＲＮＡｓ
ｅを用いて行われる場合、特に好ましいマトリックス核
酸は、デオキシリボ核酸である。マトリックス核酸は、
部分Ｃ２に加えて、部分Ｂ１またはプローブ核酸の部分
Ｂ１の存在する残存部とハイブリダイズすることができ
ない部分Ｃ１も有する。特に好ましい方法では、この部
分Ｃ１は、選択された条件下で、試料中の検出されるべ
きではない核酸または標的核酸自体と安定なハイブリッ
ドを形成しない。部分Ｃ１が部分Ｃ２から始まって５'
方向にあるのが好ましい。
【００２０】マトリックス核酸および核酸特異的部分Ｂ
２は、次反応でデオキシヌクレオチドの取込みを検出し
ようとする場合、切断生成物Ｂ'またはプローブ核酸の
５'末端がそれらのハイブリダイゼーション条件下でマ
トリックス核酸の３'末端を超えては伸長しないように
選択されるのが好ましい。これは、マトリックス核酸の
酵素的伸長を防止すきべである。同一の効果は、酵素的
伸長に対してその３'末端でマトリックス核酸を保護す
ることによって、例えば、非伸長性モノヌクレオチドを
使用することによって、達成することができる。
２は、次反応でデオキシヌクレオチドの取込みを検出し
ようとする場合、切断生成物Ｂ'またはプローブ核酸の
５'末端がそれらのハイブリダイゼーション条件下でマ
トリックス核酸の３'末端を超えては伸長しないように
選択されるのが好ましい。これは、マトリックス核酸の
酵素的伸長を防止すきべである。同一の効果は、酵素的
伸長に対してその３'末端でマトリックス核酸を保護す
ることによって、例えば、非伸長性モノヌクレオチドを
使用することによって、達成することができる。
【００２１】如何なる場合でも、確実に、１または数個
の切断生成物Ｂ'が、Ｂ'が切断の結果として生成された
末端でマトリックス核酸ともハイブリダイズするように
マトリックス核酸とハイブリダイズすることができ、マ
トリックス核酸の部分Ｃ１が、ハイブリダイズする場
合、切断の結果として生成された切断生成物Ｂ'の末端
を超えてもなお伸長するべきである。
の切断生成物Ｂ'が、Ｂ'が切断の結果として生成された
末端でマトリックス核酸ともハイブリダイズするように
マトリックス核酸とハイブリダイズすることができ、マ
トリックス核酸の部分Ｃ１が、ハイブリダイズする場
合、切断の結果として生成された切断生成物Ｂ'の末端
を超えてもなお伸長するべきである。
【００２２】次工程では、切断生成物Ｂ'およびマトリ
ックス核酸Ｃからなるハイブリッドが測定される。この
測定は、非切断プローブ核酸Ｂおよびマトリックス核酸
Ｃからなる、形成される可能性のあるハイブリッドが検
出されないように行われる。
ックス核酸Ｃからなるハイブリッドが測定される。この
測定は、非切断プローブ核酸Ｂおよびマトリックス核酸
Ｃからなる、形成される可能性のあるハイブリッドが検
出されないように行われる。
【００２３】これらのオプションのうちの１つは、切断
生成物Ｂ'はマトリックス核酸の助けにより伸長される
が、非切断プローブ核酸Ｂは伸長されないという事実に
基づいている。これは、プローブ核酸の部分Ｂ１とハイ
ブリダイズしないマトリックス核酸の前記構造と特性に
よるものであるが、切断生成物Ｂ'は、マトリックス核
酸とハイブリダイズする。切断生成物Ｂ'は、特に、切
断部位で（Ｂ'の３'末端で）Ｃとハイブリダイズする。
マトリックス核酸の末端は、切断生成物の末端を超えて
伸長するので、マトリックス核酸Ｃの対応する部分に対
して相補的である核酸は、伸長反応において付着され
る。かかる伸長反応のいくつかの変形法が存在する。１
つの変形法は、ＤＮＡポリメラーゼの助けによるモノヌ
クレオチドの付着である。好ましい場合、使用されるモ
ノヌクレオシド三リン酸は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ３
２４ ４７４に従って標識される。モノヌクレオシド三
リン酸が標識されない場合、伸長生成物の形成は、ゲル
電気泳動による分離を介して検出される。特定の具体例
では、２つの異なる標識を取り込むことも可能である。
この場合、１つの標識は、形成された伸長生成物の固定
化のために使用され、もう１つの標識は、検出のために
供される。これは、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ４３７ ７７
４に開示されている条件下で可能である。
生成物Ｂ'はマトリックス核酸の助けにより伸長される
が、非切断プローブ核酸Ｂは伸長されないという事実に
基づいている。これは、プローブ核酸の部分Ｂ１とハイ
ブリダイズしないマトリックス核酸の前記構造と特性に
よるものであるが、切断生成物Ｂ'は、マトリックス核
酸とハイブリダイズする。切断生成物Ｂ'は、特に、切
断部位で（Ｂ'の３'末端で）Ｃとハイブリダイズする。
マトリックス核酸の末端は、切断生成物の末端を超えて
伸長するので、マトリックス核酸Ｃの対応する部分に対
して相補的である核酸は、伸長反応において付着され
る。かかる伸長反応のいくつかの変形法が存在する。１
つの変形法は、ＤＮＡポリメラーゼの助けによるモノヌ
クレオチドの付着である。好ましい場合、使用されるモ
ノヌクレオシド三リン酸は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ３
２４ ４７４に従って標識される。モノヌクレオシド三
リン酸が標識されない場合、伸長生成物の形成は、ゲル
電気泳動による分離を介して検出される。特定の具体例
では、２つの異なる標識を取り込むことも可能である。
この場合、１つの標識は、形成された伸長生成物の固定
化のために使用され、もう１つの標識は、検出のために
供される。これは、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ４３７ ７７
４に開示されている条件下で可能である。
【００２４】もう１つの具体例では、切断生成物Ｂ'
は、ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして供
される。切断されない場合、プローブ核酸Ｂは、プライ
マーとして作用することはできない。この場合、ＰＣＲ
の鋳型は、マトリックス核酸である。２つの異なるプロ
ーブ核酸Ｂを使用する場合、すなわち、それらがお互い
に相補的である標的核酸の異なる領域にハイブリダイズ
する場合、両方のプライマーは、ＰＣＲにおいて生じる
ことができる。
は、ポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして供
される。切断されない場合、プローブ核酸Ｂは、プライ
マーとして作用することはできない。この場合、ＰＣＲ
の鋳型は、マトリックス核酸である。２つの異なるプロ
ーブ核酸Ｂを使用する場合、すなわち、それらがお互い
に相補的である標的核酸の異なる領域にハイブリダイズ
する場合、両方のプライマーは、ＰＣＲにおいて生じる
ことができる。
【００２５】切断生成物Ｂ'を伸長させるもう１つの可
能性は、リガーゼ反応である。この場合、ハイブリダイ
ズされた切断生成物Ｂ'とこのオリゴヌクレオチドとの
間にニックが残存するようにマトリックス核酸とハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドが添加される。次い
で、このニックは、リガーゼの助けにより閉じられる。
能性は、リガーゼ反応である。この場合、ハイブリダイ
ズされた切断生成物Ｂ'とこのオリゴヌクレオチドとの
間にニックが残存するようにマトリックス核酸とハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドが添加される。次い
で、このニックは、リガーゼの助けにより閉じられる。
【００２６】もう１つの好ましい具体例では、マトリッ
クス核酸の部分Ｃ１は、転写−または複製−開始配列を
含有する。Ｃ１は、好ましくは、プロモーター配列を含
有する。機能的完全プロモーターは、切断生成物Ｂ１の
マトリックス制御伸長の間に形成される。伸長が実際に
生じた場合にのみ生じることができる転写開始後、切断
生成物の発生を検出することができ、故に、標的核酸の
存在を検出することができる。これを達成するために、
プロモーター特異的ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼ、および、好ましくは一部分が標
識を有するリボヌクレオシド三リン酸を含む転写に必要
な全ての試薬が反応混合物に添加される。次いで、転写
物の存在は、標的核酸の検出のために使用することがで
きる。invitro転写に必要な試薬および条件は、例え
ば、ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２に開示されている。第
１の具体例と比較すると、次に転写が行われる場合、感
度は、高い。
クス核酸の部分Ｃ１は、転写−または複製−開始配列を
含有する。Ｃ１は、好ましくは、プロモーター配列を含
有する。機能的完全プロモーターは、切断生成物Ｂ１の
マトリックス制御伸長の間に形成される。伸長が実際に
生じた場合にのみ生じることができる転写開始後、切断
生成物の発生を検出することができ、故に、標的核酸の
存在を検出することができる。これを達成するために、
プロモーター特異的ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼ、および、好ましくは一部分が標
識を有するリボヌクレオシド三リン酸を含む転写に必要
な全ての試薬が反応混合物に添加される。次いで、転写
物の存在は、標的核酸の検出のために使用することがで
きる。invitro転写に必要な試薬および条件は、例え
ば、ＥＰ−Ａ−０ ３２９ ８２２に開示されている。第
１の具体例と比較すると、次に転写が行われる場合、感
度は、高い。
【００２７】本発明の方法に関する温度は、使用される
酵素の活性ができる限り最適であるように選択される
が、ハイブリダイゼーション条件は、同時に、充分な特
異性を考慮に入れるように選択される。非熱安定なＲＮ
Ａｓｅを使用する場合、好都合な温度範囲は、３０°〜
６０°であり、好ましい温度は、４２°である。熱安定
なＲＮＡｓｅを使用する場合、より高い温度も可能であ
る。伸長反応のために使用される温度は、伸長に使用さ
れる酵素にも依存する。熱安定な酵素、例えば、Ｔａｑ
−ＤＮＡポリメラーゼの使用のためには、５０°〜８０
°が好ましく、特に好ましくは、６０°〜７０°であ
る。転写酵素を使用する場合、最適な温度は、酵素の活
性に依存し、例えば、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６ポリメラ
ーゼについては、２５°〜４５°、特に好ましくは、３
７°である。
酵素の活性ができる限り最適であるように選択される
が、ハイブリダイゼーション条件は、同時に、充分な特
異性を考慮に入れるように選択される。非熱安定なＲＮ
Ａｓｅを使用する場合、好都合な温度範囲は、３０°〜
６０°であり、好ましい温度は、４２°である。熱安定
なＲＮＡｓｅを使用する場合、より高い温度も可能であ
る。伸長反応のために使用される温度は、伸長に使用さ
れる酵素にも依存する。熱安定な酵素、例えば、Ｔａｑ
−ＤＮＡポリメラーゼの使用のためには、５０°〜８０
°が好ましく、特に好ましくは、６０°〜７０°であ
る。転写酵素を使用する場合、最適な温度は、酵素の活
性に依存し、例えば、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６ポリメラ
ーゼについては、２５°〜４５°、特に好ましくは、３
７°である。
【００２８】反応の部位での酵素の存在の変化を増加さ
せることにより、転換速度を増大させることもでき、次
いで、必要な反応時間を減少させるか、または感度を増
加させることもできる。
せることにより、転換速度を増大させることもでき、次
いで、必要な反応時間を減少させるか、または感度を増
加させることもできる。
【００２９】マトリックス核酸は、環状分子であっても
よい。この場合、鎖置換活性を有する伸長酵素の使用が
好ましい。
よい。この場合、鎖置換活性を有する伸長酵素の使用が
好ましい。
【００３０】高いフレキシビリティおよび可能な二重標
識化により、試験ストリップ上での方法の使用またはビ
ーズへの結合を介する検出、および、次なるフローサイ
トメトリーまたはキャピラリー電気泳動を介する検出が
可能である。
識化により、試験ストリップ上での方法の使用またはビ
ーズへの結合を介する検出、および、次なるフローサイ
トメトリーまたはキャピラリー電気泳動を介する検出が
可能である。
【００３１】可能な具体例では、マトリックス核酸の一
部は、複製可能なＲＮＡの合成のためのマトリックスと
して供される配列、例えば、ＭＤＶ １ ＲＮＡまたはよ
り短い配列を含有する。
部は、複製可能なＲＮＡの合成のためのマトリックスと
して供される配列、例えば、ＭＤＶ １ ＲＮＡまたはよ
り短い配列を含有する。
【００３２】主として、プローブ核酸およびマトリック
ス核酸は、それらの部分の配列が決定されるとすぐに、
公知の方法に従って製造することができる。好ましい場
合、１００未満のモノヌクレオチド成分長さを有するオ
リゴヌクレオチドが使用される場合、一般的な化学方法
（例えば、メリィフィールド（Ｍerrifield）に従う固
相合成法）によるそれらの合成が好ましい。これによ
り、混合オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ）
の合成も容易になる。大きな核酸については、ＥＰ−Ａ
−３２５ ９７０に開示されているような、遺伝子工学
または化学／酵素的方法が好ましい。部分Ｂ１は、好ま
しくは、１２−３５ヌクレオチド長さを有し、部分Ｂ２
は、好ましくは、１５−５０ヌクレオチド長さを有し、
部分Ｃ１は、好ましくは、１０−１００ヌクレオチド長
さを有し、部分Ｃ２は、１５−５０ヌクレオチド長さを
有する。
ス核酸は、それらの部分の配列が決定されるとすぐに、
公知の方法に従って製造することができる。好ましい場
合、１００未満のモノヌクレオチド成分長さを有するオ
リゴヌクレオチドが使用される場合、一般的な化学方法
（例えば、メリィフィールド（Ｍerrifield）に従う固
相合成法）によるそれらの合成が好ましい。これによ
り、混合オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ）
の合成も容易になる。大きな核酸については、ＥＰ−Ａ
−３２５ ９７０に開示されているような、遺伝子工学
または化学／酵素的方法が好ましい。部分Ｂ１は、好ま
しくは、１２−３５ヌクレオチド長さを有し、部分Ｂ２
は、好ましくは、１５−５０ヌクレオチド長さを有し、
部分Ｃ１は、好ましくは、１０−１００ヌクレオチド長
さを有し、部分Ｃ２は、１５−５０ヌクレオチド長さを
有する。
【００３３】以下に図面を用いて、本発明を説明する。
【００３４】「図１」は、ＤＮＡポリメラーゼの助けに
よる非放射性標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸の
取込みに基づく本発明方法の第１の具体例を概略示す流
れ図である。
よる非放射性標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸の
取込みに基づく本発明方法の第１の具体例を概略示す流
れ図である。
【００３５】「図２」は、マトリックスオリゴヌクレオ
チドがプロモーター配列を含有し、これが機能性プロモ
ーターに戻され、次いで、転写される本発明方法の具体
例を概略示す流れ図である。該プロモーター配列は、ハ
ッチングで示される。
チドがプロモーター配列を含有し、これが機能性プロモ
ーターに戻され、次いで、転写される本発明方法の具体
例を概略示す流れ図である。該プロモーター配列は、ハ
ッチングで示される。
【００３６】「図３」は、各反応混合物のために使用さ
れる１０pmolのマトリックス核酸を有するプローブ核酸
の量に依存する「図１」に従った方法の感度を示すグラ
フである。
れる１０pmolのマトリックス核酸を有するプローブ核酸
の量に依存する「図１」に従った方法の感度を示すグラ
フである。
【００３７】「図４」〜「図６」は、ハイブリダイゼー
ションおよび消化反応のインキュベーョン温度（４２
℃、５０℃および５６℃）に依存する「図１」に従った
方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラフで
ある。
ションおよび消化反応のインキュベーョン温度（４２
℃、５０℃および５６℃）に依存する「図１」に従った
方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラフで
ある。
【００３８】「図７」は、図２の方法に従った検出の感
度を示すグラフである。
度を示すグラフである。
【００３９】「図８」は、プローブ核酸およびマトリッ
クス核酸がお互いに結合される具体例を概略示す流れ図
である。
クス核酸がお互いに結合される具体例を概略示す流れ図
である。
【００４０】図面に示される工程は、個々に必要な試薬
を添加しつつ連続的に行うことができる。成分の設計を
対応させるとすれば、同時に生じるプロセスを有するよ
うに、全ての必要な成分を反応の開始時に添加すること
もできる。
を添加しつつ連続的に行うことができる。成分の設計を
対応させるとすれば、同時に生じるプロセスを有するよ
うに、全ての必要な成分を反応の開始時に添加すること
もできる。
【００４１】第１の好ましい具体例（「図１」）では、
ハイブリダイズさせるべき標的ＤＮＡを含有する試料に
キメラＲＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプ
ローブ分子を添加する。ＲＮＡｓｅ Ｈの作用により、
プローブの標的配列特異的ＲＮＡ部分が消化される。次
いで、好適なハイブリダイゼーション条件を設定し、マ
トリックスオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼな
らびに標識および非標識デオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸と一緒に添加する。例えば、未反応の標識デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸から核酸を分離することによ
って、標識モノヌクレオチドの取込みを検出することが
できる。２つの異なる標識を有するヌクレオチドを使用
する場合には、直接的な固相ベースの検出が可能であ
る。試料中に含有された標的ＤＮＡが全くない場合、マ
トリックスオリゴヌクレオチドは、キメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａプローブ分子とのみハイブリダイズする。プローブ分
子の伸長は、３'末端がマトリックスオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズしない場合は、起こり得ない。
ハイブリダイズさせるべき標的ＤＮＡを含有する試料に
キメラＲＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプ
ローブ分子を添加する。ＲＮＡｓｅ Ｈの作用により、
プローブの標的配列特異的ＲＮＡ部分が消化される。次
いで、好適なハイブリダイゼーション条件を設定し、マ
トリックスオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼな
らびに標識および非標識デオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸と一緒に添加する。例えば、未反応の標識デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸から核酸を分離することによ
って、標識モノヌクレオチドの取込みを検出することが
できる。２つの異なる標識を有するヌクレオチドを使用
する場合には、直接的な固相ベースの検出が可能であ
る。試料中に含有された標的ＤＮＡが全くない場合、マ
トリックスオリゴヌクレオチドは、キメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａプローブ分子とのみハイブリダイズする。プローブ分
子の伸長は、３'末端がマトリックスオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズしない場合は、起こり得ない。
【００４２】第２の好ましい具体例（「図２」）では、
試料中に含有される標的ＤＮＡは、キメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａプローブ分子またはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプローブ
分子にハイブリダイズする。ＲＮＡｓｅ Ｈの作用によ
る標的配列特異的ＲＮＡ部分の消化の後、切断生成物
は、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、その５’
末端で切断生成物の末端を超えて伸長し、一本鎖プロモ
ーター配列を含有する。ＤＮＡポリメラーゼおよびデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸を添加することにより、
切断生成物の３’末端は、機能性プロモーターを形成す
るように伸長する。得られた二本鎖核酸は、ＲＮＡポリ
メラーゼおよびヌクレオシド三リン酸による転写に付さ
れる。種々のポリメラーゼのためのプロモーター配列
は、専門家に知られている［例えば、ニュークリイック
・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.ＡcidsＲes.）、１２、
７０３５−３０５６（１９８４）］。
試料中に含有される標的ＤＮＡは、キメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａプローブ分子またはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプローブ
分子にハイブリダイズする。ＲＮＡｓｅ Ｈの作用によ
る標的配列特異的ＲＮＡ部分の消化の後、切断生成物
は、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、その５’
末端で切断生成物の末端を超えて伸長し、一本鎖プロモ
ーター配列を含有する。ＤＮＡポリメラーゼおよびデオ
キシリボヌクレオシド三リン酸を添加することにより、
切断生成物の３’末端は、機能性プロモーターを形成す
るように伸長する。得られた二本鎖核酸は、ＲＮＡポリ
メラーゼおよびヌクレオシド三リン酸による転写に付さ
れる。種々のポリメラーゼのためのプロモーター配列
は、専門家に知られている［例えば、ニュークリイック
・アシッズ・リサーチ（Ｎucl.ＡcidsＲes.）、１２、
７０３５−３０５６（１９８４）］。
【００４３】第３の具体例（「図８」）では、プローブ
核酸およびマトリックス核酸は、別々の分子ではなく、
お互いに結合されている。これを達成するために、マト
リックス核酸の一端は、プローブ核酸の、向きがＢ１か
ら逸れている部分Ｂ２の末端に結合されており、その結
果、部分Ｃ２および部分Ｂ２がハイブリダイズしてヘア
ピン構造を形成することができ、かつ、部分Ｂ１および
Ｃ１がこのヘアピン分子の両端になる。部分Ｂ２および
Ｃ２は、例えば、好ましくはオリゴ−ｄＡなどのモノヌ
クレオチド単位の助けにより、共有結合を介するなどの
望ましい方法で結合することができる。ヘアピン構造を
形成させるためには、３〜２０ヌクレオチドまたは同等
の長さのリンカーがハイブリダイズ可能な部分Ｃ２およ
びＢ２の間に提供されることが推奨される。Ｂ２がプロ
ーブ分子の５'末端に位置する場合、結合は、Ｂ２の５'
末端およびＣ２の３'末端の間で提供される。この具体
例の優れている点は、プローブ核酸およびマトリックス
核酸のハイブリダイジング部分の空間近接が反応速度を
増大させることである。
核酸およびマトリックス核酸は、別々の分子ではなく、
お互いに結合されている。これを達成するために、マト
リックス核酸の一端は、プローブ核酸の、向きがＢ１か
ら逸れている部分Ｂ２の末端に結合されており、その結
果、部分Ｃ２および部分Ｂ２がハイブリダイズしてヘア
ピン構造を形成することができ、かつ、部分Ｂ１および
Ｃ１がこのヘアピン分子の両端になる。部分Ｂ２および
Ｃ２は、例えば、好ましくはオリゴ−ｄＡなどのモノヌ
クレオチド単位の助けにより、共有結合を介するなどの
望ましい方法で結合することができる。ヘアピン構造を
形成させるためには、３〜２０ヌクレオチドまたは同等
の長さのリンカーがハイブリダイズ可能な部分Ｃ２およ
びＢ２の間に提供されることが推奨される。Ｂ２がプロ
ーブ分子の５'末端に位置する場合、結合は、Ｂ２の５'
末端およびＣ２の３'末端の間で提供される。この具体
例の優れている点は、プローブ核酸およびマトリックス
核酸のハイブリダイジング部分の空間近接が反応速度を
増大させることである。
【００４４】「図８」の具体例の説明は、「図２」（プ
ロモーターの発生）と同様に適用することができる。
ロモーターの発生）と同様に適用することができる。
【００４５】本発明の優れている点は、プローブ核酸Ｂ
が標識を含有する必要がないということである。これ
は、プローブ核酸の合成を容易にするが、これらの標識
によるバックグラウンドシグナルが後の検出反応で生じ
ることができないという結果をも有する。本発明の方法
では、標的配列は、増幅されない。故に、前実験からの
増幅された分子による汚染のリスクは、排除することが
できる。本発明の方法では、最後の反応工程の生成物
は、次の最初の反応工程のための基質としては使用され
ない。したがって、該反応は、容易に制御できる。増幅
が実質的に一次的であるという事実によって、定量測定
は容易になる。他方、指数増幅系に関して実際に陽性の
少量の試料による初期の陰性試料の交差汚染による偽陽
性の結果を得るリスクは減少する。本発明方法は、イン
キュベーション温度の循環変形のための技術的装置を必
要としない。本発明は、また、ＥＰ−Ａ−０ ４３７ ７
７４に従う２種類の非放射性標識の使用により、固相に
結合させ、生成物を検出させるかぎりではフレキシブル
でもある。反応工程の継続は、全体的に本発明の方法に
おけるプローブ分子の標的配列との特異的なハイブリダ
イゼーションに依存するので、非特異的結合、または、
例えば、複製可能なリボ核酸配列による増幅（Ｑβ複
製）の間に生じる場合のハイブリダイズしないプローブ
分子の持続性によって生じるバックグラウンドシグナル
は生じない。種々の配列の２つ以上のオリゴヌクレオチ
ドが１つの混合物中で反応させられる方法とは反対に、
オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ中のプライマー二
量体）の非特異的反応は、本発明の方法でほとんど完全
に排除することができる。本発明の方法は、非ストリン
ジェント型ハイブリダイゼーション条件下で行うことが
できる。これも、関連配列を検出させる。アッセイが非
常にストリンジェントな条件下で行われる場合、点突然
変異を検出することも可能である。本発明の方法では、
検出が初期に使用された標識プローブ分子に加えて標識
されたトランケートプローブ分子の検出を必要としない
という事実のために、分子を分離するためのゲル電気泳
動方法の使用は回避される。かくして、当該方法は、自
動化され、慣用の分析方法で使用することができる。
が標識を含有する必要がないということである。これ
は、プローブ核酸の合成を容易にするが、これらの標識
によるバックグラウンドシグナルが後の検出反応で生じ
ることができないという結果をも有する。本発明の方法
では、標的配列は、増幅されない。故に、前実験からの
増幅された分子による汚染のリスクは、排除することが
できる。本発明の方法では、最後の反応工程の生成物
は、次の最初の反応工程のための基質としては使用され
ない。したがって、該反応は、容易に制御できる。増幅
が実質的に一次的であるという事実によって、定量測定
は容易になる。他方、指数増幅系に関して実際に陽性の
少量の試料による初期の陰性試料の交差汚染による偽陽
性の結果を得るリスクは減少する。本発明方法は、イン
キュベーション温度の循環変形のための技術的装置を必
要としない。本発明は、また、ＥＰ−Ａ−０ ４３７ ７
７４に従う２種類の非放射性標識の使用により、固相に
結合させ、生成物を検出させるかぎりではフレキシブル
でもある。反応工程の継続は、全体的に本発明の方法に
おけるプローブ分子の標的配列との特異的なハイブリダ
イゼーションに依存するので、非特異的結合、または、
例えば、複製可能なリボ核酸配列による増幅（Ｑβ複
製）の間に生じる場合のハイブリダイズしないプローブ
分子の持続性によって生じるバックグラウンドシグナル
は生じない。種々の配列の２つ以上のオリゴヌクレオチ
ドが１つの混合物中で反応させられる方法とは反対に、
オリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ中のプライマー二
量体）の非特異的反応は、本発明の方法でほとんど完全
に排除することができる。本発明の方法は、非ストリン
ジェント型ハイブリダイゼーション条件下で行うことが
できる。これも、関連配列を検出させる。アッセイが非
常にストリンジェントな条件下で行われる場合、点突然
変異を検出することも可能である。本発明の方法では、
検出が初期に使用された標識プローブ分子に加えて標識
されたトランケートプローブ分子の検出を必要としない
という事実のために、分子を分離するためのゲル電気泳
動方法の使用は回避される。かくして、当該方法は、自
動化され、慣用の分析方法で使用することができる。
【００４６】本発明は、また、前記検出反応を行うため
の試薬キットを提供するものでもある。このキットは、
プローブ核酸Ｂおよびマトリックス核酸Ｃを別々にまた
は同一の容器中に含有する。好ましい方法では、試薬キ
ットは、ハイブリダイゼーションおよび消化反応および
／または伸長反応のための緩衝液も含有する。特に好ま
しい方法では、キットは、検出可能に標識されたモノヌ
クレオシド三リン酸を含有する。試薬が２つの異なる容
器中に提供される場合、第１の容器は、好ましくはプロ
ーブ核酸、消化反応を行うための酵素、および好適な緩
衝液を含有する。第２の容器中には、マトリックス核
酸、モノヌクレオシド三リン酸との伸長反応を行うため
の少なくとも１つの酵素および好適な緩衝液がある。
の試薬キットを提供するものでもある。このキットは、
プローブ核酸Ｂおよびマトリックス核酸Ｃを別々にまた
は同一の容器中に含有する。好ましい方法では、試薬キ
ットは、ハイブリダイゼーションおよび消化反応および
／または伸長反応のための緩衝液も含有する。特に好ま
しい方法では、キットは、検出可能に標識されたモノヌ
クレオシド三リン酸を含有する。試薬が２つの異なる容
器中に提供される場合、第１の容器は、好ましくはプロ
ーブ核酸、消化反応を行うための酵素、および好適な緩
衝液を含有する。第２の容器中には、マトリックス核
酸、モノヌクレオシド三リン酸との伸長反応を行うため
の少なくとも１つの酵素および好適な緩衝液がある。
【００４７】
【実施例】以下の実施例は、本発明をさらに詳しく説明
する。
する。
【００４８】実施例１
標識モノヌクレオチドを取り込む方法
以下の説明において、オリゴヌクレオチドにおいて使用
される大文字は、デオキシリボヌクレオチド単位を示
し、小文字は、リボヌクレオチド単位を示す。
される大文字は、デオキシリボヌクレオチド単位を示
し、小文字は、リボヌクレオチド単位を示す。
【００４９】方法：１pmol、１０pmolまたは１００pmol
のＲＮＡ−ＤＮＡプローブ分子（ＬＰＲ０３−１９Ｒ：
５'−ＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡ
ＣＴＣＡＣｃｇｃｃｇｃｇｕｃｇｃａｇａａｇａｕｃ−
３'（配列番号１）またはＬＰＲ０３−２５Ｒ：５'−Ｇ
ＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ
Ｃｃｇｃｃｇｃｇｕｃｇｃａｇａａｇａｕｃｕｃａａｕ
ｃ−３'（配列番号２））を、ＢＳＡ ３μｇ、２０Ｕの
ＲＮａｓｉｎおよび４ＵのＲＮａｓｅ Ｈを添加した緩
衝液Ｐ２（１０ｍＭ Ｈepes、１mＭ ＭgＣl2、pＨ８.
０）中、４２℃で３時間、１０μＬの容量で、種々の量
の検出されるべきＤＮＡ（ＤＨＢＶ１：５'−ＧＡＴＴ
ＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴ−
３'（配列番号３））と一緒にインキュベートした。次
いで、１０pmolのマトリックスオリゴヌクレオチドＴＡ
Ｑ（５'−ＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡ
ＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣ
ＴＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＴＣ−３'（配列番号４））を
添加した。次いで、該混合物を１００℃まで１分間加熱
し、すぐに、氷冷した。ポリメラーゼ反応のために、Ｔ
ａｑ緩衝液（１０mＭ ＴrisｐＨ８.３、５０mＭ ＫＣ
l、１.５mＭ ＭgＣl2、０.１mg／mＬゼラチン）２μ
Ｌ、ヌクレオチド混合物１−３（１μＭ ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ（各々、ベーリン
ガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim））および
ＢＩＯ−ｄＵＴＰ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehr
inger Ｍannheim））、２０ＵのＲＮａｓｉｎ、１Ｕの
Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼおよびＨ2Ｏを最終容量２
０μＬに添加し、６０℃で１５分間インキュベートし
た。
のＲＮＡ−ＤＮＡプローブ分子（ＬＰＲ０３−１９Ｒ：
５'−ＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡ
ＣＴＣＡＣｃｇｃｃｇｃｇｕｃｇｃａｇａａｇａｕｃ−
３'（配列番号１）またはＬＰＲ０３−２５Ｒ：５'−Ｇ
ＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ
Ｃｃｇｃｃｇｃｇｕｃｇｃａｇａａｇａｕｃｕｃａａｕ
ｃ−３'（配列番号２））を、ＢＳＡ ３μｇ、２０Ｕの
ＲＮａｓｉｎおよび４ＵのＲＮａｓｅ Ｈを添加した緩
衝液Ｐ２（１０ｍＭ Ｈepes、１mＭ ＭgＣl2、pＨ８.
０）中、４２℃で３時間、１０μＬの容量で、種々の量
の検出されるべきＤＮＡ（ＤＨＢＶ１：５'−ＧＡＴＴ
ＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴ−
３'（配列番号３））と一緒にインキュベートした。次
いで、１０pmolのマトリックスオリゴヌクレオチドＴＡ
Ｑ（５'−ＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡ
ＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣ
ＴＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＴＣ−３'（配列番号４））を
添加した。次いで、該混合物を１００℃まで１分間加熱
し、すぐに、氷冷した。ポリメラーゼ反応のために、Ｔ
ａｑ緩衝液（１０mＭ ＴrisｐＨ８.３、５０mＭ ＫＣ
l、１.５mＭ ＭgＣl2、０.１mg／mＬゼラチン）２μ
Ｌ、ヌクレオチド混合物１−３（１μＭ ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ（各々、ベーリン
ガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim））および
ＢＩＯ−ｄＵＴＰ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehr
inger Ｍannheim））、２０ＵのＲＮａｓｉｎ、１Ｕの
Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼおよびＨ2Ｏを最終容量２
０μＬに添加し、６０℃で１５分間インキュベートし
た。
【００５０】検出のために、該反応混合物を緩衝液Ｄ
（１０mＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８.０）、３０mＭ ＮaＣ
l、１mＭ ＭnＣl2）で２１０μＬに希釈した。洗浄用緩
衝液（ＰＢＳ（リン酸−緩衝化生理食塩水）中０.５％
Ｖ／Ｖ Ｔween ２０）で前洗浄したＳＡ−ＭＴＰのウエ
ル中に緩衝液Ｄで希釈した反応混合物１００μＬをピペ
ットで移すことによって、ＢＩＯ−ＤＩＧ−反応合成生
成物をストレプトアビジン被覆微量滴定プレート（ＴＲ
ＳＡ−ＳＡ−ＭＴＰ、マイクロ・コート（ＭicroＣoa
t）によって製造された）中に固定した。３７℃で１時
間の振盪下、ＭＴＰをインキュベートした（ウエル−ワ
ーム１（Ｗell−Ｗarm１）、デンリィ・インストゥルメ
ンツ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハ
フツング（Ｄenley Ｉnstruments ＧmbＨ））。
（１０mＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８.０）、３０mＭ ＮaＣ
l、１mＭ ＭnＣl2）で２１０μＬに希釈した。洗浄用緩
衝液（ＰＢＳ（リン酸−緩衝化生理食塩水）中０.５％
Ｖ／Ｖ Ｔween ２０）で前洗浄したＳＡ−ＭＴＰのウエ
ル中に緩衝液Ｄで希釈した反応混合物１００μＬをピペ
ットで移すことによって、ＢＩＯ−ＤＩＧ−反応合成生
成物をストレプトアビジン被覆微量滴定プレート（ＴＲ
ＳＡ−ＳＡ−ＭＴＰ、マイクロ・コート（ＭicroＣoa
t）によって製造された）中に固定した。３７℃で１時
間の振盪下、ＭＴＰをインキュベートした（ウエル−ワ
ーム１（Ｗell−Ｗarm１）、デンリィ・インストゥルメ
ンツ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハ
フツング（Ｄenley Ｉnstruments ＧmbＨ））。
【００５１】固定核酸分子を有するＭＴＰを洗浄緩衝液
２００μＬで５回洗浄した。次いで、コンジュゲート希
釈液（ポリクローナル＜ＤＩＧ＞−Ｓ−Ｆab−ＰＯＤ
polyコンジュゲート（ベーリンガー・マンハイム・ゲゼ
ルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
（Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ）、コンジュゲート緩
衝液（１００mＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）、０.
９％（Ｗ／Ｖ）ＮaＣl、１％（Ｗ／Ｖ）ラルフォン（Ｒ
alufon）Ｆ４ＪまたはＢＳＡフラクションＶ；コンジュ
ゲート緩衝液を無菌ＤＥＰＣで処理し、濾過し（０.２
μｍフィルター、ネルジーン（Ｎelgene）によって製造
された）、４℃で貯蔵した））中２００mＵ／mＬ)１０
０μＬを添加し、同一条件下で（１時間、３７℃）イン
キュベートした。
２００μＬで５回洗浄した。次いで、コンジュゲート希
釈液（ポリクローナル＜ＤＩＧ＞−Ｓ−Ｆab−ＰＯＤ
polyコンジュゲート（ベーリンガー・マンハイム・ゲゼ
ルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
（Ｂoehringer Ｍannheim ＧmbＨ）、コンジュゲート緩
衝液（１００mＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）、０.
９％（Ｗ／Ｖ）ＮaＣl、１％（Ｗ／Ｖ）ラルフォン（Ｒ
alufon）Ｆ４ＪまたはＢＳＡフラクションＶ；コンジュ
ゲート緩衝液を無菌ＤＥＰＣで処理し、濾過し（０.２
μｍフィルター、ネルジーン（Ｎelgene）によって製造
された）、４℃で貯蔵した））中２００mＵ／mＬ)１０
０μＬを添加し、同一条件下で（１時間、３７℃）イン
キュベートした。
【００５２】５回洗浄することによって、未結合コンジ
ュゲート分子を除去した。ウエルにつき基質溶液（２,
２'−アジノ−ジ−[３−エチルベンゾチアゾリンスルフ
ェート(６)]、ＡＢＴＳ）１００μＬを添加した。振盪
下、３７℃で着色反応が生じた。ＥＬＩＳＡ読み取り装
置（ＳＬＴ）による測定の直前に微量滴定プレートの簡
単な振盪後、４９２ｎｍの参照フィルターに対する転換
されたＡＢＴＳの４０５ｎｍでのＯ.Ｄ.を測定した。ゼ
ロ値（ＡＢＴＳのみ）を差し引いた後、二重反復測定の
平均値を得た（ＳＬＴイージー−ベース・バージョン
（Ｅasy−ＢaseＶersion）４.０１）。
ュゲート分子を除去した。ウエルにつき基質溶液（２,
２'−アジノ−ジ−[３−エチルベンゾチアゾリンスルフ
ェート(６)]、ＡＢＴＳ）１００μＬを添加した。振盪
下、３７℃で着色反応が生じた。ＥＬＩＳＡ読み取り装
置（ＳＬＴ）による測定の直前に微量滴定プレートの簡
単な振盪後、４９２ｎｍの参照フィルターに対する転換
されたＡＢＴＳの４０５ｎｍでのＯ.Ｄ.を測定した。ゼ
ロ値（ＡＢＴＳのみ）を差し引いた後、二重反復測定の
平均値を得た（ＳＬＴイージー−ベース・バージョン
（Ｅasy−ＢaseＶersion）４.０１）。
【００５３】感度
当該方法の感度を測定するために、前記反応混合物にお
いて、マトリックス核酸を１０pmolの濃度で使用した。
結果を「図３」に示す。「図３」の曲線は、選択された
反応条件（１０pmolのマトリックスオリゴヌクレオチ
ド、ＲＮａｓｅＨの量、インキュベーション容量、イン
キュベーション温度など）下、最も高い感度の検出がプ
ローブ分子１０pmolにより得られたことを示す。プロー
ブ核酸１pmolだけの使用は、反応の第１工程、ハイブリ
ダイゼーションおよび消化を制限すると思われる。プロ
ーブ核酸１００pmolを使用すると、全ての消化されたプ
ローブ分子は、マトリックスオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズすることができず、かくして伸長され得な
い。故に、選択された条件下で、最も高い感度が混合物
当たり１０pmolのプローブ核酸により得られ、標的核酸
１０amolをこれらの条件下で検出することができるとい
うことができる。この検出限界は、同等の条件下で核酸
０.１fmolを検出するＷＯ ８９／１０４１５に従う方法
よりも約１０低いファクターである。
いて、マトリックス核酸を１０pmolの濃度で使用した。
結果を「図３」に示す。「図３」の曲線は、選択された
反応条件（１０pmolのマトリックスオリゴヌクレオチ
ド、ＲＮａｓｅＨの量、インキュベーション容量、イン
キュベーション温度など）下、最も高い感度の検出がプ
ローブ分子１０pmolにより得られたことを示す。プロー
ブ核酸１pmolだけの使用は、反応の第１工程、ハイブリ
ダイゼーションおよび消化を制限すると思われる。プロ
ーブ核酸１００pmolを使用すると、全ての消化されたプ
ローブ分子は、マトリックスオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズすることができず、かくして伸長され得な
い。故に、選択された条件下で、最も高い感度が混合物
当たり１０pmolのプローブ核酸により得られ、標的核酸
１０amolをこれらの条件下で検出することができるとい
うことができる。この検出限界は、同等の条件下で核酸
０.１fmolを検出するＷＯ ８９／１０４１５に従う方法
よりも約１０低いファクターである。
【００５４】温度依存性
実施例１の本発明方法の温度依存性を説明するために、
各アッセイのためにプローブ核酸１０pmolを使用し、４
２℃（「図４」）、５０℃（「図５」）および５６℃
（「図６」）で、０.０１amol〜１００amolまでの標的
核酸の存在下、ＲＮＡｓｅ Ｈでインキュベートした。
全ての次なるポリメラーゼ反応を６０℃で行った。ＡＢ
ＴＳと一緒に３０分間インキュベートした後、分析を行
った。使用したプローブ分子は、ＨＢＶ １またはＭＭ
１ ＤＨＢＶ １（５'−ＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＡＴ
ＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴ−３'、配列番号７）（１
つの塩基ミスマッチ）またはＭＭ ３ ＤＨＢＶ １（５'
−ＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣ
ＧＧＴ−３'、配列番号８）（３つの塩基ミスマッチ）
であった。消化反応のための４２℃のインキュベーショ
ン温度で、実験により、ほとんど同一の曲線が得られ、
故に、本発明方法の配列特異性が乏しくなる。インキュ
ベーション温度を５０℃に上昇させることによってスト
リンジェンシーを増加させた場合、完全に相補的なオリ
ゴヌクレオチドＨＢＶ １および１つの塩基ミスマッチ
を形成するオリゴヌクレオチドは、検出についての同様
の曲線を生じた。しかしながら、４２℃のインキュベー
ション温度と比較すると感度が低下した。原因は、ＲＮ
Ａ部分の不完全な消化である。３つの塩基ミスマッチを
形成するオリゴヌクレオチドは、有意に低いシグナルを
生じた。これは、よりストリンジェントな条件下での低
いハイブリダイゼーション速度のためであった。最も高
い特異性は、インキュベーション温度５６℃で得られ
た。１００amolのＤＨＢＶ １は、明確なシグナルを生
じ、１００amolのＭＭ １ ＤＨＢＶ １は、より低いＯ.
Ｄ.を導き、１００amolのＭＭ ３ ＤＨＢＶ １は、検出
することができなかった。これは、本発明の方法が核酸
を配列特異的検出せしめることを示す。３×３のシリー
ズにおいて、種々の量（０.０１amol〜１００amol）の
完全に相補的な標的核酸ＤＨＢＶ １を有するプローブ
核酸１０pmol、中心塩基ミスマッチを生じる標的核酸Ｍ
Ｍ １ ＨＢＶ １および３つの中心塩基ミスマッチを生
じるＭＭ ３ ＤＨＢＶ １を使用した。最初の３つのシ
リーズを４２℃でインキュベートし、第２の３つのシリ
ーズを５０℃でインキュベートし、第３の３つのシリー
ズを５６℃でインキュベートした。各シリーズについて
の負の対照は、標的核酸を含有しない反応混合物であっ
た。ポリメラーゼ反応は、全ての場合、６０℃で行っ
た。ストレプトアビジン被覆微量滴定プレートにおける
次の検出反応で測定された値を「図４」〜「図６」に示
す。
各アッセイのためにプローブ核酸１０pmolを使用し、４
２℃（「図４」）、５０℃（「図５」）および５６℃
（「図６」）で、０.０１amol〜１００amolまでの標的
核酸の存在下、ＲＮＡｓｅ Ｈでインキュベートした。
全ての次なるポリメラーゼ反応を６０℃で行った。ＡＢ
ＴＳと一緒に３０分間インキュベートした後、分析を行
った。使用したプローブ分子は、ＨＢＶ １またはＭＭ
１ ＤＨＢＶ １（５'−ＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＡＴ
ＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴ−３'、配列番号７）（１
つの塩基ミスマッチ）またはＭＭ ３ ＤＨＢＶ １（５'
−ＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣ
ＧＧＴ−３'、配列番号８）（３つの塩基ミスマッチ）
であった。消化反応のための４２℃のインキュベーショ
ン温度で、実験により、ほとんど同一の曲線が得られ、
故に、本発明方法の配列特異性が乏しくなる。インキュ
ベーション温度を５０℃に上昇させることによってスト
リンジェンシーを増加させた場合、完全に相補的なオリ
ゴヌクレオチドＨＢＶ １および１つの塩基ミスマッチ
を形成するオリゴヌクレオチドは、検出についての同様
の曲線を生じた。しかしながら、４２℃のインキュベー
ション温度と比較すると感度が低下した。原因は、ＲＮ
Ａ部分の不完全な消化である。３つの塩基ミスマッチを
形成するオリゴヌクレオチドは、有意に低いシグナルを
生じた。これは、よりストリンジェントな条件下での低
いハイブリダイゼーション速度のためであった。最も高
い特異性は、インキュベーション温度５６℃で得られ
た。１００amolのＤＨＢＶ １は、明確なシグナルを生
じ、１００amolのＭＭ １ ＤＨＢＶ １は、より低いＯ.
Ｄ.を導き、１００amolのＭＭ ３ ＤＨＢＶ １は、検出
することができなかった。これは、本発明の方法が核酸
を配列特異的検出せしめることを示す。３×３のシリー
ズにおいて、種々の量（０.０１amol〜１００amol）の
完全に相補的な標的核酸ＤＨＢＶ １を有するプローブ
核酸１０pmol、中心塩基ミスマッチを生じる標的核酸Ｍ
Ｍ １ ＨＢＶ １および３つの中心塩基ミスマッチを生
じるＭＭ ３ ＤＨＢＶ １を使用した。最初の３つのシ
リーズを４２℃でインキュベートし、第２の３つのシリ
ーズを５０℃でインキュベートし、第３の３つのシリー
ズを５６℃でインキュベートした。各シリーズについて
の負の対照は、標的核酸を含有しない反応混合物であっ
た。ポリメラーゼ反応は、全ての場合、６０℃で行っ
た。ストレプトアビジン被覆微量滴定プレートにおける
次の検出反応で測定された値を「図４」〜「図６」に示
す。
【００５５】実施例２
機能性プロモーターの形成方法
方法：ＲＤＣＰＴＡＱ（５'−ＡＴＧＡＴＡＧＴＴＧＡ
ＴＧＡＴＡＧＴＴＧＧＡＴＡＴｃｇｃｃｇｃｃｕｇｇｃ
ａｇａａｇａｕｃ−３'（配列番号５））１０pmolを、
ＢＳＡ ３μｇ、２０ＵのＲＮａｓｉｎおよび４ＵのＲ
Ｎａｓｅ Ｈを添加したＰ２緩衝液（１０mＭ Ｈepes、
１mＭ ＭgＣl2、ｐＨ８.０）中、４２℃で１時間、１０
μＬの容量において、種々の量のＤＨＢＶ１（５'−Ｇ
ＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧ
Ｔ−３'（配列番号５）、０.０１amol〜１０fmol）と一
緒にインキュベートした。使用した負の対照は、ＤＨＢ
Ｖ １を含有しない反応混合物であった。次いで、各混
合物にＱＡＴ２（５'−ＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＧ
ＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴ
−３'（配列番号６））１０pmol、Ｔａｑ緩衝液（１０m
Ｍ Ｔris ｐＨ８.３、５０mＭ ＫＣl、１.５mＭ ＭgＣl
2、０.１mg／mＬゼラチン）２μＬおよび１mＭ ｄＡＴ
Ｇ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを添加し、Ｔａ
ｑ−ＤＮＡポリメラーゼによって触媒化されたポリメラ
ーゼ反応を６０℃で１５分間行い、反応容量が２０μＬ
に増加した。次いで、転写緩衝液（４０mＭ Ｔris ｐＨ
７.９、６mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴ、２mＭスペル
ミジン）３μＬ、２０ＵのＲＮａｓｉｎ、０.５μＬの
１％Ｔriton Ｘ−１００および５００ＵのＴ７−ＲＮＡ
ポリメラーゼならびにＤＩＧ−およびＢＩＯ−ＵＴＰと
のヌクレオチド混合物ＣＰ１（９.８４μＭ ＡＴＰ、
４.９２μＭ ＧＴＰ、２.４６μＭ ＣＴＰ、３.２８μ
Ｍ ＵＴＰ、８２０nＭ ＤＩＧ−ＵＴＰおよび８２０nＭ
ＢＩＯ−ＵＴＰ）を添加した。合計容量は、３０μＬ
であった。３７℃で２時間、インキュベーションを行っ
た。検出反応のために、緩衝液Ｄを使用して全混合物を
２１０μＬに希釈し、ＳＡ−ＭＴＰの１ウエル中に１０
０μＬをピペットで移した。実施例１に記載の＜ＤＩＧ
＞−ＰＯＤpolyおよびＡＢＴＳ（ベーリンガー・マンハ
イム（Ｂoehringer Ｍannheim））を用いて検出を行っ
た。測定値を「図７」に示す。
ＴＧＡＴＡＧＴＴＧＧＡＴＡＴｃｇｃｃｇｃｃｕｇｇｃ
ａｇａａｇａｕｃ−３'（配列番号５））１０pmolを、
ＢＳＡ ３μｇ、２０ＵのＲＮａｓｉｎおよび４ＵのＲ
Ｎａｓｅ Ｈを添加したＰ２緩衝液（１０mＭ Ｈepes、
１mＭ ＭgＣl2、ｐＨ８.０）中、４２℃で１時間、１０
μＬの容量において、種々の量のＤＨＢＶ１（５'−Ｇ
ＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧ
Ｔ−３'（配列番号５）、０.０１amol〜１０fmol）と一
緒にインキュベートした。使用した負の対照は、ＤＨＢ
Ｖ １を含有しない反応混合物であった。次いで、各混
合物にＱＡＴ２（５'−ＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＧ
ＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴ
−３'（配列番号６））１０pmol、Ｔａｑ緩衝液（１０m
Ｍ Ｔris ｐＨ８.３、５０mＭ ＫＣl、１.５mＭ ＭgＣl
2、０.１mg／mＬゼラチン）２μＬおよび１mＭ ｄＡＴ
Ｇ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを添加し、Ｔａ
ｑ−ＤＮＡポリメラーゼによって触媒化されたポリメラ
ーゼ反応を６０℃で１５分間行い、反応容量が２０μＬ
に増加した。次いで、転写緩衝液（４０mＭ Ｔris ｐＨ
７.９、６mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴ、２mＭスペル
ミジン）３μＬ、２０ＵのＲＮａｓｉｎ、０.５μＬの
１％Ｔriton Ｘ−１００および５００ＵのＴ７−ＲＮＡ
ポリメラーゼならびにＤＩＧ−およびＢＩＯ−ＵＴＰと
のヌクレオチド混合物ＣＰ１（９.８４μＭ ＡＴＰ、
４.９２μＭ ＧＴＰ、２.４６μＭ ＣＴＰ、３.２８μ
Ｍ ＵＴＰ、８２０nＭ ＤＩＧ−ＵＴＰおよび８２０nＭ
ＢＩＯ−ＵＴＰ）を添加した。合計容量は、３０μＬ
であった。３７℃で２時間、インキュベーションを行っ
た。検出反応のために、緩衝液Ｄを使用して全混合物を
２１０μＬに希釈し、ＳＡ−ＭＴＰの１ウエル中に１０
０μＬをピペットで移した。実施例１に記載の＜ＤＩＧ
＞−ＰＯＤpolyおよびＡＢＴＳ（ベーリンガー・マンハ
イム（Ｂoehringer Ｍannheim））を用いて検出を行っ
た。測定値を「図７」に示す。
【００５６】曲線から推測することができるように、選
択された反応条件下で１amolの標的配列ＤＨＢＶ １を
検出することができた。この検出限界は、同等の条件下
で標的核酸１０amolが検出された標識デオキシリボヌク
レオチドの取込みによる方法（実施例１）よりも約１０
低いファクターである。
択された反応条件下で１amolの標的配列ＤＨＢＶ １を
検出することができた。この検出限界は、同等の条件下
で標的核酸１０amolが検出された標識デオキシリボヌク
レオチドの取込みによる方法（実施例１）よりも約１０
低いファクターである。
【００５７】以下に、本発明の実施態様について記載す
る。 (１) 標的核酸Ａを、該標的核酸とハイブリダイズする
ことができる部分Ｂ１および好ましくは該標的核酸とハ
イブリダイズしない核酸特異的部分Ｂ２を含有するプロ
ーブ核酸Ｂとハイブリダイズさせ、該プローブ核酸Ｂを
部分Ｂ１中で切断し、標的核酸とハイブリダイズしない
部分Ｂ２を含有するプローブ核酸の切断生成物Ｂ'を、
部分Ｂ２おいて切断生成物とハイブリダイズすることが
できる部分Ｃ２およびプローブ核酸の部分Ｂ１とハイブ
リダイズしない部分Ｃ１を含有するマトリックス核酸Ｃ
とハイブリダイズさせ、次いで、切断生成物Ｂ'および
マトリックス核酸Ｃのハイブリッドを測定することを特
徴とする標的核酸Ａの高感度検出方法。 (２) 切断生成物Ｂ'はマトリックス核酸Ｃの助けによ
り伸長されるが、プローブ核酸は伸長されない前記(１)
記載の検出方法。 (３) マトリックス核酸Ｃが部分Ｃ１にプロモーター配
列を含有する前記(２)記載の検出方法。 (４) 伸長が非放射性標識モノヌクレオチドの助けによ
り行われる前記(２)記載の検出方法。 (５) 部分Ｃ１が部分Ｃ２の５'−方向にある前記(１)
記載の検出方法。 (６) マトリックス核酸がその３'末端で伸長に対して
保護される前記(２)記載の検出方法。 (７) ハイブリダイズした後、切断生成物Ｂ'の５'末端
またはプローブ核酸がマトリックス核酸の３'末端を超
えては伸長しない前記(２)記載の検出方法。 (８) プローブ核酸を切断した後、標的核酸がプローブ
核酸分子と再度ハイブリダイズする前記(１)記載の検出
方法。 (９) 標的核酸とハイブリダイズすることができる部分
Ｂ１および標的核酸とハイブリダイズしない核酸特異的
部分Ｂ２を含有するプローブ核酸Ｂ、部分Ｂ２において
プローブ核酸とハイブリダイズする部分Ｃ２およびプロ
ーブ核酸の部分Ｂ１とハイブリダイズしない部分Ｃ１を
含有するマトリックス核酸Ｃ、核酸のマトリックス依存
性合成のための酵素、ならびに好適な緩衝液からなるこ
とを特徴とする標的核酸検出用試薬キット。 (１０) 切断酵素としてＲＮａｓｅ Ｈを、核酸のマト
リックス依存性合成のための酵素としてＤＮＡポリメラ
ーゼを含有する前記(９)記載の試薬キット。 (１１) さらに、ＲＮＡポリメラーゼを含有する前記
(１０)記載の試薬キット。
る。 (１) 標的核酸Ａを、該標的核酸とハイブリダイズする
ことができる部分Ｂ１および好ましくは該標的核酸とハ
イブリダイズしない核酸特異的部分Ｂ２を含有するプロ
ーブ核酸Ｂとハイブリダイズさせ、該プローブ核酸Ｂを
部分Ｂ１中で切断し、標的核酸とハイブリダイズしない
部分Ｂ２を含有するプローブ核酸の切断生成物Ｂ'を、
部分Ｂ２おいて切断生成物とハイブリダイズすることが
できる部分Ｃ２およびプローブ核酸の部分Ｂ１とハイブ
リダイズしない部分Ｃ１を含有するマトリックス核酸Ｃ
とハイブリダイズさせ、次いで、切断生成物Ｂ'および
マトリックス核酸Ｃのハイブリッドを測定することを特
徴とする標的核酸Ａの高感度検出方法。 (２) 切断生成物Ｂ'はマトリックス核酸Ｃの助けによ
り伸長されるが、プローブ核酸は伸長されない前記(１)
記載の検出方法。 (３) マトリックス核酸Ｃが部分Ｃ１にプロモーター配
列を含有する前記(２)記載の検出方法。 (４) 伸長が非放射性標識モノヌクレオチドの助けによ
り行われる前記(２)記載の検出方法。 (５) 部分Ｃ１が部分Ｃ２の５'−方向にある前記(１)
記載の検出方法。 (６) マトリックス核酸がその３'末端で伸長に対して
保護される前記(２)記載の検出方法。 (７) ハイブリダイズした後、切断生成物Ｂ'の５'末端
またはプローブ核酸がマトリックス核酸の３'末端を超
えては伸長しない前記(２)記載の検出方法。 (８) プローブ核酸を切断した後、標的核酸がプローブ
核酸分子と再度ハイブリダイズする前記(１)記載の検出
方法。 (９) 標的核酸とハイブリダイズすることができる部分
Ｂ１および標的核酸とハイブリダイズしない核酸特異的
部分Ｂ２を含有するプローブ核酸Ｂ、部分Ｂ２において
プローブ核酸とハイブリダイズする部分Ｃ２およびプロ
ーブ核酸の部分Ｂ１とハイブリダイズしない部分Ｃ１を
含有するマトリックス核酸Ｃ、核酸のマトリックス依存
性合成のための酵素、ならびに好適な緩衝液からなるこ
とを特徴とする標的核酸検出用試薬キット。 (１０) 切断酵素としてＲＮａｓｅ Ｈを、核酸のマト
リックス依存性合成のための酵素としてＤＮＡポリメラ
ーゼを含有する前記(９)記載の試薬キット。 (１１) さらに、ＲＮＡポリメラーゼを含有する前記
(１０)記載の試薬キット。
【００５８】
【００５９】配列番号：１
配列の長さ：４６塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：misc-feature
存在位置：１..４６
他の情報：ヌクレオチド２８−４６は、リボヌクレオチ
ドであり、ヌクレオチド１−２７は、デオキシリボヌク
レオチドである。 配列 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUC 46
ドであり、ヌクレオチド１−２７は、デオキシリボヌク
レオチドである。 配列 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUC 46
【００６０】配列番号：２
配列の長さ：５２塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：misc-feature
存在位置：１..５２
他の情報：ヌクレオチド２８−５２は、リボヌクレオチ
ドであり、ヌクレオチド１−２７は、デオキシリボヌク
レオチドである。 配列 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUCUCAA UC 52
ドであり、ヌクレオチド１−２７は、デオキシリボヌク
レオチドである。 配列 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUCUCAA UC 52
【００６１】配列番号：３
配列の長さ：２７塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列
GATTGAGATC TTCTGCGACG CGGCGGT 27
【００６２】配列番号：４
配列の長さ：５８塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列
ATTCCATGAT TCATTGATTA TTGTCGCGGC GGTGAGTCGT ATTACTTCCA GTCCGATC 58
【００６３】配列番号：５
配列の長さ：４５塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：misc-feature
存在位置：１..４５
他の情報：ヌクレオチド２７−４５は、リボヌクレオチ
ドであり、ヌクレオチド１−２６は、デオキシリボヌク
レオチドである。 配列 ATGATAGTTG ATGATAGTTG GATATACGCC GCCUGGCAGA AGAUC 45
ドであり、ヌクレオチド１−２６は、デオキシリボヌク
レオチドである。 配列 ATGATAGTTG ATGATAGTTG GATATACGCC GCCUGGCAGA AGAUC 45
【００６４】配列番号：６
配列の長さ：６４塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：promoter
存在位置：１５..３１
配列
GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACTAT AGGGCGGCGA TATCCAACTA TCATCAACTA
TCAT 64
【００６５】配列番号：７
配列の長さ：２７塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：mutation
存在位置：置換(１３,"")
他の情報：配列番号３と異なる。
配列
GATTGAGATC TTATGCGACG CGGCGGT 27
【００６６】配列番号：８
配列の長さ：２７塩基
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：mutation
存在位置：置換(１２..１４,"")
他の情報：配列番号３と異なる。
配列
GATTGAGATC TCACGCGACG CGGCGGT 27
【図１】 本発明の検出方法を概略示す流れ図。
【図２】 本発明の検出方法を概略示す流れ図。
【図３】 「図１」による検出方法の感度を示すグラ
フ。
フ。
【図４】 ハイブリダイゼーションおよび消化反応のイ
ンキュベーョン温度（４２℃）に依存する「図１」に従
った方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラ
フ。
ンキュベーョン温度（４２℃）に依存する「図１」に従
った方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラ
フ。
【図５】 ハイブリダイゼーションおよび消化反応のイ
ンキュベーョン温度（５０℃）に依存する「図１」に従
った方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラ
フ。
ンキュベーョン温度（５０℃）に依存する「図１」に従
った方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラ
フ。
【図６】 ハイブリダイゼーションおよび消化反応のイ
ンキュベーョン温度（５６℃）に依存する「図１」に従
った方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラ
フ。
ンキュベーョン温度（５６℃）に依存する「図１」に従
った方法を用いるＤＮＡ配列の検出の特異性を示すグラ
フ。
【図７】 「図２」による検出方法の感度を示すグラ
フ。
フ。
【図８】 本発明の検出方法を概略示す流れ図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ビオラ・ローゼメイヤー
ベルギー、ベー−1300ワブル、ショセ・
デ・ネルビュース（番地の表示なし）
アパルトマン12、パビヨン13
(56)参考文献 特開 平２−5864（ＪＰ，Ａ)
国際公開93／6240（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/00 - 15/09
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 標的核酸Ａを、該標的核酸とハイブリダ
イズすることができる部分Ｂ１および好ましくは該標的
核酸とハイブリダイズしない核酸特異的部分Ｂ２を含有
するプローブ核酸Ｂとハイブリダイズさせ、 該プローブ核酸Ｂを部分Ｂ１中で切断し、 標的核酸とハイブリダイズしない部分Ｂ２を含有するプ
ローブ核酸の切断生成物Ｂ'を、部分Ｂ２おいて切断生
成物とハイブリダイズすることができる部分Ｃ２および
プローブ核酸の部分Ｂ１とハイブリダイズしない部分Ｃ
１を含有するマトリックス核酸Ｃとハイブリダイズさ
せ、次いで、 切断生成物Ｂ'およびマトリックス核酸Ｃのハイブリッ
ドを測定することを特徴とする標的核酸Ａの高感度検出
方法。 - 【請求項２】 切断生成物Ｂ'はマトリックス核酸Ｃの
助けにより伸長されるが、プローブ核酸は伸長されない
請求項１記載の検出方法。 - 【請求項３】 マトリックス核酸Ｃが部分Ｃ１にプロモ
ーター配列を含有する請求項２記載の検出方法。 - 【請求項４】 伸長が非放射性標識モノヌクレオチドの
助けにより行われる請求項２記載の検出方法。 - 【請求項５】 プローブ核酸を切断した後、標的核酸が
プローブ核酸分子と再度ハイブリダイズする請求項１記
載の検出方法。 - 【請求項６】 標的核酸とハイブリダイズすることがで
きる部分Ｂ１および標的核酸とハイブリダイズしない核
酸特異的部分Ｂ２を含有するプローブ核酸Ｂ、 部分Ｂ２においてプローブ核酸とハイブリダイズする部
分Ｃ２およびプローブ核酸の部分Ｂ１とハイブリダイズ
しない部分Ｃ１を含有するマトリックス核酸Ｃ、 核酸のマトリックス依存性合成のための酵素、ならびに
好適な緩衝液からなることを特徴とする標的核酸検出用
試薬キット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4425264-1 | 1994-07-16 | ||
| DE4425264 | 1994-07-16 | ||
| DE4431269A DE4431269A1 (de) | 1994-07-16 | 1994-09-02 | Verfahren zum sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren |
| DE4431269-5 | 1994-09-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856700A JPH0856700A (ja) | 1996-03-05 |
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Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0705905B1 (ja) |
| JP (1) | JP3360977B2 (ja) |
| KR (1) | KR0161327B1 (ja) |
| CN (1) | CN1073160C (ja) |
| AT (1) | ATE206764T1 (ja) |
| CA (1) | CA2153944C (ja) |
| ES (1) | ES2165402T3 (ja) |
| FI (1) | FI114716B (ja) |
| IL (1) | IL114564A (ja) |
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| US7195871B2 (en) * | 1996-01-24 | 2007-03-27 | Third Wave Technologies, Inc | Methods and compositions for detecting target sequences |
| US5985557A (en) * | 1996-01-24 | 1999-11-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Invasive cleavage of nucleic acids |
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