JP2002501361A

JP2002501361A - 臨床検査試料におけるリガーゼ連鎖反応の阻害を軽減するためのスペルミジンの使用

Info

Publication number: JP2002501361A
Application number: JP51396296A
Authority: JP
Inventors: デイビス，アラン・エイチ; カオ，ジアンリー; リー，ユイ・エイチ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-18
Publication date: 2002-01-15

Abstract

(57)【要約】標的核酸を増幅する改良方法、特に、リカゼーゼ連鎖反応増幅に対するある種の試料の阻害作用を軽減する方法。阻害の軽減は、増幅混合物にスペルミジンのごときポリアミン試薬を、有効な量で、典型的には、１〜４ｎＭで加えることによって達成される。他の具体例において、スペルミジンの存在は、低減した濃度のＭｇＣｌ₂およびリカゼーゼの存在下で進行する増幅を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】臨床検査試料におけるリガーゼ連鎖反応の阻害を軽減するためのスペルミジンの使用発明の背景本発明は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に関する。さらに詳しくは、本発明は、ＬＣＲ阻害を軽減するためにスペルミジンを使用する改良ＬＣＲ法に関する。１つのＬＣＲ方法によると、プローブパートナーの２組を使用し、それは、一次プローブの第１の組（第１および第２プローブパートナー）および二次プローブの第２の組（第３および第４プローブパートナー）を含む。一方のプローブパートナーは標的鎖の第１セグメントにハイブリダイズし、他方のプローブパートナーは同じ標的鎖の第２セグメントにハイブリダイズし、第１および第２セグメントは、５’リン酸−３’ヒドロキシル関係において相互に接するように、およびリガーゼ酵素または他の試薬がパートナー組の２つのプローブを共有結合により融合または連結させて融合生成物とするように隣接している。加えて、第３（二次）プローブは第１プローブの一部にハイブリダイズでき、第４（二次）プローブは同様に隣接して第２プローブの一部にハイブリダイズできる。勿論、もし標的が元々二本鎖であれば、第１の例における二次プローブもまた標的相補鎖にハイブリダイズするであろう。一次プローブの融合鎖が一旦標的鎖から分離されると、該融合鎖は、連結されて相補的二次融合生成物を形成できる第３および第４プローブとハイブリダイズするであろう。融合生成物が標的またはその相補鎖のいずれかに対して機能的に同等であるのを理解するのは重要である。ハイブリダイゼーションおよび連結の反復サイクルによって、標的配列の増幅が達成される。この技術は１９８９年６月１４日に公開されたＫ．Ｂａｃｋｍａｎらの欧州特許出願公開第３２０３０８号に記載されており、参考としてその全体を本明細書に組み入れる。ＬＣＲ変形法も例えばＰＣＴ出願公開第９０／０１０６９号、英国特許出願公開第２２２５１１２号および欧州特許出願公開第４３９１８２号に記載されている。臨床試料における標的核酸の増幅に関連する１つの問題点は増幅の阻害である。完全には理解されていないが、阻害は、所要の補因子をマスクする試薬および／または活性調節酵素部位をブロックする試薬の存在から起こり得る。もし阻害が感染因子についてテストする時に起これば、試料中に現実に存在する標的配列（すなわち、感染因子の核酸）は増幅されないであろう。この結果、その因子につき試料を陰性として誤って分類させることになり、患者の疾患の不適正な診断に導きかねない。ＬＣＲ増幅に先立って、内因性及び／または外因性の試料汚染物質から標的核酸を精製することによって阻害の問題を克服しようとする試みがなされてきた。文献は、フェノール抽出／エタノール沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および塩化セシウムのような精製グラジエントのごとき、当業者によく知られている種々の精製方法を記載している。これらの手法は試料分析に多大の労力と時間が必要となる。ＬＣＲ増幅に関連するもう１つの問題点は、反応試薬の不適正な添加を介して起こる。この問題は、特に、比較的狭い範囲（例えば、２５ｍＭ−３５ｍＭ）にわたるＭｇＣｌ₂の高濃度の存在を要求する変形ＬＣＲ法（前記）を利用する場合に生起する。この最適範囲を超えるまたはそれ未満の増幅混合物に添加したＭｇＣｌ₂の濃度は増幅を阻害し得る。その結果、使用者がＭｇＣｌ₂を添加するのを要求する診断アッセイにおいては、過剰または不十分な量のＭｇＣｌ₂を反応混合物に導入するのを回避するように注意を払わなければならない。かくして、労力および時間消費がより少ない前増幅精製手法しか要さず、ＭｇＣｌ₂のような増幅試薬の非最適添加に伴う偽の結果の可能性を最小化する改良されたＬＣＲ方法に対する要求がある。発明の概要本発明は、前増幅試料調製を最小化し、増幅試薬添加に関して大きな柔軟性を可能とする改良されたＬＣＲ方法を提供する。これらの利点は、阻害低下量のスペルミジンをＬＣＲ増幅試薬に添加することによって利用可能となる。簡単に述べれば、改良された方法は、（ａ）増幅阻害を軽減するのに有効な量のスペルミジンと２対のプローブを含む組成物とを臨床検査試料に提供し、但し、各対は標的にハイブリダイズ可能な一次プローブおよび一次プローブにハイブリダイズ可能な二次プローブからなり、２つの一次プローブは標的上の隣接位置またはほぼ隣接する位置にハイブリダイズし、一次または二次プローブの少なくとも１つは、各々、一方の末端が修飾されて他の一次または二次プローブに連結できなくされており；（ｂ）一次プローブを標的にハイブリダイズさせ、次いで所望により二次プローブを標的相補鎖にハイブリダイズさせてもよく；（ｃ）該修飾を標的依存的に修正して、一次プローブが標的にハイブリダイズする場合に相互に連結可能とし、所望により標的相補鎖にハイブリダイズする場合に二次プローブが相互に連結可能としてもよく；（ｄ）一次プローブを連結させ、所望により二次プローブを連結させて融合生成物を形成させてもよく；次いで、（ｅ）標的から融合生成物を解離させ、ハイブリダイゼーション、修正および連結工程を反復して所望の標的配列を増幅する、工程を包含する。別の実施態様において、改良された方法は、（ａ）（ｉ）増幅阻害を軽減する有効量のスペルミジンと、（ｉｉ）２対のプローブを含む組成物であって、各対は標的にハイブリダイズ可能な一次プローブおよび一次プローブにハイブリダイズ可能な二次プローブからなり、２つの一次プローブは隣接位置にて標的にハイブリダイズしする、該組成物とを臨床検査試料に提供して、反応混合物を形成させ；（ｂ）一次プローブを標的にハイブリダイズさせ；（ｃ）一次プローブを連結させて融合生成物を形成させ；次いで、（ｄ）融合生成物を標的から解離させる、工程を包含する。臨床検査試料中に提供されるスペルミジンの最終濃度は約０．５ｍＭ〜約４ｍＭ、より典型的には約１ｍＭ〜約３ｍＭであり得る。臨床検査試料中のＬＣＲ増幅で達成される阻害の予期せぬ低下に加え、本明細書で教示するスペルミジンの使用は、約０．５ｍＭおよび２０ｍＭ未満の間のような２０ｍＭ未満および３５．５ｍＭを超える最終ＭｇＣｌ₂濃度の存在下で効果的なＬＣＲ増幅を可能とする。発明の詳細な記載前記したごとく、標的核酸配列のＬＣＲ増幅に先立ち、標的配列はしばしば、例えば抽出または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）グラジエントによって供給源物質または粗製試料から精製される。その結果、標的配列は供給源物質で見い出される汚染物質から分離される。精製の後、得られた検査試料を増幅反応に必要な試薬と接触させ、増幅を行う。従って、増幅は比較的「清浄な」試料で行われる。本発明は、「臨床検査試料」に存在し得る標的核酸配列の増幅の阻害を軽減するのにスペルミジンを使用できるという予期せぬ発見に基づくものである。本発明の目的では、「臨床検査試料」または「臨床試料」なる語は、核酸抽出またはＣｓＣｌグラジエントを介して精製を受けていない哺乳動物源から採取した試料である。濾過および遠心のような粗雑な分離技術にかけられた試料、または例えば、添加された酸、塩基、溶解剤(lysing agent)、緩衝液およびｐＨ指示薬のような試薬を含有する試料は「臨床検査試料」から排除されるべきではない。但し、それらは前記で与えたその語の定義に適合するものとする。かくして、例えば、臨床検査試料は、血液、血清、痰または他の哺乳動物体液であり得、これを溶解剤を含有する緩衝液中で遠心し、それに再懸濁する。また、本明細書で教示するようにスペルミジンを用いることによって、ＬＣＲ増幅を支持しないことによりＬＣＲ増幅を阻害することが従前に見いだされていたＭｇＣｌ₂濃度はもはや阻害せず、それによりＬＣＲ増幅を支持する。かくして、２０ｍＭ未満および３５．５ｍＭを超える最終ＭｇＣｌ₂濃度の存在下で効果的にＬＣＲ増幅か起こる。典型的には、０．５ｍＭおよび２０ｍＭ未満の間の最終ＭｇＣｌ₂濃度を使用できる。本発明によって使用できる改良されたＬＣＲ法は、Ａ、Ｂ(一次プローブ)、およびＡ’、Ｂ’（二次プローブ）と称する１組または２組のパートナー組のいずれかを用いる。パートナー組とは２つのプローブ（例えば、ＡおよびＢ）をいい、それは同一の標的鎖に指向され、最後には標的のアニーリングの後に相互に連結される。パートナー組における各プローブはプローブパートナーと呼ばれる。本明細書で用いるプローブ対は、１つのパートナー組からの１つのプローブおよび第２のパートナー組からのもう１つのプローブをいい、それらは相互に相補的である（例えば、ＡＢのプローブパートナ−ＡはＡ’Ｂ’のプローブパートナ− Ａ’に相補的である）。プローブ対は相互にハイブリダイズして「二本鎖」を形成することができ、その結果、ＡがＡ’にハイブリダイゼーションして二本鎖ＡＡ’を形成し、ＢがＢ’にハイブリダイゼーションして二本鎖ＢＢ’を形成する。プローブ対からの少なくとも１つのプローブは最初に「修飾された」端部を含み、これは得られた二本鎖を「非平滑」としおよび／または、２つのプローブ二本鎖のリガーゼ触媒融合のための適当な基質ではなくする。改良されたＬＣＲ法では、増幅反応の酵素触媒工程に強制的に関与するプローブ上の基は、例えば、化学部分でマスクまたはブロックされる。該酵素的工程は連結またはギャップ充填であり得る。該プローブは標的にハイブリダイズでき、酵素反応を開始させ（かくして、「イニシエーター」と呼ぶことができ）、連結または伸長された生成物は「増幅生成物」という。ブロッキング基は、プローブ対として相互にハイブリダイズした場合ではなく、実質的にはプローブが標的または増幅生成物にハイブリダイズした場合にのみ酵素によって除外できる。もう１つの態様において、プローブを修飾して、１つの端部においてさらなる塩基の突出を含有するようにできる。該塩基は後に標的依存的に切断されて、増幅反応が起こるようになる。プローブの各々はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）よりなり、これは通常のヌクレオチドホスホアミダイト化学およびＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．(ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ)；Ｄｕｐｏｎｔ，(Ｗｉｌｉｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ)；またはＭｉｌｌｉｇｅｎ，（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手できる装置を用いてルーチン的に合成できる。適当なプローブの５’末端のリン酸化はリガーゼによる連結に必要であり、キナーゼによって酵素的に達成され、あるいはリン酸化５’末端に対して公知のいずれかの化学合成方法によって達成される。市販の試薬がこの目的に入手できる。一般に、本発明の実施に有用な改良された方法は、（ａ）修飾プローブを標的（および、もし存在すれば、標的相補鎖）にハイブリダイズさせ；（ｂ）標的依存的に該修飾を（例えば、ギャップの充填により）修正してプローブ類が連結可能とし；（ｃ）修正されたプローブをそのパートナーに連結させて、融合または連結生成物を形成させ；次いで、（ｄ）融合生成物を標的から解離させる工程を含む。該ハイブリダイゼーション、修正および連結を反復して所望の配列をさらに増幅させることができる。工程（ａ）、（ｃ）および（ｄ）はすべての実施態様につき実質的に同一であり、一緒に議論できる。工程（ｂ）は使用する修飾のタイプに応じて変化する。「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」条件は、一般に、アニーリングを促進する条件と定義される。しかしながら、当該分野では、かかるアニーリングおよびハイブリダイゼーションは、温度、イオン強度、プローブ長およびプローブのＧ：Ｃ含量を含めたいくつかのパラメーターにむしろ予測可能に依存する。例えば、反応の温度の低下は、アニーリングを促進する。任意の所与のプローブ組では、融解温度またはＴｍはいくつかの公知方法のうちのいずれかによって評価できる。典型的には、診断適用は、融解温度のわずかに下のハイブリダイゼーション温度を利用する。イオン強度または「塩」濃度も融解温度に強い影響を与える。というのは、小さなカチオンは、ホスホジエステル主鎖上の負の電荷をなくすることによって二本鎖の形成を安定化させる。典型的な塩濃度は、カチオンの性質および価数に依存するが、当業者に容易に理解されるであろう。同様に、高いＧ：Ｃ含量および増大したプローブ長も二本鎖を安定化することが知られている。何故ならば、Ａ：Ｔ対が丁度２つを有する場合、Ｇ：Ｃ対合は３つの水素結合を含むし、またより長いプローブはプローブを一緒に保持するより多くの水素結合を有するからである。かくして、高いＧ：Ｃ含量およびより長いプローブ長は融解温度を上昇させることによって「ハイブリダイゼーション条件」に強い影響を与える。プローブの標的への（および所望による標的相補鎖への）ハイブリダイゼーションは、当該分野で広く知られており、欧州特許出願公開第３２０３０８号に説明されている。プローブ長、プローブ濃度および条件のストリンジェンシーはハイブリダイゼーションが起こる程度および速度に影響する。好ましくは、プローブは所望の特異性を提供するように、すなわち、試料中の非標的配列にハイブリダイズ可能であることを回避するために十分長いものとする。典型的には、１５〜１００塩基のオーダーのプローブがこの目的に適う。現在好ましいのは、約１５〜４０塩基の長さを有するプローブである。プローブ類は一般にほぼ等しいモル濃度で添加される。というのは、それらは化学量論的に反応することが期待されるからである。各プローブは、一般に、約５ナノモル(ｎＭ)〜約９０ｎＭ；好ましくは約１０ｎＭ〜約３５ｎＭの濃度範囲で存在させる。２００μＬの典型的な反応容量では、これは約３×１０¹¹〜約１．２×１０¹²分子の各プローブを添加することに等しく；２００μＬ当たり約１ ×１０¹²分子が良好な出発点であった。各反応に使用するプローブの最適量も、行うべきサイクル数および反応容量に依存して変化する。所与のサイクル数について最適シグナルを提供するために、プローブ濃度は当業者が容易に決定できる。プローブの添加に続き、改良されたＬＣＲ方法における次の工程は特異的修正工程、続いての１つのプローブのその隣接パートナーへの連結である。かくして、各修正された一次プローブはその関連の一次パートナーに連結され、各修正された二次プローブはその関連の二次パートナーに連結される。「隣接」プローブは連続した向き(contiguous orientation)で標的とハイブリダイズ可能な２のプローブのうちのいずれか１つであり、そのうちの１つは、パートナープローブの３’ヒドロキシル末端に接したリン酸化された５’末端をもつ。「隣接」プローブは標的依存的に修飾された末端の修正に際して生成される。酵素的連結は２の隣接プローブを共有結合させる好ましい方法であるので、この「連結」なる用語を本明細書全体で使用する。しかしながら、「連結」は一般的用語であって、２のプローブを共有結合させる任意の方法を含むものと理解されるべきである。「修正」とは、プローブ連結を最初の位置で不可能とする修飾の修復をいう。特異的修正メカニズムは、一般に、１）３’ ヒドロキシルの生成または回復；２）５’リン酸の生成または回復、あるいは突出伸長の切断またはギャップの充填による隣接性(adjacency)の生成のうちの１以上に関する。修正は「標的依存的」、すなわち、他のプローブの存在下ではなく実質的には標的または標的同等物の存在下でのみそれが起こることが重要である。「鋳型依存的」は、該鋳型が未連結プローブではなく連結されたプローブ生成物である点で、「標的依存的」と同じである。前記で言及したギャップ充填において、修飾された末端は、１以上のプローブから短い塩基配列を除去し、それにより、それらが共に標的（または標的相補鎖、またはそれから生じるポリヌクレオチド）にハイブリダイズした場合に、一方のプローブパートナーの５’末端と他方のプローブパートナーの３’末端の間に凹所またはギャップを残すことによって生成する。ＬＣＲが標的を増幅するためには、プローブ間のギャップは充填されなければならす、あるいは伸長されなければならない(すなわち、該修飾は「修正」されなければならない)。これは、ポリメラーゼまたは逆転写酵素および、キャップに対向する標的鎖に相補的な過剰のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を用いて達成できる。伸長は、伸長されたプローブが隣接プローブに接し、それに連結できるように、連結の時点で停止されなければならない。この方法は、単一および２重のギャップ構造双方で利用でき、ここに、一本鎖標的の場合にはいずれか１つのプローブが伸長され（単一ギャップ）、二本鎖標的の場合には２つのプローブが伸長される（二重ギャップ）。伸長によるギャップ充填はＷＯ９３／００４４７にさらに記載されており、その全開示を参考として本明細書に組み入れる。修正の第２の方法において、非リン酸化５’末端が生じ、これは上流プローブの３’ヒドロキシル末端に連結できないが、標的依存的に修正してそれを連結可能にできる。「上流プローブ」とは、その３’末端が、鎖（類）がコーディングのために「センス」方向をもつか否かに拘わらず、他のプローブパートナーの５ ’末端に向けられるプローブパートナーをいう。第２のプローブパートナーとは「下流」プローブをいう。連結不適合プローブは標的にハイブリダイズされるが、５’末端は非リン酸基の除去によって「修正」され、その結果、５’リン酸基が露出される。これは、次の隣接ヌクレオチドに露出された５’リン酸末端を残すエキソヌクレオチド分解活性を有する剤を用い、５’非リン酸基を担持する全ヌクレオチドの除去によって行われる。別の変形において、不適合５’末端は下流プローブ内の標的に関して誤対合（又はミスマッチ）した塩基（類）によって生成される。この状況では、修正は、ポリメラーゼ、リガーゼ、およびｄＮＴＰプールの存在下で起こり、ここに、該誤対合塩基は下流プローブから除去され、上流プローブはプローブパートナーが相互に接して連結できるまで伸長される。エキソヌクレオチド分解活性を用いる標的核酸の増幅はＷＯ９４／０３６３６にさらに記載されており、参考としてその開示を本明細書に取り入れる。修正の第３の方法において、無塩基部位またはさらなる塩基のごときブロッキング部分を、意図する連結点を超えて、少なくとも１つの上流プローブの３’ヒドロキシル末端に付加することによって、修飾された末端が生成する。該無塩基部位またはさらなる塩基は「突出」からなり、理想的な平滑末端連結は不可能である。該突出は、連結可能な３’末端を露出する修正試薬によって切断できる。かかる修正試薬の例は酵素エンドヌクレアーゼＩＶである。エンドヌクレアーゼＩＶ修正はＥＰ−Ａ−４３９１８２に記載され、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０４１１３により詳細に記載されており、参考として全開示を本明細書に取り入れる。好ましい酵素的連結工程を可能とする条件および試薬は、一般に、当業者に公知であり、背景に記載した文献に開示されている。本発明で有用な連結試薬は、Ｔ４リガーゼ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（カタログ番号１０７００１、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手可能なイー・コリ(Ｅ．ｃｏｌｉ)ＤＮＡリガーゼ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（カタログ番号２０８、ベバリー、マサチューセッツ州）から入手可能なサーマス・アクアティカス(Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ)ＤＮＡリガーゼおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号６００１９１、ラジョア、カリフォルニア州）から入手可能ッカス・フリオアス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｕｓ）ＤＮＡリガーゼのごとき原核生物リガーゼを含む。ＬＣＲの熱サイクルの間に活性を維持するその能力のため耐熱性リガーゼが現在好ましい。熱安定性リガーゼがなければ、サイクルが反復される毎にリガーゼを再度添加しなければならない。また、有用なのは、Ｒａｂｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０６３７−１０６４７（１９８６）によって報告されているショウジョウバエのＤＮＡリガーゼを含めた真核生物リガーゼである。本発明で有用な重合試薬はやはりＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓから入手可能なサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ）（Ｔ．ｆｌ）から単離されたポリメラーゼまたはサーマス・アクアティカス(Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ)から単離されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＰｒｏｍｅｇａおよびＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒを含めたいくつかの市販品から入手可能）を含む。一旦連結されると、通常のＬＣＲに関しては、融合された（認識された）プローブは標的から解離され（例えば、融解され）、該プロセスは数サイクル反復される。反復サイクルの数は１〜約１００まで変化できるが、約２５〜約５０が現在好ましい。増幅の間、標的核酸配列（類）の増幅を妨げる阻害剤を試料内に存在させることもできる。本発明で提供されるごとく、この阻害作用を軽減するために、スペルミジン試薬を増幅反応混合物に添加する。本明細書で使用するスペルミジンまたはスペルミジン試薬とは、反応混合物へのその添加に先立って適当な緩衝液に可溶化できる式ＮＨ₂−(ＣＨ₂)₃−ＮＨ₂−(ＣＨ₂)₃−ＮＨ₂を有する化合物をいう。本明細書で使用する「阻害」とは、標的が実際に存在する標的核酸配列の増幅の妨害をいう。阻害は、反応混合物中の阻害性物質の存在から生起し得る。例えば、阻害は所要の補因子をマスクする試薬および／または酵素の活性調節部位をブロックする試薬の存在から起こり得る。１または数種のメカニズムがＬＣＲで増幅の阻害を引き起こすのに作用し得るが、阻害が起こる現実のメカニズムは完全には理解されていない。本明細書で使用する「阻害を軽減する」または「阻害の軽減」は、スペルミジン試薬の存在下で、測定可能量の標的特異的増幅生成物がスペルミジン試薬の不存在下で生成されるその量を超えて生成されるような、標的核酸配列の増幅に対する阻害剤の阻害作用を低下させることを意味する。阻害が軽減される程度をはっきりと定義することは不可能であるが、これは、臨床試料に存在する阻害剤（類）の量は患者試料間で変化するからである。したがって、阻害の除去は最良には相対的に定義される。例えば、阻害の除去は、患者試料からの標的ＤＮＡの増幅において（または患者試料の存在下において）、測定可能量の標的特異的増幅生成物がスペルミジンの不存在下で生成するその量を超えてスペルミジンの存在下で生成される場合に達成される。但し、等量の患者試料が両条件下で増幅されるものとする。一般に、阻害を軽減するのに効果的なスペルミジンの濃度は０．５ｍＭおよび約４ｍＭの間、より典型的には約１ｍＭおよび約３ｍＭの間である。本明細書で使用する「阻害剤」とは、阻害を引き起こす、あるいは臨床検査試料に存在する標的核酸配列（類）の増幅を妨げるいずれの物質をもいう。阻害剤は検査試料に対して内因性の物質であるか、あるいは臨床検査試料に対して外因的に添加できる。内因性阻害剤は患者の系から天然に由来し、従って、患者試料に固有の物質である。外因性阻害剤は、前処理工程の間のごとくに、いずれかの目的のための臨床検査試料に添加された任意の物質であってよい。例えば、外因性阻害剤は、細胞膜の溶解および核酸の同時放出を引き起こす洗剤の添加および／または核酸に対するエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの分解的作用を妨げるヌクレアーゼ阻害剤の添加を通じて導入できる。本明細書で使用する「反応混合物」または「増幅混合物」とは、増幅反応を行うのに必要な検査試料および試薬のいずれの組合せをもいう。標準的なＬＣＲ試薬は文献に記載されており、また、実施例にも記載する。本発明の別の実施態様において、スペルミジン試薬は非最適ＭｇＣｌ₂の条件下でＬＣＲ増幅を可能とする。例えば、低下されたＭｇＣｌ₂とはＬＣＲ反応で一般的に使用される濃度未満のＭｇＣｌ₂の濃度をいう。低下されたＭｇＣｌ₂濃度は、典型的には、０．５ｍＭおよび２０ｍＭ未満の間または３５．５ｍＭを超える最終ＭｇＣｌ₂濃度である。本発明のなおさらに別の実施態様において、スペルミジン試薬は、増幅が低減リガーゼ条件下で行われる場合に反応混合物で有用である。低減リガーゼとは、ＬＣＲ反応で典型的に使用される濃度未満のリカゼーゼの濃度をいう。例えば、共にＣａｒｒｉｎｏら対するＷＯ９３／００４４７およびＷＯ９４／０３６３６はＬＣＲ増幅を記載しており、そこでは、使用されるリカゼーゼ量は、各々、５０μＬ反応容量当たり３，４００ユニットまたは５，０００ユニット（すなわち、６８〜１００ユニット／μＬ）である。本発明による低減リカゼーゼ濃度とは、約１，０００ユニット／２００μＬ反応容量および約１２，０００ユニット／２００μＬ反応容量の間（すなわち、５−６０ユニット／μＬ）、より典型的には約１０ユニット／反応容量および約５０ユニット／μＬの間をいう。増幅に続き、増幅された配列は多数の当該分野で知られている方法によって検出できる。典型的には、検出は、分離後、分離された画分中の標識の量を測定することによって行われる。勿論、系に対して添加された標識の合計量を知り、非分離画分に存在する量を測定することによって、分離された画分中の標識は減算により決定できる。分離は電気泳動によって、クロマトグラフィーによってまたは後記する好ましい方法におけるごときアフィニティーによって達成できる。特に好ましい態様において、ハプテン、または「フック」（上位概念用語「レポーター」または「標識」のサブセット）を少なくとも２つのプローブの利用できる外部末端、好ましくはすべての４つのプローブの外部末端に結合させる。「フック」は特異的結合パートナーに対して親和性を有する任意の部分である。典型的には、融合した二本鎖生成物の一方の末端（例えば、Ａの５’末端およびＡ’ の３’末端）におけるフックは固相上に被覆された（抗体またはアビジンのごとき）特異的結合試薬によって固定化され得る抗原またはハプテンからなる。他方の末端（例えば、Ｂの３’末端およびＢ’の５’末端）おけるフックは抗体−酵素コンジュゲートのごとき標識または標識系によって認識され得る異なる抗原またはハプテンを含有する。例示的フックはビオチン、フルオレセイン、ジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン、ダンシル、２，４−ジニトロフェノール、ブロモウラシルその他ののような修飾されたヌクレチオド、相補的ヌクレチオド、レクチン／炭水化物対、酵素およびその補因子、および当該分野で公知の他のものを含むが、それらに限定されるものではない。他の例示的フック類は米国特許第５，４２４，４１４号に記載されているアダマンタン酢酸および１９９３年７月１日に出願された同一所有者の同時継続の米国特許出願第０８／０８４，４９５号に記載されているカルバゾールおよびジベンゾフランを含み、両出願は１９９１年１２月１７日に出願された出願からの優先権を伴い、その双方を参考として本明細書に取り入れる。ハプテンをオリゴヌクレオチドの３’末端に付加する方法は、１９９０年１２月２０日に出願された共有の米国特許第５，２９０，９２５号に開示されている。他の方法（例えば、ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒＩＩ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，カリフォルニア州）は公知であり、３’および５’末端を標識するために商業的に入手できる。ハプテンを５’末端に付加する方法は、Ｔｈｕｏｎｇ，Ｎ．Ｔら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（４６）：６９０５−５９０８（１９８８）、またはＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．らの米国特許出願第０７／２４６，６８８号（放棄）（ＮＴＩＳオーダーの特許出願番号７−２４６，６８８（１９８８））に記載されているホスホアミダイド試薬の使用を介するものである。かくして、例示的連結オリゴヌクレオチドは、微粒子酵素免疫アッセイｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，イリノイ州）による検出のために一端にカルバゾールおよび他端にアダマンタンを有する。該アッセイプロトコルは商業的に入手可能なアルファ−フェトプロテインアッセイで使用されるものと同様のものであり、以下に適合するものである：（１）抗−アルファ−フェトプロテイン抗体被覆微粒子を抗−カルバゾール抗体被覆微粒子で置き換え、（２）抗−アルファ−フェトプロテイン抗体：アルカリ性ホスファターゼのコンジュゲートを抗−３− フェニル−１−アダマンタン酢酸抗体：アルカリ性ホスファターゼで置き換える。公開されたＫ．ＢａｃｋｍａｎらのＥＰ−Ａ−４３９，１８２にさらに記載されている。略言すると、該プロトコルは以下の通りである。ＬＣＲによって増幅された１００μＬの反応混合物をピペットで試料ウェルに入れる。次いで、この試料の５０μＬをピペットでインキュベーションウェルに入れ、抗カルバゾール抗体被覆微粒子を該ウェルに添加する。適当な時間のインキュベーションに続き、抗カルバゾール抗体とカルバゾール末端を持つ核酸配列とからなる複合体が形成される。イン維捕獲マトリックスにピペットで入れ、アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートした抗アダマンタン抗体を添加する。これは、微粒子−オリゴヌクレオチド −酵素複合体に導き、これはガラス繊維捕獲マトリックスの表面近くにとどまるであろう。洗浄工程における過剰試薬の除去の後（このプロトコルを通じて、ガラス繊維捕獲マトリックス直下のブロッターは、該ガラス繊維捕獲マトリックスをオーバーフローする試薬溶液を吸収する）、該ガラス繊維捕獲マトリックスを４−メチルウンベルフェリルホスフェート（ＭＵＰ）で処理する。表面結合酵素は非蛍光原性ＭＵＰを４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）に変換し、その蛍光は４４８ｎｍで測定できる。以下の実施例で与えられる数値は、カウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）で表した、この方法における速度読み取り値である。標識されたオリゴヌクレオチドのＭＥＩＡ読み取りのこの概念は、Ｌａｆｆｌｅｒ，Ｔ．Ｇ．らに対する１９９０年３月７日に公開された欧州特許出願第３５７，０１１号、「標的核酸配列の検出および増幅」、その他に記載されている。実施例さて、実施例によって本発明をさらに説明する。この実施例は本発明を説明するためのもので、断じて本発明を限定する意図はない。実施例全体を通じ、以下の略号は以下の意味を有する。ＢＳＡはウシ血清アルブミンを指す。ＥＰＰＳはＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）を指す。ＥＰＰＳ−ＫＯＨはＫＯＨでｐＨ７．８に調整したＥＰＰＳの緩衝液を指す。ＮＡＤはニコチンアミドアデニンデヌクレオチド（ある種の生物学的反応のためのエネルギー源）を指す。ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を指す。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰは各々、デオキシリボヌクレオチドアデノシン三リン酸、チミジン三リン酸、シトシン三リン酸、およびグアニジン三リン酸を指す。ＴＲＩＳはトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンを指す。ＴＥはＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）の緩衝液を指す。以下の説明用実施例において、プローブ対を「カルバゾール」ハプテンおよびアダマンタン酢酸（「アダマンタン」）ハプテンで標識する。典型的には、「アダマンタン」および「カルバゾール」は前記記載で一緒に使用されるが、実質的にいずれのハプテンの組合せも可能である。好ましくは、プローブパートナーの各構成員は異なる標識を有する。れはＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＡｂｏｔｔＰａｒｋ，イリノイ州）から商業的に入手可能であって、ＥＰ −Ａ−２８８７９３およびＦｉｏｒｅ，Ｍ．らＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４／９：１７２６−１７３２（１９８８）に記載されている。以下の実施例目的では、テフロン被覆鋼ピペッティングプローブよりもむしろステンレス鋼を使用する、改囲の「マシーン」ノイズまたはバックグラウンドを発生する。本発明の実施で有用な他の同等に適当な検出方法はＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ならびに免疫クロマトグラフィー、並びにサザンブロッティング、ドットブロッティング、スロットブロッティング、溶液ハイブリダイゼーションおよび当該分野でよく知られた他のものを含めたハイブリダイゼーション技術を含む。ポリメラーゼの量はユニットで表し、ここに使用したポリメラーゼの入手源であるＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓによって以下のように定義されている：１ユニットの酵素は、７０℃で３０分間で、１０ナノモルの合計ヌクレオチドを酸不溶性物質に取り込むのに要する酵素量に等しい。リガーゼ酵素のユニットはここでは以下のように定義される：１ｍｇの９５％ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼは約１×１０⁸ユニットの比活性を有する。これは正確に標準化されておらず、２０％も変化し得るが、最適化はルーテン的実施者の技量の範囲内である。標的配列およびプローブは、１９９１年７月２１日に公開されたＫ．ＢａｃｋｍａｎらによるＥＰ４３９１８２に教示されているように「停止塩基」を含めるように選択して、伸長されたプローブがそのプローブパートナーに接し、それに連結できるように、連結の時点で正確にギャップ充填伸長を終止させる。以下の実施例目的では、系列希釈剤（ＬＤ）は標的ＤＮＡおよびプローブの不存在下でマシーンノイズを検出するのに用いる５０ｍＭＴｒｉｓ酢酸ｐＨ７．５からなる緩衝液試薬である。すべてのデータはカウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）のＩＭ呼吸器系試料を実施例全体を通じて使用した。特に断りのない限り、呼吸器系試料はミコバクテリアの存在の培養測定のための呼吸器系検体を調製するのにルーチン的に使用される手法を用いて調製した。より詳しくは、試料はアルカリ性条件を用いて、汚染物を除去し、中和し、沈積させ、再懸濁した。実施例１オリゴヌクレオチド合成およびハプテン化モデル３８０ＡＤＮＡ合成器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，カリフォルニア州）にて、β−シアノエチルホスホアミダイトを用い、以下の確立された手法に従って以下のオリゴヌクレオチド（表１参照）を合成した。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはその通常の意味を有する。プローブは左から右にかけて５’側から３’側に記載する。オリゴヌクレオチドの３’および５’末端をハプテン、アダマンタンおよびカルバゾールとコンジュゲートさせた。これらのハプテンのコンジュケーションは標準的なβ−シアノエチルホスホアミダイト化学に従い、これは前記したハプテンの出願に記載されている。同様の手法が、公表された米国出願ＮＴＩＳＯＲＤＥＲＮｏ．ＰＡＴ−ＡＰＰＬ− ７−２４６，６８８（Ｃｏｈｅｎら、１９８９）において蛍光標識用で記載されている。配列番号２、３、４および５に対応するオリゴヌクレオチドを選択して、クラミジア・トラコーマティス(Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）に見いだされる潜在(cryptic)プラスミド（Ｈａｔｔ，ｃ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．１６（９）：４０５３−４０６７（１９８８））の領域（配列番号１、配列表参照）を検出した。配列番号７、８、９および１０に対応するオリゴヌクレオチドを選択して、ミコバクテリウム・ツバクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中の蛋白質抗原ｂ（ｐａｂ）のヌクレオチド３４７−３９０に対応する標的配列(配列番号６、配列表参照)を検出した。配列番号１２、１３、１４および１５に対応するオリゴヌクレオチドを選択して、ナイセリア・ゴノーエア（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のＯｐａＡ遺伝子の標的配列（配列番号１１、配列表参照）を検出し、これは、各々、マップ位置６６．１、６６．２、６６．３および６６．４に対応する。（Ｓｔｅｒｎ，Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｎｉｃｋｅｌ，Ｐ．およびＭｅｙｅｒ，Ｔ．Ｆ．，Ｃｅｌｌ４７：６１−７１（１９８６））。配列番号１７、１８、１９および２０に対応するオリゴヌクレオチドを選択して、ミコバクテリウム・ツバクロシスからのマップ化されていないゲノム配列（配列番号１６）を検出した。逆相ＨＰＬＣまたはＰＡＧＥ電気泳動（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７２）によってすべてのオリゴヌクレオチドを精製して、失敗配列および、ハプテン化オリゴの場合にはいずれの未ハプテン化種も除去した。実施例２ＰＣＲによる標的特異的ＤＮＡ増幅の阻害の軽減に対するスペルミジンの効果ＬＣＲの間の標的特異的ＤＮＡ増幅の阻害の軽減に対するスペルミジンの効果を測定するために、標的核酸（クラミジア・トラコーマティス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＤＮＡ）を、陰性臨床試料の存在下、および１ｍＭスペルミジンのの存在下または不存在下で増幅した。反応は、２００μＬの最終反応容量にて、ＫＯＨでｐＨ７．８に調整した５０ｍＭＥＰＰＳ緩衝液（ＥＰＰＳ−ＫＯＨ緩衝液）、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１０μＭＮＡＤ、３ないし６μＬのほぼ１０⁸倍希釈のＣ．トラコーマティス感染ＭｃＣｏｙ細胞（この量は約５００−１に経験的に選択した）、４．８−５×１０¹¹分子の各配列番号２、３、４および５、１００μＬの臨床試料、１．７μＭの各ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１８，０００ユニットのＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔ．ｔｈ）ＤＮＡリガーゼおよび２ユニットのＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ（Ｔ.ｆｌ）ポリメラーゼ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ミルウォーキー、ウィスコンシン州、カタログ番号１０７０．０１）中で行った。プローブは実施例１のごとくカルバゾールおよびアダマンタンで標識した。対照反応は、陰性対照としてのヒト胎盤(ＨＰ)ＤＮＡ(Ｓｉｇｍａ)または陽性対照としてのＭｃＣｏｙ細胞溶解物いずれかを含む緩衝液単独中で（すなわち、臨床試料の不存在下で）行った。サイクリングは以下の設定：９７℃，１秒；５５℃，１秒；６２℃，５０秒で４０サイクルにて、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒモデル４８０サーモサイクラーで行った。ＬＣＲ増幅生成いてサンドイッチアッセイを介して検出した。結果は表２ａに示す。また、１００μＬの合計反応容量で前記したごとくに実験を行った。プローブおよび酵素濃度ならびに臨床試料容量は、これらの反応では、比例的に減少させた（すなわち、２．４×１０¹¹分子のプローブ、９．０００ユニットのリガーゼ、１ユニットのポリメラーゼおよび５０μＬの臨床試料）。結果を表２ｂに示す。表２ａおよび２ｂから分かるように、臨床試料の存在下であるがスペルミジンの不存在下で行った標的ＤＮＡ（すなわち、Ｃ．トラコーマティス）の増幅は、陽性対照と比較してほとんどまたは全くＬＣＲ増幅を示さなかった。（表２ａにおける試料Ｕｌ３および１２の増大したＭＥＩＡ速度および表2bにおける試料Ｕｌ１２、２３、２４、２７、３４、４５、６０および６８の増大したＭＥＩＡ速度によって示されるごとく）１ｍＭスペルミジンの存在はＣ．トラコーマティスＤＮＡ増幅の阻害を軽減するのに十分であった。実施例３ゲル濾過クロマトグラフィー検査試料をＬＣＲ反応での使用に先立ってゲル濾過クロマトグラフィーにまず付すという変更を施して、１００μＬの反応につき実施例１の実験条件を用い、陰性臨床試料（前記）の存在下で実験を行った。この手法は、ＬＣＲ阻害剤を試料から除去するのを助ける部分的精製工程である。ＢａｘｔｅｒＳ／Ｐ（カタログ番号Ｐ５１９４）から購入したプラスチックスクリーニングカラム中、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０−８０（Ｓｉｇｍａ）の５ｍＬ充填ベッド容量としてスパンカラムを調製した。０．５ｍＬの試料をカラム当たりに負荷した。カラムを収集チューブ内に入れ、Ｊ６Ｂ遠心管中、Ｂｅｃｋｍａｎ装置ＴＹ．ＪＳ４．２ローターにて、１５℃で５分間、１６００ｒｐｍで回転させることによって、核酸をＴＥで溶出させた。表３に示すごとく、スパンカラムクロマトグラフィーはＬＣＲによる増幅に先立って患者試料からすべての阻害剤を除去するのには効果的でなかった。しかしながら、１ｍＭ濃度のスペルミジンの添加は、これらの部分的に精製された試料の存在下において増幅の阻害を軽減するのに効果的であった。実施例４変化させた量の阻害剤の存在下における標的特異的ＤＮＡ増幅の阻害軽減に対するスペルミジンの効果実験を行って、一定範囲の阻害剤濃度の存在下において標的特異的ＤＮＡ増幅の阻害軽減に対するスペルミジンの効果を測定した。本実験では、増大させてゆく量の陰性臨床試料（実施例１記載）の存在下で、ミコバクテリウム・ツバクロシス（Ｍ．ｔｂ）ＤＮＡの増幅を行った。反応は、５０ｍＭＥＰＰＳ−ＫＯＨ緩衝液、２０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１．７μＭの各ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ、１０μＭＮＡＤ、ほぼ１×１０¹²分子の各配列番号７、８、９および１０、２５ゲノムのＭ．ｔｂＤＮＡ、２ユニットのＴ．ｆｌポリメラーゼ、および１８，０００ユニットのＴ．ｔｈＤＮＡリガーゼを含有する２００μＬ合計反応容量中で行った。２５ゲノムのＭ．ｔｂＤＮＡは、公表されたＭ．ｔｎＤＮＡのゲノムサイズ（Ｂａｅｓｓ，Ｉ．，ＡｃｔａＰａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，Ｓｅｃｔ．Ｂ９２：２０９−２１１、（１９８４））および測定したまたはＯＤ₂₆₀もしくはＤＡＢＡ（ジアミノ安息香酸）反応いずれかによる試料調製物のＤＮＡ濃度に基づいて計算した。増幅反応は１ｍＭスペルミジンの存在下または不存在下双方で行った。反応当たりに使用した臨床試料の容量は後記にて示す。対照反応においては、Ｍ．ｔｂＤＮＡおよびＨＰＤＮＡ（各々、陽性および陰性対照）を臨床試料の不存在下で増幅した。サイクリングは９３℃、１秒間；６５℃、１秒間；６８℃、１分間、１５秒間の４０サイクルで行った。表４に示すごとく、反応混合物への増大させる量の試料容量の添加の結果、Ｍ．ｔｂＤＮＡの増幅が阻害された。スペルミジンは、１ｍＭ濃度において、増大した量の阻害剤（類）の存在に起因する阻害を軽減するのに効果的であった。実施例５臨床試料の存在下における増幅阻害の軽減に効果的なスペルミジン濃度の最適範囲実験を行って、変化させた量の臨床試料の存在下における標的核酸の増幅阻害を効果的に軽減するスペルミジン濃度の最適範囲を決定した。実験条件は実施例４に記載した通りである。反応当たりに使用した試料容量は後記にて示す。表５における結果は、１ｍＭおよび３ｍＭスペルミジンの存在下において行ったＬＣＲ反応についてのＭＥＩＡ速度を示す。示されるごとく、１ｍＭスペルミジンは、一般に、増幅阻害の軽減において３ｍＭスペルミジンと少なくとも同等に効果的であるか、それ以上であった。実施例６スペルミジンの存在下におけるマグネシウムイオン濃度実験を行って、ＬＣＲ増幅を行うのに要するＭｇＣｌ₂の濃度に対するスペルミジンの効果を測定した。特に、改良されたＬＣＲ反応で典型的に使用されるもの（すなわち、２５ないし３５ｍＭＭｇＣｌ₂）よりも低いＭｇＣｌ₂濃度で増幅が行い得るか否かを判断するために実験を行った。本実験では、５０ｍＭＥＰＰＳ−ＫＯＨ緩衝液、２０ｍＭＫＣｌ、１．７μＭの各ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ、１０μＭＮＡＤ、ほぼ１×１０¹²分子の各配列番号７、８、９および１０、２ユニットのＴ．ｆｌポリメラーゼ、１８，０００ユニットのＴ．ｔｈＤＮＡリガーゼおよび変化させた濃度のＭｇＣｌ₂（後記）中で、２５ゲノムのＭ．ｔｂＤＮＡを増幅させた。合計反応容量は２００μＬであった。サイクリング条件は、１秒間の９３℃、１秒間の６３℃および４０秒間の６６℃、合計４０サイクルであった。表６に示すごとく、１ｍＭのスペルミジンの存在下において、ＬＣＲ増幅は５および１０ｍＭもの低いＭｇＣｌ₂濃度で達成できた。実施例７スペルミジンの存在下でＬＣＲ増幅を行うマグネシウムイオン濃度の範囲実験を行って、スペルミジンの存在下で増幅がおこなえるマグネシウムイオン濃度の範囲を測定した。この場合、標的ＤＮＡはＭ．ｔｂまたはＣ．Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのいずれかからのものであった。Ｍ．ｔｂ反応は、５０ｍＭＥＰＰＳ−ＫＯＨ緩衝液、５０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭスペルミジン、１．７μＭの各ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、１０μＭＮＡＤ、１×１０¹²分子の各配列番号１７、１８、１９および２０、２ユニットのＴ．ｆｌポリメラーゼ、１８，０００ユニットのＴ．ｔｈＤＮＡリガーゼ、２５ゲノムのＭ．ｔｈＤＮＡおよび後記するＭｇＣｌ₂中の２００μＬ合計反応容量で行った。本実施例および引き続いての実施例目的では、使用したＫＣｌ濃度は５０ｍＭであることに注意すべきである。（予備実験は、バックグラウンド増幅からのシグナルは、５０ｍＭＫＣｌを含有する反応混合物では低下し、他方、標的増幅からのシグナルは影響されなかった（データは示さず）。従って、この濃度を使用して、さらにバックグラウンドシグナルを低下させた）。２μｇのＨＰＤＮＡを用いて同一条件下で平行対照実験を行った。標準的陽性および陰性反応は、以下の変更を施して同一セットの条件下で行った：２０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ₂およびスペルミジン無し。酵素を含めたすべての試薬を混合した後、反応混合物を室温で２時間インキュベートした（ほぼ２２ ℃）。次いで、９３℃にて１秒間、６５℃にて１秒間および６８℃で１分間にてサイクリングを行た。表７ａに示すごとく、ＭｇＣｌ₂濃度は１．０ｍＭまで低下させることができ、陽性対照と同程度に効果的に標的ＤＮＡのＬＣＲ増幅を依然行うことができた。さらに、非標的特異的増幅はテストした範囲を通じて明らかではなかった。というのは、ＭｇＣｌ₂濃度の変更はいずれのテスト濃度においてもＨＰＤＮＡの増幅に影響しなかったからである。Ｃ．ＴｒａｃｈｏｍａｔｉｓＤＮＡを標的として用い、実質的に同一の実験を行った。Ｃ．Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ反応は、５０ｍＭＥＰＰＳ−ＫＯＨ緩衝液、５０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭスペルミジン、１．７μＭの各ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、１０μＭＮＡＤ、４．５×１０¹¹分子の各配列番号２、３、４および５、１．５ユニットのＴ．ｆｌポリメラーゼ、１，８００ユニットのＴ．ｔｈＤＮＡリガーゼ、２５分子の配列番号１（すなわち、合成標的）および後記するＭｇＣｌ₂中で行った。最終反応容量は再度２００μ Ｌであった。サイクリングは９７℃で１秒間、５５℃で１秒間および６２℃で５０秒間で行った。試料のアリコートごとく、スペルミジンは、再度、増幅を行うことができるＭｇＣｌ₂濃度範囲を実質的に低下させた。実施例８低減ＭｇＣｌ₂条件下で増幅を行うスペルミジン濃度の最適範囲実験を行って、低減した濃度のＭｇＣｌ₂（すなわち、２ｍＭ）の存在下でＬＣＲ増幅を行うスペルミジン濃度の最適範囲を測定した。反応は、２００μＬの合計容量で行い、以下の試薬：５０ｍＭＥＰＰＳ−ＫＯＨ緩衝液、５０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１．７μＭのｄＧＴＰ、１０μＭＮＡＤ、１．４×１０¹¹分子の各配列番号１２、１３、１４および１５、１０μＭＢＳＡ、１８，０００ユニットのＴ．ｔｈＤＮＡリガーゼ、２．０ユニットのＴ．ｆｌＤＮＡポリメラーゼおよび２５４ゲノムのＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＤＮＡを含有した。２５４ゲノムは、試料調製物のＤＮＡ濃度（ＯＤ₂₆₀によって測定）およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＤＮＡのゲノム当たりの重量（ゲノム当たり２ .３フェムトグラムＤＮＡとして計算）から計算した。スペルミジンは０ないし３ｍＭの範囲の最終濃度に添加した。サイクリング条件は９７℃で１秒間、５５ ℃で１秒間および６２℃で５０秒間にて確立した。陽性および陰性対照反応は、以下の変更：２０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂および無スペルミジンにて、実質的に同一セットの条件で行った。加えて、陰性対照では、標的ＤＮＡを１５０ｎｇのサケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）で置き換えた。た。表８ａに示すごとく、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＤＮＡのＬＣＲ増幅を行うのに典型的に使用したＭｇＣｌ₂の濃度は３０ｍＭであつた。（陽性対照、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＤＮＡ参照）。ＭｇＣｌ₂濃度を２ｍＭまで低下させた場合、増幅はスペルミジンの不存在下では達成されなかった。（試料１、ＭＥＩＡ速度＝１８．０参照）。しかしながら、試料６および７に示すごとく、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＤＮＡの増幅は、２．５ないし３ｍＭの範囲の濃度のスペルミジンの存在下では陽性対照のそれとほとんど同程度達成された。以下のデオキシヌクレオチド、プローブ、および標的ＤＮＡを、１．７μＭの各ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓプローブ組６９１７の４．５×１０¹¹オリゴ、および２５分子の配列番号１（すなわち、合成標的）に置き換えて、実施例８ａと同一の条件下で行った。サイクリング条件および対照は記載した通りである。表８ｂに示すごとく、２−３ｍＭの範囲の濃度のスペルミジンの存在下では、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの増幅は陽性対照のそれとほとんど同程度達成された。実施例９スペルミジンの存在下におけるリガーゼ要件実験を行って、スペルミジンの存在下において、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの増幅を行うのに必要なリガーゼ濃度の最適範囲を測定した。標的ＤＮＡは、標準的な反応条件下（すなわち、スペルミジンの不存在下）および変更した反応条件下（すなわち、スペルミジンの存在下）で増幅した。合計反応容量は２００μＬであった。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼの最終濃度は以下に示す通りである。表９の結果は、スペルミジンの存在下では、１／１０の濃度のリガーゼを用いて増幅を行えることを示す。特定の具体例を参照して本発明を詳細に記載してきたが、当業者には、本発明の思想および範囲を逸脱することなくかかる具体例に対して種々の変形および変更修飾をなし得るのは明らかであろう。加えて、前記したすべての特許および刊行物を参考として本明細書に取り入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者カオ，ジアンリーアメリカ合衆国、イリノイ・60061、バーノン・ヒルズ、タリー−ホー・ドライブ・ 358 (72)発明者リー，ユイ・エイチアメリカ合衆国、イリノイ・60061、バーノン・ヒルズ、ウエスト・ダンベリー・ドライブ・364

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）（ｉ）増幅阻害を軽減するのに有効な量のスペルミジンと、（ｉｉ）２対のプローブを含む組成物であって、各対は標的にハイブリダイズ可能な一次プローブおよび該一次プローブにハイブリダイズ可能な二次プローブからなり、２つの一次プローブは標的上の隣接位置またはほぼ隣接する位置にハイブリダイズし、一次または二次プローブの少なくとも１つはその一端が修飾されてそれを他の一次または二次プローブに連結できなくされている該組成物とを臨床検査試料に提供して、反応混合物を形成し；（ｂ）一次プローブを標的にハイブリダイズさせ；（ｃ）該修飾を標的依存的に修正して、一次プローブが標的にハイブリダイズする場合に相互に連結可能とし；（ｄ）一次プローブを連結させて融合生成物を形成させ；次いで、（ｅ）標的から融合生成物を解離させる工程を包含する、リガーゼ連鎖反応における増幅阻害を軽減する方法。２．該反応混合物におけるスペルミジンの量が約０．５ｍＭおよび約４ｍＭの間の最終濃度である請求項１記載の方法。３．該組成物がさらにＭｇＣｌ₂を含み、該反応混合物中のＭｇＣｌ₂の最終濃度が３５．５ｍＭを超える請求項１記載の方法。４．該組成物がさらにＭｇＣｌ₂を含み、該反応混合物中のＭｇＣｌ₂の最終濃度が０．５ｍＭおよび２０ｍＭ未満の間である請求項２記載の方法。５．該反応混合物中のスペルミジンの量が２．０ｍＭおよび３ｍＭの間の最終濃度であり、該組成物が、１０ｍＭ未満の該反応混合物中のＭｇＣｌ₂の最終濃度でＭｇＣｌ₂を含む請求項１記載の方法。６．（ａ）（ｉ）増幅阻害を軽減するのに有効な量のスペルミジンと、（ｉｉ）２対のプローブを含む組成物であって、各対は標的にハイブリダイズ可能な一次プローブおよび該一次プローブにハイブリダイズ可能な二次プローブからなり、２つの一次プローブは隣接位置にて標的にハイブリダイズする該組成物とを臨床検査試料に提供して、反応混合物を形成し；（ｂ）一次プローブを標的にハイブリダイズさせ；（ｃ）一次プローブを連結させて融合生成物を形成させ；次いで、（ｄ）融合生成物を標的から解離させる工程を包含する、リガーゼ連鎖反応において増幅阻害を軽減する方法。７．該反応混合物中のスペルミジンの該量が約０．５ｍＭおよび約４ｍＭの間の最終濃度である請求項６記載の方法。８．該組成物がさらにＭｇＣｌ₂を含み、該反応混合物中のＭｇＣｌ₂の最終濃度が３５．５ｍＭを超える請求項７記載の方法。９．該組成物がさらにＭｇＣｌ₂を含み、該反応混合物中のＭｇＣｌ₂の最終濃度が０．５ｍＭおよび２０ｍＭ未満の間である請求項７記載の方法。１０．該反応混合物中のスペルミジンの該量が２．０ｍＭおよび３ｍＭの間の最終濃度であり、該組成物が、１０ｍＭ未満の該反応混合物中のＭｇＣｌ₂の最終濃度でＭｇＣｌ₂をさらに含む請求項６記載の方法。