JPH048293A - ライゲーシヨン可能なヘアピンプローブ及びその転写を用いた核酸の増巾方法 - Google Patents
ライゲーシヨン可能なヘアピンプローブ及びその転写を用いた核酸の増巾方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は核酸配列を増巾する方法に関する。特に発明は
高感度で特定の核酸配列の存在を検出する方法に関する
。
高感度で特定の核酸配列の存在を検出する方法に関する
。
特異的な核酸配列を検出することが種々の分野、特に医
療診断の分野において急速にその重要性が増してきてい
る。核酸ハイブリダイゼーション法は遺伝病、ガン、及
び細菌及びウィルスの感染を示すＤＮＡまたはＲＮＡ配
列のような医学的に重要な核酸配列を検出する方法を提
供する。核酸ハイブリダイゼーション法はＤＮＡ及びＲ
ＮＡのハイブリッドにおいて見出される非常に特異的な
塩基対に基づいている。核酸の鏡上に見られる問題とな
っている分析可能な配列は問題となっている配列と相補
的な塩基配列から成ることが知られている核酸プローブ
の存在下でハイブリッドの形成を観察することによって
非常に特異的にそして高感度に検出される。
療診断の分野において急速にその重要性が増してきてい
る。核酸ハイブリダイゼーション法は遺伝病、ガン、及
び細菌及びウィルスの感染を示すＤＮＡまたはＲＮＡ配
列のような医学的に重要な核酸配列を検出する方法を提
供する。核酸ハイブリダイゼーション法はＤＮＡ及びＲ
ＮＡのハイブリッドにおいて見出される非常に特異的な
塩基対に基づいている。核酸の鏡上に見られる問題とな
っている分析可能な配列は問題となっている配列と相補
的な塩基配列から成ることが知られている核酸プローブ
の存在下でハイブリッドの形成を観察することによって
非常に特異的にそして高感度に検出される。
完全に分析可能な潜在力を獲得するハイブリダイゼーシ
ョン法では検出感度を増大させる方法がいっそう必要と
なることは明らかである近年この方面に相当な努力が払
われてきており、多数の異なった方法が考案され開発さ
れてきている。特に有望なものは目的核酸配列またはそ
の相補的なシグナル配列の生化学的増巾に基づく方法で
ある。
ョン法では検出感度を増大させる方法がいっそう必要と
なることは明らかである近年この方面に相当な努力が払
われてきており、多数の異なった方法が考案され開発さ
れてきている。特に有望なものは目的核酸配列またはそ
の相補的なシグナル配列の生化学的増巾に基づく方法で
ある。
それぞれの検出系は限度に限界があるのに対して、生化
学系は数百万及び数百万コピーもの目的またはシグナル
配列を作製することができ、それゆえかかる検出系の有
効感度の限界を格段に延ばすように開発されてきている
。
学系は数百万及び数百万コピーもの目的またはシグナル
配列を作製することができ、それゆえかかる検出系の有
効感度の限界を格段に延ばすように開発されてきている
。
そのような一つの核酸増巾方法はポリメラーゼチェイン
リアクシシン法あるいはＰＣＲとして知られており、そ
れは米国特許第４．６８３，１９５号及び同法第４，６
８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲは目的配列の
二本鎖型における二本の相補釣鐘に対するブライマーと
して一対の特定のオリゴヌクレオチドを用いる。プライ
マーは目的の相補鎖の反対にある３′末端において特異
的なハイブリッドを形成するように選ばれる。熱安定な
りＮＡポリメラーゼを用いて、ブライマーは目的配列に
相当して合成されながら伸長する。特異的なハイブリッ
ドを形成し、そして伸長後、プライマーハイブリダイゼ
ーション及び伸長をさらに行えるようにハイブリダイゼ
ーションし伸長した鎖を変性させるために熱周期法（ｔ
ｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ）が必要
である。この工程を数回繰り返すことによって混合物中
に著量の目的配列の等止紐数的な増巾がなされる。
リアクシシン法あるいはＰＣＲとして知られており、そ
れは米国特許第４．６８３，１９５号及び同法第４，６
８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲは目的配列の
二本鎖型における二本の相補釣鐘に対するブライマーと
して一対の特定のオリゴヌクレオチドを用いる。プライ
マーは目的の相補鎖の反対にある３′末端において特異
的なハイブリッドを形成するように選ばれる。熱安定な
りＮＡポリメラーゼを用いて、ブライマーは目的配列に
相当して合成されながら伸長する。特異的なハイブリッ
ドを形成し、そして伸長後、プライマーハイブリダイゼ
ーション及び伸長をさらに行えるようにハイブリダイゼ
ーションし伸長した鎖を変性させるために熱周期法（ｔ
ｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ）が必要
である。この工程を数回繰り返すことによって混合物中
に著量の目的配列の等止紐数的な増巾がなされる。
ＰＣＲの変法としては欧州特許第３２０，３０８号に記
載されているがリガーゼチェインリアクション（Ｌ Ｃ
Ｒ）がある。この方法では少なくとも４本の別々のオリ
ゴプローブが必要であり、そのうち２本は、それらが目
的配列にハイブリダイゼーションするとそれぞれの３′
及び５′末端がライゲーションするために並べて置かれ
るように同一の目的鎖の反対側の末端にハイブリダイゼ
ーションする第３及び第４のプローブは第１及び第２の
プローブにハイブリダイゼーションし、ライゲージ３ン
後、変性し検出される融合プローブを形成する。
載されているがリガーゼチェインリアクション（Ｌ Ｃ
Ｒ）がある。この方法では少なくとも４本の別々のオリ
ゴプローブが必要であり、そのうち２本は、それらが目
的配列にハイブリダイゼーションするとそれぞれの３′
及び５′末端がライゲーションするために並べて置かれ
るように同一の目的鎖の反対側の末端にハイブリダイゼ
ーションする第３及び第４のプローブは第１及び第２の
プローブにハイブリダイゼーションし、ライゲージ３ン
後、変性し検出される融合プローブを形成する。
他の既知の増巾方法はＰＣＴ刊行第８８−１０３１５に
記載されており、転写増巾系またはＴＡＳとして引用さ
れるであろう。同様の方法が欧州特許第３１０．２２９
号及びＰＣＴ第８８−１０３１５号に記載されている。
記載されており、転写増巾系またはＴＡＳとして引用さ
れるであろう。同様の方法が欧州特許第３１０．２２９
号及びＰＣＴ第８８−１０３１５号に記載されている。
ＰＣＲと同様にＴＡＳは所望の目的配列の反対側の末端
にハイブリダイゼーションするオリゴブライマ一対を用
いる。
にハイブリダイゼーションするオリゴブライマ一対を用
いる。
プライマーは伸長生成物が一回の伸長またはＰＣＲのよ
うに幾サイクルかの後、転写プロモーター部位を含むよ
うに選ばれる。適当なプロモーター特異的ポリメラーゼ
及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）の存在下
において、伸長生成物それ自身が転写することによって
さらに増巾される。
うに幾サイクルかの後、転写プロモーター部位を含むよ
うに選ばれる。適当なプロモーター特異的ポリメラーゼ
及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）の存在下
において、伸長生成物それ自身が転写することによって
さらに増巾される。
ＰＣＴ第８７−０６２７０号に記載されているＱβレプ
リカーゼ（ＱβＲ）法はレプリカーゼ酵素によって特異
的に転写することができる特異的ＲＮＡプローブを用い
る。この法は一次反応力学でありレプリカーゼの開始部
位に合うＲＮＡプローブを設計して合成する必要がある
。
リカーゼ（ＱβＲ）法はレプリカーゼ酵素によって特異
的に転写することができる特異的ＲＮＡプローブを用い
る。この法は一次反応力学でありレプリカーゼの開始部
位に合うＲＮＡプローブを設計して合成する必要がある
。
これらすべての方法では目的核酸配列の増巾の収量をあ
げるが、一般及び洗練されていない利用者にとって望ま
しくない複雑さを伴なわないものはない。先行する技術
による方法の多くはわずられしい手動による方法または
必要とする多くの操作を自動化する複鍍で高価な機械に
よってしか成されない多くの相いれない工程が必要であ
る。さらに、多くのものは異なる目的配列に対する方法
へ・の簡便な適応を制限する多くの混合試薬の調製が必
要である。
げるが、一般及び洗練されていない利用者にとって望ま
しくない複雑さを伴なわないものはない。先行する技術
による方法の多くはわずられしい手動による方法または
必要とする多くの操作を自動化する複鍍で高価な機械に
よってしか成されない多くの相いれない工程が必要であ
る。さらに、多くのものは異なる目的配列に対する方法
へ・の簡便な適応を制限する多くの混合試薬の調製が必
要である。
上述の研究とは関係なく、種々の合成及び天然に存在す
るＤＮＡ及びＲＮＡの構造及びその機能に関する研究が
なされてきている。そのような構造のひとつとして適当
な条件下で一本のポリヌクレオチドにおいて自己相補的
な領域がハイブリダイゼーションし、その形が普通のヘ
アピンに似ているループ構造を形成するというヘアピン
が知られている。そのようなヘアピン構造は多くの生物
、特にＲＮＡの二次構造において天然に存在することが
知られているが、しかし、それらの機能的な役割につい
てはこの時点ではうまく立証されていない。ヘアピン構
造の物理化学については記載がなされているーカンター
及びシュンメル（Ｃａｎｔｏｒａｎｄ ５ｃｈｉ膳ｍｅ
ｌ）、バイオフィジカル ケミストリー第三部（Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｐａｒｔ
ｌ［［）１１８３ページＷ、Ｈ，フリーマン及カンパニ
ー（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆ Ｃｏ、）（サンフラ
ンシスコ１９８０）。
るＤＮＡ及びＲＮＡの構造及びその機能に関する研究が
なされてきている。そのような構造のひとつとして適当
な条件下で一本のポリヌクレオチドにおいて自己相補的
な領域がハイブリダイゼーションし、その形が普通のヘ
アピンに似ているループ構造を形成するというヘアピン
が知られている。そのようなヘアピン構造は多くの生物
、特にＲＮＡの二次構造において天然に存在することが
知られているが、しかし、それらの機能的な役割につい
てはこの時点ではうまく立証されていない。ヘアピン構
造の物理化学については記載がなされているーカンター
及びシュンメル（Ｃａｎｔｏｒａｎｄ ５ｃｈｉ膳ｍｅ
ｌ）、バイオフィジカル ケミストリー第三部（Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｐａｒｔ
ｌ［［）１１８３ページＷ、Ｈ，フリーマン及カンパニ
ー（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆ Ｃｏ、）（サンフラ
ンシスコ１９８０）。
本生層に関する文献は不完全であり矛盾している。例え
ば、ヘアピンは転写終結シグナルを提供するという示唆
があるージエンドロセック（Ｊ ｅｎｄｒｏｓｓｅｋ）
らジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）１７０ ： ５２４８ （１９８８）及
びウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、バイオケミカルジャ
ーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、） ２２４ ： ７
９９ （１９８４）。既知のロー依存性転写終結シグナ
ルに類似しているヘアピン構造は大腸菌のウニクオベロ
ン（Ｕｎｋ ０ｐｅｒｏｎ）及びｇ１■Ｓのあとに見ら
れた。
ば、ヘアピンは転写終結シグナルを提供するという示唆
があるージエンドロセック（Ｊ ｅｎｄｒｏｓｓｅｋ）
らジャーナル オブ バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）１７０ ： ５２４８ （１９８８）及
びウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、バイオケミカルジャ
ーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、） ２２４ ： ７
９９ （１９８４）。既知のロー依存性転写終結シグナ
ルに類似しているヘアピン構造は大腸菌のウニクオベロ
ン（Ｕｎｋ ０ｐｅｒｏｎ）及びｇ１■Ｓのあとに見ら
れた。
一方、安定なヘアピン型を形成することが可能なパリン
ドローム配列はベーターアミロイドの前駆体遺伝子の転
写開始部位付近に見出されている一うファウシ（Ｌａ
Ｆａｕｃ）ら、バイオケミストリーバイオフィジックス
リサーチ コミュニケーション（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、
Ｂ １ｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ
、 ）１５９ ： ２９７ （１９８９）。
ドローム配列はベーターアミロイドの前駆体遺伝子の転
写開始部位付近に見出されている一うファウシ（Ｌａ
Ｆａｕｃ）ら、バイオケミストリーバイオフィジックス
リサーチ コミュニケーション（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、
Ｂ １ｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ
、 ）１５９ ： ２９７ （１９８９）。
オリゴヌクレオチドからＤＮＡを合成する際及びオリゴ
ヌクレオチドを標識する際にヘアピン構造を用いること
は欧州特許第２９２．８０２号及びスリブラカッシュ（
Ｓ ｒｉｐｒａｋａｓｈ）及びハータス（Ｈａｒｋａｓ
）ジーンアナリテイカルテクノロジー（Ｇｅｎｅ Ａｎ
ａｌ、 Ｔｅｃｈｎ、） ６ ： ２９−３２ （１
９８９）によって提案されている。さらに、クラップ（
Ｋｒｕｐｐ）及びゼール（Ｓ ５１１）はＦＥＢＳレタ
ーズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） ２１２ ： ２
７１ （１９８９）及び「ヌクレイツクアシッドプロー
ブ」“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｐｒｏｂｅｓ”、シ
モンズ（Ｓ ｙｍｏｎｓ）編（ＣＲＣプレス、バコンラ
トン、ＦＬ、１９８９） （ＣＲＣＰｒｅｓｓ、 Ｂ
ａｃｏｎ Ｒａｔｏｎ、 ＦＬ、 １９８９）２１
及び２２ページにヘアピン構造を用いてＭ１３ベクター
／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系によって標識ＲＮＡ転写物
を作製することを記載している。
ヌクレオチドを標識する際にヘアピン構造を用いること
は欧州特許第２９２．８０２号及びスリブラカッシュ（
Ｓ ｒｉｐｒａｋａｓｈ）及びハータス（Ｈａｒｋａｓ
）ジーンアナリテイカルテクノロジー（Ｇｅｎｅ Ａｎ
ａｌ、 Ｔｅｃｈｎ、） ６ ： ２９−３２ （１
９８９）によって提案されている。さらに、クラップ（
Ｋｒｕｐｐ）及びゼール（Ｓ ５１１）はＦＥＢＳレタ
ーズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） ２１２ ： ２
７１ （１９８９）及び「ヌクレイツクアシッドプロー
ブ」“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｐｒｏｂｅｓ”、シ
モンズ（Ｓ ｙｍｏｎｓ）編（ＣＲＣプレス、バコンラ
トン、ＦＬ、１９８９） （ＣＲＣＰｒｅｓｓ、 Ｂ
ａｃｏｎ Ｒａｔｏｎ、 ＦＬ、 １９８９）２１
及び２２ページにヘアピン構造を用いてＭ１３ベクター
／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系によって標識ＲＮＡ転写物
を作製することを記載している。
本発明の要約
本発明は目的配列を転写可能にさせ、従って相補的なＲ
ＮＡの多数のコピーを提供することができるプローブに
ハイブリダイゼーションしそしてライゲーションするこ
とによって問題になっている特定の核酸配列（目的配列
）を増巾する方法及び手段を提供する。プローブは２つ
の重要な部分、（１）適当なハイブリダイゼーション条
件下において機能的なプロモーター領域を含むヘアピン
構造を形成することが可能な一本鎖自己相補的配列、及
び（２）自己相補的配列の３′末端から伸長し、そして
それと同じ核酸分子の部分を形成する一本鎖のプローブ
配列を有している。
ＮＡの多数のコピーを提供することができるプローブに
ハイブリダイゼーションしそしてライゲーションするこ
とによって問題になっている特定の核酸配列（目的配列
）を増巾する方法及び手段を提供する。プローブは２つ
の重要な部分、（１）適当なハイブリダイゼーション条
件下において機能的なプロモーター領域を含むヘアピン
構造を形成することが可能な一本鎖自己相補的配列、及
び（２）自己相補的配列の３′末端から伸長し、そして
それと同じ核酸分子の部分を形成する一本鎖のプローブ
配列を有している。
適当なハイブリダイゼーション条件下において、プロー
ブの自己相補的な領域は一般にヘアピンループまたは簡
単なヘアピンといわれるループ状の自己ハイブリダイゼ
ーションをする構造を形成する。自己相補的領域の塩基
配列はプローブの５′末端にライゲーションする目的配
列とヘアピンを形成する際、所望の二本鎖プロモーター
配列がライゲーションした目的配列と操作上連結して形
成するように選択される。それゆえ、目的配列にライゲ
ーションするプローブのヘアピン型は適当なＲＮＡポリ
メラーゼ及び必要なりポフクレオシド三リン酸（ｒＮＴ
Ｐｓ）の存在下で転写可能である。
ブの自己相補的な領域は一般にヘアピンループまたは簡
単なヘアピンといわれるループ状の自己ハイブリダイゼ
ーションをする構造を形成する。自己相補的領域の塩基
配列はプローブの５′末端にライゲーションする目的配
列とヘアピンを形成する際、所望の二本鎖プロモーター
配列がライゲーションした目的配列と操作上連結して形
成するように選択される。それゆえ、目的配列にライゲ
ーションするプローブのヘアピン型は適当なＲＮＡポリ
メラーゼ及び必要なりポフクレオシド三リン酸（ｒＮＴ
Ｐｓ）の存在下で転写可能である。
ＲＮＡ転写産物の塩基配列は従って目的配列と相補的で
ある。
ある。
転写は目的配列の増巾物を生成する集積した転写産物に
よって所望の時間続かせることができる。
よって所望の時間続かせることができる。
目的配列が分析上重要である場合、目的配列を高感度で
検出することが本発明の方法によって目的物を増巾し、
次に集積した転写産物を適当に検出することによってな
さる。集積したＲＮＡ転写産物を検出するための多数の
従来の方法が取られている。
検出することが本発明の方法によって目的物を増巾し、
次に集積した転写産物を適当に検出することによってな
さる。集積したＲＮＡ転写産物を検出するための多数の
従来の方法が取られている。
例えば、転写の際に添加されるｒＮＴＰｓは検出可能な
標識物を含み、得られた標識転写産物を使われなかった
標識ｒＮＴＰｓから分離した後、その標識物を分離した
生成物画分において検出する。
標識物を含み、得られた標識転写産物を使われなかった
標識ｒＮＴＰｓから分離した後、その標識物を分離した
生成物画分において検出する。
他の方法は検出可能な核酸プローブでハイブリダイゼー
ションし、例えば、標識プローブまたは抗ＤＮＡ／ＲＮ
Ａのような抗ハイブリッド選択抗体を用いる従来の方法
によって得られたハイブリッドを検出することによって
転写産物を検出する。
ションし、例えば、標識プローブまたは抗ＤＮＡ／ＲＮ
Ａのような抗ハイブリッド選択抗体を用いる従来の方法
によって得られたハイブリッドを検出することによって
転写産物を検出する。
生成したＲＮＡ転写産物を二次的なまたは第二段階の増
巾に供することによってさらに増巾を増大させることが
できる。種々の方法がこの目的に適しており、そのうち
代表的な例はより詳細に以下に記載されている。
巾に供することによってさらに増巾を増大させることが
できる。種々の方法がこの目的に適しており、そのうち
代表的な例はより詳細に以下に記載されている。
本発明の増巾方法は先行する技術による方法に勝る多数
の相当に有利な点を提供する。第一に、もっとも−数的
な態様において本発明の方法は上に記載したＰＣＲｌＴ
ＡＳ及びＬＣＲのような多くの先行する技術による方法
ではオリゴブライマーのような多数のプローブを必要と
するのに対して、−本のプローブ成分のみしか必要とし
ない。
の相当に有利な点を提供する。第一に、もっとも−数的
な態様において本発明の方法は上に記載したＰＣＲｌＴ
ＡＳ及びＬＣＲのような多くの先行する技術による方法
ではオリゴブライマーのような多数のプローブを必要と
するのに対して、−本のプローブ成分のみしか必要とし
ない。
さらに、ＰＣＲ及びＬＣＲにおけるような時間の淡黄及
びわずられしい熱周期の必要がない。上に記載したＱβ
Ｒ法とは違った本プローブは複雑な三次構造がないどこ
ろか簡単な伸長した一本鎖の核酸である。他の利点につ
いてはこの分野の当業者には明らかであろう。
びわずられしい熱周期の必要がない。上に記載したＱβ
Ｒ法とは違った本プローブは複雑な三次構造がないどこ
ろか簡単な伸長した一本鎖の核酸である。他の利点につ
いてはこの分野の当業者には明らかであろう。
本発明の好ましい態様
プローブ及びその調製
本発明のプローブは一本鎖ポリヌクレオチドと結合する
少なくとも２つの主要部分から成る。第１〜３図の図に
関しては、第１の部分はループ配列工によって分離した
旦及び互の自己相補的部分から成る塩基配列Ａである。
少なくとも２つの主要部分から成る。第１〜３図の図に
関しては、第１の部分はループ配列工によって分離した
旦及び互の自己相補的部分から成る塩基配列Ａである。
ハイブリダイゼーション条件下において配列ａ及びａ′
は自己アニールし、自己相補的配列の間に形成した塩基
対結合を示す線ＢＰが描かれた第２図に説明したループ
状ヘアピン構造を形成する。配列ａ及びａ′は出来たル
ープ領域Ａが機能的なプロモーターまたは転写開始部位
を含むように選ばれる。本発明のプローブで第２に主要
な部分はプロモーター領域Ａの３′末端に直接または介
在配列すを介して連結しているプローブ配列Ｃであり、
そして増巾されるかまたは検出される目的配列とハイブ
リダイゼーションが可能となるように遥ばれる。第１〜
３図に描かれているように介在配列すは自己相補的プロ
モーター領域Ａの５′末端に隣接する配列ｂ′と相補的
である。しかし、隣接配列ｂ′がもし存在するのであれ
ば、目的配列とプローブ配列Ｃがハイブリダイゼーショ
ンする際、目的配列の３′末端がそのような隣接配列ｂ
′の５末端とライゲージ３ン可能な（らい充分に長いこ
とのみが必要とされることが認識される。またプローブ
は、一般に第１及び２図に配列ｄとして説明されている
ように３′隣接配列を付加的に含む。
は自己アニールし、自己相補的配列の間に形成した塩基
対結合を示す線ＢＰが描かれた第２図に説明したループ
状ヘアピン構造を形成する。配列ａ及びａ′は出来たル
ープ領域Ａが機能的なプロモーターまたは転写開始部位
を含むように選ばれる。本発明のプローブで第２に主要
な部分はプロモーター領域Ａの３′末端に直接または介
在配列すを介して連結しているプローブ配列Ｃであり、
そして増巾されるかまたは検出される目的配列とハイブ
リダイゼーションが可能となるように遥ばれる。第１〜
３図に描かれているように介在配列すは自己相補的プロ
モーター領域Ａの５′末端に隣接する配列ｂ′と相補的
である。しかし、隣接配列ｂ′がもし存在するのであれ
ば、目的配列とプローブ配列Ｃがハイブリダイゼーショ
ンする際、目的配列の３′末端がそのような隣接配列ｂ
′の５末端とライゲージ３ン可能な（らい充分に長いこ
とのみが必要とされることが認識される。またプローブ
は、一般に第１及び２図に配列ｄとして説明されている
ように３′隣接配列を付加的に含む。
第２図に描かれたヘアピン型のプローブはライゲージ１
ンした目的配列及び介在配列ｂ′の３′−５′の転写に
必要な同起源のポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの存在下で
その５′末端にライゲージ運ンする目的配列の転写を可
能とする。与えられたプローブの濃度及び反応条件に依
存して、機能的な転写可能な二量体型も形成される（第
３図）。自己相補的な領域Ａは潜在的に自身のみならず
、第２のプローブともハイブリダイゼーションし、分れ
たプローブ鏡上の相補的な領域ａ及びａ′がハイブリダ
イゼーションすることによって二量体を形成する。その
ような二量体は第２図に描かれたヘアピン型のように、
領域Ａにおいて機能的なプロモーターを含み、そして同
起源のポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの存在下においてラ
イゲーションした目的配列及び介在配列ｂ′の３’−５
’の転写がなされる。従って、ここに本プローブの「ヘ
アピン型」について言及するならば、機能的に等価な二
量体型が同様の意味をもっことを理解するであろう。
ンした目的配列及び介在配列ｂ′の３′−５′の転写に
必要な同起源のポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの存在下で
その５′末端にライゲージ運ンする目的配列の転写を可
能とする。与えられたプローブの濃度及び反応条件に依
存して、機能的な転写可能な二量体型も形成される（第
３図）。自己相補的な領域Ａは潜在的に自身のみならず
、第２のプローブともハイブリダイゼーションし、分れ
たプローブ鏡上の相補的な領域ａ及びａ′がハイブリダ
イゼーションすることによって二量体を形成する。その
ような二量体は第２図に描かれたヘアピン型のように、
領域Ａにおいて機能的なプロモーターを含み、そして同
起源のポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの存在下においてラ
イゲーションした目的配列及び介在配列ｂ′の３’−５
’の転写がなされる。従って、ここに本プローブの「ヘ
アピン型」について言及するならば、機能的に等価な二
量体型が同様の意味をもっことを理解するであろう。
プローブのヘアピン領域Ａのハイブリダイゼーシヨンに
よって形成されるプロモーターは本技術分野で知られて
いるようにプロモーターに結合しそれから３’−５’の
転写を開始するポリメラーゼ酵素に相当し、そしてそれ
によって認識される二本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）配列である。
よって形成されるプロモーターは本技術分野で知られて
いるようにプロモーターに結合しそれから３’−５’の
転写を開始するポリメラーゼ酵素に相当し、そしてそれ
によって認識される二本鎖核酸（例えばＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）配列である。
本発明における操作には重要ではないが、プロモーター
を形成する自己相補的配列ａ及びａ′の長さは一般的に
は約７及び約２００塩基の間であり、より一般的には約
１０及び約５０塩基の間となるであろう。−数的に、既
知で入手可能な適当なポリメラーゼに対するプロモータ
ーが本発明において用いられる。通常−プローブはＤＮ
Ａ依存性のＲＮＡポリメラーゼすなわち、ＲＮＡ転写物
を生成するＤＮＡの鋳型に作用するポリメラーゼによっ
て転写可能であるＤＮＡより成る。しかしながら、ＲＮ
Ａ依存性のＲＮＡポリメラーゼ（ある種のウィルス、例
えばレトロウィルス及びピコルナウィルスによって生成
されるような）によって転写可能なＲＮＡプローブが用
いられる。有用なプロモーターとしてはとりわけ、Ｔ７
．Ｔ３及びＳＰ６フアージのようなバクテリオファージ
によって生成されるＲＮＡポリメラーゼによって認識さ
れるものがある。
を形成する自己相補的配列ａ及びａ′の長さは一般的に
は約７及び約２００塩基の間であり、より一般的には約
１０及び約５０塩基の間となるであろう。−数的に、既
知で入手可能な適当なポリメラーゼに対するプロモータ
ーが本発明において用いられる。通常−プローブはＤＮ
Ａ依存性のＲＮＡポリメラーゼすなわち、ＲＮＡ転写物
を生成するＤＮＡの鋳型に作用するポリメラーゼによっ
て転写可能であるＤＮＡより成る。しかしながら、ＲＮ
Ａ依存性のＲＮＡポリメラーゼ（ある種のウィルス、例
えばレトロウィルス及びピコルナウィルスによって生成
されるような）によって転写可能なＲＮＡプローブが用
いられる。有用なプロモーターとしてはとりわけ、Ｔ７
．Ｔ３及びＳＰ６フアージのようなバクテリオファージ
によって生成されるＲＮＡポリメラーゼによって認識さ
れるものがある。
そのようなファージポリメラーゼに対するプロモーター
機能を持った典型的な塩基配列は（旦＝２から５；配列
は自己ハイブリダイゼーションしたヘアピン型として表
わされており、プロモーター機能に必要な最少配列を必
ずしも表わすものではない）： である。
機能を持った典型的な塩基配列は（旦＝２から５；配列
は自己ハイブリダイゼーションしたヘアピン型として表
わされており、プロモーター機能に必要な最少配列を必
ずしも表わすものではない）： である。
プローブ配列Ｃは問題の目的配列とのハイブリダイゼー
ションが可能な配列である。本技術分野において知られ
るように、プローブと目的配列の間の相同性の程度は使
用者それぞれの必要性に依存している。程度の高い特異
性を必要とするかまたは望むのであれば、−塩基対のミ
スマツチを検出する場合のような完全かまたは完全に近
い相同性が必要となる。しかしながら、標準的な場合で
は、非相同性の程度は目的配列の必要な特異性、増巾、
または検出を犠牲にすることな（大目に見られている。
ションが可能な配列である。本技術分野において知られ
るように、プローブと目的配列の間の相同性の程度は使
用者それぞれの必要性に依存している。程度の高い特異
性を必要とするかまたは望むのであれば、−塩基対のミ
スマツチを検出する場合のような完全かまたは完全に近
い相同性が必要となる。しかしながら、標準的な場合で
は、非相同性の程度は目的配列の必要な特異性、増巾、
または検出を犠牲にすることな（大目に見られている。
それゆえ、「相補的な」または「）＼イブリダイゼーシ
ョン可能な」という用語はここではプローブ配列及び目
的配列間の相同性の望まれているまたは必要は程度を記
載するために用いられている。プローブ配列の長さは一
般的には重要ではない。しかしながら、選ばれた目的配
列と迅速にそして強くハイブリダイゼーションさせるた
めには、少な（とも約１０塩基の標準的なプローブ配列
である。
ョン可能な」という用語はここではプローブ配列及び目
的配列間の相同性の望まれているまたは必要は程度を記
載するために用いられている。プローブ配列の長さは一
般的には重要ではない。しかしながら、選ばれた目的配
列と迅速にそして強くハイブリダイゼーションさせるた
めには、少な（とも約１０塩基の標準的なプローブ配列
である。
自己相補的なヘアピン型配列且及びＡ′に連結するプロ
ーブにおけるループ配列呈は実質的に転写可能なヘアピ
ンまたは二量体構造の形成を妨害しない、または阻害し
ないくらいの組成及び長さである。標準的にはループ配
列呈は実質上それ自身では非相補的であるように選ばれ
、例えばポリＴ１ポリＡ１ポリＣまたはポリＧまたはそ
の組み合わせのみから成る鎖のようなヘテロ多量体また
はホモ多量体ＤＮＡまたはＲＮＡから成り、そしてルー
プ形成のため十分な空間的自由度をもたせるように少な
くとも２塩基の長さである。より標準的にはループ配列
産は約４及び約５０の塩基の長さである。
ーブにおけるループ配列呈は実質的に転写可能なヘアピ
ンまたは二量体構造の形成を妨害しない、または阻害し
ないくらいの組成及び長さである。標準的にはループ配
列呈は実質上それ自身では非相補的であるように選ばれ
、例えばポリＴ１ポリＡ１ポリＣまたはポリＧまたはそ
の組み合わせのみから成る鎖のようなヘテロ多量体また
はホモ多量体ＤＮＡまたはＲＮＡから成り、そしてルー
プ形成のため十分な空間的自由度をもたせるように少な
くとも２塩基の長さである。より標準的にはループ配列
産は約４及び約５０の塩基の長さである。
プローブはプローブ配列Ｃに対して目的配列がハイブリ
ダイゼーションする際、プローブ５′末端（すなわち、
自己相補的配列ａまたは介在配列すのどちらかの５′末
）が目的配列の３′末端とのライゲーションが可能とな
るように設計される。
ダイゼーションする際、プローブ５′末端（すなわち、
自己相補的配列ａまたは介在配列すのどちらかの５′末
）が目的配列の３′末端とのライゲーションが可能とな
るように設計される。
これによって本技術分野において知られているように目
的配列はプロモーターの５′末端と操作上連結するよう
になる。それゆえ、転写開始によってプロモーターの５
′末端から伸長する配列はポリメラーゼによって機能的
に転写され、目的配列と相補的な配列から成るＲＮＡ転
写物を形成する。
的配列はプロモーターの５′末端と操作上連結するよう
になる。それゆえ、転写開始によってプロモーターの５
′末端から伸長する配列はポリメラーゼによって機能的
に転写され、目的配列と相補的な配列から成るＲＮＡ転
写物を形成する。
上に示したように、プローブの５′末端に対して目的配
列がライゲーションする際、相当する介在配列ｂ′がプ
ローブ配列と操作上連結可能であるならば、例えばそれ
が転写終結部位を含まず、プローブ配列の転写効率をか
なりプ減少させるくらい長いかまたは相当に非特異的な
ハイブリダイゼーションを招くのであるならば、プロー
ブ配列Ｃは介在配列すによって分断される。ある状況に
おいては安定性または検出の目的のため、そのような介
在配列を含めることが望ましくなる。上に記述したよう
に、介在配列す及びｂ′が存在する場合、−数的にそれ
らは正確に相補的であり、それゆえそのヘアピン型にお
いてハイブリダイゼーションし、プローブ配列の反対側
の５′末端と正確にマツチするプローブの５′末端に位
置するようになることが好まれる。目的配列のハイブリ
ダイゼーションによってその３′末端はプローブの５′
末端と効率的にライゲーションする位置におかれる。
列がライゲーションする際、相当する介在配列ｂ′がプ
ローブ配列と操作上連結可能であるならば、例えばそれ
が転写終結部位を含まず、プローブ配列の転写効率をか
なりプ減少させるくらい長いかまたは相当に非特異的な
ハイブリダイゼーションを招くのであるならば、プロー
ブ配列Ｃは介在配列すによって分断される。ある状況に
おいては安定性または検出の目的のため、そのような介
在配列を含めることが望ましくなる。上に記述したよう
に、介在配列す及びｂ′が存在する場合、−数的にそれ
らは正確に相補的であり、それゆえそのヘアピン型にお
いてハイブリダイゼーションし、プローブ配列の反対側
の５′末端と正確にマツチするプローブの５′末端に位
置するようになることが好まれる。目的配列のハイブリ
ダイゼーションによってその３′末端はプローブの５′
末端と効率的にライゲーションする位置におかれる。
しかし、介在配列ｂ′は介在配列すと全体的にまたは部
分的に非相補的であり、そして介在配列すよりかなり長
いことも考えられる。そのような場合、介在配列ｂ′は
プローブ配列Ｃにハイブリダイゼーションする目的配列
の３′末端が本発明のプローブの５′末端にライゲーシ
ョンするのに充分な長さで、そして実質的に非阻害的で
はないことのみが必要となる。転写効率は転写可能な配
列において最初の数（例えば３から５）ヌクレオチドに
存在する配列に依存するということも見出されている。
分的に非相補的であり、そして介在配列すよりかなり長
いことも考えられる。そのような場合、介在配列ｂ′は
プローブ配列Ｃにハイブリダイゼーションする目的配列
の３′末端が本発明のプローブの５′末端にライゲーシ
ョンするのに充分な長さで、そして実質的に非阻害的で
はないことのみが必要となる。転写効率は転写可能な配
列において最初の数（例えば３から５）ヌクレオチドに
存在する配列に依存するということも見出されている。
特に、開始配列がＣＣＣＴＣである場合に、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いた高い効率の転写がなされることが
見出されている。
ポリメラーゼを用いた高い効率の転写がなされることが
見出されている。
プローブはその３′において隣接配列をも含む。
５′末に隣接する配列ｄは用いたＲＮＡポリメラーゼの
効率及び転写条件に依存しである程度まで転写される。
効率及び転写条件に依存しである程度まで転写される。
ある状況においては、そのような隣接配列は分離または
検出に有利なため用いられている。
検出に有利なため用いられている。
本発明のプローブは適当な方法によって調製される。そ
のような方法としては一般的に、オリゴヌクレオチド合
成及び複製可能なベクターによるクローニングがある。
のような方法としては一般的に、オリゴヌクレオチド合
成及び複製可能なベクターによるクローニングがある。
核酸合成の方法は本技術分野においてよく知られている
。例えば、「オリゴヌクレオチド合成：実験的方法」（
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ。
。例えば、「オリゴヌクレオチド合成：実験的方法」（
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ。
ｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ＠）Ｍ、Ｊ、 ガイド編、
ＩＲＬブレス（ｅｄ Ｍ、 Ｊ 、 Ｇａ１ｔ、 Ｉ
ＲＬＰｒｅｓｓ）（オックスフォード１９８４）（Ｏ
ｘｆｏｒｄ １９８４ ）において、オリゴヌクレオチ
ド合成及び得られた生成物の精製及び分析のいくつかの
異つた方法が記載されている。自動合成機の場合、５′
が保護され、固定した（３′ヒドロキシルを介して）ヌ
クレオシド残基から始める。５′を脱保護した後、３′
−ホスホラミダトと５′保護ヌクレオシド残基を反応さ
せることによってホスホジエステル結合を導入する。ホ
スファイト結合は次に酸化され安定な結合となり、そし
てこの工程は所望のヌクレオシド残基が配列へと合成さ
れるように繰り返される。このホスファイトトリエステ
ルホスホトリエステル法に替わって、固相的な方法も用
いることができる。また、合成された核酸はさらに合成
方法によりて修飾される（例えば米国特許第４，８１８
，６８１号に記載されている）。増巾ベクターによる核
酸のクローニングもまた本技術分野でよ（知られている
（マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
クローニング［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ
：７−ルドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂａｒ）（１９８２）を参照］。
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ＠）Ｍ、Ｊ、 ガイド編、
ＩＲＬブレス（ｅｄ Ｍ、 Ｊ 、 Ｇａ１ｔ、 Ｉ
ＲＬＰｒｅｓｓ）（オックスフォード１９８４）（Ｏ
ｘｆｏｒｄ １９８４ ）において、オリゴヌクレオチ
ド合成及び得られた生成物の精製及び分析のいくつかの
異つた方法が記載されている。自動合成機の場合、５′
が保護され、固定した（３′ヒドロキシルを介して）ヌ
クレオシド残基から始める。５′を脱保護した後、３′
−ホスホラミダトと５′保護ヌクレオシド残基を反応さ
せることによってホスホジエステル結合を導入する。ホ
スファイト結合は次に酸化され安定な結合となり、そし
てこの工程は所望のヌクレオシド残基が配列へと合成さ
れるように繰り返される。このホスファイトトリエステ
ルホスホトリエステル法に替わって、固相的な方法も用
いることができる。また、合成された核酸はさらに合成
方法によりて修飾される（例えば米国特許第４，８１８
，６８１号に記載されている）。増巾ベクターによる核
酸のクローニングもまた本技術分野でよ（知られている
（マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
クローニング［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ
：７−ルドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂａｒ）（１９８２）を参照］。
二本鎖ベクターによってクローニングする場合、鎖の分
離が生成物をプローブとして用いるために必要となる。
離が生成物をプローブとして用いるために必要となる。
目的物の増巾方法
本発明方法に従って特定の目的核酸を増巾する第１段階
は適当な液体混合物中でそのような目的物と転写可能な
プローブをハイブリダイゼーションさせることである。
は適当な液体混合物中でそのような目的物と転写可能な
プローブをハイブリダイゼーションさせることである。
そのようなハイブリダイゼーションはこの技術分野にお
いてよく知られている適当な条件下においてなされる。
いてよく知られている適当な条件下においてなされる。
意義のある目的核酸を含有すると思われるがまたは含有
していることが知られているサンプルは種々の源から得
られる。それは生物試料、食物または農産物のサンプル
、環境中のサンプル、その他である。この方法を医療診
断の補助として特定の核酸配列を検出することに応用す
る際、試験サンプルは、尿、血液、乳、脳を髄液、たん
、だ液、便、肺呼気、のどまたは生殖器をふき取った綿
棒、その他の体液または浸出物である。ここにおいて他
でより詳細に考察するように、目的核酸はＲＮＡまたは
ＤＮＡである。
していることが知られているサンプルは種々の源から得
られる。それは生物試料、食物または農産物のサンプル
、環境中のサンプル、その他である。この方法を医療診
断の補助として特定の核酸配列を検出することに応用す
る際、試験サンプルは、尿、血液、乳、脳を髄液、たん
、だ液、便、肺呼気、のどまたは生殖器をふき取った綿
棒、その他の体液または浸出物である。ここにおいて他
でより詳細に考察するように、目的核酸はＲＮＡまたは
ＤＮＡである。
−数的にプローブにハイブリダイゼーションし、そして
ライゲーション可能である目的配列から成る適当な断片
を形成させるためにサンプルの核酸を処理する必要があ
ることが了解される。さらにある状況下では、試験サン
プルを処理してハイブリダイゼーション用に目的核酸を
遊離及び／または抽出すること、及び／または目的配列
が二本鎖型として存在する場合、この技術分野でよく知
られている方法によってハイブリダイゼーション可能な
一本鎖型に変性し抽出することが必要であり、またはそ
れが望ましい。
ライゲーション可能である目的配列から成る適当な断片
を形成させるためにサンプルの核酸を処理する必要があ
ることが了解される。さらにある状況下では、試験サン
プルを処理してハイブリダイゼーション用に目的核酸を
遊離及び／または抽出すること、及び／または目的配列
が二本鎖型として存在する場合、この技術分野でよく知
られている方法によってハイブリダイゼーション可能な
一本鎖型に変性し抽出することが必要であり、またはそ
れが望ましい。
目的配列をプローブにライゲーションさせるためにサン
プルの核酸を断片化することが通常必要である。そのよ
うな断片化はランダムにまたは特異的な方法によって成
される。より一般的なりＮＡアーゼ、ホスホジェステラ
ーゼ、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼと同
様に特異的な制限エンドヌクレアーゼがこの目的で使わ
れる。
プルの核酸を断片化することが通常必要である。そのよ
うな断片化はランダムにまたは特異的な方法によって成
される。より一般的なりＮＡアーゼ、ホスホジェステラ
ーゼ、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼと同
様に特異的な制限エンドヌクレアーゼがこの目的で使わ
れる。
これらの方法はこの技術分野においてよく知られている
。ある場合では、断片化したサンプルの核酸をさらに加
工することがライゲーション可能な部位を生成するため
に必要となる。例えば、ＤＮＡアーゼ！はＤＮＡを分解
して、５′リン酸化残基を生成する。それゆえ、他の方
法によって分解されたＤＮＡはＤＮＡアーゼＩで処理さ
れライゲーション可能な断片を生成する。
。ある場合では、断片化したサンプルの核酸をさらに加
工することがライゲーション可能な部位を生成するため
に必要となる。例えば、ＤＮＡアーゼ！はＤＮＡを分解
して、５′リン酸化残基を生成する。それゆえ、他の方
法によって分解されたＤＮＡはＤＮＡアーゼＩで処理さ
れライゲーション可能な断片を生成する。
断片化のために制限酵素を用いることは通常量も有利で
ある。制限酵素による核酸の分解によって決った末端及
びライゲーション可能な部位をもつ断片が生成される。
ある。制限酵素による核酸の分解によって決った末端及
びライゲーション可能な部位をもつ断片が生成される。
例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような特異的な酵素を用
いてＤＮＡをライゲーションする場合、一方の断片のリ
ン酸化５′末端が他方の断片の３′ヒドロキシル基に並
べられることが望ましい。これは制限酵素分解によって
容易に成される。この方法を行うにあたって、ライゲー
ションされる両方の断片がライゲーション部位において
二本鎖型である場合にライゲーション効率が最大になる
。
いてＤＮＡをライゲーションする場合、一方の断片のリ
ン酸化５′末端が他方の断片の３′ヒドロキシル基に並
べられることが望ましい。これは制限酵素分解によって
容易に成される。この方法を行うにあたって、ライゲー
ションされる両方の断片がライゲーション部位において
二本鎖型である場合にライゲーション効率が最大になる
。
多くの既知の制限酵素が、選ばれそしてライゲーション
部位に隣接する配列に基づいて本発明で用いられる。制
限酵素の配列特異性によって本発明のヘアピンプローブ
に含まれるプローブ配列を設計する融通性が与えられる
。例えばベーターグロブリンによるヒト錐状赤血球変異
のＤｄｅＩ多形成はＤｄｅＩ分解したヒトのＤＮＡサン
プルを用いることによって同定する。プローブ配列は変
異部位を包囲するように設計され、ＤｄｅＩ切断断片は
ハイブリダイゼーションによりその３′末端がヘアピン
プローブの５′末端に並ぶ。そのようなハイブリダイゼ
ーションをしたＤＮＡ断片はプローブと効率的にライゲ
ーション可能となりそれゆえ転写可能となる。一方、変
異が起っていないＤＮＡは相当なまでハイブリダイゼー
ションするが、分解されない。しかし、ライゲーション
する相手の方向が正しくないためライゲーションはより
非効率的に進む。制限酵素を用いる他の例としてはクラ
ミジアトラコマテイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃ
ｈｏｉ＋ａｔｉｓ）の配列を検出することがある。サン
プルの核酸はその生物のプラスミドＤＮＡもまた分解さ
れ多数の断片を生成するのと同じように制限酵素で分解
される（プラスミドＤＮＡを１ケ所で切断するＳ ｓｔ
ｒまたはそれを数ケ所で切断するＨｉｒｄｌ［［、ブ
ラック（Ｂ １ａｃｋ）ら、カレントマイクロバイオロ
ジー（（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ）＋
）） （１９８９） １９ ： ６７−７４）。その
ような断片のすべてに相当するプローブは別々にまたは
同時にハイブリダイゼーション、ライゲーション及び転
写がなされる。転写後、ＲＮＡは単一プラスミドＤＮＡ
プローブとのハイブリダイゼーションによって分析され
る。
部位に隣接する配列に基づいて本発明で用いられる。制
限酵素の配列特異性によって本発明のヘアピンプローブ
に含まれるプローブ配列を設計する融通性が与えられる
。例えばベーターグロブリンによるヒト錐状赤血球変異
のＤｄｅＩ多形成はＤｄｅＩ分解したヒトのＤＮＡサン
プルを用いることによって同定する。プローブ配列は変
異部位を包囲するように設計され、ＤｄｅＩ切断断片は
ハイブリダイゼーションによりその３′末端がヘアピン
プローブの５′末端に並ぶ。そのようなハイブリダイゼ
ーションをしたＤＮＡ断片はプローブと効率的にライゲ
ーション可能となりそれゆえ転写可能となる。一方、変
異が起っていないＤＮＡは相当なまでハイブリダイゼー
ションするが、分解されない。しかし、ライゲーション
する相手の方向が正しくないためライゲーションはより
非効率的に進む。制限酵素を用いる他の例としてはクラ
ミジアトラコマテイス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃ
ｈｏｉ＋ａｔｉｓ）の配列を検出することがある。サン
プルの核酸はその生物のプラスミドＤＮＡもまた分解さ
れ多数の断片を生成するのと同じように制限酵素で分解
される（プラスミドＤＮＡを１ケ所で切断するＳ ｓｔ
ｒまたはそれを数ケ所で切断するＨｉｒｄｌ［［、ブ
ラック（Ｂ １ａｃｋ）ら、カレントマイクロバイオロ
ジー（（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ）＋
）） （１９８９） １９ ： ６７−７４）。その
ような断片のすべてに相当するプローブは別々にまたは
同時にハイブリダイゼーション、ライゲーション及び転
写がなされる。転写後、ＲＮＡは単一プラスミドＤＮＡ
プローブとのハイブリダイゼーションによって分析され
る。
以下の種類の試薬を用いるというような種々の他の方法
でＤＮＡはまた分解される。ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）、
ストロエベル（Ｓ ｔｒｏｅｂｅｌ）ら、（１９８８）
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテ
イ−（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、）１１
０： ７９２７、及びデルパン（Ｄｅｒｖａｎ） （１
９８６）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２ ： ４
６４、Ｃｏ（ｎ）−フェナントロリン、チェノとシグマ
（Ｃｈｅｎ ａｎｄＳｉｇ■ａ）（１９８７）サイエン
ス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ） ２３７：１１９７、クラスＩ
Ｉの制限酵素、キム（Ｋｉｎ）ら（１９８８）サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０ ： ５０４、ハイブリッ
ドＤＮＡアーゼ、コリー（Ｃｏｒｅｖ）ら（１９８９）
バイオケミストリー（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 ）２８ ：
８２７７、ベロマイシン、ウメザワ（ＵｍｅｚａＷａ
）ら（１９８６）ジャーナル・オブ・アンチバイオチフ
ス（Ｊ 、 Ａｎｔｉｂｉｏｔ、）（Ｔｏｋｙｏ）Ｓｅ
ｔ、 Ａ１９：２００、ネオカルジノスフチン、ゴール
ドベルブ（Ｇ ｏｌｄｂｅｒｇ）ら（１９８１）セカン
ドアニュアルブリストルーマイカーシンポジウムインキ
ャンサーリサーチ（Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｂｒ
１ｓｔｏｌ −Ｍｙｅｒｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（アカデ
ミツクプレス、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１６３ページ、及びメチ
ジラムプロビル−ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）へルツベルグ
ＣＨｅｒｔｚｂｅｒｇ）ら（１９８２）ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイー（Ｊ、Ａ■
、Ｃｈｅｔ Ｓｏｃ、）１０４ ： ３１３゜本発明
の増巾方法は第４図の図に説明されている。本ヘアピン
プローブと核酸のサンプル中に存在する目的配列とのハ
イブリダイゼーションにょうてプローブにおけるプロー
ブ配列Ｃが、その相補的目的配列Ｃ′とハイブリダイゼ
ーションしているハイブリッド（１）を生成する。第４
図においてプローブ中の介在配列す及びｂ′は相互に相
補的であるように描かれており、それはここで他に考察
されているように、重要とは考えられていないが、−数
的に好まれている。ハイブリダイゼーション後、並列し
ているそれぞれプローブ配列ｂ′及び目的配列Ｃ′の５
′及び３′末端がライゲージコンしたハイブリッド生成
物（Ｉｆ）を生じる。
でＤＮＡはまた分解される。ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）、
ストロエベル（Ｓ ｔｒｏｅｂｅｌ）ら、（１９８８）
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテ
イ−（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｗ、 Ｓｏｃ、）１１
０： ７９２７、及びデルパン（Ｄｅｒｖａｎ） （１
９８６）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２ ： ４
６４、Ｃｏ（ｎ）−フェナントロリン、チェノとシグマ
（Ｃｈｅｎ ａｎｄＳｉｇ■ａ）（１９８７）サイエン
ス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ） ２３７：１１９７、クラスＩ
Ｉの制限酵素、キム（Ｋｉｎ）ら（１９８８）サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４０ ： ５０４、ハイブリッ
ドＤＮＡアーゼ、コリー（Ｃｏｒｅｖ）ら（１９８９）
バイオケミストリー（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 ）２８ ：
８２７７、ベロマイシン、ウメザワ（ＵｍｅｚａＷａ
）ら（１９８６）ジャーナル・オブ・アンチバイオチフ
ス（Ｊ 、 Ａｎｔｉｂｉｏｔ、）（Ｔｏｋｙｏ）Ｓｅ
ｔ、 Ａ１９：２００、ネオカルジノスフチン、ゴール
ドベルブ（Ｇ ｏｌｄｂｅｒｇ）ら（１９８１）セカン
ドアニュアルブリストルーマイカーシンポジウムインキ
ャンサーリサーチ（Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｂｒ
１ｓｔｏｌ −Ｍｙｅｒｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）（アカデ
ミツクプレス、ニューヨーク、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）１６３ページ、及びメチ
ジラムプロビル−ＥＤＴＡ−Ｆｅ（ＩＩ）へルツベルグ
ＣＨｅｒｔｚｂｅｒｇ）ら（１９８２）ジャーナル・オ
ブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイー（Ｊ、Ａ■
、Ｃｈｅｔ Ｓｏｃ、）１０４ ： ３１３゜本発明
の増巾方法は第４図の図に説明されている。本ヘアピン
プローブと核酸のサンプル中に存在する目的配列とのハ
イブリダイゼーションにょうてプローブにおけるプロー
ブ配列Ｃが、その相補的目的配列Ｃ′とハイブリダイゼ
ーションしているハイブリッド（１）を生成する。第４
図においてプローブ中の介在配列す及びｂ′は相互に相
補的であるように描かれており、それはここで他に考察
されているように、重要とは考えられていないが、−数
的に好まれている。ハイブリダイゼーション後、並列し
ているそれぞれプローブ配列ｂ′及び目的配列Ｃ′の５
′及び３′末端がライゲージコンしたハイブリッド生成
物（Ｉｆ）を生じる。
ポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの添加によって、結合配列
ｂｅを持つ多数のＲＮＡ転写物の生成と共に転写が進む
。
ｂｅを持つ多数のＲＮＡ転写物の生成と共に転写が進む
。
転写はライゲーションした転写可能な目的配列から成る
ハイブリッドを含む液体混合物中にポリメラーゼ及び必
要なｒＮＴＰｓを添加することによって開始する。適当
な条件下において、充分な量のｒＮＴＰｓが存在するな
らばＲＮＡ転写物の合成が連続的に進む標準的には、リ
ボヌクレアーゼの混入によるＲＮＡ転写物の望ましくな
い分解を避けるために転写反応混合物中にリボヌクレア
ーゼインヒビターが含まれる。転写は事前に決めておい
た時間または検出可能かまたは所望の量のＲＮＡ転写産
物が集積されるまで続けられる。任意の時間で生成した
ＲＮＡ転写物の量は元のサンプル中に存在してした目的
配列の量に比例している。それゆえ集積された転写産物
は目的配列の増巾物として与えられる。次に転写はポリ
メラーゼの不活性化または混合物から反応物を除去する
といったような従来の方法によって終結される。
ハイブリッドを含む液体混合物中にポリメラーゼ及び必
要なｒＮＴＰｓを添加することによって開始する。適当
な条件下において、充分な量のｒＮＴＰｓが存在するな
らばＲＮＡ転写物の合成が連続的に進む標準的には、リ
ボヌクレアーゼの混入によるＲＮＡ転写物の望ましくな
い分解を避けるために転写反応混合物中にリボヌクレア
ーゼインヒビターが含まれる。転写は事前に決めておい
た時間または検出可能かまたは所望の量のＲＮＡ転写産
物が集積されるまで続けられる。任意の時間で生成した
ＲＮＡ転写物の量は元のサンプル中に存在してした目的
配列の量に比例している。それゆえ集積された転写産物
は目的配列の増巾物として与えられる。次に転写はポリ
メラーゼの不活性化または混合物から反応物を除去する
といったような従来の方法によって終結される。
ＲＮＡ転写産物のさらなる増巾は例えばＱβレプリカー
ゼまたはブロムモザイクウィルス由来のレプリカーゼの
ようなレプリカーゼを用いることによる多数の方法でな
される。また（１）転写可能なヘアピンプローブ（本プ
ローブのように自己アニーリングし、プロモーター含有
領域によって構築されるが、このプローブのように３′
末端からもむしろ５′末端から伸長するＲＮＡ転写物と
相補的な転写可能なプローブ領域をもつ）及び（２）Ｒ
ＮＡ転写産物において隣接した配列とハイブリダイゼー
ションする第２プローブから成るヘアピンプローブ／第
２プローブ対の別々のセットが用いられる。転写物に対
するヘアピンプローブ／第２プローブ対のハイブリダイ
ゼーション後、ハイブリダイゼーションした対はライゲ
ーションしポリメラーゼの存在下付加的なＲＮＡ転写物
を自ら生成する転写可能な核酸を形成する。さらにＲＮ
Ａ転写物は固定化のための部位を含むように生成され（
例えば、それぞれアビジンまたは抗ハブテン抗体のよう
なリガンド結合相手の固定化型の添加によって得られた
ｒＮＴＰｓ及び固定化物を修飾する例えばビオチンまた
はハブテンのようなリガンドの利用による）、混合物か
ら分離した後、さらなるプローブにハイブリダイゼーシ
ョンし、さらなる転写のためのプロモータ一部位を導入
する。２．３サイクル後、百万倍以上の増巾物が可能で
ある。
ゼまたはブロムモザイクウィルス由来のレプリカーゼの
ようなレプリカーゼを用いることによる多数の方法でな
される。また（１）転写可能なヘアピンプローブ（本プ
ローブのように自己アニーリングし、プロモーター含有
領域によって構築されるが、このプローブのように３′
末端からもむしろ５′末端から伸長するＲＮＡ転写物と
相補的な転写可能なプローブ領域をもつ）及び（２）Ｒ
ＮＡ転写産物において隣接した配列とハイブリダイゼー
ションする第２プローブから成るヘアピンプローブ／第
２プローブ対の別々のセットが用いられる。転写物に対
するヘアピンプローブ／第２プローブ対のハイブリダイ
ゼーション後、ハイブリダイゼーションした対はライゲ
ーションしポリメラーゼの存在下付加的なＲＮＡ転写物
を自ら生成する転写可能な核酸を形成する。さらにＲＮ
Ａ転写物は固定化のための部位を含むように生成され（
例えば、それぞれアビジンまたは抗ハブテン抗体のよう
なリガンド結合相手の固定化型の添加によって得られた
ｒＮＴＰｓ及び固定化物を修飾する例えばビオチンまた
はハブテンのようなリガンドの利用による）、混合物か
ら分離した後、さらなるプローブにハイブリダイゼーシ
ョンし、さらなる転写のためのプロモータ一部位を導入
する。２．３サイクル後、百万倍以上の増巾物が可能で
ある。
特に示し以下の方法は第２段階の増巾をするのに有効で
ある。
ある。
（１）ＲＮＡによるハイブリッドからのプローブの置換
−プロモータープローブは固体支持物上に固定化したか
または固定化可能な支持物にノ１イブリダイゼーション
しているそれと相補的なりＮＡとハイブリダイゼーショ
ンする。固定化または固定化可能な支持物は特異的なＩ
＼イブリダイゼーション条件下生成ＲＮＡと接触するよ
うになる。
−プロモータープローブは固体支持物上に固定化したか
または固定化可能な支持物にノ１イブリダイゼーション
しているそれと相補的なりＮＡとハイブリダイゼーショ
ンする。固定化または固定化可能な支持物は特異的なＩ
＼イブリダイゼーション条件下生成ＲＮＡと接触するよ
うになる。
ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとＤＮＡ−ＤＮＡノーイブ
リッドの間の安定性の違いのためのＲＮＡがＤＮＡに替
ってハイブリダイゼーションするためこれによって転写
可能なプローブが遊離される。第１段階の転写後、ＲＮ
Ａポリメラーゼ活性は鎖が置換する条件下において固定
化Ｄ Ｎ Ａ ／１イブリッド支持体と混合物が反応す
る前に加熱することによって破壊される。ＲＮＡのそれ
ぞれの分子に対して１分子のプロモータープローブがも
つとも理想的な条件下において生成される。糸を周期化
することによってさらに転写可能なプローブを生成する
ためにＲＮＡを用いることが可能であり、それゆえ糸の
第２の増巾が可能となる。より効果的に鎖を置換するた
めには、側鎖移動が利用可能である。本方法において、
置換するＤＮＡ分子にはその３′または５′末端におい
てノ＼イブリダイゼーションしない一本鎖領域があり、
ＲＮＡにおいてそれに相当する部分がＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッド形成を開始する。
リッドの間の安定性の違いのためのＲＮＡがＤＮＡに替
ってハイブリダイゼーションするためこれによって転写
可能なプローブが遊離される。第１段階の転写後、ＲＮ
Ａポリメラーゼ活性は鎖が置換する条件下において固定
化Ｄ Ｎ Ａ ／１イブリッド支持体と混合物が反応す
る前に加熱することによって破壊される。ＲＮＡのそれ
ぞれの分子に対して１分子のプロモータープローブがも
つとも理想的な条件下において生成される。糸を周期化
することによってさらに転写可能なプローブを生成する
ためにＲＮＡを用いることが可能であり、それゆえ糸の
第２の増巾が可能となる。より効果的に鎖を置換するた
めには、側鎖移動が利用可能である。本方法において、
置換するＤＮＡ分子にはその３′または５′末端におい
てノ＼イブリダイゼーションしない一本鎖領域があり、
ＲＮＡにおいてそれに相当する部分がＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッド形成を開始する。
一本鎖側鎖移動現象が二本鎖ＤＮＡの転写において見ら
れると考えられる。ＲＮＡの新たに合成された鎖がＤＮ
Ａ鎖の同じ配列と置換する。−木調側鎖の移動速度は１
０００塩基対／秒よりも速いと見積もられている。二本
鎖側鎖移動についても記載がある。この工程は３７℃に
おいて約６０００塩基対／秒である。（バイオフィジカ
ルケミストリー （（ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＬ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ） ）、カウンター＆シュンメル（（Ｃ
ａｎｔｏｒ＆５ｃｈｉ＋ｕｅｌ））フリーマン刊行、サ
ンフランシスコ、１９８０、第■巻、（（Ｆｒｅｅｍａ
ｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、 ５ａｎＦｒａｎｃｉ
ｓｃｏ１１９８０、ｖｏｌ。ＩＩＩ） ’） 、１２３
８−１２３９ページ）。この情報により高温処理するこ
とな（２０塩基の側鎖移動置換が非常に速い工程である
ことが容易に判断される。
れると考えられる。ＲＮＡの新たに合成された鎖がＤＮ
Ａ鎖の同じ配列と置換する。−木調側鎖の移動速度は１
０００塩基対／秒よりも速いと見積もられている。二本
鎖側鎖移動についても記載がある。この工程は３７℃に
おいて約６０００塩基対／秒である。（バイオフィジカ
ルケミストリー （（ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＬ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ） ）、カウンター＆シュンメル（（Ｃ
ａｎｔｏｒ＆５ｃｈｉ＋ｕｅｌ））フリーマン刊行、サ
ンフランシスコ、１９８０、第■巻、（（Ｆｒｅｅｍａ
ｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、 ５ａｎＦｒａｎｃｉ
ｓｃｏ１１９８０、ｖｏｌ。ＩＩＩ） ’） 、１２３
８−１２３９ページ）。この情報により高温処理するこ
とな（２０塩基の側鎖移動置換が非常に速い工程である
ことが容易に判断される。
（２）プローブの一方の鎖の置換−この方法は遊離した
プローブが完全なプローブではな（、むしろプロモータ
ーの一方の鎖をもつプローブの一方の鎖であることを除
いて前述の方法と同様である。他の鎖を添加することに
よってのみ転写が可能となる。
プローブが完全なプローブではな（、むしろプロモータ
ーの一方の鎖をもつプローブの一方の鎖であることを除
いて前述の方法と同様である。他の鎖を添加することに
よってのみ転写が可能となる。
（３）ライゲーション可能なリンカ−の置換−この方法
もまた前述の方法と同様であるが、しかし、遊離した断
片はプロモータープローブの２つの部分をライゲーショ
ンするためのリンカ−として作用する。
もまた前述の方法と同様であるが、しかし、遊離した断
片はプロモータープローブの２つの部分をライゲーショ
ンするためのリンカ−として作用する。
（４）ＲＮＡ介在型のライゲーション−この方法は２つ
のＤＮＡ断片のライゲーションがなされ、液溶中におい
て行なわれる可能な限りの利点によって特徴付けされる
架橋を形成するＲＮＡ産物の利用である。
のＤＮＡ断片のライゲーションがなされ、液溶中におい
て行なわれる可能な限りの利点によって特徴付けされる
架橋を形成するＲＮＡ産物の利用である。
（５） リサイクルの獲得−この方法はプロモータープ
ローブの獲得試薬として最初の転写物のリガンド修飾し
た（例えばビオチニル化した）ＲＮＡ産物を利用する。
ローブの獲得試薬として最初の転写物のリガンド修飾し
た（例えばビオチニル化した）ＲＮＡ産物を利用する。
転写開始時において、ビオチニル化ＶＴＰを転写開始の
ために他のヌクレオシド三リン酸に混合する。ビオチニ
ル化ＲＮＡは次に相補的プロモータープローブとの混合
前かまたはその後に獲得される。ビオチニル化ＲＮＡが
獲得されたら、固体支持物上で相補的ＤＮＡプロモータ
ーの最初の相互作用がなされる。ビオチニル化ＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッドは次により多くのＲＮＡを生成する
転写のために用いられる。そのようなハイブリッドから
の転写が効率的でないならば、ハイブリッドからＤＮＡ
を遊離するために熱またはアルカリ処理を転写前に行う
。同様な方法もまた抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体
の獲得反応を用いそしてビオチニル化ＲＮＡの工程を不
要とすることによって行なわれる。
ために他のヌクレオシド三リン酸に混合する。ビオチニ
ル化ＲＮＡは次に相補的プロモータープローブとの混合
前かまたはその後に獲得される。ビオチニル化ＲＮＡが
獲得されたら、固体支持物上で相補的ＤＮＡプロモータ
ーの最初の相互作用がなされる。ビオチニル化ＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッドは次により多くのＲＮＡを生成する
転写のために用いられる。そのようなハイブリッドから
の転写が効率的でないならば、ハイブリッドからＤＮＡ
を遊離するために熱またはアルカリ処理を転写前に行う
。同様な方法もまた抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体
の獲得反応を用いそしてビオチニル化ＲＮＡの工程を不
要とすることによって行なわれる。
（６）ＲＮＡが仲介するコピー−この方法は転写物をブ
ライマーとして用いることによってプロモータ一部位を
作成する。ブライマー伸長生成物は転写可能シグナルと
して作用する。ＲＮＡ産物と相補する配列は例えばＭ１
３のような一本鎖ファージベクターにクローン化される
。転写物はそのようなＭ１３ＤＮＡと反応し、そしてハ
イブリッドは次にＤＮＡポリメラーゼ及び生成物を同定
するためにそのうちのいくつかを標識したデオキシヌク
レオシド三リン酸を用いて伸長する。本方法によってま
たさらなる増巾のための転写可能な配列を生成する。
ライマーとして用いることによってプロモータ一部位を
作成する。ブライマー伸長生成物は転写可能シグナルと
して作用する。ＲＮＡ産物と相補する配列は例えばＭ１
３のような一本鎖ファージベクターにクローン化される
。転写物はそのようなＭ１３ＤＮＡと反応し、そしてハ
イブリッドは次にＤＮＡポリメラーゼ及び生成物を同定
するためにそのうちのいくつかを標識したデオキシヌク
レオシド三リン酸を用いて伸長する。本方法によってま
たさらなる増巾のための転写可能な配列を生成する。
同様な方法が転写生成物ＲＮＡブライマーを伸長する鋳
型としてクローン化したＤＮＡにかわって合成オリゴヌ
クレオチドを用いて行なわれる。
型としてクローン化したＤＮＡにかわって合成オリゴヌ
クレオチドを用いて行なわれる。
プロモーターを含むＤＮＡは生成ＲＮＡとハイブリダイ
ゼーションし、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し次に
伸長した生成物が転写される。始めの一本鎖ＲＮＡは転
写されない。最終生成物は特異的固定化プローブによる
獲得によって分析される。この方法は高感度は分析に必
要なくらいの増巾物を生成することに用いられる。
ゼーションし、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し次に
伸長した生成物が転写される。始めの一本鎖ＲＮＡは転
写されない。最終生成物は特異的固定化プローブによる
獲得によって分析される。この方法は高感度は分析に必
要なくらいの増巾物を生成することに用いられる。
（７）置換したＤＮＡが仲介するコピー−この方法は転
写産物を生成する伸長のためにブライマーとして置換し
たＤＮＡを用いる点を除いて前述の方法と同様である。
写産物を生成する伸長のためにブライマーとして置換し
たＤＮＡを用いる点を除いて前述の方法と同様である。
（８）固定化オリゴが仲介する獲得−この方法において
、オリゴヌクレオチド（例えば、完全な転写物の半分の
大きさ）は固体支持物に固定化し、生成ＲＮＡはハイブ
リダイゼーションによって取得され、ＲＮＡの残りのハ
イブリダイゼーションしていない部分は次に転写可能な
ヘアピンプローブを獲得するために用いられる。
、オリゴヌクレオチド（例えば、完全な転写物の半分の
大きさ）は固体支持物に固定化し、生成ＲＮＡはハイブ
リダイゼーションによって取得され、ＲＮＡの残りのハ
イブリダイゼーションしていない部分は次に転写可能な
ヘアピンプローブを獲得するために用いられる。
（９）ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの利用−本方
法において、始めのプローブは転写後ＲＮＡ依存性のＲ
ＮＡポリメラーゼ（例えばＱβレブリカーゼ）によって
さらなる増巾に特異的なＲＮＡを生成する一本鎖または
二本鎖ＤＮＡの配列を持つように修飾される。この配列
はプローブの５′末端上にある。生成ＲＮＡは第２の工
程を済すにさらなる増巾のために用いられる（ＰＣ７８
８−１０３１５参照）。
法において、始めのプローブは転写後ＲＮＡ依存性のＲ
ＮＡポリメラーゼ（例えばＱβレブリカーゼ）によって
さらなる増巾に特異的なＲＮＡを生成する一本鎖または
二本鎖ＤＮＡの配列を持つように修飾される。この配列
はプローブの５′末端上にある。生成ＲＮＡは第２の工
程を済すにさらなる増巾のために用いられる（ＰＣ７８
８−１０３１５参照）。
検出方法
合成されそして集積されたＲＮＡ転写物を検出する方法
は主として使用者の希望及び必要性に頼る。種々の方法
が知られており、そして本発明に応用できるものが将来
開発されるであろう。単なる例として、２．３の方法を
ここに詳細に記載する。主として、これらの方法は標識
した転写産物の生成または得られたハイブリッドを検出
する転写産物のハイブリダイゼーションに基づいている
。
は主として使用者の希望及び必要性に頼る。種々の方法
が知られており、そして本発明に応用できるものが将来
開発されるであろう。単なる例として、２．３の方法を
ここに詳細に記載する。主として、これらの方法は標識
した転写産物の生成または得られたハイブリッドを検出
する転写産物のハイブリダイゼーションに基づいている
。
（１）標識したＲＮＡ転写物の合成−１つまたはそれ以
上の検出可能な標識物を含むｒＮＴＰｓを転写混合物に
添加することによって、これまた検出可能な標識物を含
むＲＮＡ転写物を合成することができる。有効な検出可
能な標識物として供給される物質はこの技術分野におい
てよく知られており、直接検出されないが、例えばそれ
ぞれアビジン及び抗体等の特異的結合相手の標識型と反
応させることによって簡単に検出されるビオチン及びハ
ブテンのようなりガントと同様に、例えば”Ｐ、”Ｈ，
”’Ｉ、 及Ｕ１４Ｃ（Ｄような放射性同位体、蛍光物
質、化学ルミネセンス、発色団その他である。
上の検出可能な標識物を含むｒＮＴＰｓを転写混合物に
添加することによって、これまた検出可能な標識物を含
むＲＮＡ転写物を合成することができる。有効な検出可
能な標識物として供給される物質はこの技術分野におい
てよく知られており、直接検出されないが、例えばそれ
ぞれアビジン及び抗体等の特異的結合相手の標識型と反
応させることによって簡単に検出されるビオチン及びハ
ブテンのようなりガントと同様に、例えば”Ｐ、”Ｈ，
”’Ｉ、 及Ｕ１４Ｃ（Ｄような放射性同位体、蛍光物
質、化学ルミネセンス、発色団その他である。
（２）標識プローブとのハイブリダイゼーションによる
検出−この方法はＲＮＡ転写物を検出するためのさらな
るハイブリダイゼーション工程による。直接または間接
的に検出可能な標識物を含むプローブの調製のための種
々の方法が知られている。標識物はすぐ上に述べた材料
と同じである。
検出−この方法はＲＮＡ転写物を検出するためのさらな
るハイブリダイゼーション工程による。直接または間接
的に検出可能な標識物を含むプローブの調製のための種
々の方法が知られている。標識物はすぐ上に述べた材料
と同じである。
（３）ハイブリダイゼーション及び抗ハイブリッド試薬
の利用による検出−検出プローブはまたＲＮＡ転写物と
形成したハイブリッドが混合物中において特異的であり
それゆえ抗ハイブリッド試薬を用いることによって選択
的に検出可能であるように選ばれる。抗ＤＮＡ／ＲＮＡ
及び抗ＲＮＡ／ＲＮＡ抗体（米国特許第４，８３３．０
８４号及び欧州特許筒１６３，２２０号）、抗Ｄ Ｎ
Ａ／Ｄ ＮＡ抗体（米国特許第４．６２３，６２７号）
及び挿入複合体に対する抗体（米国特許第４．５６３，
４１７号）を含めて種々の抗ハイブリッド抗体が文献中
において知られている。抗ハイブリッド抗体は上述した
検出した可能な標識物を含むように効果的に修飾される
。
の利用による検出−検出プローブはまたＲＮＡ転写物と
形成したハイブリッドが混合物中において特異的であり
それゆえ抗ハイブリッド試薬を用いることによって選択
的に検出可能であるように選ばれる。抗ＤＮＡ／ＲＮＡ
及び抗ＲＮＡ／ＲＮＡ抗体（米国特許第４，８３３．０
８４号及び欧州特許筒１６３，２２０号）、抗Ｄ Ｎ
Ａ／Ｄ ＮＡ抗体（米国特許第４．６２３，６２７号）
及び挿入複合体に対する抗体（米国特許第４．５６３，
４１７号）を含めて種々の抗ハイブリッド抗体が文献中
において知られている。抗ハイブリッド抗体は上述した
検出した可能な標識物を含むように効果的に修飾される
。
（４）ＲＮＡ転写物の検出−転写産物それ自体は混合物
からＲＮＡを分離することによって、または先ずホスフ
ァターゼで未反応のｒＮＴＰｓを破壊し、次にポリヌク
レオチドホスホリラーゼ、ピルベートキナーゼ及びホタ
ルルシフェラーゼの反応から成−るバイオルミネセンス
糸のようなＲＮＡに対して検出可能な反応をする試薬を
添加することによって溶液中において検出可能である（
例えばＣ，Ｐ、Ｈ，バリー（Ｃ，Ｐ、ＨＳＶａｒｙ）
（１９８７）ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎ ｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、）１５ ： ６８８
３−６８９７に記載されている）。
からＲＮＡを分離することによって、または先ずホスフ
ァターゼで未反応のｒＮＴＰｓを破壊し、次にポリヌク
レオチドホスホリラーゼ、ピルベートキナーゼ及びホタ
ルルシフェラーゼの反応から成−るバイオルミネセンス
糸のようなＲＮＡに対して検出可能な反応をする試薬を
添加することによって溶液中において検出可能である（
例えばＣ，Ｐ、Ｈ，バリー（Ｃ，Ｐ、ＨＳＶａｒｙ）
（１９８７）ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎ ｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、）１５ ： ６８８
３−６８９７に記載されている）。
当然のことながら、転写糸は特異的な大きさの転写物を
生成するように設計されるので、そのような場合におい
てはそれらのゲル電気泳動のようなサイズ分析方法によ
って簡単に同定される。
生成するように設計されるので、そのような場合におい
てはそれらのゲル電気泳動のようなサイズ分析方法によ
って簡単に同定される。
本発明をここに説明するが、以下の実施例によって限定
されるものではない。
されるものではない。
実施例１
相補的オリゴヌクレオチドに対するプローブのライゲー
ション及び転写 本実施例はサンプル配列が本発明のプローブに対してハ
イブリダイゼーションしライゲーションした後転写によ
ってＲＮＡ合成をすることを示した。
ション及び転写 本実施例はサンプル配列が本発明のプローブに対してハ
イブリダイゼーションしライゲーションした後転写によ
ってＲＮＡ合成をすることを示した。
下に示したオリゴヌクレオチドＨＮＴ及びＣＮＴは供給
者からの試薬を用いてアブライドバイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） （フ
ォスター市、カリフォルニア、アメリカ合衆国、Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃ１ｔｙ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）モデル３８０
Ｂ（Ｍｏｄｅｌ ３８０ Ｂ ）オリゴヌクレオチド
合成機で合成された。
者からの試薬を用いてアブライドバイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） （フ
ォスター市、カリフォルニア、アメリカ合衆国、Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃ１ｔｙ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）モデル３８０
Ｂ（Ｍｏｄｅｌ ３８０ Ｂ ）オリゴヌクレオチド
合成機で合成された。
ＨＮＴはゲル電気泳動による精製後、マニアテイス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）モレキュラークローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、コ
ールドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂ。
ａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）モレキュラークローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、コ
ールドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂ。
ｒ）、１２２ページに記載されている方法に従ってポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いてその５′末端がリン酸化
された。カイネーションされたＨＮＴを次に３７℃で５
分間ＣＮＴとハイブリダイゼーションし次に１００ユニ
ツトの７４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム、
インデイアナポリス、インデイアナ、アメカリ合衆国、
Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、 Ｉ Ｎ５ＵＳＡ）及びＡＴＰ
（最終濃度１０ｍＭ）を添加した。ライゲーション反
応は混合物を３７℃で２時間インキュベーションするこ
とによって行った。ＨＮＴ及びＣＮＴの量は出発材料と
して２０ｎｇであった。
ヌクレオチドキナーゼを用いてその５′末端がリン酸化
された。カイネーションされたＨＮＴを次に３７℃で５
分間ＣＮＴとハイブリダイゼーションし次に１００ユニ
ツトの７４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム、
インデイアナポリス、インデイアナ、アメカリ合衆国、
Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、 Ｉ Ｎ５ＵＳＡ）及びＡＴＰ
（最終濃度１０ｍＭ）を添加した。ライゲーション反
応は混合物を３７℃で２時間インキュベーションするこ
とによって行った。ＨＮＴ及びＣＮＴの量は出発材料と
して２０ｎｇであった。
ライゲーション後、酵素を１００℃で加熱するかまたは
フェノール抽出することによって失活させ、エタノール
沈殿をした。ライゲーション生成物は次にそれぞれ１ｍ
ＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ及び２μＣｉの
α−３ａｐ標識ＵＴＰ （３０００Ｃｉ／ｍＭ アマ
ジャム、アーリングトンハイツ、イリノイ、アメリカ合
衆国、Ａ■ｅｒｓｈａｍ。
フェノール抽出することによって失活させ、エタノール
沈殿をした。ライゲーション生成物は次にそれぞれ１ｍ
ＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ及び２μＣｉの
α−３ａｐ標識ＵＴＰ （３０００Ｃｉ／ｍＭ アマ
ジャム、アーリングトンハイツ、イリノイ、アメリカ合
衆国、Ａ■ｅｒｓｈａｍ。
ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＩＬ、 Ｕ
ＳＡ）及び２０ユニツトのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（フ
ァルマシア、ミルウオーキーｔウイスコンシン、アメリ
カ合衆国、Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ、 Ｍｉｌｗａｕｋｅ
ｅ、 Ｗ Ｉ ｓ Ｕ Ｓ Ａ ）を添加することによ
って転写された。反応物を次に３７℃で２時間インキュ
ベーションした。生成物を２０％変性ポリアクリルアミ
ドゲル上で分析した。結果は第５図に示し、ライゲーシ
ョン工程によって転写可能な生成物が生成していること
を説明している。
ＳＡ）及び２０ユニツトのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（フ
ァルマシア、ミルウオーキーｔウイスコンシン、アメリ
カ合衆国、Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ、 Ｍｉｌｗａｕｋｅ
ｅ、 Ｗ Ｉ ｓ Ｕ Ｓ Ａ ）を添加することによ
って転写された。反応物を次に３７℃で２時間インキュ
ベーションした。生成物を２０％変性ポリアクリルアミ
ドゲル上で分析した。結果は第５図に示し、ライゲーシ
ョン工程によって転写可能な生成物が生成していること
を説明している。
実施例２
過剰なヒトＤＮＡ存在下でのライゲーション実施例１と
同じライゲーションをヒト血液から抽出した１から１０
μｇのＤＮＡの存在下で行った。結果は電気泳動ゲルの
オートラジオダラムの図として第５図の図中に示しであ
る。レーン１は転写の鋳型としてのカイネーションした
ＨＮＴである。レーン２及び３は鋳型として分解したＨ
ＮＴ及びＣＮＴであり、レーン２は未精製の材料で、レ
ーン３はライゲーション後フェノール抽出した材料であ
る。レーン４はヘアピンプローブの転写可能型によって
与えられたポジティブコントロールである。
同じライゲーションをヒト血液から抽出した１から１０
μｇのＤＮＡの存在下で行った。結果は電気泳動ゲルの
オートラジオダラムの図として第５図の図中に示しであ
る。レーン１は転写の鋳型としてのカイネーションした
ＨＮＴである。レーン２及び３は鋳型として分解したＨ
ＮＴ及びＣＮＴであり、レーン２は未精製の材料で、レ
ーン３はライゲーション後フェノール抽出した材料であ
る。レーン４はヘアピンプローブの転写可能型によって
与えられたポジティブコントロールである。
実施例３
目的配列の検出
ヒトベーターグロブリン遺伝子の挿入物を含むプラスミ
ドＤＮＡ ｐｓｓ７３７のサンプル（欧州特許刊行１
３０，５１５参照）をＤｄｅｌ制限酵素で分解してＨＮ
Ｔとライゲーション可能な末端を生成した。分解したＤ
ＮＡを次に変性のため１００℃で５分間加熱した。変性
サンプルを次にＨＮＴオリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリダイゼーションし、３７℃で２時間ライゲーショ
ンし、実施例１のとおりに転写した。ゲル電気泳動分析
は約２００ヌクレオチドの長さの主要なＲＮＡ生成物の
形成を示した。
ドＤＮＡ ｐｓｓ７３７のサンプル（欧州特許刊行１
３０，５１５参照）をＤｄｅｌ制限酵素で分解してＨＮ
Ｔとライゲーション可能な末端を生成した。分解したＤ
ＮＡを次に変性のため１００℃で５分間加熱した。変性
サンプルを次にＨＮＴオリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリダイゼーションし、３７℃で２時間ライゲーショ
ンし、実施例１のとおりに転写した。ゲル電気泳動分析
は約２００ヌクレオチドの長さの主要なＲＮＡ生成物の
形成を示した。
本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。
１、（１） ハイブリダイゼーション条件下において
機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構造を形成す
ることが可能な一本鎖の自己相補的配列、及び（２）該
自己相補的配列の３′末端から伸長する一木調ブローブ
配列で、該プローブ配列と相補的な目的配列をハイブリ
ダイゼーションし、そしてヘアピン型自己相補的配列の
５′末端に得られたハイブリダイゼーションした目的配
列がライゲーションすることによって、該ヘアピン型が
ハイブリダイゼーションする条件でＲＮＡポリメラーゼ
及び必要なりポヌクレオシド三リン酸存在下において該
目的配列が転写可能となることを特徴とする核酸プロー
ブ。
機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構造を形成す
ることが可能な一本鎖の自己相補的配列、及び（２）該
自己相補的配列の３′末端から伸長する一木調ブローブ
配列で、該プローブ配列と相補的な目的配列をハイブリ
ダイゼーションし、そしてヘアピン型自己相補的配列の
５′末端に得られたハイブリダイゼーションした目的配
列がライゲーションすることによって、該ヘアピン型が
ハイブリダイゼーションする条件でＲＮＡポリメラーゼ
及び必要なりポヌクレオシド三リン酸存在下において該
目的配列が転写可能となることを特徴とする核酸プロー
ブ。
２、ＤＮＡ及び該ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼ、好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６バクテ
リオフアージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくは該
プロモーター領域はヘアピン型として表わされた以下の
塩基配列から成る第１項記載のプローブ。
リメラーゼ、好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６バクテ
リオフアージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくは該
プロモーター領域はヘアピン型として表わされた以下の
塩基配列から成る第１項記載のプローブ。
Ｔ３用、（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ
−３’Ｔ。
−３’Ｔ。
′ＱＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣ−５′
、またはＳＦ３用、ｆ ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴ
ＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’Ｔ。
、またはＳＦ３用、ｆ ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴ
ＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’Ｔ。
て−ＧＴＡＴＧＣＴＡＡＡＴＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴ
Ｃ−５’、図中ｎは２と５０を含めて２から５０の整数
であ３、（ａ） 液体混合物中で第１項のプローブと
該目的配列をハイブリダイゼーションし、（ｂ） 得
られたハイブリダイゼーションした目的配列を該ヘアピ
ン型自己相補的配列の５′末端にライゲーションし、 （ｃ） ハイブリッド中で該目的配列の転写に充分な
該ＲＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオシド三リン酸を
ライゲーションしたハイブリッドに添加し、及び （ｄ） 最終的に事前に決められた時間該目的配を転
写し該目的配列の増巾物として最終的な相補的ＲＮＡ転
写産物を集積する 工程から成ることを特徴とする特定の目的核酸配列を増
巾する方法。
Ｃ−５’、図中ｎは２と５０を含めて２から５０の整数
であ３、（ａ） 液体混合物中で第１項のプローブと
該目的配列をハイブリダイゼーションし、（ｂ） 得
られたハイブリダイゼーションした目的配列を該ヘアピ
ン型自己相補的配列の５′末端にライゲーションし、 （ｃ） ハイブリッド中で該目的配列の転写に充分な
該ＲＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオシド三リン酸を
ライゲーションしたハイブリッドに添加し、及び （ｄ） 最終的に事前に決められた時間該目的配を転
写し該目的配列の増巾物として最終的な相補的ＲＮＡ転
写産物を集積する 工程から成ることを特徴とする特定の目的核酸配列を増
巾する方法。
４、得られたＲ転写産物を第２段階の増巾でさらに増巾
する第３項記載の方法。
する第３項記載の方法。
５、該ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ｋＮＡポリメラーゼ
、好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６バクテリオフアー
ジＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくは該プロモータ
ー領域はヘアピン型として表わされた以下の塩基配列か
ら成る第３及び４項記載の方法。
、好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６バクテリオフアー
ジＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくは該プロモータ
ー領域はヘアピン型として表わされた以下の塩基配列か
ら成る第３及び４項記載の方法。
Ｔ７用１．、− ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ
Ｇ−３’Ｔ。
Ｇ−３’Ｔ。
（ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣ−５′、Ｔ３
用、／−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ−
３’Ｔ。
用、／−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ−
３’Ｔ。
’−ＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣ−５’
、またはＳＦ３用、／／−ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’−ＧＴＡＴＧＣＴＡＡＡ
ＴＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴＣ−５′、図中ｎは２と５
０を含めて２から５０の整数である。
、またはＳＦ３用、／／−ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’−ＧＴＡＴＧＣＴＡＡＡ
ＴＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴＣ−５′、図中ｎは２と５
０を含めて２から５０の整数である。
６、（ａ） 液体混合物中で第１項のプローブとテス
トサンプル中の該目的配列をハイブリダイゼーションし
、 （ｂ） 得られたハイブリダイゼーションした目的配
列を該ヘアピン型自己補助的配列の５′末端にライゲー
ションし、 （Ｃ） ハイブリッド中で該目的配列の転写に充分な
該ＲＮＡポリメラーゼ及びリポヌクレオシド三リン酸を
ライゲーションした配列に添加し、（ｄ） 最終的に
事前に決められた時間該目的配を転写し最終的に相補的
ＲＮＡ転写産物を集積し、 （ｅ） 該集積ＲＮＡ転写産物を検出する工程から成
ることを特徴とするテストサンプル中で特定の目的核酸
配列を検出する方法。
トサンプル中の該目的配列をハイブリダイゼーションし
、 （ｂ） 得られたハイブリダイゼーションした目的配
列を該ヘアピン型自己補助的配列の５′末端にライゲー
ションし、 （Ｃ） ハイブリッド中で該目的配列の転写に充分な
該ＲＮＡポリメラーゼ及びリポヌクレオシド三リン酸を
ライゲーションした配列に添加し、（ｄ） 最終的に
事前に決められた時間該目的配を転写し最終的に相補的
ＲＮＡ転写産物を集積し、 （ｅ） 該集積ＲＮＡ転写産物を検出する工程から成
ることを特徴とするテストサンプル中で特定の目的核酸
配列を検出する方法。
７、得られたＲＮＡ転写産物を第２段階の増巾でさらに
増巾する第６項記載の方法。
増巾する第６項記載の方法。
８、該プロモーター流域はヘアピン型として表わされた
以下の塩基配列から成る第６及び７項記載の方法。
以下の塩基配列から成る第６及び７項記載の方法。
Ｔ７用、／−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−
３’Ｔ。
３’Ｔ。
’−ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣ−５’、１
３月、／−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ＾
−３′Ｔイ て−Ｔ＾＾ＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣ−５’
、またはＳＰＢ用１．− ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’Ｔ。
３月、／−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ＾
−３′Ｔイ て−Ｔ＾＾ＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣ−５’
、またはＳＰＢ用１．− ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’Ｔ。
（ＧＴＡＴＧＣＴＡＡＡＴＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴＣ
−５′、図中ｎは２と５０を含めて２から５０の整数で
ある。
−５′、図中ｎは２と５０を含めて２から５０の整数で
ある。
９、 （１） 該目的配列とハイブリダイゼーション
し、ライゲーションすることによって、ＲＮＡポリメラ
ーゼ及びリボヌクレオシド三リン酸の存在下で転写可能
な第１及び２項記載の核酸プローブ及び （２）該ＲＮＡポリメラーゼ から成ることを特徴とする特定の核酸配列を増巾するた
めに、用いる試薬キット。
し、ライゲーションすることによって、ＲＮＡポリメラ
ーゼ及びリボヌクレオシド三リン酸の存在下で転写可能
な第１及び２項記載の核酸プローブ及び （２）該ＲＮＡポリメラーゼ から成ることを特徴とする特定の核酸配列を増巾するた
めに、用いる試薬キット。
第１〜３図はヘアピン型及び二量体型を含む本発明の転
写可能なプローブのい（っがの異なる形状を示すもので
ある。 第４Ｗは目的核酸配列を増巾する本発明のプローブの利
用について説明した図である。 第５図は本発明のプローブから生成したライゲーション
生成物の転写を実証するポリアクリルアミドゲルのオー
トラジオグラム写真を示す。 特許出願人 モレキュラー・ダイアグノスティックス・
インコーホレーテッド へ７ビンプ０−ｉ′◆ａシ１す）γル ＦＩＧ、３ ｂ 【 転５Δ物 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 ５ 手続補正書 （方式） ％式％ ２、発明の名称 ３゜ 補正をする者 事件との関係
写可能なプローブのい（っがの異なる形状を示すもので
ある。 第４Ｗは目的核酸配列を増巾する本発明のプローブの利
用について説明した図である。 第５図は本発明のプローブから生成したライゲーション
生成物の転写を実証するポリアクリルアミドゲルのオー
トラジオグラム写真を示す。 特許出願人 モレキュラー・ダイアグノスティックス・
インコーホレーテッド へ７ビンプ０−ｉ′◆ａシ１す）γル ＦＩＧ、３ ｂ 【 転５Δ物 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 ５ 手続補正書 （方式） ％式％ ２、発明の名称 ３゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （ａ）液体混合物中で第１項のプローブと該目的配列を
ハイブリダイゼーシヨンし、 （ｂ）得られたハイブリダイゼーシヨンした目的配列を
該ヘアピン型自己相補的配列の５′末端にライゲーシヨ
ンし、 （ｃ）ハイブリッド中で型目的配列の転写に充分な該Ｒ
ＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオシドシリン酸をライ
ゲーシヨンしたハイブリッドに添加し、及び （ｄ）最終的に事前に決められた時間該目的配を転写し
該目的配列の増巾物として最終的相補的ＲＮＡ転写産物
を集積する 工程から成ることを特徴とする特定の目的核酸配列を増
巾する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43437289A | 1989-11-09 | 1989-11-09 | |
| US07/569,991 US5215899A (en) | 1989-11-09 | 1990-08-23 | Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription |
| US569991 | 1990-08-23 | ||
| US434372 | 1995-05-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH048293A true JPH048293A (ja) | 1992-01-13 |
Family
ID=27030154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2300033A Pending JPH048293A (ja) | 1989-11-09 | 1990-11-07 | ライゲーシヨン可能なヘアピンプローブ及びその転写を用いた核酸の増巾方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5215899A (ja) |
| EP (1) | EP0427073A3 (ja) |
| JP (1) | JPH048293A (ja) |
| KR (1) | KR910009926A (ja) |
| AU (1) | AU645996B2 (ja) |
| FI (1) | FI905517A0 (ja) |
| IE (1) | IE904029A1 (ja) |
| IL (1) | IL96251A0 (ja) |
| NO (1) | NO904634L (ja) |
| NZ (1) | NZ235980A (ja) |
| PT (1) | PT95817A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005304489A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-11-04 | Sysmex Corp | 標的物質検出用プローブセット及び標的物質検出方法。 |
Families Citing this family (162)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5708154A (en) * | 1989-02-24 | 1998-01-13 | City Of Hope | RNA-DNA hybrid molecules of nucleic acid |
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| DE4216134A1 (de) * | 1991-06-20 | 1992-12-24 | Europ Lab Molekularbiolog | Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen |
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| ES2211878T3 (es) * | 1991-08-30 | 2004-07-16 | The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Sobre-expresion de moleculas de adnn monocatenario. |
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| DE4213029A1 (de) * | 1991-09-26 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen |
| DE4132133A1 (de) * | 1991-09-26 | 1993-04-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren |
| DE69207580T2 (de) * | 1992-03-23 | 1996-08-08 | Hoffmann La Roche | Verfahren zum DNS-Nachweis |
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| US5751629A (en) | 1995-04-25 | 1998-05-12 | Irori | Remotely programmable matrices with memories |
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