PT95817A - Metodo para a amplificacao de acidos nucleicos empregando sondas em gancho ligaveis e transcricao - Google Patents

Description

FUNDAMENTO PO INVENTO O presente invento está relacionado com métodos para ampiíficçSo de sequências ds ácido nuclsico» Em particular, o invento diz respeito a métodos para detecçao da presença de uma sequência de áido nuclsico particular com elevada ssnsihi1 idade = A detecçao de sequências especificas de ácido nuclsico está a ter rapidamente uma importância crescente numa variedade de campos,, particularmente no campo tio diagnóstico médico» Os métodos de HibridaçSo ae ácidos nucleicos proporcionam ensaias para detecçâo cie sequências de ácido nuc laico c Unicamente importantes5 coma sejam sequências de DNA ou RNA indicativas de doenças genéticas, cancro e infecções bacterlanas e virais» Os ensaies ds hibridaçao de ácidos nucleicos slo baseados no empars-· lhamento muito especifico de bases que se encontra nos hibridos ds DMA e RNA,, Sequências de bases com interesse analítico surgindo ao longo de uma cadeia de ácido nucleico podem ser detestadas ds forma muito especifica e sensivsl através da observação da formação de hibridos na presença de um ácido nucleico sonda que se sabe conter uma sequência de bases que é complementar da sequência de interesse. é evidente que para ds ensaios de hibridaçSo atingiram totalmente α seu potencial analítico, slo necessários métodos para aumentar ainda mais a sensibilidade da dstecçâo» Têm sido aplicados esforços consideráveis neste aspecto nos últimos anos e foram concebidas s desenvolvidas uma série de abordagens diferentes » SSo particularmente promissoras as abordagens baseadas na amplificação química da sequência ds ácido nuclsico alvo ou da sua sequência sinal complementar„ Se bem que os sistemas ds detecçao tenham os seus próprios limites de sensibilidade,, foram desenvolvidos sistemas bioquímicas que podem fazer milhões a milhões de cópias das sequências sinal ou alvo aumentando assim efectivaments os limites de sensibilidade de tais sistemas ds detecção em muitas ordens de grandeza*

Um destes métodos de ampliíicação de ácidas nucleicos ê o conhecido como método da rsacção em cadeia com polimerases ou PCR? o qual está descrito nas Pat. U«S. NS4,;ó83P195 e 4;;è83P202* PCR emprega um par ds oiigonuc1eótidos especificas coma iniciadores para as duas cadeias complementares da forma de cadeia dupla ds uma sequência alvo* Os iniciadores sSo escolhidos da modo a formarem híbridos específicos nos extremos 35 opostos das sequências alvo complementares* Usando uma DNft-poIimerase tsrmostávsl* os iniciadores foram prolongados sintéticamente em conformidade com as sequências alvo* ê necessário um processo de ciclos térmicos para se formarem híbridos específicos e após extensão* para desnaturar as cadeias prolongadas hibridadas para subsequente hibritíaçSoe sMtensla de iniciadores* A repetição do processo várias vezes resulta numa amplificação geométrica da quantidade de sequências alvo na mistura*

Uma variação de PCR ê a reacção em cadeia com ligase ÍLCR) descrita na Publicação de Patente Europeia 320,:308 = Este método requere pelo menos quatro oligo-sondas separadas* duas das quais hibridam com extremos opostos tía mesma cadeia alvo de tal forma que quando elas hibridam com a ssquincia alvo os respecti-vos extremos 3* e 5* sSo justapostos para ligação* A terceira s quarta sondas hibridam com as primeira e sgunda sondas para formar* quando da ligação* sondas fundidas que podam ser desnaturadas e detestadas*

Um outro método de amplificação conhecido está descrito na Publicação PCT N2 88—10315 e será referido como o sistema de amplificação por transcrição ou TAS* Métodos senilhantes estão descritos no Pedido ds Patente Europeia MS 310*229 e Publicação PCT NS 88-10315» Tal como em PCR, T as utiliza paras d© oliqo--iniciadores para hibridarem com extremos opostos ds uma sequência alvo pretendida. Os iniciadores são escolhidos tíe forma a que os produtos ds extensão* após um ou mais ciclos ds extensão como em POR. compreendem sitios de promotores da transcrição» Na presença de uma polimerase adequada específica para o promotor e trifosfatos ds ribonucleésido CrNTPs)* os produtos de extensão são slss próprios ainda amplificados por transcrição» 0 método da replicase Q|í CQilR) descrito na Publicação PCT NO S7--0Ó270 utiliza uma sonda ds RNA especifica a qual á capaz de transcrição específica por uma enzima replicase» 0 método tem uma cinética de reacção 1inssre necessita da projecção a sintas© ds sondas de RMft com sítios ds inciaçlo para a replίο ase »

Se bem que todos estes métodos dêm amplificação de uma sequência alvo* nenhum é isento de comp1exicidades indesejáveis para o utilizador geral não sofisticado» Mutios dos métodos anteriores requerem múltiplos passos incompatíveis que podem ser consequidos apenas através de processos manuais morosos ou ds instrumentos complexos e dispendiosos para a automatização de muitas manipulações necessárias. Ainda muitos requerem a preparação da vários reagentes sofisticados que limita uma aplicação rápida dos métodos a diferentes sequências alvo» Não relacionado com as tentativas rsfsridas5 dsssnvol-veram-se estudos sobre uma variedade de estruturas de DNfi e RNA sintéticas e naturais e suas funções» Uma destas estruturas é a conhecida como a estrutura em gancho em que regiões autocomple-mentares num único polinucleótido hibridam em condições adequadas para formar estruturas sm ansa cuja forma se assemelha a um vulgar gancho de cabelo» έ conhecido que tais estruturas em gancho ocorrem naturaimente em muitos organismos, particularmsnte sm estruturas secundárias de RNA, no entanto, o seu papel funcional não está neste momento bem esclarecido» A fisica-quimica destas estruturas em gancho foi descrita - Cantor s Schimmel =, Biophysical Chemistry» Parte III,; p« 1183,, W„H« Freeman & Co» (San Franscisco 198©)« A literatura sobre este assunto está incompleta a é contraditória» Por exemplo, existem hipóteses de que as estruturas em gancho podem proporcionar um sinal da terminação da transcrição ~ uendrossek et ai, J» Bacteriol» ΐ.7Φ«524θ (1988) a walker st ai =, Biochem,, J» 224s799 (1984)» Estruturas em gancho assemelhando-se a sinais de terminação da transcrição conhecidos dependentes de rho foram observados a seguir ao operão une e glnis de E» coli» Por outro lado, sequências palindrómicas espaces de formar formas em gancho estáveis foram encontradas perto cio sítio de iniciação da transcrição do gene precursor beta-amilóide - La Fauci et ai, Biochem» Biophys. Res„ Commun» 159s297 (1989)» A utilização de estruturas em gancho na síntese de DMA a partir de oligenuelaótidos e na marcação ds Dligonuc1eótidos está proposta na Publicação de Patente Europeia 292,8#2 e por Sriprakash e Hartas, Bens Anal» Tsshn» 6s29-32 (1989)» Em adição» Krupp a Soll, FEBS Letters 212«271 (1987) e í!Nuclsic Acid Probes”» ed„ Symons CCRC Press» Boca Raton» FL» 1989) pp» 21 & 22» descrevem a utilização de uma estrutura em gancha para fazer RNA marcado produto de transcrição a partir de um sistema vector W13/RHA-pD1imerase de T7=

SUjláfilQ DO -INVENTO O presente invento proporciona um método s meios para a amplificação de uma sequência de ácida nucleico particular com interesse (sequfncia alvo) por hibridaçSo coro uma sonda s ligação a elas, que torna a sequência alvo susceptível de ser transcrita s deste modo, capas ds proporcionar múltiplas cópias de RMfi complementar, A sonda tem duas partes principais. Cl) uma sequfncia de cadeia simples autocomplementar capas de formar, em contíiçSes de hibritíaçSc adequadas5 uma estrutura em gancho tendo uma região tíe promotor funcional, s <2) uma sequência sonda de cadeia simples estendendo-se? e fazendo parte da mesma molécula de ácido nucleico, a partir do extreme 3S da sequência autocomplementar =

Em condiçSes de hibridaçSo adequadass a região autoconv-plementar da sonda forma uma estrutura auto-hibridada em ansa normalmsnte referida como ansa em gancho ou simplesmente gancho.·.· A sequfncia ds bases tía região autocomplementar é seleccionada de forma a que durante a formaçSo do gancho com a sequência alvo ligada ao extremo 5!í da sondas se forme uma sequência de promotor ds cadeia dupla operacionalmente ligado à sequfncia alvo ligada. Assim, a forma em gancho da sonda ligada à sequência alvo é susceptível de ser transcrita na presença de uma RNA-polimerase adequada s dos trifosfatos ds ribonucleósitío necessários <r!MTPs>, A sequência de bases no RNA produto de transcrição será pois complementar da sequência alvo,

Pods-ss deixar decorrer a transcrição durante qualquer período de tempo com o produto de transcrição acumulado produzindo uma amplificação da sequência alvo. Sempre que a sequência alvo tenha interesse analítico, a dstscçSo da sequência alvo com elevada sensibilidade pode ser conseguida pejr amplificação do alvo como descrito no presente invento seguido ds detecçSo do produto de transcrição adequado. Pode ser usada qualquer uma das abordagens convencionais para detectar o RhIA produto de transcrição acumularia.

Por exemplo, os rTNPs adicionados para a transcrição podem compreender uma marca detsctável e, após separação do rpotíuto de transcrição resultante marcado dos rWTPs marcados ão usadoss a nsarca foi dstsctads na fracção de produto separado. Uma outra abordagem è para detectar o produto de transcrição per hibridação com uma sonda de ácido nucleico detectâvsl e deiecçio dos híbridos resultantes de forma convencional, e.g» , usando sonda marcada ou anticorpo anti-hibrido selectivo como seja anti-DNA/RNA. A amplificação pode ainda ser aumentada empregando uma amplificação secundária ou de duas fases do RNA produto de transcrição gerado. Para esta finalidade são adequados vários métodoss exemplos representativos dos quais estão descritos ma is deialhadainents infra» 0 presente método de amplificação proporciona uma série da vantagens significativas relativamente aos métodos de trabalhos anteriores» Primeiro, o presente método requere» na sua forma mais geral» um único componente sonda em oposição à necessidade de múltiplas sondas, tais como oligo-iniciadores, como acontecia em mutios das métodos anteriores tais como PCR, TAS e LCR descrito atrás. Ainda, não existe a necessidade de ciclos térmicas demoradas s incómodos tais coma PCR s LCR» Aa contrário do método QBR descrito atrás, a presente sonda é um ácido nuclsi-cq de cadeia simples sem estrutura secundária complexa» Outras vantagens serão evidentes para os familiarizados com a matéria. mzvzm§miçm.....flssjs^aaps.

Figs» í-3 slo ilustrações de várias formas diferentes da sonda da presente invento, incluindo a forma em gancho e a sua forma de dimsro.

Fig,= 4 é um diagrama ilustrando a utllizaçso de uma sonda do presente invento na amplificação de uma sequfncia de écitío nuclaico alvo»

Fig= 5 mostra um auto-radiograma de um gel de poli-acrilamida demonstrando a transcriçSo dos produtos de 1igaçlo produzidos a partir de uma sonda do presente invento=

BESÇRIgmDftS^iâLimçgES PREFERIDAS A sonda do presente invento compreende pelo menos duas partes principais ligadas uma á outra num única polinucleótido. Com referência ás Fiqs,, 1-3 dos desenhos? a primeira parte é a sequfncia ds bases A que compreende fracções autocomplsmentares a s â..l separadas por uma sequfncia em gancho guEm condições de hibridaçlOy as sequências a e af_ auto-emparelham para formar®® uma estrutura em ansa ilustrada na Fig. 2 com as linhas SP representando as ligações de pares de bases formadas entre as sequências aubocoiuplementares» As sequências a e a_3_ slo seleccio-nadas ds forma a qus a regiSo sm ansa resultante A contenha assim um proiísotor funcional ou sitio de iniciaçSo da transcrição. A segunda parte principal da sonda do presente invento é a sequência sonda c que está ligada directamente ou através de uma sequfncia interveniente b ao estremo 3? da regiSo de promotor A s s selsccionada de forma a ser hibriaâvsl com uma sequfncia alvo a ser amplificada ou deteciada* Conforme descrito nas Figs, 1-3, a sequfncia interveniente b é caiaplsmentar da sequfncia bf..

delimitante do εκtremo 53 da rsgiSo autocooipismentar da promotor A ,·. No entanto, ssrá reconhecida que & sequfncia dslimitsnte bj;_ , ss estiver presente, necessita de ser apenas suficientemente longa para que, quando da hibridação cia sequfncia sonda c com a sequfncia alvo, o sktremo 3? da sequlucia alvo è ligávei ao sktremo 5" de tal. sequfncia dslimitante bjN Também, a sonda pode, sm geral 5 conter ainda um sequencia delimifcante 3S como a ilustrada nas Figs» 1 © 2 como sequfncia d»

J ► A forma em gancho da sonda como descrito na Fig* 2 permitirá a transcrição de uma sequfncia alvo ligada ao seu extremo 55 para prosseguir na presença de uma polimerase cognata e dos rNTPs necessários para a transcrição 3?-55 da sequfncia alva ligada e de qualquer sequfncia interviniente bf_» Dependendo da concentração da sonda presente e das condiçSes de reacção, poda também formar~se uma forma d imbrica que potíe ser transcrita (Fig« 3). A região A autocomp1smentar pode potencialmente hibri-dar não sé com ela própria como também cqib uma segunda molécula sonda para formar um dímero através da hibridaçSo de regiSss complementares a s a_f_ em cadeias de sonda separadas= Tal dímero, tal como a forma em gancho descrita na Fiq* 2, compreende um promotor funcional na região A e na presença de uma polimerase cognata s rNTPs, produzirá transcrição 35~5? da sequfncia alvo ligada e os qualquer sequfncia interviniente b?» Assim, quando é feita referfncia à "forma em gancho" da presente sonda, será entendido que também está incluída a forma de dímero funcional·-osnis equivalente= 0 promoto formado pela hibridação da região em gancho A tía sonda pode ser qualquer sequfncia de ácido nuclsico de cadeia oupls DNA ou RWA) que corresponde e é reconhecido por um® enzima polimerase que, como é do conhecimento geral, se íiqa ao promotor e portanto inicia a transcrição 3 *-5 *. 0 comprimento das

sequências autocomplementares a s a_L que forma® o promotor.; se bem que nao seja critica para a realizaçSo do presente invento*, estará de um modo gerai entre cerca de 7 e cerca de 20Θ basas* a reais vulgarmente entre cerca de 1© s cerca da 5Φ bases* Em geral., no presente invento pode ser usado qualquer promotor para o qual seja conhecida uma polimerase adequada que esteja disponível* Seralmente., a sonda será composta por DMA que possa ser transcrito com RNA~poIimerases DNA-dependente9 ou seja polimerases que actusm no DMA molde para produzir RMA produto de transcrição * Md ^ entanto, podem também ser empregues sondas de RNA suscepiívais de sarem transcritas com RMA~polimerases RNA-dependantes (como sejam as produzidas por determinados vírus* e*gDS rstrovírus e picorna-virusl» Promotores úteis incluem^ entre outros* os reconhecidos por RMA-polimerases produzidas por bacteriófagos* tais como os fagos T7? 13 e SPò»

Seguem-se sequências de bases exsmpiificativas tsndo a funçSo de promotor relativamsnte às polimerases fâqicas (n = 2 a 5u;; as sequências estio apresentadas na sua forma auto-hitaritíada em gancho s nao representam necessáriamente as sequências mínimas necessárias para a função de promotor>=

I

ThhThCGACTCACTATAG~35 rr ATTATBCTBAGTGATATC-5? ATTAACCCTCACTAAAG8GA-35 TAATTGSGASTTAGCTTTCC-53

Para SP6 CAT ACSATTT AGSTGACACT AT AG—3?

Tn· GTAT8CTAAATCCACTSTCATATC~59 A sequência sonda ç pode ser qualquer sequência que seja capaz de hifaridar com a sequência alvo da interessa. Como é conhecido na área* o grau de homoiogia entre as sequências sonda e alvo dependerá das necessidades especificas do utilizador. Sempre que seja necessário ou pretendido um elevado grau de especificidade, poda ser necessário homoiogia perfeita ou quase perfeita, como é o caso da detecç3o de desampareihamento de um único par da bases» No entanto, no caso normal, poda ser tolerado um certo grau de nlo homoiogia sem sacrifício da especificidade, amplificação ou dstacçlo da sequência alvo necessária» Assim, o termo "complementar" ou "hibridável” será usado aqui para descrever α grau de homoiogia necessário ou pretendedido entre a sequência sonda e a sequência alvo» Em geral, o comprimento da sonda não é critico, Mo entanto, para se obter ftibridação rápida e forte ccm uma sequência alvo ssleccionada, a sonda tem normal-mente pelo menos cerca de 1® bases, A sequência em ansa q na sonda que liga as sequências autoeomplementares formadoras do gancho a s ajj_ podem ter qualquer

composição e comprimento desde que não impeça ou iniba a formação de estruturas em gancho ou dimsros suscsptivsis os serem transcritos » NorfRaifiisntBj a sequência era ansa gt será salsccionada para ser substancia1menta não complementar com sla própria, s,g., sará composta por um DNA ou RN* heterapolimérico ou homopolimêrico tal como uma cadeia compreendendo apenas poli T, poli A, poli C ou poli G, ou combinações, e terá pelo menos cerca da duas bases da comprimentopara permitir suficiente liberdade espacial para a formação da ansa= fiais geralmenta, a sequfneia da ansa g. terá entre cerca da 4 e cerca da 5Θ bases de comprimento„ na A sonda á projectada da tal forma qua quando cia hxbri--· dação de uma saqufncia alvo com a saqufncia sonda ç, α extremo Ss da sonda (i.e., o extremo 5? da saqufncia autocompiementar a ou qualquer saqufncia interviniente b) é ligával ao extremo 35 tía saqufncia alvo» Desta modo, a saqufncia alvo fica operacionalmenta ligada, como é conhecido na área, ao extremo 55 do promotor. Assim, quando da iniciação da transcrição, as sequências qua se prolongam a partir do extremo 55 do promotor são funcionalmente transcritas pela polimerass para formar RMA produto de transcrição qua compreende uma saqufncia complementar da saqufncia alvo= Conforma indicado atrás, a saqufncia sonda ç poda sar separada por uma sequfneia interviniente b desde que quando da ligação fâe uma saqufncia alvo ao extremo 53 da sonda, a correspondente sequfneia interviniente bf_ retenha a ligação operacional com a saqufncia sonda, e„g., não contem ura sitio de terminação da transcrição, seja tão comprida qua reclusa significativaments a eficácia da transcrição da sequfneia sonda ou introduza híbrida— ção inespeeífica significativa» Em certas situações sará desejável incluir uma sequfneia interviniente por questões de estabilidade ou tietecçio. Conforme referido atrás, sempre que as sequências iniervinientes b e bf_ estiverem presentes, será preferida que elas sejam sksctsínsnts complementares e portanto hibridem

forma de ganche para colocar o extremo 53 da sonda exactamente em frente do extremo 55 oposto da sequência sonda» Quando da hibri-daçao da sequência alvo, α seu extrema 33 fica eficazmente coiocado para ligação ao extrema 53 da sonda» Nd entanto,, é também possível que a sequência interveniente seja total ou parcialmente nao complementar da sequência interveniente b e pade mesmo ser maior do que a sequência interveniente b« Em tal caso3 é apenas necessário que a sequência interveniente b^. seja suficiente-mente longa3 mas nSo substancialmente inibidora5 da ligação do extremo 3,, .... , , ... • as uma sequenexa alvo que nxorioou com a sequenexa sonda c ao extremo 53 da sonda do presente invento» Também se encontrou que a eficácia da transcrição pode ser dependente tía ssqufncia das primeiros nucleotideos fs=g», 3 a 5)na sequência a ser transcrita» Em particular,, encontrou-se que se pode atingir uma transcrição altamsnte eflcac usando RNA-polimerase de T7 se a sequência inicial fôr CCCTC» A sonda pode também compreender uma sequência delimi--tante no seu extremo 3*» A sequência d delimitante do extremo 53 será transcrita num grau dependente da eficácia da RNA-polimerase usada s das condições de transcrição» Em certas situsçSes» tal sequência delimitante pode ser usada com vantagem na separação ou dstecçao» s A sonda do presente invento pode ser preparada por qualquer método adequado» Tais métadoBj em geral» incluem síntese de oiigonuclsóiidos e clonagem num vecior replicável» Os métodos para a síntese de ácidos nucleicos slo do conhecimento geral» Por exemplo» em ” 01igonucleotide Synthesiss A Praticai ftpproach"3 sd» M=J= 8ait3 IRL Press COxford 1984) são descritas vários métodos diferentes de síntese de oligonucleótidos e purificação e análise dos produtos resultantes» Num sinteticador automático» começa-se com um resíduo de nucleótido orafceqido em 55 imobilizado (através- do hidroxilo -d5 > = Após desprotecçio o ' ê introduzida uma ligação fosfodiéster por rsacçio com um rssitíuo u© nuclsósido 3J~fcsforamidato protegido sa 5!. A ligação fosfita é entlo oridada para dar uma ligaçlo estável s o processo Φ tornado cíclico com os resíduos ds nuclsósidos pretendidos para a sequência a ser sintetizada. Em vez deste método de fosfita triéstsr fesfotriésisr, pods-se também usar uma abordagem em fase sólida. Também. o ácido nucleico sintetizado pode ser ainda modificado por métodos sintéticas ís.g.» como descrito na Pat. U.S. N9 4,818,681). A clonagem dos ácidos nucleicos num vector de amplificação é também bem conhecido (ver Maniafcis et al» , Molecular Cloning, Cold Bring Harbor (1982)= Quando da clonagem num vector ds cadeia dupla. pode ser necessária a separação de cadeias para usar o produto como sonda»

HéTODOS DE AMPLIFICARÃO.......DE. ALVOS 0 primeiro passo na amplificação ds um ácido nucleico particular ds acordo com o método do presente invento é a hifori-tíação ds tal alvo com uma sonda suscsptívsl ds ser transcrita numa mistura liquida adequada. Tal hifcridaçSo será efsctuada em condições adequadas bem conhecidas. s A amostra suspeita de conter. ou que com certeza contem, o ácido nucleico alvo pretendido pods ser obtida de uma variedade ds fontes. Pode ser uma amostra biológica, uma amostra agrícola ou alimentar, uma amostra do ambiente e outras. Na aplicação do presente método à detecção ds uma sequência de ácido nucleico particular no diagnóstico clínico, a amostra a testar pode ser um fluido do corpo ou exudato tal como urina, sangue, leite, fluido cerebrospinal, especturaçlo, saliva» fezes, fluido ds aspiração dos pulmões, esfregaços de garganta ou genitais. r \

similares» Conforme discutido algures sais detalhadamenfces, α ácido nucleico alvo pode ser RNA ou DMA»

Será entendido» que é geral mente necessária tratar a amostra de ácidos nucisicos cora a finalidade de formar fragmentos adequados compreendendo a sequência alvo que hibridarà e será ligável à sonda» Ainda» em certas circunstâncias» será necessário ou desejável tratar a amostra a analisar para libertar s/ou extrair o ácido nucleico alvo para hibriclaçlo e/ou quando o ácido nucleico o ácido nucleico alvo está presente na forma de cadeia dupla, para desnaturar e torná-lo na forma de cadeia simples hibridâvel por meios bem conhecidos» A fragmentação dos ácidos nuclsicos da amostra è normalmente necessária para permitir a ligação da sequência alvo á sonda» Tal fragmentação pode ser conseguida ao acaso ou especi-ficaments» Com este fim podem ser usadas endonuc1eases de restrição especificas assim como DNAsss roais gerais» fosfodiestsrsses? axonuclsases s endonuclesses» Estes processos são bem conhecidos» Nalguns csso5 posterior processamento dos ácidos nuclsicos fragmentadas da amostra será necessário para produzir sítios ligáveis» Por eKemplo, DNAse I degrada BNA para produzir resíduos fosforilados em 5?* Assim, o DMA que foi degradado por outros métodos pode ser tratado com DNAse I para produzir fragmentos ligáveis» A utilização de enzimas ds restriçSo com s finalidade de fragmentar é normalmente mais vantajoso» fi degradação de ácidos nuclsicos com enzimas ds restrição produz fragmentos tendo extremos definidos e sítios ligáveis» Por exampla? no caso da ligação de DMA usando uma enzima especifica como seja BMA-ligase de T4» à desejável1 que um extremo 5* fosforilado de um fragmento seja justaposto cam um grupo hiároxilo no outro fragmento» Isto

uods ssr fácilmente conseguido por digestão com enzimas de restrição,. Como acontece na realização do presente método* a eficácia da ligação é maior quando ambos os fragmentos a serem ligados estão na forma da cadeia dupla no sitia da ligação»

Mo presente invento pode ser usada qualquer uma das muitas enzimas de restrição conhecidas dependendo da ssqutncia ssleccionads no sitio de ligação s d-s!imitando-o = A especificidade de ssqutncia das enzimas de restrição proporciona flexibilidade na projecção da sequência contida na sonda em gancho do presente invento,. Por exemplo,, polimorfismo Dtísl da mutação das células faleiformes humanas no gene da bsta-globina pode ser identificada usando uma amostra de DMA humano digerido com Ddel„ fi sequência sonda pode ssr project&da para incluir o sitio da mutação de tal modo que o fragmento cortado com Dtísl» quando da hibridaçao5 alinhará o seu extremo 35 com o extremo 5? da sonda em gancho. Tal fragmento da DMA hibridado será eficazmente ligado á sonda e portanto tornado susceptivsl de ser transcrito,. Por outro lado* o DMA em que não há mutação não será digerido se bem que hihride atá certo ponto» Mo entanto? a ligação decorrerá muito menos eficasmenfcs devido à orientação incorrscta dos parceiros de ligação» Um outro exemplo usando enzimas de restrição é a detecção de sequências de Chlamydia trachomatis,, Os ácidos nucleicos na amostra podem ssr digeridos com enzimas de restrição (tíst í para cortar o DMA de pl asm .ídec? usa vez ou Hindi II para cortá-lo várias vezes* Black st al = » Current Micro-oiology (19889) 19567-74) de fornsa aque o DMA ds plasmidso do organismo ê também digerido para produzir fragmentos múltiplos» Sondas correspondentes a todos estes fragmentos podem ser hibri-dadas,, ligadas s transcritas separada ou simultaneamente» Após transcrição* o RMA pode ser analisado por hibridaçSo com uma única sonda de DMA da plasmídea»

V

0 DNA pode ser também degradado por uma variedade de outros métodos¥ tais como a utilização dos seguintes tipos de reagentesí EBTA-Fe<II)s Btrosbelst al» (1988) J= Am» Ches= 3oc,: 110=7927 e Dervan (1986) Science 232s4è4» CuC II)-fenanirolin-a¥ Chsn s Sigman (1987) Science 237=1197= enzima de restrição classe IIS¥ Kime et al (1988) Science 240s5©4s DNAse hibrida¥ Corey et al (19895 Biochem. 28s8277s bleomicina» Umezawa st al \19Êtó) J = Antibiot. (Tokyo) ser. As 19s2®0= neicarzinosiaiina» Bolberg st al (1981) Second Annual Bristol-Myers Symposium in Cancsr Research (Academic Press5 New York) p. 163§ s meiidiumpropil--EDTA-Fs<Ií)» Hertzberget al (1982) JAm» Chem. Soc» Iô4s3i3. 0 método de amplificação do presente invento está ilustrado no diagrama da Fig» 4» A hibritíaçSo da presente sonda em gancho e a sequência alvo presente numa amostra de ácidos nucleicos produz híbridos <|_) em que a sequência sonda ç na sonda è hibridada com a sua sequência alvo complementar çj_ = Na Fig= 4» as sequências intervinienfces b s bf. na sonda estão descritas como sendo complementares uma da outra¥ o que» conforme discutido algures aquis não è considerado critico» mas é geralmenfce preferida» Apés hibrioaçloj os entremos justapostos Sr e 33 da sequência sonda b_f_ s da sequência alvo çjj» respectivamente5 são ligadas para dar produtos híbridos ligados <!JL> » Com a adição da poli meras© s rNTPs » a transcrição decorre com a geração de múltiplas RNAs produtos de transcrição tendo a sequência combinada bc, fl terminação da transcrição é iniciada psla adição de ροϊimerase e dos rNTPs necessários á mistura liquida que contem os híbridos compreendendo a sequência alva liqada que pode ser transcrita» Em condições adequadas? a síntese de RNA produto de transcrição decorrerá de forma contínua desde que estejam presentes quantidades suficientes de rNTPs» Normalmente* será incluído um inibidor de rifaonuclesses na mistura de rsacçao da transcrição

para evitar degradação indesejável do RNA produto da transcrição por qualquer contaminação com ribonucleases, Deixa-se decorrer a transcrição durante um período predeterminada de tempo ou até se acumular uma quantidade de RNA desjávsl ou deteclável. A quantidade ds RNA produto de transcrição produzida num determinado período ds tempo será proporcional á quantidade de ssqufncia alvo presente na amostra original0 produto de transcrição acumulado serve assim como uma amplificação da sequfncis alvo= A transcrição pods então ser terminada por qualquer método convencional, como seja inactivação da polimerase ou remoção de reagentes da mistura.

Posterior amplificação dos RNAs produtos de transcrição pode ser conseguida por uma série da maneiras, por exemplo, através da utilização de replicasas tais como raplicass Qf5 ou replicase do vírus do mosaico das bromeiiáceas. Também, pode ser usada uma série de pares de sonda sm gancho/seguntía sonda compreendendo (1) uma sonda em gancho susceptível de ser transcrita íconstruída com uma reqião contendo promotor e que se possam auto-emparelhar como na presente sonda mas com uma região sonda susceptível de ser transcrita complementar do RNA produto de transcrição estendendo-se a partir do estremo 35 em vsz de ser a partir do extremo 35 como na presente sonda) e (2) uma segunda sonda que híbrida com uma sequência adjacente no RNA produto ds transcrição. Após hibridação dos pares sonda em gancho/ssgunda sonda com ds produtos de transcrição, o par hitaridado é ligado para formar ácidos nucleicos susceptíveis ds serem transcritas os quais produzirão elss próprios RNA produto de transcrição adicionai na prsssnça da polimerass, Ainda, α RNA produto de transcrição pode ser produzido de forma a conter um sitio para imobilização Cs = g., , através da utilização tíe ligando, e,g,s hiotina ou hsptsnoji rNTPs modificados s imobilização dos produtos de transcrição resultantes pela adição ds uma forma imobilicada de um

parceiro ds ligação a ligando? s.çu- avidinaou um anticorpo anii-hapteno. respectivamente)s e serem separado» da mistura podem ser hibridados cora uma outra sonda para introduzir um sitio de promotor para mais transcrição.. Após alguns ciclos,, é possível uma amplificação ds mais ds um milhão ds vezes.

Os métodos cius ss seguem são úteis em particular para proporcionar uma amplificação com uma segunda fases (I) Deslocamento da sonda do híbrido com RIMA --· A sonda com promotor á nibridada cas o seu DMA complementar que é imobilizado num suporte sólido ou nibridada com um suporte imobilizável 0 suporte imobilizado ou imobilizâvei é colocado em contacta com o produto SRNA em condições ds hibridaçãa específica. Isto liberta a sonda susceptívsl da ser transcrita uma vez qus hibri-dará RNA em vez do DNA devido è diferença de estabilidade entre o híbrido RhiA-DMA e o híbrida DNA-DNA= Após a primeira fase ds transcrição., a actividade de RWA polimerase é destruida por aquecimento antes da mistura reagir com o suporte híbrido ds DNA imobilizado RWA em condiçSss ds deslocamento de cadeia. Para cada molécula de RÍMA3 será produzida uma molécula de sonda com promotor nas condiçSes mais ideais. Ao tornar-se cíclico d sistema epossível usar RNA para produzir mais a mais sondas que podem ssr transcritas e portanto amplificação secundária do sistema. Para um deslocamento de cadeia mais eficaz pode ssr utilizada a migração de ramo. Deste medo? a molécula de DMA do deslocamento tem no seu extremo 3S ou no seu extremo 5? uma região ds cadeia simples não hibridada onde uma parte carrespondents do RWA inicia a formação ds híbridos RNh-DNA.

Assumiu-se qus um fenómeno ds migração de rama ds cadeia simples está envolvido na transcrição de um DNA ds cadeia dupla, lima cadsia do RWA sintetizada de novo substitui uma cadeia

de DNAda mesma ssqu®ncia= A velocidade de migração de um rama de cadeia simples foi calculado como sendo mais rápido do que 1 ΘΜ pares de bases por segunda» Também foi descrita uma migração de ramo de cadeia dupla» Este processo è cerca de 6 Θ&Θ pares de bases por segundo a 37 °C (Eiophysical Chefiiistry.» Cantor & ^ Schimmal,. Frseman Publication5 San Francisco» i93wq vol ,= ϊΐϊ ρρ = :1233-1239)= A partir desta informação pode ser fácil mente calculado que a migraçao de um ramo de 2Φ bases dsvrè ser um processo muito rápido sem qualquer tratamento a temperatura mais alta. (2) Deslocamento de uma cadeia da sonda - Este método s semelhante ao método anterior eMcepto a sonda libertada não ser a sonda completa,; mas antes uma cadeia da sonda com uma cadeia do promotor» Apenas a adição da outra cadeia a torna susceptivel de ser transcrita» (3) Deslocamento tíe um adaptador ligável - Este métcsdo é também ssmlhants aos métodos anteriorssp no entanto» o fragmento libertado actua como um adaptador para a ligação da duas fracçÊfes das sondas com promotor» (4) Ligação mediada por RNA - Este método envolve a } utilização de produto RNA para formar uma ponte através da qual ^ pode ocorrer a ligação de dois fragmentos de DMA s caracteriza-se peia vantagem da sa poder realizar em solução» (5) Reciclagem da captura - Este método usa produto RNA modificado com ligando (s=g=* biotinilado) da primeira transcrição coso agente de captura para as sondas com promotor» Na altura de transcrição inicial? UTP botinilado è misturado com outros trifos-fatos ds nucleósido para a transcrição inicial» 0 RNA biotinilado é então capturado antes ou apés mistura com a sonda complementar contendo promotor» i3uando o RNA biotinilado é

capturado, a primeira interseção com d promotor de DNA complementar é realizada em suporta sólido* 0 híbrido RNft-DNA biotinilado é entSo usado na transcrição para produzir mais RNA* Se a transcrição ss tornar ineficaz a partir de tal híbrido, pode-se fazer um tratamento com calor ou bases para libertar o DMA do híbrido -r antes da transcrição* Um método semelhante pode também ser realizado usando reaeçSo de captura caiu anticorpo anti-KNA/DNA e eliminando o passo de biotinilação de RNA* I Cé) Cópia mediada por RNA - Este método cria um sitio de promotor através da utilização do produto de transcrição como iniciador* 0 produto de extensão da iniciador actua como sinal suscsptlvel de ser transcrito* Uma sequfncia complementar do produto RNA foi clonada num vectar fágico de cadeia simples e = g*5 H13* 0 produto de transcrição foi deixado reagir com tal DMA de Ml3 a o híbrido foi então prolongado usando uma DMA-polimsrass © trife-sfatos de desoKinuc 1 só tidas alguns dos quais são marcados para a identificação do produto* Este processo também produziu sequfr.cias de susceptlveis de serem transcritas para posterior amplificação*

Um processa idfntico pode ser seguido através de um ) oligormcleótido sintático em vez de um DNA clonada coma molde para extensão dos iniciadores de RNA produto da transcrição* G DNA contendo promotor á híbridado com o produto RNA* prolongado usando uma DNA-palinisrass e depois o produto prolonga-do ê transcrito* 0 RNA de cadeia simples de partida não é transcrito* O produto final ê analisado por captura com uma sonda específica imobilizada* Este processo pade ser ajustada para fazer tanta amplifieaçlo quanto a necessária para uma análise sensível * C7) Cópia mediada mediada por DNA deslocado - Este método é o mesmo do método anterior SKcepto usar DMA deslocado como iniciador para produzir produtos que podem ser transcritos» CS) Captura mediada por oligonuclsótidas imobilizadas ~ Neste métodoum oligonucleótido (e = a . 5 metada da tamanha da produto de transcrição intacto) é imobilizado num suporte sói idoP o produto RMA é capturado por hibritíaçSo e a fracção do RNA residual não hibridado é então usada para capturar uma sonda em gancho que pode ser transcrita* <9> Utilização de RNft-polimsrases RNfi-dependsntss -Neste método a sonda inicial á modificada para ter uma sequência de DNA de cadeia dupla ou sifiiples que apóa transcrição produz RNA especifico para posterior amplificação por uma RNA-poi imerass RNA-dependente Ce.g» * replicase 0í5>» Esta sequfncia está na smtremo 55 da sonda» 0 produto RNA é usado para posterior amplificação sem processamento secundário Cver Publicação PCI 88™ -10315)- 0 método pelo qual o RNA produto ele transcrição sintetizado e acumulado sao deisctados. está dependente principaIments dos desejos e necessidades do utilizador, é conhecida uma larga variedade de métodos s outros serão desenvolvidos no futuro que podem ser aplicados ao presente invento. Apenas com fim exempli-ficativo? serão aqui descritos mais detaihadamsnte alguns métodos. Principalmente5 estes métodos sao baseados na produção de produto ds transcrição marcado ou na hibridação do produto de transcrição com detecção dos híbridos resultantes.

íi? Síntese de RNA marcada produto de transeriçlo - A adição ds rNTPs, um ou mais dos quais compreende uma marca dstactávelj â «ilstura ds transcrição resultará na síntese de RMA que também compreende a marca detestável. Ma área são bem conhecidas as substâncias que servem como marcas detestáveis ateis s

Tv_ 1 os, _ ·] 4 xnciuem 3.sòtopos radioacfcivos? e = g» 5 -"r5 ~H, “ ’“i e " *C? compostos f1uorescentess quimioluminescentes, cromóforos e similaress assim coma ligandos tais como biotina e haptenos que, se bem que não tíirecismenie deteciáveis, podem ser fácilmente detsetados por rsaeção com formas marcadas dos seus parceiros de ligação específicos, Ssg.j avidina e anticorpos, respsetivamsnts. <2> Detecção par hibridaçlci com sonda marcada ~ Esta abordagem baseia-se em mais um passo de hibridação para a detec™ cão do RNA produto de transcrição» è conhecida uma variedade ds métodos para a preparação de sondas que compreendem marcas dírects ou indirectamente detestáveis* Bs marcas podem ser dos mesmos materiais referidos imediatamente atrás» Í3> Detecção por hibridsção s utilização de reagente anti-híbrido - A sonda de detecção pode também ser seleccionada de forma a que os híbridos formados ccsm o RMA produto de transcrição sejam únicos na mistura e portanto selectivamente detestáveis através da utilização de reagentes anti-híbridos» é conhecida na literatura uma variedade de anticorpos anti—híbridos, incluindo anticorpos anfci-DNA/RNA e arii-RNA/RMA <Pat« U»S= NS i63,22Θ), anti-DNA/BNfi ÍPat. U„S„ NQ 4,023,627) e anticorpos contra complexos de intercalação CPat» U»S« MS 4,563,417)» 0 anticorpo anti-híbrido será vantajosamente modificado ds forma a conter uma marca detectável como atrás» (4) Detecção de RNA produto tíe transcrição - Os próprios produtos ds transcrição pode® ser detsetados em solução por

separação do RNA da mistura ou destruindo primeiro os rMTPs que nlo reagiram com fosfatases- e depcis adicionando reagentes que produzem uma resposta detestável ao RNAS coma seja o sistema cie bioluminescência envolvendo a reacçSo com polinucleótido-fosfori-lasa» piruvato-cinasa a luciferasa da pirilampo (a,g=5 como descrito por C«P»H. Vary <1987) Nus leio ftcids Res« 15s6663-6697) ,

Certamenta5 uma ysí qua o sistema de transcrição pode ser projectado para produzir produtos de transcrição de um tamanha aspscifiçado» nesta caso alas podem sar fácilmeta identificados por métodos de resolução de acordo com o tamanho como saja alactroforasa am gel» 0 presente invento sará agora ilustrado» mas não pretende ser limitado» pelos exemplos qua sa saguem» )

Ligaçlo da sonda a oligonucleétldo complementar e transcrição

Este exemplo demonstrou que uma sequência de amostra apés hibridação e ligação com a sonda da presente invento proporcionará síntese de RNft por transcrição.

J

Os o1igonuc1eétidas HNT s CMT apresentados abaixo foram sintetizados num sintetizador de oligonuc1eòtidos Applied Biosysiems (Foster City5 CA. USA) Modelo 38® B usando os reagentes fornecidos pelo fabricante. HNT s ATTATSCTSAGT6ATATC-55 (T>7 TAATAC8ACTCACTATABS8ASAA8TCTSCC8TTAC-39 C.N7 s 35 -CCTCTTCASAC88CAATG-55 HNT:; após purificação por electroforsse em gel foi fosforilado no seu extremo 5S usando poiinuclsótido-cinase de acordo com o método descrito por Maniatis et al (1982) Molecular

Cloning. Colo Spring Harbor, p„ 122. 0 HNT fosforilado foi então Hibridsdo com CMT a 37°C durante 5 minutos e depois adicionou-se DNA-ligass de T4 (Boehringer Mannhsim. Indianapolis. IMS USA) s ATP (te mil concentração final 5, A rsaeção de ligação foi efectua-da por incubação da mistura a 37°C durante 2 horas. As quantidades de HNT e ds CNT foram tíe 2® ng para cada um coma material de partida.

Após ligação5 a sn?isa fai inactivada por aquecimento a

108°C ou por extracção com fenol e precipitação com etanol, D produto liqado foi então transcrito pela adição de ftTP, CTP, GIF5 _ 72 s Ufp5 1 mn cada e 2 sucrocuriss as U!r marcado sm aí ta com ~ r (3ΘΟ0 Ci por mH da Amersham,, Arlington Heigts? 1L, USA) s 2Θ unidades da RMA~pq1imerase de T7 (Pharmacia, rtiteaukes? WI, USA), A reacçlo foi entlo incubada a 37°C durante 2 horas. Os produtos foram analisados num gel desnaturants de poliacrilamida= Os resultados estio apresentados na Fig, 5 e demonstram que o processo de ligação produs um produto suscsptivel de sar transcrito.

Ligação na presença de DMA humano sm excesso

Rsalicou-se uma ligação idêntica á tio Exemplo i na presença de 1 a 10 micrograms de DMA extraído de sangue humano. Os resultados estão apresentados na Fig, 5 dos desenhos como uma fotografia de um auto-radiograma de electroforess em gel, A faixa 1 à ΗΜΪ fosforilado como molde da transcrição. As faixas 2 e 3 são HMT e CNT digeridos como moldes, com a faixa 2 sendo material não purificado s a faixa 3 sendo material extraído com fenol após ligação, A faixa 4 é uma testemunha positiva proporcionada por uma forma de uma sonda em gancho susceptível de ser transcrita, EXEMPLO 5

Detecção de uma sequência alvo

Uma amostra de DMA da plasmídao pss737 contenda uma inserção do gane da hstaglobina humana (ver Publicação de Patente

Europeia i30?515) foi digerida com a encima de restrição Dele 1 para produzir extremos compatíveis para ligaçSo com HNT ,= 0 DMA digerido foi então aquecido a 100°C durante cinco minutos para desnaturação» A amostra desnaturada foi então hibridada com a sonda oligonucleótido HMTS ligada a 37°C durante 2 horas a transcrita como no Exemplo 1= A análise electroforética do gel indicou a formação do principal produto RNfi com aproximadamenie rmcleótirfos de comprimento»

J

)

Claims (1)

1. REIVINDICACaES; lã» - Método para amplifícaçlo de u.ma sequência de ácida nucleica alvo particular, caracterisada par compreender os passos de: (a) hibridação da referida sequência alvo com uma sonda que compreende (1) uma sequência auto-complementar de cadeia simples capaz de formar, sm condiçSes de hibridação, uma estrutura em gancho tendo uma região de promotor funcional, e Í2) uma sequência sonda de cadeia simples estendendo-se desde o extremo 3' da referida sequência auto-complementar, pelo que quando da hibridação de uma sequência alvo complementar da referida sequência sonda e ligação da sequência alvo hibridada resultante ao extremo 5' da sequência auto-complementar formadora de gancho, a referida sequência alvo pode ser transcrita na presença de uma RNA-polimerase e dos trifosfatos de ribonuclsósidos necessários rias referidas condiçSes de hibridação formadoras de estruturas em gancho numa mistura liquida. (b) ligação da sequência alvo hibridada. resultante ao extremo 5* da referida sequência auto-complementar formadora de estruturas em gancho. Cc> adição aos híbridos ligados, da referida RNA-poli-merase e trisfosfatos de ribonucleósido suficientes para a transcrição da referida sequência alvo nos híbridos e Cd) permitir que a transcrição resultante da referida sequência alvo tenha lugar durante um período predeterminado de tempo para acumular o RNA complementar produto de transcrição resultante como uma amplificação da referida sequência alvo. 29

   2ã, -· Método da? acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por D produto de transcrição resultante ser ainda amplificado numa segunda fase de amplificação. 31n - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2? caracterizado por a referida polimerase ser uma RIMA-poli me rase DMA-dependente , de preferência FiMA-pol imerase do bacteriáfaGO T7, T3 ou SP6 e de preferência, por a referida reqião do promotor compreender a sequência de bases que se segue mostrada na sua forma de ganchos para T7, para T3, para SPé, (TAATACSACTCACTATftB-3' τio.ATTATGCTBASTGATATC-5',ξ ATT ftftCCCT CACT AAAS8GA-3' T (“TAATTGGGAGTTAGCTTTCC-5* ou(CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3f TGTATGCTAAATCCACTBTCATATC-5', em que n è um inteiro de 2 a 5© inclusive. 4â. - Método para detecçSo de uma sequência de ácido riucleico alvo particular, caracterizado por compreender os passos de; (a) hibridação da referida sequência alvo com uma sonda que compreende (1) uma sequência auto-comp1ementar de cadeia simples capaz de formar, em condições de hibridação, uma estrutura em gancho tendo uma região de promotor funcional, e (2) uma sequência sonda de cadeia simples estendendo-se desde a βκtremo 3' da referida sequência auto-complementar, pelo que quando da hibridação de uma sequência alvo complementar da referida sequência sonda e ligação da sequência alva hibridatía resultante ao extremo 5' da sequência auto-complementar formadora de gancho, a referida sequência alvo pode ser transcrita na presença de uma RNA-polimerasa e dos trifosfatos de ribonucleósidos necessários nas referidas condições de hibridação formadoras de estruturas em gancho numa mistura liquida;, íh> ligação da sequência alvo hibridada resultante ao extremo 5* da referida sequência auto-complementar formadora de estruturas em gancho, (c) adição aos hibritíos ligados, da referida RNA—poli-merass e trisfosfatos de ribanucleôsido -suficientes para a transcrição da referida sequência alvo nos hibridos e (d) permitir que a transcrição resultante da referida sequência alvo tenha lugar durante um período predeterminado de tempo para acumular o RNA complementar produto de transcrição resultante e <e) rietecçãa do referido RNA produto de transcrição acumulado. 5§« - Método de acordo com a reivindicação 4, caracte-riçado por o RNA produto de transcrição resultante ser ainda amplificado numa segunda fase de amplificação. o§, --- Método de acordo com qualquer u.ma das reivindicações 4 e 5, caracterizado por a referida região do promotor compreender a sequência, de bases que se segue mostrada na sua forma de ganchos para T7? sTAATACSACTCACTΑΤΑΒ—3* - Q. 1ATTATSCTSAGTBftTATC-5' para T3, . AT IAAUL-CT ChCT AAAfcBBA ·~·: T,n s. T AATTBSBAGTT ABCTTTCC-5' ou para SP6, . CATAC8ATTTASBT6ACACTATAS-3 ST ATBCT AAATCCACTSTCATATC-5', em que n é um inteira de 2 a. ΌΘ inclusiva. 7§. Equipamento («kit») de reagentes para usar na amplificaçSo de uma sequência de ácido nucleico particular3 caracterizado por compreenders (1) uma sonda de ácido nucleico de qualquer reivindicações 1 e 2 que quando da hibrídaçao com a sequência alvo e ligaçlo a ela, pode ser transcrita na uma das referida presença. de uma RMA-polimera.se e de trifosfatos- (2) ã referida RNA-poIimerase. Lisboa.t / de Novembro de 1 VVfeío ADJUVO r3.^EREÍRA DA CRUZ lente Oficial da Propriedade Industrial Rua victor cordon, io-a a.» 200 USBQA