JP2807202B2 - 核酸の高感度検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の高感度検出
方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、
プローブ核酸を標的核酸とハイブリダイズさせ、該プロ
ーブ核酸のハイブリダイズした部分を消化し、切断産生
物を検出することによる核酸の特に高感度な検出方法お
よび該検出方法に適している試薬セットに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】研究
によって、核酸に含まれる特異的な情報の使用が感染症
パラメーターおよび遺伝条件の認識において大きな利益
をもたらすことが判明した後、研究者は、核酸をアッセ
イの対象にしようと試みた。多くの場合、かかる検出方
法は、使用されるアッセイ方法において充分な感度を生
じさせるために、核酸配列の増幅を必要とする。研究者
は、標的配列の増幅方法および標的配列とは無関係の核
酸配列の増幅方法の両方を提案した。標的配列の増幅の
例は、ＥＰ−Ａ−０ ２０１１８４に開示されている、
標的核酸の二本の鎖がin vitro複製反応で増幅されるポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。該反応温度をサ
イクルにおいて変化させて、二本鎖標的核酸を変性さ
せ、イニシエーター分子（プライマー）とハイブリダイ
ズさせ、次いで、ＤＮＡ合成し（プライマーの伸長）、
これらの工程を繰り返す。ＰＣＲの全ての工程が最適な
方法で行われると、核酸は、指数的に増幅する。しかし
ながら、実際には、増幅因子は、しばしば、非常に減少
する。

【０００３】また、標的核酸を増幅させるために、in v
itro転写をも使用した。かかる反応の例は、ＷＯ ８８
／１０３１５に開示されている。この増幅反応では、１
つがプロモーター配列を含有する２つのプライマーを使
用する。ＰＣＲにおけると同様に、これらのプライマー
は、増幅されるべき配列の別々の鎖と相補的である。Ｅ
Ｐ−Ａ−０ ３２９ ８２２には、新しく合成されたＤＮ
Ａをプロモーター含有プライマー分子とハイブリダイズ
させるために、中間産生物である二本鎖核酸産生物を転
写することによって得られるリボ核酸をハイブリッド中
で消化させることからなるこの方法の改良が開示されて
いる。最初に形成された転写産生物を消化することによ
って、このようにして形成された各ＲＮＡ分子から別の
二本鎖プロモーター含有核酸を形成することが可能であ
る。これらの二本鎖プロモーター含有核酸は、別の転写
開始のために使用される。

【０００４】前記方法とは対照的に、標的配列特異的シ
グナル増幅は、検出されるべき核酸を増幅させるために
は使用されないが、代わりに、標的配列の特異的な同定
に集中する。これを行うために、標的配列の存在に依存
してシグナルが増幅される。かかる方法は、例えば、Ｗ
Ｏ ８９／０９２８４およびＷＯ ８９／１０４１５に開
示されている。このいわゆるサイクリングプローブ反応
（ＣＰＲ）では、標的ＤＮＡ分子とハイブリダイズする
標識されたキメラＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプローブ分子
を使用する。このハイブリダイゼーションの結果、ＲＮ
ａｓｅ Ｈについての基質として供されるＲＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッドが得られる。この酵素は、ハイブリッド
のＲＮＡ部分を特異的に消化するので、該プローブ分子
は、解離され、得られたフラグメントは、低融点のため
に標的配列から拡散する。次いで、該標的分子を別のプ
ローブ分子とハイブリダイズさせることができ、該サイ
クルが繰り返される。プローブ分子のフラグメントは、
それに付着している標識を介して検出される。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、 ａ）複数のプライマーを標的配列依存性産生させ、 ｂ）該プライマーまたは該プライマーの一部を増幅させ
ることを特徴とする核酸の検出方法を提供するものであ
る。

【０００６】また、本発明は、短い核酸配列を含有する
長い核酸配列の助けによる短い核酸配列の増幅方法、標
的核酸Ａの高感度検出方法およびこの方法を実施するた
めのキットを提供するものでもある。

【０００７】標的核酸は、直接または間接的に検出され
るべきである核酸であると解される。以下、および、特
に図面において、標的核酸は、Ａで表す。標的核酸の直
接検出方法は、核酸が本発明の方法の処理工程のために
すでに準備されている方法であると解される。間接的方
法は、標的核酸が前処理に付されているか、または、前
処理によって準備されている方法であると解される。か
かる前処理工程は、核酸の単離、制限酵素などの試薬に
よる処理、または、前増幅を含む。ＲＮＡの逆転写は、
前処理であると考えることもできる。故に、標的核酸
は、ウイルス、細菌または細胞核酸などのいずれの所望
の起源の核酸であってもよい。それは、溶液、懸濁液中
で提供され得るが、固体支持体に固定化されてたり、あ
るいは、細胞含有培地、細胞塗抹標本、固定化細胞、組
織切片、または固定化微生物中に含有されたりしていて
もよい。好ましくは、該核酸は、溶液中に存在する。

【０００８】相補的または相同核酸は、対応する核酸と
ハイブリダイズすることができるか、または、対応する
核酸と相補的である核酸とハイブリダイズすることがで
きるものである。

【０００９】通常、核酸の検出方法における第一工程
は、入手可能な好適な試薬を用いて標的核酸を調製する
ことである。これは、ｐＨの変化（アルカリ）、加熱、
極端な温度変化（冷凍／解凍）の反復、生理学的増殖条
件（浸透圧）の変化、核酸を遊離させるための洗浄剤、
カオトロピック塩もしくは酵素（例えば、プロテアー
ゼ、リパーゼ）の単独または組み合わせた効果を含んで
もよい。本発明の方法は、非常に感度が高く、選択的で
あるので、タンパク、細胞、細胞フラグメントなどの他
の物質の存在下で、検出されるべきではない核酸の存在
下であっても、少量の核酸を検出することも可能であ
る。

【００１０】好適な標的核酸としては、例えば、リボ核
酸およびデオキシリボ核酸が挙げられる。該核酸は、例
えば、前記処理において、修飾されていてもよい。特に
好ましい標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であ
る。

【００１１】本発明は、ハイブリダイゼーション、特
に、標的配列特異的シグナル増幅に基づく試験の特別な
具体例である。ハイブリダイゼーションに基づく試験
は、基本的には、核酸診断薬の分野における当業者に知
られている。実験についての詳細は、以下に記載されな
い限り、ビィ・ディ・ヘイムズ（Ｂ.Ｄ.Ｈames）および
エス・ジェイ・ヒギンズ（Ｓ.Ｊ.Ｈiggins）によって編
集された「ニュークリイック・アシッド・ハイブリダイ
ゼーション」（nucleic acid hybridization）［ＩＲＬ
プレス、１９８６］の全内容、例えば、第１章（ハイブ
リダイゼーション・ストラテジー（Ｈhybridization Ｓ
trategy））、第３章（クウォンティテイティブ・アナ
リシス・オブ・ソルーション・ハイブリダイゼーション
（Ｑuantitative Ａnalysis of Ｓolution Ｈybridizat
ion））および第４章（クウォンティテイティブ・フィ
ルター・ハイブリダイゼーション（Ｑuantitative Ｆil
ter Ｈybridization））、カレント・プロトコルズ・イ
ン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurrent Ｐrotocol
s in Ｍolecular Ｂiology）、エフ・エム・オースベル
（Ｆ.Ｍ.Ａusubel）ら編、ジェイ・ウィリィ・アンド・
サン（Ｊ.Ｗiley and Ｓon）、１９８７、および、モレ
キュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃloning）、ジ
ェイ・サムブルーク（Ｊ.Ｓambrook）ら編、ＣＳＨ、１
９８９を引用する。他の公知の方法としては、ＥＰ−Ａ
−０ ３２４ ４７４に開示されている標識ヌクレオシド
三リン酸の調製、修飾および非修飾オリゴヌクレオチド
の化学合成、制限酵素の助けによる核酸の切断、特にハ
イブリダイズされるべき核酸間の相補性に依存する所望
の特異性、それらのＧＣ含量およびそれらの長さを達成
するためのハイブリダイゼーション条件の選択、ならび
に、ポリメラーゼの助けによる、所望により、いわゆる
プライマーの助けによるヌクレオシド三リン酸からの核
酸の形成が挙げられる。

【００１２】本発明において解される標識は、直接また
は間接的に検出可能な基である。直接検出可能な基は、
例えば、放射性（³²Ｐ）、着色性または蛍光性の基また
は金属原子である。間接的に検出可能な基としては、免
疫学的または酵素学的に活性な化合物、例えば、抗体、
抗原、ハプテン、または酵素もしくは酵素の酵素学的に
活性な部分が挙げられる。それらは、次反応または反応
シーケンスで検出される。ポリメラーゼの基質として特
によく適している標識ヌクレオシド三リン酸などのハプ
テンが特に好ましい。次いで、ハプテンまたはハプテン
化ヌクレオシドに対する標識抗体との次反応が迅速に行
われる。かかるヌクレオシド三リン酸としては、ブロモ
ヌクレオシド三リン酸またはジゴキシゲニン、ジゴキシ
ン、ビオチン、またはフルオレセイン結合ヌクレオシド
三リン酸が挙げられる。ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４に
開示されているステロイドおよびそれらの検出は、特に
適していることが証明された。核酸の取込みについて
は、本発明者らは、ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４に言及
している。

【００１３】ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、リボ
ヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ） −またはデオキシリボ−ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）である。

【００１４】本発明の特徴は、プライマーとして機能す
る短い配列を有する多数の核酸が、標的核酸の助けによ
り、および該標的核酸の存在に依存して、長い核酸を有
する核酸から産生され得ることである。長い配列は、短
い核酸よりも長い、１以上、好ましくは、５〜１００
０、特に好ましくは、８〜１００の核塩基ユニット（例
えば、モノヌクレオチド）によるものである配列である
と解される。短い核酸は、２つの条件を満たさなければ
ならない。まず、塩基−塩基相互作用を介する核酸との
ハイブリッドを形成することができなければならない。
かかる配列は、特に、天然ヌクレオチド成分からなる核
酸を含有する。しかしながら、該配列は、核酸類似物ま
たは修飾核酸、例えば、核酸のハイブリダイゼーション
特性をまだ示すが、もはやリン酸−糖鎖骨格を有しない
か、または、非天然塩基を含有する核酸であってもよ
い。特に好適な分子は、ＷＯ ９２／２０７０２または
ＷＯ ８６／０５５１８に開示されているものである。
配列が満たさなければならない第２の条件は、伸長反応
においてのプライマーとしてのその使用である。かかる
伸長反応は、特に、モノヌクレオシド三リン酸の助けに
よるモノヌクレオチドユニットによるプライマーのポリ
メラーゼ依存性伸長である。かかる反応では、該プライ
マーの３'−末端は、鋳型核酸とハイブリダイズする場
合、モノヌクレオチドによって伸長され、その結果、該
伸長産生物は、鋳型核酸上の対応する部位と実質的に相
補的である。

【００１５】本発明によるプライマーまたは短い核酸の
産生は、所望の手段で行うことができるが、長い核酸
の、特にこの核酸の部分的酵素消化による切断が好まし
い。

【００１６】本発明による工程で産生されたプライマー
は、１２塩基以上の長さであるのが好ましい。プライマ
ーの次処理（例えば、ハイブリダイゼーションおよび酵
素的伸長）に必須であるプライマーは、１２〜３５塩基
の配列を含有するのが好ましい。

【００１７】特に、それらの５'−末端で、該プライマ
ーは、所望により、多くの他のヌクレオチドまたは非ヌ
クレオチド分子部分を含有することもできる。

【００１８】本発明の方法の第二工程では、第一工程で
形成されたプライマーまたはその一部、例えば、部分配
列が増幅される。好ましくは、プライマー増幅工程は、
長い分子の消化を含む。特に好ましくは、鋳型核酸Ｃ上
でのプライマー（短い配列）の、該プライマーと比較し
て長い配列への伸長、増幅プローブＤの、該プライマー
の伸長産生物とのハイブリダイゼーション、および増幅
プローブの消化（切断）と同時の新しいプライマー分子
の産生によって行われる。該プライマーの伸長産生物が
増幅プローブを切断するために再利用可能であるという
事実のために、プライマー分子の数は、各切断工程に伴
って増加する。さらにまた、切断により得られたプライ
マーの伸長により、伸長産生物も形成され、これは、次
いで、増幅プローブを切断するために利用可能である。

【００１９】プライマーの最初の産生が標的配列依存性
であるために、プライマーおよび／または伸長産生物ま
たは産生された他の中間産生物の量は、試料中の標的核
酸Ａの存在についての尺度である。

【００２０】したがって、本発明の方法は、プライマー
の一度産生された伸長産生物が１個または数個のプライ
マーのサイクル産生のために再使用され、一度産生され
たプライマーが伸長産生物を産生するために再使用され
る方法である。

【００２１】長い核酸は、不活性プライマー部分および
消化された場合にプライマーを活性化させる部分を含有
する核酸であると解される。プライマーの活性化後、後
者は、伸長反応のために利用可能である。本発明の１つ
の態様は、長い核酸を消化すると同時にプライマーを形
成することによる、短い核酸、特に、プライマーの増幅
に関する。本発明において解されるように、プローブ核
酸Ｂは、かかる長い核酸でもある。

【００２２】本発明において解される短い核酸は、前記
の長い核酸の消化産生物である。短い核酸は、特に、プ
ライマーとしても機能することができるこれらの核酸、
すなわち、伸長セグメントによって伸長され得る核酸で
ある。

【００２３】プローブ分子Ｂは、お互いに連結し合って
いる２つの部分Ｂ１およびＢ２を含有する分子である。
部分Ｂ１は、標的核酸またはその一部とハイブリダイズ
することができることを特徴とする。これを行うために
は、該部分は、充分に相補的でなければならない。さら
にまた、後者が標的核酸とハイブリダイズした後、部分
Ｂ１を切断することが可能でなければならない。ここ
で、消化または切断は、部分Ｂ１の、２つ以上のもはや
連結していない部分への分離であると解されるか、また
は、部分Ｂ１をＢ２と切断することを意味するが、標的
核酸は、切断されないことが好ましい。したがって、部
分Ｂ１は、リボヌクレオチドまたはアベイシック（abas
ic）配列を含有することもできる。好ましく、部分Ｂ１
は、核酸から一般的に知られているようにお互いに連結
し合っている２つ、特に好ましくは、４つ以上のモノリ
ボヌクレオチドユニットを含有しているが、一方、それ
と相補的である核酸の一部は、デオキシリボ核酸であ
る。この場合、プローブ核酸Ｂは、形成されたハイブリ
ッドがＲＮａｓｅ Ｈと接触させられると、部分Ｂ１に
おいて切断することができる。アベイシック配列が存在
すると、消化は、ＡＰエンドヌクレアーゼの助けにより
行われ得る。

【００２４】充分な感度が与えられると、標的核酸の切
断さえ許容できるようになり、すなわち、いくつかのプ
ライマーの代わりに１個のプライマーが各標的分子につ
いて産生される。

【００２５】このプロセスでは、ハイブリダイズ可能な
部分Ｂ１の少なくとも一部が切断される。その結果、Ｂ
と標的核酸とのハイブリッドにおいて切断されることが
できず、好ましくは標的核酸とハイブリダイズしない、
核酸特異的部分Ｂ２を含有する切断産生物Ｂ'が得られ
る。それは、標的核酸と最初にハイブリダイズした部分
Ｂ１の一部も含有する。

【００２６】標的核酸のプローブ核酸とのハイブリダイ
ゼーションのための条件は、部分Ｂ１を介するプローブ
核酸の、標的核酸との選択的ハイブリダイゼーションが
なおも生じ、一方、プローブ核酸の、試料中の検出され
るべきではない他の核酸との非特異的ハイブリダイジン
グが生じないように選択されるのが好ましい。切断産生
物Ｂ'を含むプローブ核酸の切断において産生されるフ
ラグメントは、最初のプローブ核酸よりも短く、選択さ
れた条件下では、もはや標的核酸との安定なハイブリッ
ドを形成する能力がない。したがって、それらは、選択
された条件下で標的核酸Ａを遊離する。次いで、後者
は、別のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションのた
めに利用可能である。

【００２７】プローブ核酸の切断は、部分Ｂ２だけを含
有するか、または、部分Ｂ１の残部も含有する種々のフ
ラグメントＢ'を産生することもできる。これは、選択
された条件に依存する。

【００２８】以下、核酸の核酸特異的な部分は、選択さ
れた条件下で生じる特異的なハイブリダイゼーションを
伴って、標的核酸として別の配列とハイブリダイズする
ことができる配列であると解される；すなわち、各々の
反応工程において含まれない反応混合物中に存在する他
の核酸との、該方法に無関係のハイブリダイゼーション
はない。典型的な核酸特異的部分は、プローブ核酸の部
分Ｂ２、鋳型核酸の部分Ｃ２および増幅プローブの部分
Ｄ２である。

【００２９】標的核酸とハイブリダイズしないのが好ま
しいプローブ核酸の核酸特異的な部分Ｂ２は、部分Ｂ１
の標的配列特異的消化のために選択された条件下では消
化されないという条件を満たさなければならない。さら
にまた、それは、後で定義する鋳型オリゴヌクレオチド
とハイブリダイズできるべきである。主に、部分Ｂ２の
配列は、所望により選択され得る。しかしながら、標的
核酸との相補性が、切断産生物Ｂ'の、鋳型オリゴヌク
レオチドとのハイブリダイゼーションをより困難にし、
最適条件と比較して感度が低下することを考慮すべきで
ある。Ｂ２は、リボ核酸、デオキシリボ核酸または修飾
核酸であってもよい。部分Ｂ１がリボ核酸を含有し、切
断がＲＮａｓｅの助けにより行われると、部分Ｂ２は、
好ましくは、これらの条件下で切断することができるリ
ボ核酸ではなく、好ましくは、それは、デオキリボ核酸
である。しかしながら、Ｂ２は、もはやＲＮａｓｅによ
って切断され得ないように修飾されているリボ核酸でも
あり得る。別の可能性は、なおも核酸のハイブリダイゼ
ーション特性を有しているが、もはやリン酸糖鎖部分ま
たは非天然塩基を含有しない核酸類似物の使用である。
特に好適なＲＮＡ分子は、ＷＯ ９２／２０７０２に開
示されているか、または、ＷＯ ８６／０５５１８に開
示されているような他の分子である。この部分が標的核
酸とハイブリダイズすべきではないという好ましい条件
は、特に、プローブ核酸の、標的核酸とのハイブリダイ
ゼーションの間じゅう、選択された条件に適用される。
部分Ｂ２は、試料中に含有されるが、検出されるべきで
はない核酸とハイブリダイズしないように選択されるの
が好ましい。しかしながら、部分Ｂ２は、鋳型核酸Ｃと
ハイブリダイズすることができる配列を含有すべきであ
る。標的核酸の、プローブ核酸とのハイブリダイゼーシ
ョン、および、鋳型核酸の、切断産生物Ｂ'とのハイブ
リダイゼーションのための条件は、無関係に選択するこ
とができる。

【００３０】本発明の鋳型核酸Ｃは、切断産生物Ｂ'、
特にその核酸特異的部分Ｂ２またはその一部とハイブリ
ダイズすることができ、なおも存在するＢ１の残部とも
ハイブリダイズすることができる部分Ｃ２を含有する。
鋳型核酸Ｃについて好適な分子は、かかるハイブリダイ
ゼーションを可能にする全てのものであり、すなわち、
天然ヌクレオチド成分からなる核酸である。しかしなが
ら、非天然成分からなるか、または、かかる成分を含有
し、鋳型として機能することができる核酸類似物も使用
することができる。さらにまた、鋳型核酸は、選択され
た条件下での消化に関して安定であるべきである。プロ
ーブ核酸がＲＮａｓｅで切断される場合、鋳型核酸は、
デオキシリボ核酸であるのが好ましい。部分Ｃ２に加え
て、鋳型核酸は、なおも存在するプローブ核酸の部分Ｂ
１または部分Ｂ１の残部とハイブリダイズすることがで
きない部分Ｃ１を有する。特に好ましくは、この部分Ｃ
１は、試料中に含有される検出されるべきではない核酸
および標的核酸自体と安定なハイブリッドを形成しな
い。この部分Ｃ１は、部分Ｃ２から５'−方向にあるの
が好ましい。

【００４０】当該条件は、いずれの場合であっても、切
断産生物Ｂ'が切断の間に生じた末端で鋳型核酸とハイ
ブリダイズするように、１個または数個の切断産生物
Ｂ'と鋳型核酸とを確実にハイブリダイズさせなければ
ならない。

【００４１】次の工程では、切断産生物Ｂ'および鋳型
核酸Ｃからなるハイブリッドは、部分Ｃ１と相補的であ
る核酸部分Ｂ３を用いて伸長される。したがって、Ｂ'
は、プライマーとしても供されなければならない。すな
わち、３'−末端で伸長可能でなければならない。しか
しながら、これは、いずれの望ましい手段でも、好まし
くは、酵素伸長法によって行われ得る。好ましい酵素伸
長法は、鋳型核酸としてＣ１を使用する縮合反応でモノ
ヌクレオシド三リン酸を連結することである。選択され
るべき条件は、当該技術分野における当業者によく知ら
れている。伸長は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ２５８ ０１
８に従ってサーマス・アクアティカス（Ｔhermus aquat
icus）のＤＮＡポリメラーゼの助けにより行われ得る。
好ましいモノヌクレオシド三リン酸は、ｄＮＴＰであ
る。この場合、切断産生物Ｂ'は、プライマーおよび伸
長される短い核酸として供される。酵素伸長法の別の可
能性は、リガーゼの使用である。このようにして形成さ
れた伸長産生物がプローブ核酸の切断のために選択され
た条件下で安定であるという事実に注意が払われるべき
である。これらの条件は、ＲＮａｓｅ Ｈを使用してプ
ローブ核酸を切断する場合にプライマーおよび伸長産生
物の両方がＤＮＡである場合に満たされる。

【００４２】切断産生物Ｂ'の伸長のために選択された
条件下で、未切断プローブ核酸Ｂと鋳型核酸Ｃとの形成
され得るハイブリッドは、プローブ核酸の３'末端とし
て伸長されず、例えば、鋳型核酸とはハイブリダイズし
ない。

【００４３】鋳型としての標的核酸での未切断プローブ
核酸Ｂの伸長は、プライマーＢ'の産生に影響を及ぼさ
ず、プローブ核酸Ｂの３'−末端を遮断することによっ
て、例えば、最後のヌクレオチドとしてジデオキシヌク
レオチドを使用することによって、防止することができ
る。

【００４４】本発明の方法の１つの具体例では、好まし
くは部分Ｂ３によって伸長された鋳型核酸およびプライ
マーＢ'のハイブリッドを変性した後、この目的のため
に、Ｂ３の増幅プローブＤとのハイブリダイゼーション
のためのセグメントＢ３の形成を使用するというプライ
マーの増幅が行われる。

【００４５】増幅プローブＤは、Ｂ３と完全にまたは部
分的に相補的である部分Ｄ１、すなわち、伸長により産
生されたプライマー（切断産生物Ｂ'）の伸長産生物の
該部分を含有する核酸であると解される。プライマーに
結合したこの部分は、ここで、Ｂ３と称する。増幅プロ
ーブＤの必須の特徴は、それが、その部分Ｄ１において
切断され得るということである。それは、好ましくは、
増幅プローブおよびプローブ核酸Ｂについての切断条件
が、使用される試薬に関して実質的に同一であるように
形成される。したがって、Ｄ１は、好ましくは、リボ核
酸でもある。さらにまた、増幅プローブＤは、核酸特異
的配列の条件を満たす部分Ｄ２を含有する。

【００４６】増幅プローブの消化により、鋳型核酸とハ
イブリダイズすることができる別の切断産生物が直接ま
たは間接的に産生され、したがって、（プライマーとし
て）別の増幅サイクルを開始するという該方法の特定の
増幅効果が達成される。

【００４７】さらに、適当な条件が選択されると、得ら
れた各伸長産生物に数個の増幅プローブが連続的に次々
と結合することができ、その結果、プローブ核酸Ｂと同
様の切断産生物は、伸長産生物と安定なハイブリッドを
形成しないので、数個の切断産生物が産生される。

【００４８】直接産生される場合、増幅プローブは、さ
らなる部分Ｄ２がＣ２と完全にまたは部分的に相補的で
あるように選択され、故に、最初に形成された切断産生
物Ｂ'と実質的に同一である。したがって、Ｄの消化反
応において形成された切断産生物Ｄ'は、鋳型として核
酸Ｃの助けにより伸長反応において再使用することがで
きる。

【００４９】部分Ｄ１およびＤ２のタイプおよび配置に
関して、増幅プローブは、プローブ核酸Ｂに適用する条
件に付される。

【００５０】間接的な方法においては、増幅プローブＤ
は、部分Ｄ１に加えて核酸特異的部分Ｄ２を含有するよ
うに選択される；しかしながら、該部分Ｄ２は、Ｃ２と
相補的ではなく、別の鋳型核酸Ｅ（ここで、該鋳型核酸
Ｅは、Ｄ２とハイブリダイズすることができる部分Ｅ２
およびＤ'を伸長するために鋳型として供される部分Ｅ
１を含有する）を除いて、反応混合物に含有された他の
核酸とハイブリダイズしない。切断フラグメントＤ'を
第２の鋳型核酸Ｅとハイブリダイズさせ、切断フラグメ
ントおよびプライマーを部分Ｄ３によって伸長させた
後、新しく形成された部分Ｄ３は、好ましくはハイブリ
ッドの分離後に、部分Ｂ３と同様に別の増幅プローブＦ
を切断するのに利用可能である。

【００５１】この増幅プローブＦは、Ｄ３と相補的な部
分Ｆ１および核酸特異的部分Ｆ２を含有することができ
る。部分Ｆ１における切断により、選択された配列に依
存して、切断産生物Ｄ'または切断産生物Ｂ'と同一に作
用する切断産生物Ｆ'が産生される。さらなる鋳型およ
び増幅プローブを使用して別の伸長／消化サイクルにお
いて該切断産生物を再導入すると、増幅度は増加する。
故に、本発明の系は、プローブ核酸および／または増幅
プローブにおける核酸特異的部分の配列の選択のために
非常にフレキシブルである。プローブおよび鋳型核酸の
数の増加により、非常に変化に富んだ種々の分子が誘導
されると思われるので、異なるプローブおよび／または
鋳型核酸の数が増加するとともに複雑さも増加するであ
ろう。故に、増幅プローブの部分Ｄ２は、Ｃ２またはそ
の一部と相補的であるのが好ましい。

【００５２】熱変性を使用して、例えば、鋳型核酸Ｃと
切断産生物Ｂ'の伸長産生物とのハイブリッドおよび鋳
型核酸ＣまたはＥと切断産生物Ｄ'の伸長産生物とのハ
イブリッド、ならびに起こりうるさらなるハイブリッド
（例えば、さらなる鋳型核酸を使用した場合）を分離す
ることができる。しかしながら、概して、非熱変性方法
を使用することも可能である。

【００５３】未切断増幅プローブの、例えば伸長産生物
を用いる伸長は、プローブ核酸Ｂをを用いて行う場合と
同様に、例えばジデオキシヌクレオチドによって増殖プ
ローブの３'−末端を遮断することにより防止すること
ができる。

【００５４】本発明の方法の温度は、使用される酵素の
活性が最適化される一方、ハイブリダイゼーション条件
がなお充分に特異的であるように選択される。非熱安定
性ＲＮａｓｅを使用する場合、例えば、好都合な温度範
囲は、３０〜６０°、特に好ましくは４２°である。熱
安定性ＲＮａｓｅを使用する場合、より高い温度で行う
こともできる。伸長反応のために使用される温度は、伸
長反応について使用される酵素にも左右される。熱安定
性酵素、例えば、Ｔaq−ＤＮＡ−ポリメラーゼを使用す
る場合、５０〜８０°の温度範囲が好ましく、特に好ま
しくは、約６０〜７０°である。反応部位での酵素の保
持時間を増加させることによって、反応速度を増加させ
ることができ、したがって、必要な作用時間を減少させ
るか、または、感度を増加させることができる。

【００５５】鋳型核酸は、環状分子であってもよい。こ
の場合、鎖置換活性を有する伸長酵素を使用するのが好
ましい。

【００５６】プローブ核酸、マトリックス核酸、および
増幅核酸は、一部の配列が決定されるとすぐに、主に知
られている方法に従って得ることができる。１００モノ
ヌクレオチド成分未満の長さのオリゴヌクレオチドを使
用する好ましい場合、一般に知られている化学的方法に
従った合成法が好ましい（例えば、メリフィールド（Ｍ
errifield）による固相合成法）。これにより、混合さ
れたオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ）の合
成が簡単にされる。長い核酸を使用する場合、ＥＰ−Ａ
−３２５９７０に開示されている遺伝子工学法または化
学的／酵素的方法が好ましい。部分Ｂ１は、好ましく
は、１２〜３５ヌクレオチド長さであり、部分Ｂ２は、
好ましくは、１５〜５０ヌクレオチド長さであり、部分
Ｃ１は、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド長さで
あり、部分Ｃ２は、１５〜５０ヌクレオチド長さであ
る。他の全ての鋳型核酸および増幅プローブに同様に適
用する。

【００５７】図１は、増幅プローブの部分Ｄ２が鋳型核
酸の部分Ｃ２と相補的であり、したがって、切断産生物
Ｄ'が鋳型核酸Ｃで伸長される本発明の方法の基本的な
具体例を示す。

【００５８】図２は、切断産生物Ｄ'が新しい鋳型核酸
Ｅとハイブリダイズさせられる具体例の流れを示す図で
ある。プローブ核酸Ｆを使用して、鋳型核酸Ｃ（経路
１）と、鋳型核酸Ｅ（経路２）と、または、別の鋳型核
酸Ｇ（経路３）とハイブリダイズするように選択された
切断産生物Ｆ'を産生することができる。

【００５９】図３および４は、反応の中間産生物を有す
るゲルを示す。

【００６０】図５は、ゲル中の増幅産生物を示す。

【００６１】図面に示される工程は、各々必要な試薬を
添加しつつ、連続的に行うことができる。しかしなが
ら、反応の開始時に全ての必要な成分を添加して、成分
がそれに応じて設計されるとの条件で同時に起こるプロ
セスを有することもできる。

【００６２】伸長産生物からの鋳型核酸の変性が加熱法
で行われる場合、全ての非熱安定性成分は、変性プロセ
ス後に再度添加されなければならない。これに関して、
熱安定性酵素、例えば、サーマス−アクアティカス（Ｔ
hermus-aquaticus）−ポリメラーゼおよび熱安定性ＲＮ
ａｓｅ Ｈの使用が好都合である。

【００６３】標的核酸Ａは、増幅反応で得られる産生物
および／または中間産生物のために検出することができ
る。これは、使用されたプローブ核酸もしくは鋳型核酸
の少なくとも１つまたはこのようにして得られた切断産
生物もしくは伸長産生物において標識を検出することに
より行うのが好ましい。鋳型オリゴヌクレオチドが好適
なハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡポリメラーゼ
および標識デオキシリボヌクオシド三リン酸と一緒に切
断産生物と反応されるのが好ましい。標識モノヌクレオ
チドの取込みは、例えば、核酸を未反応標識デオキシヌ
クレオシド三リン酸から分離した後に検出することがで
きる。２種類の標識ヌクレオチドを用いると、直接固相
結合検出が可能である。

【００６４】高度のフレキシビリティおよび起こりうる
二重標識化、すなわち、伸長反応の間の異なる標識デオ
キシヌクレオチドの同時取込みにより、試験片またはマ
イクロタイタープレート上で該方法が使用され、流動サ
イトメトリーまたはキャピラリー電気泳動を介して検出
される。

【００６５】試料が標的核酸を含有しない場合、鋳型オ
リゴヌクレオチドは、キメラＲＮＡ／ＤＮＡプローブ分
子とのみハイブリダイズする。３'−末端は、鋳型オリ
ゴヌクレオチドとハイブリダイズしないので、該プロー
ブ分子の伸長は生じない。

【００６６】本発明の方法は、伸長産生物および産生さ
れたプライマーの両方が増幅サイクル中に再導入される
検出方法である。増幅サイクルは、１つの反応の産生物
を再使用して、１つまたは数個のこれらの産生物を産生
する反応シーケンスであると解される。図面では、これ
らのサイクルは、初期の反応段階に戻る矢印によって示
される。これにより、ｘがサイクルの数を示すとする
と、２^x以上の理論的増幅因子との増幅が導かれる。し
たがって、これに関して、本発明の方法は、ＰＣＲに基
づくこれらの方法よりも優れている。さらにまた、増幅
速度は、好適な設計によって増加させることができる。

【００６７】本発明の課題は、また、以下の工程からな
る短い核酸配列の増幅方法でもある： ａ）短い核酸配列を伸長セグメントによって伸長させ； ｂ）この短い核酸配列と（完全にまたは一部）相同であ
る配列を含有する長い核酸配列を伸長産生物と伸長セグ
メントにおいてハイブリダイズさせ、 ｃ）長い核酸を消化して、ハイブリダイズされた配列の
一部または全てを除去し、 ｄ）工程ｃ）において得られた消化産生物を用いて、工
程ａ）〜ｃ）を繰り返す。

【００６８】短い核酸配列は、前記プライマーまたは切
断産生物であるのが好ましい。長い核酸配列は、プロー
ブ核酸および／または増幅核酸であるのが好ましい。し
たがって、伸長セグメントは、セグメントＤ３であるの
が好ましい。長い核酸の消化は、部分Ｂ１および／また
はＤ１またはＦ１におけるプローブ核酸および／または
増幅プローブの切断に対応するのが好ましい。工程ａ）
からｃ）の反復は、切断産生物のサイクル法に対応する
のが好ましい。

【００６９】本発明の別の課題は、以下の工程： ａ）標的核酸Ａをプローブ核酸Ｂとハイブリダイズさせ
（ここで、該プローブ核酸Ｂは、標的核酸とハイブリダ
イズする部分Ｂ１および核酸特異的部分Ｂ２を含有す
る）、 ｂ）プローブ核酸Ｂを部分Ｂ１において切断し、 ｃ）該プローブ核酸の切断産生物Ｂ'を鋳型核酸Ｃとハ
イブリダイズさせ（ここで、切断産生物Ｂ'は、標的核
酸とハイブリダイズしない部分Ｂ２を含有し、鋳型核酸
Ｃは、切断産生物Ｂ'と部分Ｂ２においてハイブリダイ
ズする部分Ｃ２を含有し、かつ、プローブ核酸の部分Ｂ
１とハイブリダイズしない部分Ｃ１をも含有する）、 ｄ）部分Ｃ１と完全にまたは一部相補的である核酸部分
Ｂ３によって、切断産生物Ｂ'を伸長させ、 ｅ）増幅プローブＤを切断産生物Ｂ'の伸長産生物と部
分Ｂ３においてハイブリダイズさせる（ここで、増幅プ
ローブＤは、Ｃ１またはその一部と相同である部分Ｄ１
を含有し、該部分Ｄ１は、切断され得る）ことからなる
標的核酸Ａの高感度検出方法である。

【００７０】前記方法において、部分Ｄ１における増幅
プローブＤは、切断されて、切断産生物Ｄ'を産生す
る。後者は、直接法においては、鋳型核酸Ｃへのハイブ
リダイゼーションおよびＢ'の伸長と同様の伸長を生じ
る配列を含有する。したがって、増幅サイクルは、閉じ
られる。直接法において、増幅プローブＤは、部分Ｄ１
に加えて、Ｂ２またはその一部と相同である核酸特異的
部分を含有する。

【００７１】特に好ましくは、核酸特異的部分Ｂ２は、
標的核酸とハイブリダイズすべきではない。好ましく
は、切断産生物Ｂ'の伸長産生物と鋳型核酸Ｃとのハイ
ブリッドは、工程ｄ）およびｅ）の間で変性される。

【００７２】特に好ましくは、前記間接方法として使用
される場合の該方法は、以下の工程： ｆ）増幅プローブＤを部分Ｄ１において、好ましくはＲ
Ｎａｓｅ Ｈの助けにより、切断し、 ｇ）切断産生物Ｄ'を鋳型核酸Ｅとハイブリダイズし
（ここで、鋳型核酸Ｅは、該切断産生物と部分Ｄ２にお
いてハイブリダイズすることができる部分Ｅ２を含有
し、かつ、部分Ｄ１とハイブリダイズすることができな
い部分Ｅ１をも含有する）、 ｈ）部分Ｅ１と相補的である核酸部分Ｄ３によって、切
断産生物Ｄ'を伸長させ、所望により ｉ）増幅プローブＦを切断産生物Ｄ'の伸長産生物と部
分Ｄ３においてハイブリダイズさせる（ここで、増幅プ
ローブＦは、部分Ｆ１を含有し、該部分Ｆ１は、Ｃ１も
しくはその一部と相同であるか、または、Ｅ１もしくは
その一部と相同であり、該Ｆ１は、切断され得る）こと
からもなる。

【００７３】この場合、増幅プローブＤは、部分Ｄ１に
加えて核酸特異的部分Ｄ２を含有するように選択され
る。ここで、部分Ｄ２は、Ｂ２もしくはその一部と相同
ではない。特に好ましくは、部分Ｄ２は、鋳型核酸Ｅの
部分Ｅ２について特異的である。

【００７４】本発明の別の課題は、 ａ）部分Ｂ１およびＢ２を有する核酸Ｂ（ここで、部分
Ｂ１は、標的核酸の一部と相補的であり、かつ、標的核
酸とのハイブリッドとして消化可能な部分であり、部分
Ｂ２は、核酸特異的部分である）、 ｂ）部分Ｃ１およびＣ２を有する核酸Ｃ（ここで、部分
Ｃ１は、別の核酸特異的部分であり、Ｃ２は、Ｂ２と相
補的な部分である）、 ｃ）部分Ｄ１を有する核酸Ｄ（ここで、部分Ｄ１は、Ｃ
１もしくはその一部と相同であり、切断され得る部分で
ある）からなる標的核酸の高感度検出のための核酸のセ
ットである。

【００７５】好ましくは、核酸Ｄは、Ｂ２またはその一
部と相同である部分Ｄ２も含有する。換言すると、Ｄ２
は、Ｃ２と相補的である。

【００７６】本発明の別の課題は、 ａ）部分Ｃ１およびＣ２を有する核酸Ｃ（ここで、部分
Ｃ１は、核酸特異的部分であり、部分Ｃ２は、別の核酸
特異的部分であり、部分Ｃ１およびＣ２は、いずれも標
的核酸とハイブリダイズすることができない）、 ｂ）部分Ｄ１およびＤ２を有する核酸Ｄ（ここで、部分
Ｄ１は、部分Ｃ１またはその一部と相同であり、部分Ｄ
２は、部分Ｃ２またはその一部と相補的である）からな
る核酸の高感度検出のための核酸のセットである。

【００７７】これは、部分Ｄ１が部分Ｂ３と相補的であ
ることを意味する。

【００７８】本発明のセットは、消化に必要な試薬、特
に、消化酵素、例えば、ＲＮａｓｅＨ、核酸を伸長させ
るための酵素、例えば、ＤＮＡ−ポリメラーゼまたはリ
バーストランスクリプターゼ、モノヌクレオチドおよび
酵素反応に適している緩衝液を含有することもできる。

【００７９】

【実施例】以下の実施例において、本発明の方法をさら
に説明する。以下の実施例において、デオキシリボヌク
レオチドユニットを記すためには、大文字を使用し、リ
ボヌクレオチドユニットを記すためには、小文字を使用
する。

【００８０】実施例１ 放射性検出のための実験方法 ＢＳＡ ３μg、ＲＮａｓｉｎ ２０Ｕ、およびＲＮａｓ
ｅ Ｈ ４Ｕを添加しつつ緩衝液Ｐ２（１０mＭ Ｈepes、
１mＭ ＭgＣl₂、ｐＨ８.０）中、４２℃で３時間、ＲＮ
Ａ−ＤＮＡプローブ分子（Ｂ：5'-GATCGGACTGGAAGTAATA
CGACTCACcgauacuaacauugagauucccg-3'、配列番号１）１
pmolを種々の量の検出されるべきＤＮＡ（Ａ：5'-ATCTC
GGGAATCTCAATGTTAGTATCGG-3'、配列番号２）と２０μl
の量でインキュベートした。次いで、該反応混合物に鋳
型オリゴヌクレオチド（Ｃ：5'-CGACGCCGCGTCGCAGAAGAT
CGGTGAGTCGTATTACTTCCAGTCCGATC-3'、配列番号３）１pm
olを添加し、１００℃まで１分間加熱し、次いで、すぐ
に氷冷した。次いで、各混合物に１０×Ｔａｑ緩衝液
（１００mＭ Ｔris ｐＨ８.３、５００mＭ ＫＣl、１５
mＭ ＭgＣl₂、１mg／mlゼラチン）３μl、ｄＮＴＰ（ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの各最終濃度１
mＭ）、およびＴａｑ−ポリメラーゼ１Ｕを添加した。
次いで、該混合物を３０μlの容量にし、６０℃で３０
分間インキュベートした。次いで、該反応混合物に、
５'−末端がガンマ−[³²Ｐ]−ＡＴＰで放射性標識され
た増幅プローブ１０pmolおよびポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｄ：5'-GATCGGACTGGAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgca
gaagauc-3'、配列番号４）を添加した。（＊）変性を繰
り返し行い（１分、１００℃）、該混合物にＲＮａｓｅ
Ｈ４Ｕを添加し、次いで、それを４２℃で３時間イン
キュベートした。次いで、別のインキュベーション工程
を６０℃で３０分間行った。ＲＮａｓｅ Ｈによって触
媒化されたこの分解反応およびＴａｑ−ＤＮＡポリメラ
ーゼ触媒化伸長反応を（＊）で始めて２回繰り返した。

【００８１】検出反応について、オリゴヌクレオチド
（５'−末端が放射性標識された増幅プローブの切断産
生物Ｄ'の蓄積された伸長産生物を含む）を、１２％配
列決定用ゲル［サムブルック（Ｓambrook）ら（１９８
９）モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlonin
g）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbour Ｌaboratory Ｐres
s）、Ｓ.６.３６および次の頁を参照）上に置き、電気
泳動処理により分離した。オートラジオグラフィーを使
用して、伸長されたプライマーＤ'を同定し、標識配列
Ａの存在を検出した。

【００８２】実施例２ 非放射性検出の実験方法 ＢＳＡ ３μg、ＲＮａｓｉｎ ２０Ｕ、およびＲＮａｓ
ｅ Ｈ ４Ｕを添加しつつ緩衝液Ｐ２（１０mＭ Ｈepes、
１mＭ ＭgＣl₂、ｐＨ８.０）中、４２℃で３時間、ＲＮ
Ａ−ＤＮＡプローブ分子（Ｂ：5'-GATCGGACTGGAAGTAATA
CGACTCACcgauacuaacauugagauucccg-3'、配列番号１）１
０pmolを種々の量の検出されるべきＤＮＡ（Ａ：5'-ATC
TCGGGAATCTCAATGTTAGTATCGG-3'、配列番号２）と２０μ
lの量でインキュベートした。次いで、該反応混合物に
鋳型オリゴヌクレオチド（Ｃ：5'-CGACGCCGCGTCGCAGAAG
ATCGGTGAGTCGTATTACTTCCAGTCCGATC-3'、配列番号３）１
０pmolを添加し、１００℃まで１分間加熱し、次いで、
すぐに氷冷した。次いで、各混合物に１０×Ｔａｑ緩衝
液（１００mＭ Ｔris ｐＨ８.３、５００mＭ ＫＣl、１
５mＭ ＭgＣl₂、１mg／mlゼラチン）３μl、ｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、
ＢＩＯ−ｄＵＴＰの各最終濃度１mＭ）、およびＴａｑ
−ポリメラーゼ１Ｕを添加した。次いで、該混合物を容
量３０μlにし、６０℃で３０分間インキュベートし
た。次いで、該反応混合物に、５'−末端がガンマ−[³²
Ｐ]−ＡＴＰで放射性標識された増幅プローブ１００pmo
lおよびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｄ：5'-GATCGGACTG
GAAGTAATACGACTCACcgccgcgucgcagaagauc-3'、配列番号
４）を添加した。（＊）変性を繰り返し行い（１分、１
００℃）、該混合物にＲＮａｓｅ Ｈ ４Ｕを添加し、次
いで、それを４２℃で３時間インキュベートした。次い
で、別のインキュベーション工程を６０℃で３０分間行
った。ＲＮａｓｅ Ｈによって触媒化されたこの分解反
応およびＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ触媒化伸長反応を
（＊）で始めて２回繰り返した。

【００８３】ここで、オリゴヌクレオチドのエタノール
沈殿法によって、非取込みヌクレオチドを分離した。検
出のために、沈殿したオリゴヌクレオチド（蓄積したＢ
ＩＯ−ＤＩＧ標識伸長産生物を含む）を緩衝液Ｄ（１０
mＭ Ｈepes、ｐＨ８.３、３０mＭ ＮaＣl、１mＭ ＭnＣ
l₂）２１０μlに溶解させた。二重標識産生物をストレ
プトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）
（リバーストランスクリプターゼアッセイからのストレ
プトアビジン被覆マイクロタイタープレート、非放射
性、ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannhei
m）１４６８ １２０）中で固定化した。これは、オリゴ
ヌクレオチド溶液を１００μlずつ２回、洗浄緩衝液
（ＰＢＳ（「リン酸緩衝化生理食塩水」）中０.５％
（ｖ／ｖ）Ｔween ２０）で予備洗浄したＭＴＰのウエ
ル中にピペットで移すことによって行った。３７℃で１
時間、振盪しつつ、ＭＴＰをインキュベートした（デン
レイ・インシュトゥメンツ・ゲゼルシャフト・ミット・
ベンシュレンクテル・ハフツング（Ｄenley Ｉnstument
s ＧmbＨ）によって製造されたウエル−ウォーム（Ｗel
l−Ｗarm）１）。

【００８４】固定された核酸分子を含有するＭＴＰを、
洗浄緩衝液２００μlずつで５回洗浄した。次いで、コ
ンジュゲート希釈液 （ポリクローナル＜ＤＩＧ＞−Ｓ−Ｆab−ＰＯＤポリコ
ンジュゲート（ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャ
フト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング（Ｂoehr
inger Ｍannheim ＧmbＨ））、コンジュゲート緩衝液
（１００mＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７.５、０.９％
（ｗ／ｖ）ＮaＣl、１％（ｗ／ｖ）ＲalufonＦ４Ｊまた
はＢＳＡ Ｆraction Ｖ；該コンジュゲート緩衝液は、
ジエチルピロカーボネート（diethylpyrocarbonate）で
処理され、濾過滅菌され（ナルジーン（Ｎalgene）によ
って製造された０.２μmのフィルター）、４℃で貯蔵さ
れる）中２００mＵ／ml）１００μlずつを添加し、ＭＴ
Ｐを同一条件下で再度インキュベートした。

【００８５】５回洗浄することによって、未結合コジュ
ゲート分子を除去する。ここで、各ウエルに基質溶液
（２,２'−アジノ−ジ−[３−エチルベンゾチエゾリン
スルフォネート(６)]、ＡＢＴＳ）１００μlを添加し
た。３７℃で振盪すると、着色反応が生じた。ＭＴＰを
簡単に振盪した後、反応したＡＢＴＳの光学密度を４０
５nmで測定し、その直後に、４９２nmの参照フィルター
に対するＥＬＩＳＡリーダー（ＳＬＴ）において測定
し、０値（ＡＢＴＳだけ）を差し引いた後、２つの測定
値の平均値を得た（ＳＬＴ Ｅasy−Ｂase Ｖersion ４.
０１）。

【００８６】実施例３ ジゴキシゲニンが取り込まれる場合の実験方法 標的−ＤＮＡ Ａ（5'-ATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCGG-
3'、２８mer、配列番号２）５０pmolを、ＢＳＡ ６μ
g、ＲＮａｓｉｎ ４０ＵおよびＲＮａｓｅ Ｈ ４Ｕを添
加しつつＲＮＡ−ＤＮＡプローブ分子Ｂ（5'-GATCGGACT
GGAAGTAATACGACTCACcgauacuaacauugagauucccg-3'、５０
mer、３'−末端に２３リボースを有するＤＮＡ−ＲＮＡ
−オリゴ、配列番号１）５０pmolおよび１０×緩衝液
（１００mＭＴris−ＨＣl、５０mＭ ＫＣl、１５mＭ Ｍ
gＣl₂、ｐＨ８.３）４μlと一緒に４０μlの容量で４２
℃で３時間インキュベートした。インキュベーション
後、ゲル分析のために２０μlを取り出し、停止緩衝液
（６×ＴＢＥ、３０％グリセリン、ブロモフェノールブ
ルー）２μlで停止した。

【００８７】伸長反応のために、残存する２０μlに鋳
型オリゴＣ（5'-CGACGCCGCGTCGCAGAAGATCGGTGAGTCGTATT
ACTTCCAGTCCGATC-3'、５０mer、配列番号３）２５pmol
を添加した。この混合物を９５℃で１分間変性させ、す
ぐに氷冷した。１０×緩衝液（前記を参照のこと）０.
５μl、各々１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄ
ＧＴＰ、６５μＭのｄＴＴＰ、３５μＭのＤＩＧ−ｄＵ
ＴＰ（各々、最終濃度）およびＴaq−ＤＮＡポリメラー
ゼ２.５Ｕの添加後、水を２５μlまで添加した。６０℃
で３０分間インキュベートした後、該反応を停止緩衝液
（前記を参照のこと）３μlで停止した。該試料を２０
％ポリアクリルアミドゲル（バイオメトラ−ミニゲル・
チャンバー（Ｂiometra−Ｍinigel chamber）上に完全
に添加した。ランニング緩衝液＝１×ＴＢＥ、ランニン
グ時間＝約１時間（２５０Ｖで）。

【００８８】次いで、該ゲルを１×ＴＢＥ ＋ ＥtＢr
（１μg／ml）中で染色した。ＵＶ光下での可視実験
後、該ゲルをナイロン膜にプロットし、次いで、ＵＶ固
定した。検出は、ＤＩＧシステム（ベーリンガー・マン
ハイム・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・
ハフツング）の標準的な方法に従ってを行った。

【００８９】したがって、ＤＩＧ−ｄＵＴＰを含まない
（１００μＭ ｄＴＴＰを含む）反応を並行して行い、
該試料を第２のゲルに適用した。電気泳動およびＥtＢr
による染色後、このゲルからレーン６を切り出し、該Ｄ
ＮＡを、マニアティス（Ｍaniatis）［マキサム・アン
ド・ギルバート（Ｍaxam and Ｇilbert）（１９７７）
による「クラッシュ・アンド・ソーク」法］に従って溶
離した（ＴＥ緩衝液２０μl中）。

【００９０】図３は、反応の個々の段階を示す（臭化エ
チジウム染色）。図４は、ブロッティング後の反応産生
物を示す。

【００９１】レーン１： Ｂ ２５pmol レーン２： Ｃ ２０pmol レーン３： Ａ ２５pmol ＋ Ｂ ２５pmol ＋ ＲＮａｓ
ｅ Ｈ レーン４： Ａ ２５pmol ＋ Ｂ ２５pmol ＋ ＲＮａｓ
ｅ Ｈ レーン５： Ａ ２５pmol ＋ Ｂ ２５pmol（ＲＮａｓｅ
Ｈを含まない） レーン６： レーン３と同様 ＋ Ｃ ２５pmol → 充填
反応 レーン７： レーン４と同様 → 充填反応（Ｃを含まな
い） レーン８： レーン５と同様 ＋ Ｃ ２５pmol → 充填
反応 レーン９： Ｃ ２５pmol → 充填反応 レーン１０：Ｃ ２５pmol ＋ Ａ ２５pmol → 充填反応 （充填反応：Ｔａｑ−ポリメラーゼおよびｄＮＴＰと一
緒にインキュベーション）

【００９２】「サイクル」実験 鋳型Ｃ（配列番号３）２０pmol、増幅プローブＤ（5'-G
ATCGGACTGGAAGTAATACGACTCAGcgccgcgucgcagaagauc-3'、
４６mer、３'−末端に１９リボースを有するＤＮＡ−Ｒ
ＮＡ−オリゴ、配列番号４）、１０×緩衝液（前記を参
照のこと）５μl、各々１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
ＰおよびｄＧＴＰ、６５μＭのｄＴＴＰ、３５μＭのＤ
ＩＧ−ｄＵＴＰ（各々、最終濃度）、ＲＮａｓｉｎ ４
０Ｕ、および熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ ５ＵおよびＴａｑ
−ＤＮＡ−ポリメラーゼ２.５Ｕを溶離されたＤＮＡ２
μlに添加し、該混合物を５０μlまで充填した。３分間
変性した後、以下のサイクルを１０回繰り返した：４２
℃で２０分間 − ６０℃で１０分間 − ９５℃で１分
間。

【００９３】このサイクルを１回、５回および１０回繰
り返した後、分析のために１５μlずつ取り出し、停止
緩衝液（前記を参照のこと）２μlと混合した。該試料
を２０％ポリアクリルアミドゲル上に付した；ランニン
グ緩衝液＝１×ＴＢＥ、２５０Ｖでのランニング時間約
１時間。

【００９４】次いで、該ゲルをナイロン膜上にブロット
した。ＵＶ固定化後、該ブロットを、ＤＩＧ系の標準的
な方法に従って、anti−ＤＩＧ−ＡＰコンジュゲートを
用いて検出した（図５を参照のこと）。

【００９５】レーン１： ＤＩＧ標識オリゴ、４６mer
（標準的な長さ） レーン２： サイクルを１回 レーン３： サイクルを５回 レーン４： サイクルを１０回。

【００９６】以下に、本発明の実施態様について記載す
る。 （１）ａ）標的配列に依存して複数のプライマーを産生
させ、 ｂ）該プライマーまたは該プライマーの一部を増幅させ
ることを特徴とする標的核酸の検出方法。 （２）複数のプライマーが、不活性形のプライマーを含
有するプローブ核酸を切断することによって得られる前
記（１）記載の検出方法。 （３）プライマーが、該プライマーを鋳型核酸とハイブ
リダイズさせ、該プライマーを該鋳型核酸の助けによっ
て伸長させ、該伸長産生物を増幅プローブとハイブリダ
イズさせ、次いで、増幅プローブを解離して該プライマ
ーを遊離することによって増幅される前記（１）記載の
検出方法。 （４）ａ）短い核酸配列を伸長セグメントによって伸長
させ、 ｂ）この短い核酸配列と相同である配列を含有する長い
核酸配列を、伸長産生物と伸長セグメントにおいてハイ
ブリダイズさせ、 ｃ）この長い核酸を消化させて、ハイブリダイズされた
配列の一部または全てを取り出し、 ｄ）工程ｃ）で得られた消化産生物を使用して、工程
ａ）〜ｃ）を繰り返すことを特徴とする短い核酸配列の
増幅方法。 （５）ａ）標的核酸Ａをプローブ核酸Ｂとハイブリダイ
ズさせ（ここで、プローブ核酸Ｂは、標的核酸とハイブ
リダイズする部分Ｂ１および核酸特異的部分Ｂ２を含有
する）、 ｂ）プローブ核酸Ｂを部分Ｂ１において切断し、 ｃ）該プローブ核酸の切断産生物Ｂ'を鋳型核酸Ｃとハ
イブリダイズさせ（ここで、切断産生物Ｂ'は、標的核
酸とハイブリダイズしない部分Ｂ２を含有し、鋳型核酸
Ｃは、切断産生物Ｂ'と部分Ｂ２においてハイブリダイ
ズする部分Ｃ２を含有し、かつ、プローブ核酸の部分Ｂ
１とハイブリダイズしない部分Ｃ１を含有する）、 ｄ）部分Ｃ１と完全にまたは一部相補的である核酸部分
Ｂ３によって、切断産生物Ｂ'を伸長させ、 ｅ）増幅プローブＤを切断産生物Ｂ'の伸長産生物と部
分Ｂ３においてハイブリダイズさせる（ここで、増幅プ
ローブＤは、Ｃ１またはその一部と相同である部分Ｄ１
を含有し、該部分Ｄ１は、切断され得る）ことを特徴と
する標的核酸Ａの高感度検出方法。 （６）プローブ核酸ＢがＲＮａｓｅ Ｈの助けによって
切断される前記（５）記載の検出方法。 （７）増幅プローブＤが、部分Ｄ１に加えて、Ｂ２また
はその一部と相同である核酸特異的部分Ｄ２をも含有す
る前記（５）記載の検出方法。 （８）さらに、以下の工程： ｆ）増幅プローブＤを部分Ｄ１において切断し、 ｇ）切断産生物Ｄ'を鋳型核酸Ｅとハイブリダイズし
（ここで、鋳型核酸Ｅは、該切断産生物と部分Ｄ２にお
いてハイブリダイズする部分Ｅ２を含有し、かつ、部分
Ｄ１とハイブリダイズしない部分Ｅ１を含有する）、
ｈ）部分Ｅ１と相補的である核酸部分Ｄ３によって、切
断産生物Ｄ'を伸長させ、 ｉ）所望により、増幅プローブＦを切断産生物Ｄ'の伸
長産生物と部分Ｄ３においてハイブリダイズさせる（こ
こで、増幅プローブＦは、部分Ｆ１を含有し、該部分Ｆ
１は、Ｃ１もしくはその一部と相同であるか、または、
Ｅ１もしくはその一部と相同であり、該Ｆ１は、切断さ
れ得る）ことからなる前記（５）記載の検出方法。 （９）増幅プローブＤが部分Ｄ１においてＲＮａｓｅ
Ｈの助けによって切断される前記（５）記載の検出方
法。 （１０）ａ）部分Ｂ１およびＢ２を有する核酸Ｂ（ここ
で、部分Ｂ１は、標的核酸の一部と相補的であり、消化
され得る部分であり、部分Ｂ２は、核酸特異的部分であ
る）、 ｂ）部分Ｃ１およびＣ２を有する核酸Ｃ（ここで、部分
Ｃ１は、別の核酸特異的部分であり、Ｃ２は、Ｂ２と相
補的な部分である）、 ｃ）部分Ｄ１を有する核酸Ｄ（ここで、部分Ｄ１は、Ｃ
１またはその一部と相同であり、切断され得る部分であ
る）からなることを特徴とする標的核酸の高感度検出用
キット。 （１１）核酸Ｄが部分Ｄ２をも含有する（ここで、部分
Ｄ２は、Ｂ２と相同であるか、または、部分Ｃ２もしく
はその一部と相補的である）前記（１０）記載のキッ
ト。 （１２）ａ）部分Ｃ１およびＣ２を有する核酸Ｃ（ここ
で、部分Ｃ１は、核酸特異的部分であり、部分Ｃ２は、
別の核酸特異的部分であり、部分Ｃ１およびＣ２は、い
ずれも標的核酸とハイブリダイズできない）、 ｂ）部分Ｄ１およびＤ２を有する核酸Ｄ（ここで、部分
Ｄ１は、部分Ｃ１またはその一部と相同であり、部分Ｄ
２は、部分Ｃ２またはその一部と相補的である）からな
ることを特徴とする核酸の高感度検出用キット。

【００９７】

【配列表】

【００９８】配列番号：１ 配列の長さ：５０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１..２７ 他の情報：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２８..５０ 他の情報：ＲＮＡ 配列 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGA UACUAACAUU GAGAUUCCCG 50

【００９９】配列番号：２ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 ATCTCGGGAA TCTCAATGTT AGTATCGG 28

【０１００】配列番号：３ 配列の長さ：５０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列 CGACGCCGCG TCGCAGAAGA TCGGTGAGTC GTATTACTTC CAGTCCGATC 50

【０１０１】配列番号：４ 配列の長さ：４６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 オリゴリボヌクレオチド ハイポセティカル：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：１..２７ 他の情報：ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：misc feature 存在位置：２８..４６ 他の情報：ＲＮＡ 配列 GATCGGACTG GAAGTAATAC GACTCACCGC CGCGUCGCAG AAGAUC 46

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の方法の基本的な具体例を示す図。

【図２】 切断産生物Ｄ'が新しい鋳型核酸Ｅとハイブ
リダイズする具体例の流れを示す図。

【図３】 反応の中間産生物についてのゲル電気泳動の
結果を示す図面代用写真。

【図４】 反応の中間産生物についてのゲル電気泳動の
結果を示す図面代用写真。

【図５】 ゲル中の増幅産生物についてのゲル電気泳動
の結果を示す図面代用写真。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィオラ・ローゼメイヤー ベルギー、ベー−1300バヴル、ショゼ・ デ・ネルヴィアン（番地の表示なし） アパルトマン12、パヴィヨン13 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）標的ＤＮＡと相補的な配列のＲＮＡ
   部分および標的ＤＮＡと相補的ではない配列のＤＮＡ−
   オリゴヌクレオチド部分を有するプローブから標的配列
   に依存して複数のプライマーを産生させ、 ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を選択的
   に分解する酵素を用いて、該プライマーまたは該プライ
   マーの一部を増幅させることを特徴とする標的核酸の検
   出方法。
2. 【請求項２】 プライマーが、 （１）該プライマーを標的ＤＮＡとハイブリダイズさ
   せ、 （２）該標的ＤＮＡを鋳型として用いて該プライマーを
   伸長させ、 （３）該伸長産生物を、該伸長産生物と相補的な配列の
   ＲＮＡ部分および該伸長産生物と相補的ではない配列の
   ＲＮＡ部分を有するプローブ分子とハイブリダイズさ
   せ、次いで、 （４）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を選択
   的に分解する酵素を用いてプローブ分子を切断し、これ
   により、該プライマーを遊離する工程 によって増幅される請求項１記載の検出方法。
3. 【請求項３】 ａ）短い核酸配列を伸長セグメントによ
   って伸長させ、 ｂ）伸長セグメントと相補的な配列のＲＮＡ部分および
   短い核酸配列と相同なＤＮＡ−オリゴヌクレオチド部分
   を有する長い核酸分子を、伸長セグメント内で伸長産生
   物とハイブリダイズさせ、 ｃ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を選択的
   に分解する酵素によりこの長い核酸を消化させて、ハイ
   ブリダイズされた配列の一部または全てを取り出し、 ｄ）工程ｃ）で得られた消化産生物を使用して、工程
   ａ）〜ｃ）を繰り返すことを特徴とする短い核酸配列の
   増幅方法。
4. 【請求項４】 ａ）標的核酸Ａをプローブ核酸Ｂとハイ
   ブリダイズさせ（ここで、プローブ核酸Ｂは、標的核酸
   Ａと相補的な配列を有するＲＮＡ部分Ｂ１および標的Ｄ
   ＮＡと相補的ではない配列を含有するＤＮＡ−オリゴヌ
   クレオチド部分Ｂ２を含有する）、 ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を選択的
   に分解する酵素を用いてプローブ核酸Ｂを部分Ｂ１にお
   いて切断し、 ｃ）該プローブ核酸の切断産生物Ｂ'を鋳型核酸Ｃとハ
   イブリダイズさせ（ここで、切断産生物Ｂ'は、標的核
   酸とハイブリダイズしない部分Ｂ２を含有し、鋳型核酸
   Ｃは、切断産生物Ｂ'と部分Ｂ２においてハイブリダイ
   ズする部分Ｃ２を含有し、かつ、プローブ核酸の部分Ｂ
   １とハイブリダイズしない部分Ｃ１を含有する）、 ｄ）部分Ｃ１と完全にまたは一部相補的である核酸部分
   Ｂ３によって、切断産生物Ｂ'を伸長させ、 ｅ）該酵素により増幅プローブＤを切断産生物Ｂ'の伸
   長産生物と部分Ｂ３においてハイブリダイズさせる（こ
   こで、増幅プローブＤは、Ｃ１またはその一部と相同で
   ある部分Ｄ１を含有し、該部分Ｄ１は、切断され得る）
   ことを特徴とする標的核酸Ａの高感度検出方法。