JPH08501212A

JPH08501212A - エキソヌクレオリチック活性を用いた標的核酸の検出及び増幅

Info

Publication number: JPH08501212A
Application number: JP6505369A
Authority: JP
Inventors: カリーノ，ジヨン・ジエイ; シユピーズ，ウーベー; ラインハード，ローリー・エイ; パビツク，エドワード・ケイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1993-07-21
Publication date: 1996-02-13
Anticipated expiration: 2019-04-05
Also published as: AU4687393A; ES2154648T3; CA2140331A1; EP0654093A4; CA2140331C; WO1994003636A1; JP3516953B2; EP0654093B1; DE69329824T2; DE69329824D1; EP0654093A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、５’エンドで改変された少なくとも１個の下流プローブを用いて、標的非依存性増幅を低減するか又は除去することからなる改善されたＬＣＲ増幅方法に関する。種々の改変プローブ及び該プローブを含むキットも提供する。改変プローブを用い、標的非依存性増幅を低減させて核酸配列の違いを検出する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】エキソヌクレオリチック活性を用いた標的核酸の検出及び増幅発明の分野本発明は一般に核酸増幅技術、特にリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を用いるアッセイでの標的非依存性バックグラウンド増幅の低減及び好ましくは除去に関する。本発明は更に、標的核酸配列の違いの同定に関する。背景リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、試料中の特異的核酸配列（標的）を増幅する方法である。ＬＣＲを使用して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの標的を検出することができる。通常、一方のプローブ対が他方の対とハイブリッド形成可能である連結可能な二対のプローブを、標的に対して過剰に使用する。標的ＤＮＡが（二本鎖の場合）、これをまず変性させて、連結可能なプローブ対を各相補鎖とハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたプローブをＤＮＡリガーゼにより連結する。次いで、連結したプローブを標的から解離すると、標的配列自体として機能する。ハイブリダイゼーション及び連結のサイクルを反復することにより、標的配列の増幅が達成される。ＬＣＲ法は文献に、とりわけヨーロッパ特許出願公開第３２０，３０８号、ヨーロッパ特許出願公開第４３９，１８２号、ヨーロッパ特許出願公開第３３６，７３１号、ＷＯ８９／０９８３５号、ＷＯ８９／１２６９６号及びＷＯ９０／０１０６９号に記載されている。ＬＣＲの共通の問題は非特異的（即ち標的非依存性）増幅であり、この増幅は誤った陽性結果を出し得る。例えば標的の不在下で一対の隣接するＬＣＲプローブ同士を連結するとこのようなことが生じ得る。ＬＣＲプローブは通常標的に比べて高濃度で使用されるので、標的非依存性連結の可能性が大きく、この問題を相応的に克服する必要がある。標的非依存性連結事象の低減方法は文献に記載されている。例えばヨーロッパ特許出願公開第４３９，１８２号は、連結可能な対のプローブの一方を改変させて、修正事象が生じるまで連結できないようにするＬＣＲの変形を記載している。修正事象は、プローブが標的とハイブリダイズするときにのみ生じる。特に、前記明細書は上流プローブの３’エンドへの改変を説明している。上流とは、３ ’エンドが連結反応に関与するプローブを意味する。開示されている改変は、３’ブロッキング基（例えばホスフェート）；（デオキシリボヌクレオチドプローブ上の）リボヌクレオチドの３’突出部；アバシック（abasic）部位を含む３’突出部；及びプローブを隣接させて連結可能とするために充填しなければならない３’ギャップである。開示された実施態様のいずれも下流プローブの５’エンドの改変は包含していない。発明の要約本発明は、標的依存性修正過程なしには連結し得ない５’エンド、即ちプローブと標的核酸配列とのハイブリダイゼーション後に酵素分解されれば連結され得る５’エンドを有する改変された下流プローブを用いて、標的非依存性増幅を低減し、好ましくは除去する方法を提供する。従って、本発明の方法は、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下にて、一本鎖形態の標的核酸配列を含むと思われる試料を、第１の上流プローブ及び第１の下流プローブを含む第１組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブが標的核酸配列の部分と実質的に相補的な配列を有し且つ第１の上流プローブの３’末端が第１の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズするものである過剰の前記第１組のオリゴヌクレオチドに暴露し、ここにおいて第１の下流プローブの５’エンドを改変させて連結インコンピーテント不在修正（ligation incompetent absent correction）とし、これにより第１組のオリゴヌクレオチドを任意に存在する標的核酸配列とハイブリダイズさせ、（ｂ）実質的に下流プローブが標的とハイブリダイズするときにのみ下流プローブの５’エンドに該５’エンドのエキソヌクレオリチック分解を含む修正を施して、この５’エンドを連結コンピーテントにし、（ｃ）修正した下流プローブを上流プローブに連結して連結産物を生成し、（ｄ）修正及び連結段階がどの程度生起するかを試料中の標的核酸の尺度として決定する段階を包含する。下流プローブの５’エンドを連結インコンピーテントにするための手段は一般的に２種に分類される。第１番目では、非リン酸化５’末端により連結インコンピーテントエンドを得、末端ヌクレオシドの開裂により前記連結インコンピーテントエンドを修正して、前記下流プローブ上に新しい５’リン酸化末端を生成する。第２番目では、ハイブリダイズする相手の標的配列とは非対合のヌクレオチド塩基を少なくとも１個前記５’エンドに含んでいるプローブ配列を選択して連結インコンピーテントエンドを得る。この改変を非対合ヌクレオチドの開裂により修正して、前記下流プローブ上に新しい５’リン酸化末端を生成する。このような非対合ヌクレオチド塩基は直接５’末端にあってもよいし、内側、即ち５’末端から１〜約５残基内側にあってもよい。非対合塩基の修正に際して、その非対合に隣接する３’側の対合塩基も開裂されることが判明した。ある実施態様では、５’エンドの分解は、上流プローブの３’エンドが当接する、即ち隣接する点で停止される。他の実施態様では、分解はこの点を超えて継続し、上流プローブもまた伸長して、新たに生成された修正された下流プローブの５’リン酸化末端と当接する。この開裂／伸長活性は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するある種のポリメラーゼにより十分に発揮されるが、これら２つのプロセスは異なる試薬により実施してもよい。試料中の標的の存在及び／又は量に依存する連結事象は、例えばそのより大きい分子量によりもしくは、区別的に標識したプローブを結合して二重標識分子とすることにより連結産物をアッセイするか、又は例えば蛍光偏光もしくは蛍光消光により修正５’エンドからの開裂断片の離脱を監視することにより決定され得る。第２の上流プローブ及び第２の下流プローブを含む第２組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブがそれぞれ第１の下流プローブ及び第１の上流プローブと実質的に相補的な（従って標的配列の相補体（complement）と相補的な）配列を有し、且つ第２の上流プローブの３’末端が第２の下流プローブの５’ 末端に近接してハイブリダイズする、過剰の前記第２組のオリゴヌクレオチドを含ませることにより試料中の標的配列の量を検出前に増加させることが好ましい。このような場合、増幅は、ハイブリダイゼーション、修正及び連結の各段階（ａ−ｃ）を数回繰り返すことにより実施される。一般に１０〜約５０サイクル繰り返す。増幅の変形では、第２の下流プローブが更に該下流プローブを連結インコンピーテントにする５’改変を有してもよいが、必要はない。５’改変を有する場合、改変は第１の下流プローブの場合と同一であってもよいし、異なってもよい。修正、連結及び検出は前述したのと同一である。本発明の他の態様は、前述の改変プローブを含む組成物を提供する。前記組成物は、（ａ）第１の上流プローブ及び第１の下流プローブを含む第１組のオリゴヌクレオチドであって、ここでその両プローブが標的核酸配列の部分と実質的に相補的な配列を有し、且つ第１の上流プローブの３’末端が第１の下流プローブの５ ’末端に近接してハイブリダイズする、前記第１組のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）第２の上流プローブ及び第２の下流プローブを含む第２組のオリゴヌクレオチドであって、ここでその両プローブがそれぞれ第１の下流プローブ及び第１の上流プローブと実質的に相補的な配列を有し、且つ第２の上流プローブの３ ’末端が第２の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズする、前記第２組のオリゴヌクレオチドとを含み、ここで、第１又は第２の下流プローブの少なくとも一方の５’エンドを改変して連結インコンピーテント不在修正とすることを特徴とする。本発明の他の態様は、標的核酸の検出及び／又は、標的非依存性増幅のない又はそのような増幅を低減させた増幅のために使用できる前記改変プローブを含むキットを提供する。このようなキットは、（ａ）上流プローブ及び下流プローブを含む１組のオリゴヌクレオチドであって、ここでその両プローブが標的核酸配列の部分と実質的に相補的な配列を有し、且つ第１の上流プローブの３’末端が第１の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズし、前記下流プローブの５’エンドを改変して連結インコンピーテント不在修正とする、前記１組のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）連結インコンピーテントな下流プローブを標的依存的に修正して下流プローブを連結可能とし、且つ上流及び下流プローブに連結コンピーテントとするための１種以上の修正試薬と、（ｃ）修正された下流プローブを上流プローブに連結するための連結試薬とを１個以上の適切な容器内に含んでいる。修正試薬は、重複プローブの場合には１種の開裂剤を含んでいてもよいし、開裂剤及び伸長剤を含んでいてもよい。修正のために２つの機能が必要であれば、２種の異なる試薬を使用してもよいが、重合活性及び５’→３’エキソヌクレオリチック活性の両方を有するポリメラーゼを使用することが好ましい。増幅方法で使用する場合にはポリメラーゼが熱安定性であることが好ましい。図面の簡単な説明図面は一般に、本発明の種々の好ましい実施態様を示している。各図面の項ａは下流プローブの５’エンドに好ましい改変を含んでいる２組のプローブを示し、項ｂは標的ＤＮＡ鎖とハイブリダイズした第１組のプローブを示し、項ｃは、改変プローブの修正後ではあるが、プローブ１とプローブ２との連結前の第１の２個のプローブを示している。項ａは両方の下流プローブの改変を示しているが、本発明では一方の下流プローブを改変するだけでよい。各図面の黒四角は一方のラベル又はリポーター基（通常は第１のハプテン）を示し、黒丸は他方のラベル又はリポーター基を示す（これは第２のハプテンであってもよいしなくてもよい）。図１は、下流プローブが連結コンピーテンシー（ligati on competency）に必要な５’ホスフェートの代わりに５’ヒドロキシル末端を有する２組のブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。図２は、各下流プローブが、５’ヒドロキシル末端と、相補的プローブ及び標的と対合しない１個の末端塩基とを有する２組のブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。連結インコンピーテンシー（ligation incompe tency）は、５’ヒドロキシル末端によるだけでなく、末端塩基が非対合であるために弱い鋳型との水素結合により付与される。図３は、各下流プローブが、５’ヒドロキシル末端と、相補的プローブ及び標的と対合しない１個の内部塩基とを有する２組のブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。図２と同様に、標的非依存性連結は、内部非対合のために弱い水素結合及び５’ヒドロキシルの両方により低減する。図４は、５’伸長部を含む下流プローブを有する２組の非ブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。これらの５’伸長部は互いにも又は各標的ともハイブリッド形成し得ない。これらの下流プローブも図示するように５’ヒドロキシル末端を有する。連結インコンピーテンシーは、伸長部により課される立体的制約により及び５’ヒドロキシルにより付与される。図５は、各下流プローブが一塩基の５’伸長部を有し、伸長部同士は相補的であるが、標的とは相補的でない２組の非ブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。これらの下流プローブも図示するように５’ヒドロキシル末端を有する。標的上での連結インコンピーテンシーは、末端非対合のために弱い水素結合により及び５’ヒドロキシルにより付与される。図６は、下流プローブがそれぞれ５’ヒドロキシル末端を有し、この５’末端塩基が相補的プローブ及び標的とは非対合である２組のブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。連結インコンピーテンシーは、末端非対合のために弱い水素結合により及び５’ヒドロキシルにより付与される。図７は、互いに、また標的とも対合する３’伸長部を（上流プローブに）有する２組の非ブラント末端化プローブを用いた核酸増幅技術の図式例である。下流プローブは５’ヒドロキシル末端を有する。連結インコンピーテンシーは５’ヒドロキシルにより付与される。詳細な説明これから以下の概要に従って本発明を詳細に説明する：Ｉ．定義 II．連結インコンピーテント改変及びその修正Ａ．非リン酸化５’末端Ｂ．非対合の塩基、末端及び内部 III．プローブの構造Ａ．ブラントＢ．非ブラント IV．使用方法Ａ．検出方法Ｂ．増幅方法Ｃ．重合非依存性方法Ｖ．検出モードＡ．連結複合体Ｂ．離脱断片 VI．組成物及びキット VII．実施例 VIII．配列表Ｉ．定義本明細書で使用する以下の用語の意味を説明する。 “標的”又は“標的配列”は、その存否を検出するか又は配列が非常に密接に関連し得る他の核酸と区別しようとする核酸を意味する。標的核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、又はこれほど一般的ではないがリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでいる。本発明では、標的は一本鎖として記載する。しかしながら、これは、標的が実際には二本鎖であるが、プローブとのハイブリダイゼーションの前に（ “標的相補体”とも呼ばれる）相補鎖から単に分離した場合を含むものと考えるべきである。二本鎖標的の場合、最初の段階で第２組のプローブを使用して、標的相補体とハイブリダイズすることもできる。一本鎖標的の場合、第２組のプローブは最初のハイブリダイゼーション段階には関与しないが、例えば連結産物とハイブリダイズすることにより以後のハイブリダイゼーション段階に関与する。 “プローブ”は、本発明で使用するオリゴヌクレオチドセグメントを意味する。プローブは、１０〜約１００ヌクレオチド長さ、好ましくは約１５〜３５ヌクレオチド長さを有し、所望の標的に適した規定の塩基配列を有する。プローブは通常ＤＮＡであるが、ＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合組成物であってもよい。本明細書に記載するように、５’エンドで改変されたプローブもある。プローブは天然源から産生してもよいし、合成源から産生してもよい。 “塩基”は、ＤＮＡの場合はピリミジン／プリン化合物のグアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）を指し、ＲＮＡの場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）を指す。“塩基”には、アッセイ条件下で標的とハイブリダイズし得る類似体、誘導体及び改変塩基（例えば３７ＣＦＲ §１．８２２（ｐ）（１）で認識されたもの）も含まれる。特に明記しない限り、“塩基” は更に時折、例えば適切な塩基でギャップを埋めるときには、糖及びホスフェート部分を含む完全ヌクレオチド残基を示すために使用される。塩基は規定通り、ＤＮＡの場合はＡとＴ、ＣとＧが、ＲＮＡの場合はＡとＵ、ＣとＧが対になることが知られている。個々の塩基に関しては、“相補的”とは、前記説明に従って対になる又は“対合する”ことを意味する。従って、Ｇ又はＣと対になるＡは“非対合”又は“非相補的”塩基を示す。しかしながら、オリゴヌクレオチドプローブに関しては、他のプローブ又は標的と“相補的”なプローブは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下で相補的プローブ又は標的とハイブリダイズし得ることを意味する。従って、相補的プローブは、ハイブリッド形成可能領域に対合しない塩基対を有し得る配列を含み得る。但し、この配列はハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることができるものとする。プローブが、標的又は相補的プローブと選択的にハイブリダイズするように十分相補的であることが好ましい。 “終止塩基”は、そこでヌクレオリチックプロセス又は重合プロセスが終了するヌクレオチドを意味する。例えば終止塩基は、その相補的塩基がｄＮＴＰプールに存在しない鋳型塩基として存在し得る。あるいは、終止塩基は、下流プローブのヌクレアーゼ耐性リンケージとして存在し得る。代替の終止塩基を組み合わせて使用することもできる。 “アッセイ条件”は、温度、イオン強度、プローブ濃度等に関するＬＣＲの条件を意味する。これらは一般に当業界では公知である。ＬＣＲは本質的に２つの状態又は条件：アニーリング又はハイブリダイゼーション条件及び変性条件を含む。 “ハイブリダイゼーション条件”は一般に、核生成（nu cleation）及びアニーリングを促進する条件として定義されている。しかしながら、このようなアニーリング及びハイブリダイゼーションがかなり予測されるように幾つかのパラメーター（例えば温度、イオン強度、プローブ長さ及びプローブのＧ：Ｃ含量）に依存することは当業界ではよく知られている。例えば、反応温度を下げれば、アニーリングが促進される。所定組のプローブの融解温度（me lt temperature）（即ちＴｍ）は幾つかの公知の方法のいずれかにより推定され得る。通常、ハイブリダイゼーション条件には、融解温度よりも僅かに低い温度が含まれる。小さなカチオンはホスホジエステル主鎖上の負電荷を遮蔽（shield ）することにより二本鎖の生成を安定化させる傾向にあるので、イオン強度又は “塩”濃度も融解温度に大きく影響する。通常の塩濃度はカチオンの種類及び原子価に依存するが、当業者には容易に理解されよう。同様に、Ｇ：Ｃ含量が多く、プローブ長さが増せば、二本鎖生成が安定化することも知られている。何故ならば、Ａ：Ｔ対が正に２個の水素結合を有するのに対しＧ：Ｃ対は３個の水素結合を有し、またプローブが長くなれば、鎖を保持する水素結合が増すからである。従って、Ｇ：Ｃ含量が多く、プローブ長さが増せば、融解温度を上げることにより“ハイブリダイゼーション条件 ”に大きく影響する。一旦プローブを選択すると、Ｇ：Ｃ含量及び長さが規定され、“ハイブリダイゼーション条件”の内容を正確に決定する際に明示することができる。イオン強度は通常酵素活性のために最適化されているので、変動すべきパラメーターは温度のみで、特定のプローブ組及び系に適した“ハイブリダイゼーション条件”が得られることは当業者には自明である。 “変性条件”は一般に、二本鎖核酸の一本鎖形への解離を促進する条件として定義されている。これらの条件には、高い温度及び／又は低いイオン強度が含まれ、本質的には前述したパラメーターと反対であることが当業界ではよく知られている。 “連結”とは、２個のプローブを共有結合させる任意の方法を包含する一般用語である。好ましい方法は酵素による連結である。本明細書では、“連結コンピーテント”は、酵素リガーゼが連結し得るプローブエンドを意味する。公知の酵素リガーゼの場合、連結コンピーテンシーは、３’ヒドロキシル末端が５’リン酸化末端に隣接して配置されるような核酸セグメントを必要とする。逆に言えば、通常３’ヒドロキシルの欠失、５’ホスフェートの欠失又は近接性欠除のために、“ 連結インコンピーテント”プローブは連結に適したエンドを示さない。連結インコンピーテンシーの多くの例は以下で説明する。連結インコンピーテンシーは、本発明では一時的な状態で、“修正”までの間だけ存在する。従って、連結コンピーテンシーは時として、“連結インコンピーテント不在修正”とも呼ばれる。 “修正”は、まずプローブを連結インコンピーテントにした改変の修復を意味する。特定の修正機構については特定の改変に関連して以下で説明するが、一般的に、１）３’ヒドロキシルの生成もしくは再生；２）５’ホスフェートの生成もしくは再生：又は近接性の生起のうちのひとつ以上に関係し、突出する伸長部を開裂するか又はギャップを埋めることからなる。修正が“標的依存性”である、即ち修正が実質的に標的又は標的等価物の存在下でのみ行われ、他のプローブの存在下では行われないことは本発明の重要な特徴である。“鋳型依存性”は、鋳型が非連結プローブではなく、連結プローブ産物のみである点で“標的依存性 ”と同一である。ハイブリッド形成したプローブを、標的内に含まれる配列情報に依存する適切なエキソヌクレオリチック活性を有する物質により酵素作用で修正することが好ましい。 “ヌクレオリチック活性”とは、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ基質を切り出すか又は分解する酵素の活性を意味する。ヌクレオリチック活性は、エキソヌクレオリチック（エンドから内側に）であってもよいし、エンドヌクレオリチック（内部から）であってもよい。本発明では、ヌクレオリチック活性の種類は重要ではない。但し、ヌクレオリチック活性は標的依存的に改変５’エンドを修正し得るものとする。分かり易くするため、本明細に記載するヌクレオリチック活性は一般に“エキソヌクレオリチック”活性と称するが、これはヌクレオリチック活性を特定の機構に限定するものではない。従って、本明細書で使用する“エキソヌクレオリチック”又は“エキソヌクレアーゼ”という用語は核酸分解を包含し、エンドからの分解であれ内部からの分解であれ、また分解産物がモノマーであれそれより大きな断片であれ、また酵素手段による分解であれ化学的手段による分解であれかまわない。適切なエキソヌクレオリチック活性はエキソヌクレアーゼ酵素内に、即ちあるＤＮＡポリメラーゼと従来の方法で会合した５’−３’エキソヌクレアーゼ活性中に認められ得る。例えば、ＤＮＡ合成依存性の鎖置換５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び５’→３’重合活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｇｅｌｆａｎｄの文献：ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．編，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年）第２章に記載されている。同様の活性は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｓｅｓ（ＭＢＲ）Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ製のＴｈｅｒｍｕｓ起源の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで実証されている。適切なｄＮＴＰの存在下で、これらのＤＮＡポリメラーゼは、標的ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブの３’ヒドロキシル末端から合成を開始し、ＤＮＡ標的鋳型に沿って進行し、進行中に下流のハイブリダイズしたＤＮＡ配列を分解してこれらを置換する。本明細書では便宜的に、プローブは“上流”又は“下流”として示す。２個のプローブが同一の直鎖状核酸の異なる領域とハイブリダイズし、一方のプローブの３’末端が他方のプローブの５’ 末端に向かうときに、鎖がコード化のために“センス”方向を有するかどうかの如何を問わず、前者のプローブを“上流”プローブと呼び、後者のプローブを“ 下流”プローブと呼ぶ。これら２個のオリゴヌクレオチドプローブはまとめて、１組のプローブもしくはオリゴヌクレオチド又は（相補的対とは異なるものとして）“連結可能対”と呼ぶ。各図面の項ａでは、このようなプローブを２組示す。第１組は、プローブ１（“第１の上流プローブ”とも称する）及びプローブ２（“第１の下流プローブ”）からなる。第２組は、プローブ４（“第２の上流プローブ”）及びプローブ３（“第２の下流プローブ”）からなる。状況によっては、１組のプローブは更に４個全てのプローブ又は相対する鎖とハイブリダイズする２個のプローブを示し得る。本明細書では、プローブの“エンド（end）”と“末端（termius）”とは異なる。３’又は５’末端は、それぞれ３’又は５’で示されるヌクレオシド炭素を意味し、従ってオリゴヌクレオチドの末端点を意味する。対照的に、３’又は５ ’“エンド”はより一般的に、それぞれ３’又は５’末端付近の領域を意味する。“エンド”は“末端”を含んでいるが、更に全オリゴヌクレオチドの４分の１以下又は３分の１以下に相当する数個の隣接塩基を含んでいる。しかしながら、“ブラント末端化”という用語は以下で定義する共末端プローブ（coterminal probes）を意味する。１組の上流及び下流プローブが標的とハイブリダイズする場合、これらは互いに“近接”している。“近接”という用語は、末端が約２０ヌクレオチド以内離れて位置し、（１）一方のプローブの３’末端が他方のプローブの５’末端と当接する、即ちプローブが直接隣接している；（２）ハイブリッド形成した上流プローブの３’末端とハイブリッド形成した下流プローブの５’末端との間の塩基を欠失させることにより生じる“ギャップ”がある；（３）下流プローブの５’ エンドが標的の限定領域と相補的でないか又は一部分のみ相補的であるのに対し、上流プローブの３’エンドは同一領域と相補的である状況を包含する。このような２個のプローブが標的とハイブリダイズすると、図４ｂに示すように、下流プローブの５’エンドのこの限定された領域に“重複”が生じる。 “ＷＲＴＰ”という用語は、２個のハイブリッド形成可能なプローブ間の非対合（末端非対合又は内部非対合）を説明する際に使用される“標的に対して”の略字である。ブラント末端化プローブの場合、プローブ１とプローブ３；及び／又はプローブ２とプローブ４の間で非対合が生じ得る。更には、非ブラント末端化プローブは潜在的非対合用の他の領域を有する。５’伸長部非ブラント末端化プローブでは、プローブ２の５’伸長部とプローブ３の５ ’伸長部との間で非対合が生じ得る。３’伸長部非ブラント末端化プローブでは、プローブ１の３’伸長部とプローブ４の３’伸長部との間で非対合が生じ得る。 “ＷＲＴＴ”という用語は、プローブとその標的との間の非対合（末端非対合又は内部非対合）を説明する際に使用される“標的に対して”の略字である。プローブは、ＷＲＴＴ及びＷＲＴＰの非対合を１つ以上含むと考えてもよいし、ＷＲＴＰではなくＷＲＴＴの非対合を含んでいてもよい。本明細書で使用する“ラベル”は、プローブに結合してその存在を信号化又は報告することのできる任意の部分を意味する。ラベルは直接的なもの（例えば化学発光化合物、蛍光化合物又は放射性同位体）であってもよいし、間接的なもの（例えばビオチンもしくは他の配位子又はハプテン）であってもよい。間接ラベルの場合、他の反応を用いて、測定可能なシグナルを生成させる。他の反応には、ハプテンに特異的な結合パートナー及び適切な直接ラベルを含む結合体ラベルとの反応が含まれる。放射性同位体の例は³²Ｐ及びトリチウムであり、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン及びＴｅｘａｓＲｅｄは蛍光ラベルであり、アクリジン及びキノリンは化学発光ラベルの例である。ハプテンの例としては、多くの薬物（例えばジゴキシン、テオフィリン、フェンシクリジン（ＰＣＰ）、サリチレート等）、Ｔ３、ビオチン、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ダンシル、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）；改変ヌクレオチド（例えばブロモウラシル及びＮ−アセチル−７−ヨード−２−フルオレニルアミノ（ＡＩＦ）基の取り込みにより改変した塩基）；及び他の多くのものが挙げられる。各種のラベルの他の多くの例は当業者には公知である。カルバゾール及びアダマンタン由来のハプテンについては実施例で説明する。これらは、１９９１年１２月１７日出願の同時係属中の米国特許出願第８０８，５０８号“Ｈａｐｔｅｎｓ，Ｔｒａｃｅｒｓ，ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｓａｎｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒ３−ｐｈｅｎｙｌ−１−ａｄａｍａｎｔａｎｅａｃｅｔｉｃＡｃｉｄｓ”；及び１９９１年１２月１７日出願の同時係属中の米国特許出願第８０８，８３９号“Ｈａｐｔｅｎｓ，Ｔｒａｃｅｒｓ，ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｓａｎｄＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒＣａｒｂａｚｏｌｅａｎｄＤｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ” に記載されている。ホスホアミダイト試薬を用いてハプテンラベルをオリゴヌクレオチドに付加する方法はＴｈｕｏｎｇ，Ｎ．Ｔ．等のＴｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）、又はＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．等の米国特許出願第０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳ番号Ｐａｔ −Ａｐｐｌ−７−２４６，６８８（１９８８年））に記載されている。 II 連結インコンピーテント改変及びその修正本発明は、連結インコンピーテント不在修正である５’エンドを有する下流プローブを包含する。前述したように、修正は、このエンドを除去、置換又は更に改変させてこれを連結可能にすることであり得る。また修正は同時に上流プローブの変化を包含していてもよい。Ａ．非リン酸化５’末端第１の形態の連結インコンピーテントエンドは、上流プローブの３’ヒドロキシル末端には連結できないが、標的依存的に修正されて連結可能となり得る非リン酸化５’末端である（以後“非リン酸化５’末端”、“非リン酸化５’末端” と称するか又は下流プローブの５’末端に関して“非リン酸化”と記載する）。連結インコンピーテントプローブが標的とハイブリダイズすると、５’末端は非ホスフェート基の除去及びホスフェート基での置換又はホスフェート基の露出により“修正”される。通常、これは、次の隣接ヌクレオチド上に露出された５’ ホスフェート末端を離脱させるエキソヌクレオリチック活性を有する試剤を用いて、５’非ホスフェート基を保有する全ヌクレオチドを除去することにより実施される。除去されたヌクレオチドは通常、それと同等のヌクレオチドを上流プローブの３’末端に付加することにより置換される。従って、５’→３’エキソヌクレオリチック活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、必要な活性のいずれも１種の酵素により発現されるので理想的な修正剤である。標識された置換ヌクレオチドは必要ではないが、下流プローブの５’エンドから開裂させて、対応する上流プローブの３’ エンドで置換するこの修正方法は“ニックトランスレーション”反応に類似している。本質的に、連結インコンピーテントプローブ間の“ニック”は１個以上の塩基下流で翻訳され、このようにして、連結インコンピーテントエンドが修正されて連結コンピーテントになる。しかしながら、全ての実施態様が単なる“ニック”として開始するわけではない。５’非リン酸化エンドは単に、ホスフェートがエキソ環（５’）炭素により核酸鎖の５’末端に結合していないことを意味する。その代わり、その５’炭素は、Ｈ、ＯＨ又は連結用基質として機能し得ない他の化学基に結合し得るが、ハイブリッド形成した下流プローブに由来する“非ホスフェート”基を含むヌクレオチドを除去し及び／又はハイブリッド形成した上流プローブを伸長してポリメラーゼ又はエキソヌクレアーゼの修正活性を目につくほどは妨げない。従って、非ホスフェート基は少なくとも１の分子量を有するべきであるが、ハイブリッド形成したプローブの修正を妨げる三次構造を生じる分子量よりは小さい分子量でなければならない。非ホスフェート基には、前述した特性を有するホスフェート誘導体が含まれ得る。非ホスフェート基を下流プローブの５’末端に直接結合してもよいし、リンカーを介して結合してもよい。又はリンカーだけであってもよい。非ホスフェート基は更に、以下で説明する標識系又はリポート系の一部を含み得る。非ホスフェート基には非制限的ではあるが、以下の群が含まれる：発色団、ハプテン、放射性標識化合物、ペプチド、磁性粒子、炭水化物及びアミノ保有基（例えばＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ）。非ホスフェート基の他の例は−ヒドリル；−ヒドロキシル；−スルフヒドリル（チオール）；炭化水素（例えば−メチル；−アシル；−ハライド、−第一級アミン；−ニトロ及び一環式化合物である。使用できるリンカーには、アルケン、アルキン、アミド、アミン、エステル、エーテル、ケトン、スルフィド、スルホン、スルホキシド及びイミンが含まれる。５’非リン酸化エンドは好ましくはヒドロキシル、メチルもしくはＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｄ末端又は蛍光ラベルもしくは蛍光標識系の成分を含むエンドである。Ｂ．非対合塩基第２の型の連結インコンピーテント５’エンドは下流プローブ内の末端又は内部非対合ＷＲＴＴ、ＷＲＴＰである。“末端”非対合はプローブの正に最後の残基で生じるが、“内部”非対合はエンド付近、通常は５’ 末端から１〜約５〜８塩基内で生じればよい。各種の非対合は１〜約５塩基長さ、更に好ましくは１又は２塩基長さからなり、通常は全て隣接し合っている。５ ’エンドが更に非リン酸化末端を含む特に好ましい実施態様では、このような非対合を有するプローブが連結コンピーテントプローブと同様に効果的に連結しないことが判明した。恐らく、末端非対合又は内部非対合は、エキソヌクレアーゼ活性に適した基質である、水素結合が減少したために“ルーズ”な５’エンドを生じる。末端非対合の一例を図２に示す。図２では、各下流プローブが５’ヒドロキシル末端と、相補的プローブ及び標的と対合しない１個の末端塩基とを有する２組のブラント末端化プローブを図示する。ポリメラーゼ、リガーゼ及び２’−デオキシチミジン５’−トリホスフェート（ｄＴＴＰ）を含むｄＮＴＰプールの存在下では、修正は、連結インコンピーテントな５’ヒドロキシル末端を有する非対合Ｇを下流プローブから除去し、プローブ同士が当接して連結し得るまで上流プローブをｄＴＴＰで伸長させることにより行われる。ポリメラーゼは、上流プローブが下流終止塩基、この場合は標的のＧに達するまで上流プローブを伸長させ下流プローブを分解し続ける。下流プローブの５’ヒドロキシル末端を分解除去したら、ポリメラーゼは、連結コンピーテントな５’ホスフェート末端（“ｐ”で示す）を有する下流プローブ内のＣを出現させる。“ＴＴ”は、上流プローブの伸長に使用されるｄＴＴＰ由来のチミジレート残基を示す。次に、当接し合う２個のプローブ及び５’ホスフェート末端を含むように修正された下流プローブを用いて、２個のプローブを連結することができる。本発明のアッセイ条件下では、重合を含む効果的なＬＣＲ増幅を行うために、非対合塩基の修正は非対合塩基のすぐ下流にある少なくとも１個のハイブリダイズしたヌクレオチドを置換する必要があるように思える。従って、効果的な増幅を起こすには、ｄＮＴＰプールが更に、この置換に必要な塩基を含むべきである。これを図６に示す。図６では、ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰの両方を、効果的な増幅を起こすために使用する必要がある。内部非対合の一例を図３に示す。この図面では、各下流プローブはそれぞれ、５’ヒドロキシル末端と、相補的プローブ及び標的と対合しない１個の内部塩基とを有する。プローブ２の第２のＣはプローブ４及び標的のＴとは相補体になり得ない。同様に、プローブ３の第２のＡはプローブ１及び標的のＧとは相補体になり得ない。これらの内部非対合を５’ヒドロキシル末端と組み合わせると、連結インコンピーテントプローブが得られる。修正は、ポリメラーゼ、リガーゼ、並びに２’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（ｄＡＴＰ）及び２’−デオキシシチジン５’−トリホスフェート（ｄＣＴＰ）を含むｄＮＴＰプールの存在下で行われる。図２に示す同じ機構がここで生じる。一旦プローブ組のプローブが標的とハイブリダイズすると、ポリメラーゼが下流プローブ由来の５’ヒドロキシル末端、内部非対合及び非対合塩基のすぐ下流にあるハイブリダイズした塩基を除去して５’リン酸化末端を出現させる一方で、上流プローブを伸長して修正した下流プローブに当接させ、上流プローブを下流プローブに連結し得る。図３では、３個のＣをプローブ２の５’エンドから除去し、３個のＡをプローブ３から除去する。ほぼ同時に、ＣＡＣを付加してプローブ１を伸長する。プローブ４もＡＣＡを付加して伸長させる。プローブ４では、Ａはプローブ１の伸長用終止塩基として機能する。図示しないが、Ａ又はＣはプローブ１の終止塩基として機能し得る。５’→３’標的依存性エキソヌクレアーゼ活性を有する標的依存性５’→３’ エキソヌクレアーゼ又はポリメラーゼを使用する場合、上流プローブの３’エンドがＷＲＴＴ非対合を含んでいてはいけないし、修正も効果的には生じない。しかしながら、上流プローブの３’エンドはＷＲＴＰと非対合であり得る。しかし、ＤＮＡ結合の逆平行性（antiparallel nature）のために、３’上流プローブと非対合のプローブは実際には、他方のプローブ組の下流プローブの５’エンドである。従って、この非対合は下流プローブの５’非対合と同一であると考える。連結可能対のプローブが重複している場合の１組の非対合連結インコンピーテントエンドを考察する。この場合、下流プローブの５’エンドは標的上で上流プローブの３’エンドと同一の位置を占める必要がある。しかし、５’エンドは非対合なので、上流プローブによって置換され、５’エンドは標的から解離するか又は“ルーズ”な状態になり、エキソヌクレオリチック活性に適した基質が離脱する。各プローブ組の連結可能パートナーに関して定義した重複を、相補的プローブに関して定義する伸長部（以下参照）と混同してはならない。重複する実施態様を図４に示し、以下で説明する。プローブは好ましくは、連結用でない末端（“外側末端”）が連結できず、この連結インコンピーテンシーが修正され得ないように設計されている。これらの望ましくない連結の一例は、上流プローブの５’末端と下流プローブの３’末端との連結である。少なくとも１個のプローブの外側末端は、ハプテン、ビオチン及びフルオレセインを包含する“フック”即ちマーカーでブロックすることができる。以下の実施例では、フック即ちマーカーはアダマンタン由来のハプテン、カルバゾール由来のハプテン、ビオチン由来のハプテン及びフルオレセイン由来のハプテンである。カルバゾール由来のハプテン及びアダマンタン由来のハプテンはそれぞれ、図１〜図４及び図６、図７のプローブの外側末端の黒丸及び黒四角で示す。図５では、これらのブロッキング基はフルオレセイン及びビオチンである。これらのブロッキング基は、更にプローブのその後の検出又は捕捉用ラベルとして作用することにより二重の機能を果たし得る。他の点については以下の実施例で説明する。 III．プローブの構造連結インコンピーテント改変エンドの生成について幾つかの手段を説明したが、プローブ構造に関しては更に変形が考えられることが明白である。従って、連結インコンピーテントなエンドは、幾つかのプローブ構造（例えば以下で説明するブラント末端化プローブ及び非ブラント末端化プローブ）で認められ得る。Ａ．ブラント末端構造 “ブラント末端化プローブ”は、結合に用いられるエンドの末端位置が同一のプローブを示す。即ち、プローブ１の３’エンドはプローブ３の５’エンドと末端位置が同一であり、及び／又はプローブ２の５’エンドはプローブ４の３’エンドと末端位置が同一である。図１〜図３及び図６はブラント末端化プローブの例を示す。一方の側のプローブ（例えばプローブ１、３）がブラント末端で、他方の側のプローブがそうでないこともあると理解するべきであるが、図１及び以下の説明では、両側がブラント末端のプローブであるとする。図１は、下流プローブ（２、３）がヒドロキシル基形態の５’非ホスフェート改変末端を有する２組のブラント末端化プローブを示す。項１ａは、第１組のプローブが第２組と相補的であるような２組のプローブを示し、従って図１ａでは相補的プローブを一線に並べる。簡略化のため、項１ｂでは標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズした第１組のプローブのみを示す。これらのプローブの塩基は各標的と相補的である。項１ｂから項１ｃへの矢印で示すように、修正はポリメラーゼ、リガーゼ及び２’−デオキシチミジン５’−トリホスフェート（ｄＴＴＰ）を含むデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）プールの存在下で実施される。ポリメラーゼは、標的鋳型に含まれる情報を使用して、下流プローブ（２）の連結インコンピーテントヒドロキシルエンドを除去し、上流プローブ（１）を伸長させることにより上流プローブと下流プローブとを当接させて連結させ得る。ポリメラーゼは潜在的に、それが下流終止塩基に達するまで上流プローブを伸長させて、下流プローブを分解し続ける。この場合、この終止塩基は標的のＧに相当する。下流プローブの５’ヒドロキシルエンドを分解除去したら、ポリメラーゼは、連結コンピーテントな５’ホスフェート末端（“ｐ”で示す）を有する下流プローブのＣを出現させる。“ＴＴ”は、上流プローブ伸長のために使用されるｄＴＴＰ由来のチミジレート残基を示す。次いで、２個のプローブが当接し合い、下流プローブが５’ホスフェート末端を含むように修正されると、２個のプローブは連結され得る。連結点を項１ｃの矢印で示す。非対合のないブラント末端の最も簡単な場合、下流プローブの５’末端は非リン酸化していなければならない。図２及び図３の好ましい実施態様に関連して説明したように５’非リン酸化末端は好ましいが、別の状況では不要である。末端又は内部非対合のブラントプローブ構造では、下流プローブの非対合ＷＲＴＴは必要上非対合ＷＲＴＰを示すが、必ずこうなるのはこの状況だけである。前述の如く、５’エンドの非対合塩基の数は１〜５であり、最も好ましくは１又は２であり得る。現在好ましいブラント末端化プローブの変形例は、図２及び図３に示すように５’非リン酸化末端と、末端又は内部非対合ＷＲＴＰ、ＷＲＴＴとを有する下流プローブである。Ｂ．非ブラント構造本発明は更に、非ブラント末端化プローブを包含する。ここでは少なくとも１個の上流プローブが相捕的な下流プローブと同一位置に末端をもたない。２つの可能性がある：（１）３’伸長部（上流プローブ）及び（２）５’伸長部（下流プローブ）。“伸長部”はその連結パートナーよりもむしろプローブの相補体を基準に規定されたものであり、それらは相対する側と同一種でなくても、同一長さでなくてもよい。２組のプローブを使用し、両方の組が同一種（即ち５’又は３’）の“伸長部”を有する場合、伸長部はハイブリッド形成可能で（付着エンドを形成する）あってもよいし、互いにハイブリッド形成不能（非付着エンド）であってもよい。伸長部が互いにハイブリッド形成不能な場合、伸長部の長さは好ましくは１〜約１０塩基であり、更に好ましくは１〜約５塩基であり、最も好ましくは１又は２塩基である。伸長部が互いにハイブリッド形成可能な場合、伸長部の長さは好ましくはより短く、例えば１〜約４塩基であり、更に好ましくは僅かに１又は２塩基である。プローブが３’又は５’伸長部を有する場合で、これらがハイブリッド形成可能であれば、下流プローブが他の任意の型の連結インコンピーテンシーの他に非リン酸化５’末端を有することが好ましい。（１）３’伸長部３’伸長部の場合、第１及び第２の下流プローブは更に、各相補的プローブに対して５’末端又は内部非対合の塩基を有し得る。５’→３’ポリメラーゼを使用する場合、３’伸長部の塩基は標的と相補的でなければならないが、５’伸長部の全ての又は幾つかの塩基は標的と相補的であってもなくてもよい。ハイブリッド形成可能な３’伸長部を有するプローブの一例を図７に示す。図７ａに示すように、伸長部はプローブ１の“Ｔ”及びプローブ４の“Ａ”である。“Ａ”は“Ｔ”と相補的なので、伸長部は互いにハイブリッド形成可能であり、５’エンドが非リン酸化していなければプローブは標的とは関係なく連結し得る。修正は、ポリメラーゼ、リガーゼ、並びに２’−デオキシチミジン５’−トリホスフェート（ｄＴＴＰ）及び２’−デオキシグアノシン５’−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）を含むｄＮＴＰプールの存在下で実施される。ポリメラーゼは下流プローブの５’ヒドロキシルエンドを除去して、利用可能な５’ホスフェート“Ｐ”を出現させる一方で、上流プローブを伸長して修正済下流プローブに当接させて、２個のプローブを連結させ得る。他の実施態様、即ち３’ハイブリッド形成不能伸長部の場合（図示せず）、３ ’伸長部は互いにハイブリッド形成し得ない。互いに相補的でない十分な数の塩基をもたせることにより伸長部を互いにハイブリッド形成不能にすることができる。３’エンドは標的とハイブリッド形成して好ましいポリメラーゼ剤を受容すべきなので、これらの伸長部を互いにハイブリッド形成不能にするということは、近接するハイブリダイズしたプローブ間に必ずギャップがあることを意味する。ギャップが含まれる場合、ギャップは１〜２０塩基長さとなり得る。しかしながら、実際には遥かに短いギャップ、例えば１〜３又は５塩基が好ましい。標的、プローブ及びｄＮＴＰ試薬は、このギャップを埋めて、改変下流プローブの５ ’エンド由来の“修正済”塩基を置換することができるように選択すべきである。（２）５’伸長部５’ハイブリッド形成可能伸長部を有する非ブラントプローブの一例を図５に示す。項５ａに示すように、伸長部はプローブ２の“Ａ”及びプローブ３の“Ｔ ”である。この場合、“Ａ”は“Ｔ”と相補的なので、伸長部は互いにハイブリッド形成可能であるが、いずれも標的のＧ：Ｃ対とは相補的でない。下流プローブ２、３は更に５’ヒドロキシル末端を有する。修正は、ポリメラーゼ、リガーゼ、並びに２ ’−デオキシシチジン５’−トリホスフェート（ｄＣＴＰ）及び２’−デオキシグアノシン５’−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）を含むｄＮＴＰプールを包含する。ポリメラーゼは、標的と非対合の塩基及び非対合末端塩基のすぐ下流の対合塩基と共に、各５’ヒドロキシル末端を除去する。ポリメラーゼは更に、上流プローブ１、４をそれぞれｄＣＴＰ及びｄＧＴＰで伸長して、連結コンピーテントエンドを生成する。他の実施態様、即ち５’ハイブリッド形成不能伸長部の場合、伸長部は互いにハイブリッド形成し得ない。５’伸長部を有する全てのプローブ対に対して、５ ’→３’ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）プールを反応混合物で使用する場合、５’伸長部が標的と相補的でないことが好ましい。そうであれば、修正に必要なｄＮＴＰプールは伸長部と相補的な塩基を含み、ＤＮＡポリメラーゼは標的とは関係なく上流プローブを“エンドポリッシュ（end polish）”し得る。“エンドポリッシング（End polishing）”は、伸長部を、ポリメラーゼが相補的上流プローブを伸長するための鋳型として用いて、５’伸長部で生起し得る。エンドポリッシングは本発明では重要ではないが、５’伸長部の場合をブラントエンドプローブの場合とすることができる。従って、５’伸長部を有する下流プローブを使用する場合、このプローブの５’エンドは以下の特徴のひとつ以上を有するべきである：（１）非リン酸化末端；（２）他方の組のプローブも５’伸長部を備えた下流プローブを含む場合、これらの伸長部は共に特定のアッセイ条件下で互いにハイブリッド形成し得ない；（３）非相補的塩基ＷＲＴＴ。図４を例にとると、図示する５’伸長部（ＧＧＧ）は互いにハイブリッド形成し得ないし標的ともハイブリッド形成し得ない。項４ｂは、プローブ１、２が標的とハイブリダイズすると何が起きるかを示している。５’伸長部は標的とは非対合なので、解離して“ルーズ”になり、エキソヌクレオリチック活性の良好な基質が確立する。修正にはポリメラーゼ、ｄＴＴＰ及びリガーゼを使用する。エキソヌクレオリチック活性は３個のＧ残基及び少なくとも１個のＴ残基を開裂して、５’ホスフェート基を出現させる。ポリメラーゼは少なくとも１個のＴ残基をプローブ１の３’末端に付加する（図面では２個を付加する）が、ｄＣＴＰが提供されていないため鋳型Ｇで終止する。連結は項４ｂの矢印で起きる。図面では相補的プローブ対（プローブ１、３；及びプローブ２、４）は同一型の改変プローブを示すが、２個のプローブ対は異なっていてもよい。例えば、プローブ１、３がブラント末端化プローブ型で、プローブ３、４が異なるブラント末端化プローブ型又は非ブラント末端化プローブ型であってもよいし、その反対になってもよい。例えば、前述したように１種以上の塩基を除去して“終止塩基 ”を提供する及び／又はエンドポリッシングを避けるｄＮＴＰプールを受容する必要があるために、変形は限定される。 IV．５’→３’エキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼ活性を使用する方法本発明の一態様は、ＤＮＡ合成依存性の鎖置換５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び５’→３’重合活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する（Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｉｎＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，編，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年）第２章）。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがこの活性を示すことが判明し、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｓｅｓ（ＭＢＲ）Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ製のＴｈｅｒｍｕｓ起源の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで同様の活性が実証されている。適切なｄＮＴＰの存在下で、これらのＤＮＡポリメラーゼは、標的ＤＮΛとハイブリダイズしたプローブの３’ヒドロキシル末端から合成を開始し、ＤＮＡ標的鋳型に沿って進行し、この過程で下流のハイブリダイズしたＤＮΛ配列を分解してこれらを置換する。本発明では、下流ＤＮＡは下流プローブである。Ａ．検出方法本発明の方法を標的核酸の簡単な検出法として又は増幅技術として使用することができる。僅か２個のプローブ（１組）を検出するために、５’エンドで改変された下流プローブを使用する必要がある。標的の存在下で、改変を前述した方法で修正し、プローブを連結する。連結事象を開示した方法のいずれかにより、標的の存在の尺度として監視することができる。検出技術は、例えばヨーロッパ特許第１８５４９４号及びヨーロッパ特許第２４６８６４号に開示された技術と同様であるが、標的非依存性連結減少という改善点が見られる。ハイブリダイゼーション、修正及び連結の段階は、増幅方法のところで説明する段階と同一であるが、１組のプローブだけで実施する必要がある。反復（cyclin g）は不要である。Ｂ．増幅方法しかしながら、本発明は、標的配列の増幅を含む方法（例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））での使用に最適である。増幅により感度が改善され、遥かに低レベルの標的ＤＮＡの検出が可能となる。線形増幅（Linear amplification）は、たった１つのプローブ組で反復することにより実施可能であるが、指数増幅は互いに相補的な２つのプローブ組を使用する。ＬＣＲに適用されているように、連結インコンピーテント不在修正である５’エンドを含む下流プローブを使用する。この改変はプローブの標的非依存性連結を妨げる。更には、標的核酸配列の存在下では、近接ＬＣＲプローブはハイブリダイズするが、連結し得ない。標的ＤＮＡ内に含まれる配列情報を、連結インコンピーテントエンドの修正用鋳型として使用する。合成依存性の鎖置換５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して上流プローブを伸長し、標的核酸を鋳型として用いて下流プローブを加水分解してもよい。ＤＮＡ合成に必要な４個からなる１組のｄＮＴＰを使用して、相補的ｄＮＴＰが存在しない標的の鋳型塩基に遭遇すると合成（及び加水分解）が終了するように上流プローブの伸長（及び従って下流プローブの加水分解）を制御することができる。得られた下流プローブは、伸長した上流プローブの３’ヒドロキシル末端に隣接する５’ホスフェートを有する。従って、隣接し合うプローブはＤＮＡリガーゼによる連結のための適切な基質となる。次の段階で連結したプローブを分離すると、第１組と相補的な第２組のプローブのための“標的”になる。好ましくは第２組も本発明の改変プローブを利用する。第２のプローブ組でハイブリダイゼーション、（任意の修正）及び連結のプロセスを繰り返す。一般に、好ましい増幅方法は、（ａ）連結インコンピーテント改変プローブを標的とハイブリダイズし、（ｂ）改変を標的依存的に修正してプローブを連結可能にし、（ｃ）修正したプローブをパートナーに連結して、融合又は連結産物を生成し、（ｄ）標的から融合産物を解離し、各プローブ組について何度もハイブリダイゼーション、修正及び連結の段階を繰り返して、所望の標的配列を増幅するという段階の反復からなる。標的が二本鎖の場合、前記段階は更に、第２組のプローブ３、４を用いて標的相補体に適用される。しかし、二本鎖標的が存在しなくても、プローブ３、４を使用して連結したプローブ１、２を増幅及び／又は検出することが好ましい。同様に、連結したプローブ３、４は、更なる検出のためにプローブ１、２の標的として機能する。従って、過剰のプローブ１、２、３、４及び反復を含むアッセイ条件を用いて、標的配列の増幅を実施することができる。１．プローブと標的とのハイブリダイゼーションプローブとその標的（及び場合によっては標的相補体）とのハイブリダイゼーションは、従来技術で、例えばヨーロッパ特許第３２０，３０８号及びヨーロッパ特許第４３９，１８２号で適切に説明されている。プローブ長さ、プローブ濃度及び条件の厳密性は全て、ハイブリダイゼーションの程度及び速度に影響する。プローブが所望の特異性を提供する、即ち試料中のランダム配列とハイブリッド形成しないようにするのに十分な長さを有することが好ましい。通常、約１０〜１００塩基のプローブがこの目的を果たす。現在好ましいのは、長さが約１５〜約４０ヌクレオチド、通常約２０ヌクレオチドのプローブである。プローブは化学量論的に反応すると予想されるので、プローブをほぼ等モル濃度で加えることが好ましい。更に好ましくは、各プローブは、約５ナノモル（ｎＭ）〜約９０ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲の濃度で存在する。各反応で使用するプローブの最適量は、実施すべきサイクルの回数によっても変動する。最適濃度は当業者により決定され得る。条件の厳密性は一般に、温度、溶媒及び他のパラメーターに依存することが当業者には公知である。恐らく、これらのパラメーターのうちで最も簡単に制御されるのは温度であり、従って、温度は一般にＬＣＲの性能で変動する反応パラメーターである。ハイブリダイゼーションのための温度は通常、使用するプローブの融解温度より僅かに（即ち１〜約１０℃）低くなるように選択する。本発明を実施するために必要なハイブリダイゼーション条件は、通常のＬＣＲの条件と同様であり、当業者により決定され得る。２．プローブの修正修正機構は先に説明しており、ここでは方法の段階として適用する。好ましい修正試薬は、５’→３’エキソヌクレアーゼ及び重合活性の両方を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（“標的依存性ＤＮＡポリメラーゼ”とも称する）である。修正試薬には、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）及び他のＴｈｅｒｍｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。ＬＣＲに必要な高温反復に耐え得るポリメラーゼを使用することが好ましい。ポリメラーゼは熱安定でなければ、通常各ＬＣＲサイクルで再度添加しなければならない。ポリメラーゼは天然であっても非天然（例えば組換えにより産生）であってもよい。本発明を実施するために使用できるポリメラーゼとしては、重合活性を有するポリメラーゼ及びポリメラーゼ断片が含まれ、標的依存性エキソヌクレアーゼ活性はあってもなくてもよい。別のエキソヌクレオリチック剤も使用するならば、ポリメラーゼは標的依存性エキソヌクレアーゼ活性をもつ必要はない。このような修正は、標的の塩基と相補的なｄＮＴＰの反応混合物の存在を必要とする。ｄＮＴＰは、多数の会社［例えばＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）及びＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）］から市販されている。前述したように、１組のｄＮＴＰを使用して、終止塩基が合成／分解反応を所定の終止点に限定するようにしてもよい。ヌクレアーゼ（例えば前記エキソヌクレアーゼ又は、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ）による加水分解に耐える結合を、代替法として又は前記方法と組み合わせて下流プローブで使用することができる。ヌクレアーゼ耐性結合の例はホスホチオエート結合及びメチルホスホネート結合である。これらの型の結合は、これらのプローブの合成中に、分解及び合成を終結する必要のある地点でＬＣＲプローブ内に組み込むことができ、かくして、ｄＮＴＰプールを制限せずに又はｄＮＴＰプールを制限した上に修正を制限することができる。３．修正したプローブの連結酵素連結は、修正したプローブを共有結合する好ましい方法である。しかしながら、連結は、２個のプローブを共有結合するための任意の方法（例えばヨーロッパ特許出願公開第３２４，６１６号に記載の光−連結（photo-ligation））を用いて実施され得る。好ましい酵素連結段階の条件及び試薬は当業者には公知であり、“背景”のところに記載した参考文献に開示されている。連結試薬の例には、原核リガーゼ［例えば大腸菌リガーゼ、Ｔ４リガーゼ、ヨーロッパ特許第３２０，３０８号に教示されているＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ（例えばＡＴＣＣ２７６３４）、及び（例えばＷＯ９１／１７２３９号に開示されているような）Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓリガーゼ］が含まれる。最後の２種のリガーゼはＬＣＲの熱サイクル中にリガーゼ活性を保持するのでこれらが好ましい。熱安定性リガーゼがなければ、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを添加しなければならない。真核リガーゼ（例えばＲａｂｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０６３７−１０６４７（１９８６年）に記載されているＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａのＤＮＡリガーゼ）も有用である。融合プローブは一旦連結すると、標的から解離する。従来のＬＣＲと同様に、プロセスを数サイクル繰り返す。反復するサイクルの回数は１〜約１００回であり、好ましくは約１５〜７０回であり得る。増幅後、公知の方法又は開示された方法のいずれかを用いて連結事象を決定する。本発明の他の態様は、前述の改変プローブを用いて標的の核酸配列の違いを検出する方法を提供する。この方法を使用して突然変異（例えば点変異、挿入、欠失及びフレームシフト）をスクリーニングし；例えば遺伝子マッピングに有用なＤＮＡ多型現象を同定し；更には微生物（例えば細菌）の薬物耐性株及び薬物感受性株を最初に培養せずともこれらの間の相違を確認することができる。例えば、非対合塩基（ＷＲＴＴ）を有するプローブ及び非対合塩基と相補的な塩基の欠如したｄＮＴＰプールを用いて欠失を実施する。一例としては、ＣｈｌａｍｙｄｉａＭＯＭＰ３５４−４０１配列の３７８位のＴ−Ａ塩基対（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．−Ｘ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１８：１０６１（１９９０年））（表１参照）をＣ−Ｇ塩基対に改変すると、プローブ３５４．１、３５４．２Ｂ、３５４．３Ｂ及び３５４．４を用いる修正反応を実施例２に記載の方法で実施することはできない。反応にはｄＴＴＰしか存在しないので、プローブ３５４．１（第１の上流プローブ）の伸長は妨げられる。従って、当然プローブ３５４．２Ｂ（第１の下流プローブ）の連結インコンピーテントな５’エンドを修正することができなくなる。更には、プローブ３５４．４（第２の上流プローブ）の伸長の有効性は、このプローブの５’エンドが標的と非対合であるために弱まる。その結果、点変異を含む標的配列の増幅は排除されるか大幅に減少すべきである。結果的に、使用するプローブの型によって、点変異の位置が変動し得る。例えば、末端非対合の型の手順は前述した非対合の他に少なくとも１個の対になった塩基の置換を必要とするように思えるので、これを使用して３７８位又は３７９位の塩基の違いを検出することができる。ＷＯ９２／０２６３８号には、Ｔａｑポリメラーゼによるオリゴヌクレオチドの重合非依存性開裂が可能であると記載されている。本発明は、この活性を用いて、重合させずに連結プローブを検出する方法を提供する。この方法は、標的とハイブリッド形成し得ない５’伸長部を有する図４と同様のプローブを用いて、“ルーズな”重複エンドを生成する。これらのプローブは５’非リン酸化末端を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本方法によれば、プローブは、標的依存性エキソヌクレアーゼ（又は標的依存性エキソヌクレアーゼを有するポリメラーゼ）が重複を除去し、ハイブリダイズしたプローブが隣接して連結が生起し得るように設計されている。増幅は、標的相補体とハイブリダイズしたときに重複を生じ得る第２組のプローブを加えて実施され得る。前述のハイブリダイゼーション、修正及び連結の段階は、過剰な４個全てのプローブの存在下で実施されるが、ｄＮＴＰプールは使用しない。単純エキソヌクレアーゼを使用してもよい。前述したように、増幅は、ハイブリッド形成し連結したプローブを標的又は標的相補体から分離する他の段階を含み、連結したプローブはそれぞれ、他のハイブリダイゼーション、修正及び連結のサイクルの標的相補体又は標的自体として機能する。Ｖ．検出法修正及び連結の後に、公知の方法を用いてＬＣＲ反応産物を検出することができる。例えば、連結産物の存在又は量を決定することにより連結事象を監視することができる。連結産物は個々のプローブよりも長いので、この決定は分子量を基準にして実施され得る。プローブを標識せずとも、正しい長さ又は分子量の染色バンドは連結事象及び標的の存在を示し得る。あるいは、一つの組のプローブの一方又は両方を、ほとんどの公知の技術を用いて標識することができる。例えば、ＬＣＲプローブは、（例えば米国特許第４，９４８，８８２号に開示されているリンカーアーム技術を用いる）合成方法の一部としてか、プローブの合成中に付加する反応性基（例えばＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ II^TM，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を手動で用いるか、又はプローブの合成後に酵素で処理して標識することができる。ある好ましい実施態様では、相補的なプローブ１、３はある種のラベル（例えばプローブ１の５’エンド及びプローブ３の３’エンド）を用いて合成し、相補的なプローブ２、４は図面に示すように、第２の異なるラベル（例えばプローブ２の３’ エンド及びプローブ４の５’エンド）を用いて合成する。従って、非連結相補的プローブは一方の型のラベルしかもたないのに対して、連結産物は両方の型のラベルを有する。次いで、第１のラベルを固相で捕捉し、固相を溶液から分離し、固相と会合した第２のラベルを検出することにより、増幅ＬＣＲ反応産物を検出することができる。反応中に生成した不完全産物（例えば個々の非連結プローブ又は相補的プローブ二本鎖）では固相の捕捉及びラベル検出の一方又は両方が不可能である。代替の標識方法は、修正のために使用されるｄＮＴＰ内にラベルを組み込む。このような標識は一般に従来の有機化学の分野である。リンカー又はスペーサーを使用してもよいが、必須ではない。改変ｄＮＴＰがその相補体に対向して標的鎖上に組み込まれることだけが重要である。他の検出代替例では、連結事象は、下流ＤＮＡ配列のヌクレオリチック分解を調べることにより監視される。前述したように、このヌクレオリチック活性により、モノ、ジ及びこれよりも大きいヌクレオチド断片が離脱する。従って、本発明を使用し、このように離脱した断片を検出することによっても標的の存在を検出することができる。幾つかの方法が使用され得る。これは、例えば下流プローブの５’エンドを検出可能な化学基で標識することにより達成され得る。離脱した断片は、分子量がプローブよりも遥かに小さく、幾つかの検出方法（例えばゲル電気泳動又はクロマトグラフィー技術）のいずれかを用いて容易に識別できねばならない。一般に、可能であれば均質な検出系を使用することが好ましい。蛍光ラベルを開裂した断片に付着させれば連結事象を均質に検出することができる。このようなラベルのスピン特性は開裂状態と非開裂状態とでは十分に異なり、蛍光偏光による検出が可能となる。これは均質な検出方法であるだけでなく、中間段階で増幅反応の進行を監視するために使用することもできる。蛍光偏光による開裂断片の検出を示す特定例については実施例６で説明する。第２のホモジニアス法は、蛍光“ドナー”を終止塩基の３’位で下流プローブに結合し、適切な消光剤又は阻止剤化合物を開裂領域の５’エンドに結合することからなる。もちろん、蛍光剤と消光剤とが逆向きであってもよい。いずれの向きでも、蛍光は、修正されるまで未反応のプローブで消光又は阻止される。５’ 断片をヌクレオリチック活性で開裂すると、消光剤及び蛍光剤は分離して、蛍光を観察することができる。イムノアッセイ技術としての蛍光消光は当業界でよく知られ、例えば米国特許第４，１７４，３８４号に記載されている。蛍光剤／消光剤対の例には以下の化合物が含まれる：ａ）フルオレセイン（イソチオシアネート又は他の誘導体）と、以下の消光剤：スルホローダミン１０１、塩化スルホニル（ＴｅｘａｓＲｅｄ）；スクシンイミジル１−ピレンブチレート；テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；エオシン−５−イソチオシアネート（ＥＩＴＣ）；エリトロシン−５−イソチオシアネートのいずれか；ｂ）ＴｅｘａｓＲｅｄとマラカイトグリーンイソチオシアネート；及びｃ）７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルと、４−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＡＢＣＹＬＮＨＳ−エステル）又は４−ジメチルアミノアゾベンゼンスルホニルクロライド（ダブシルクロライド）。これらの及び他の蛍光剤／消光剤対は市販品又は文献に記載されたものを容易に入手することができる。 VI．組成物及びキット本発明の他の態様は、本明細書に記載した方法を実施するのに有用な本明細書に記載の改変プローブを含む物質の組成物を提供する。例えば、そのような組成物は、少なくとも一方の下流プローブが５’エンドで改変している１組又は２組のプローブを含み得る。本発明の方法で使用する試薬は診断キットに収納され得る。このキットは好ましくは標識した改変プローブを含んでいる。プローブが標識されていない場合、標識試薬をキットに加えることもできる。キットは更に、他の適切に収納された、増幅に必要な試薬／材料（例えば緩衝液；リガーゼ；ｄＮＴＰ；ポリメラーゼ活性及びエキソヌクレアーゼ活性の両方を含むＤＮＡポリメラーゼ、又はポリメラーゼ試薬とエキソヌクレアーゼ試薬とを組み合わせたもの）を含んでいてもよい。検出分析のために、キットは更に例えば酵素及び固相抽出剤を含み得る。キットが、アッセイ実施のための説明書を含んでいることが好ましい。 VII．実施例本発明を実施例により更に詳しく説明する。実施例は本発明を例示するものであって、何等限定するものではない。以下の実施例では、ポリメラーゼの量を製造業者（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）が規定した単位で表す。リガーゼ酵素の単位は本明細書に規定する通りであり、９５％精製ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼ１ｍｇは約１×１０⁸単位の比活性を有する。これは正確には規格化されておらず、２０％ほど変動し得るが、当業者により容易に最適化される。実施例１以下で２組のプローブを用いた増幅を例示する。各組のプローブは、３塩基からなる５’伸長部と５’ヒドロキシル末端とを含む下流プローブを有する。第１及び第２の下流プローブの５’伸長部は互いにハイブリッド形成し得ないし、各標識ともハイブリッド形成し得ない。（図４と同様）。Ｃｏｙサーモサイクラーにて、８５℃で３０秒間のインキュベーション及び５５℃で４０秒間のインキュベーションからなるＬＣＲを７５サイクル実施した。ヒト胎盤ＤＮＡ（陰性対照）１０μｇ、又は種々の希釈度のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ陽性ＭｃＣｏｙ細胞溶解物を含むヒト胎盤ＤＮＡ（陽性対照）１０μｇを用いて反応を生起した。１０^-2希釈度のＭｃＣｏｙ溶解物は、約１０⁴個のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓＤＮＡゲノム等価物を含んでいる。使用したＬＣＲプローブを以下の表１に示す。これらのプローブは、（Ｚｈａｎｇ，Ｙ． −Ｘ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１８：１０６１（１９９０年）に開示されている）ＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＭＯＭＰＩ遺伝子内のマップ位置３５４−４０１に特異的である。５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１μＭｄＴＴＰ、表１に示す各オリゴヌクレオチド分子（３５４．１，３５４．２Ａ，３５４．３Ａ，３５４．４）１×１０¹²個、１単位のＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、及び５０００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を生起した。最終反応容量は５０μｌであった。増幅後、反応物をＩＭｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅産物を、ＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）自動化イムノアッセイ系を用いて実施されるサンドイッチイムノアッセイにより検出した。検出は以下の方法で実施した。表中の“Ｃａｒｂ．”はカルバゾール由来のハプテンを示し、“Ａｄａｍ．”はアダマンタン由来のハプテンを示す。先に説明した種々のラベルでのオリゴヌクレオチドの標識にはこれらのハプテンを使用した。従って、連結オリゴヌクレオチドは、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）技術を用いたＩＭｘ（登録商標）機器（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）による検出のために、一方の末端にカルバゾールを有し、他方の末端にアダマンタンを有する。アッセイ手順は、市販のα−フェトプロテインアッセイで使用されている手順と同様であり、以下の手順を適応する：（１）抗α−フェトプロテイン抗体被覆微粒子を抗カルバゾール抗体被覆微粒子で置換し；（２）抗α−フェトプロテイン抗体：アルカリ性ホスファターゼの結合体を抗−３−フェニル−１−アダマンタン酢酸抗体：アルカリ性ホスファターゼの結合体で置換する。ＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡアッセイの手順はヨーロッパ特許出願公開第４３９，１８２号（上掲）に更に詳しく記載されている。手短に言えば、手順は以下の通りである。ＬＣＲで増幅した１００μｌの試料を試料ウェルにピペットで加える。次いで、この試料３０μｌをインキュベーションウェルにピペットで加え、抗カルバゾール被覆微粒子をウェルに加える。適当な期間インキュベートすると、抗カルバゾールとカルバゾールエンドを有する核酸配列とからなる複合体が形成される。インキュベーション後に、この混合物をＩＭｘ（登録商標）反応セルのガラス繊維捕捉マトリックス上にピペットで加え、アルカリ性ホスファターゼに結合した抗アダマンタンを加える。これにより微粒子ーオリゴヌクレオチドー酵素複合体が得られる。この複合体はガラス繊維捕捉マトリックスの表面上に滞留する。洗浄過程で過剰試薬を除去した後に（この手順中は常にガラス繊維捕捉マトリックス下方のブロッターが試薬溶液を吸収する。そうでなければ試薬溶液がガラス繊維捕捉マトリックスから溢出する）、ガラス繊維捕捉マトリックスを４− メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）で処理する。表面結合酵素は非蛍光性（nonfluorogenic）ＭＵＰを、蛍光の測定が可能な４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）に変換する。以下の実施例で示す数値は、このプロセスの速度値（カウント数／秒／秒：ｃｐｓｓ）である。連結プローブの量は、この速度値に直接関係する。標識オリゴヌクレオチドのこのＭＥＩＡ読み取りの概念は、１９９０年３月７日公開のＬａｆｆｌｅｒ，Ｔ．Ｇ．等によるヨーロッパ特許出願公開第３５７，０１１号“ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ”に記載されている。２回のアッセイを実施した。平均結果を以下に示す：標的 IMx（登録商標）速度 0 11.23±1 10^-3希釈度 1139.34±100 10^-4希釈度 359.99±21 10^-5希釈度 36.88±9 前記結果は、標的配列の量が増すと、連結プローブの数も増すことを示している。実施例２以下の標的増幅は、下流プローブが５’ヒドロキシル末端を有する２組のブラント末端化プローブの使用を例示している。Ｃｏｙサーモサイクラーにて、８５℃で３０秒間のインキュベーション及び５５℃で４０秒間のインキュベーションからなるＬＣＲを１００サイクル実施した。ヒト胎盤ＤＮＡ（陰性対照）１μｇ、又は種々の希釈度のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ陽性ＭｃＣｏｙ細胞溶解物を含むヒト胎盤ＤＮＡ（陽性対照）１μｇを用いて反応を生起した。使用したＬＣＲオリゴヌクレオチドは前記実施例１の表１に示した通りである。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＭＯＭＰＩ遺伝子内のマップ位置３５４−４０１に特異的である。５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１μＭｄＴＴＰ、表１に示す各オリゴヌクレオチド分子（３５４．１，３５４．２Ｂ，３５４．３Ｂ，３５４．４）１×１０¹² 個、１単位のＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ、及び５０００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を生起した。最終反応容量は５０μｌであった。増幅後、反応物を１Ｍｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅産物を、実施例１に記載したようにＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）自動化イムノアッセイ系を用いて実施されるサンドイッチイムノアッセイにより検出した。３回のアッセイを実施した。平均結果を以下に示す：標的 IMx（登録商標）速度 0 17.18±3 10^-2希釈度 794.83±130 10^-3希釈度 81.80±23実施例３２組のブラント末端化プローブを用いた増幅を以下で説明する。各下流プローブは５’ヒドロキシル末端を有し、一塩基末端が非対合（ＷＲＴＴ、ＷＲＴＰ）である。Ｃｏｙサーモサイクラーにて、８５℃で３０秒間のインキュベーション及び５５℃で４０秒間のインキュベーションからなるＬＣＲを７０サイクル実施した。ヒト胎盤ＤＮＡ（陰性対照）１μｇ、又は１０^-4希釈度のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ陽性ＭｃＣｏｙ細胞溶解物を含むヒト胎盤ＤＮＡ（陽性対照）１μｇを用いて反応を生起した。使用したＬＣＲオリゴヌクレオチドは前記実施例１の表１に記載する通りである。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＭＯＭＰＩ遺伝子内のマップ位置３５４−４０１に特異的である。５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１μＭｄＴＴＰ、表１に示す各オリゴヌクレオチド分子（３５４．１，３５４．２Ｃ，３５４．３Ｃ，３５４．４）１× １０¹²個、１単位のＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ、及び５０００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を生起した。最終反応容量は５０μｌであった。増幅後、反応物を１Ｍｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅産物を、実施例１に記載したようにＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）自動化イムノアッセイ系を用いるサンドイッチイムノアッセイにより検出した。２回のアッセイを実施した。平均結果を以下に示す：標的 IMx（登録商標）速度 0 11.18±1 10^-4希釈度 1648.87±120実施例４以下の増幅では、実施例３で使用したものと同一フォーマットではあるが、核酸配列の異なるブラント末端化プローブを使用した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）にて、８５℃で３０秒間のインキュベーション及び５５℃で２５秒間のインキュベーションからなるＬＣＲを４０、５０又は６０サイクル実施した。ヒト胎盤ＤＮＡ（陰性対照）１μｇ、又は１０²個のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体を含むヒト胎盤ＤＮＡ（陽性対照）１μｇを用いて反応を生起した。使用したＬＣＲオリゴヌクレオチドは前記実施例１の表１に示す通りである。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＭＯＭＰＩ遺伝子内のマップ位置２７０−３１５に特異的である。５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１ μＭｄＣＴＰ、表１に示す各オリゴヌクレオチド分子（２７０．１，２７０．２，２７０．３，２７０．４）１×１０¹²個、２単位のＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ、及び５０００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を生起した。最終反応容量は５０μｌであった。増幅後、反応物を１Ｍｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅産物を、実施例１に記載したようにＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）自動化イムノアッセイ系を用いて実施されるサンドイッチイムノアッセイにより検出した。２回のアッセイを実施した。平均結果を以下に示す：実施例５以下の実施例では、各下流プローブが５’ヒドロキシル末端と１個の塩基からなる５’伸長部とを有する２組のプローブを使用した。これらの伸長部は互いにハイブリッド形成し得るが、各標的とはハイブリッド形成し得ない。これらのプローブを使用して、血清試料中でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に特異な配列を検出した。本実施例でプローブとして使用したＨＢＶ特異核酸配列をＯｎｏＹ．等の方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１１，１７４７−１７５７（１９８３年））に従ってマッピングした。特に明記しない限り、配列は５’から３ ’の方向（左から右）に記載する。“Ｆ”はラベルのフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ異性体、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．）を示し、“Ｂ”はビオチン分子（Ｂｉｏｔｉｎ−ｘｘ−ＮＨＳエステル、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ）を示す。プローブ配列は、ＨＢＶ亜型ＡＤＷの塩基６６６〜塩基７０９である。ＨＢＶ陰性血清（陰性対照）、又は１．４×１０⁵個もしくは１．０×１０³個のＨＢＶゲノムを含む血清を用いて反応を生起した。血清試料をプロティナーゼＫ（５０℃、３時間）で処理し、１００℃で１５分間加熱した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーモサイクラーにて、８５℃で３０秒間のインキュベーション及び５０℃で４０秒間のインキュベーションからなる変形ＬＣＲを５５サイクル実施した。５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、それぞれ１μＭのｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、各オリゴヌクレオチド分子（６６６：１，６６６：２，６６６：３，６６６：４）１ ×１０¹²個、２単位のＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ、及び５０００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を生起した。最終反応容量は５０μｌであった。増幅後、反応物をＨ₂ Ｏで１：１に希釈し、特異的連結産物を、ＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）自動化イムノアッセイ系でのサンドイッチイムノアッセイにより検出した。連結プローブ検出のためのＭＥＩＡ手順は前記実施例１で使用した手順と同様であった。但し、以下の点が異なる：（１）抗ビオチン抗体被覆微粒子；及び（２）抗フルオレセイン抗体：アルカリ性ホスファターゼの結合体。結果を以下に示す：標的分子 IMx（登録商標）速度 0 13.37 1×10³ 32.19 1.4×10⁵ 331.24実施例６以下の標的増幅は、ハイブリダイズドプローブの離脱（又は放出）断片の検出を例示している。この標的増幅は、５’末端に検出可能なフルオレセイン基を含む一塩基の５’伸長部を有する下流プローブを使用した。これらの伸長部は互いにハイブリッド形成し得ず、各標的ともハイブリッド形成し得ない。Ｃｏｙサーモサイクラーにて、８５℃で３０秒間のインキュベーション及び５５℃で４０秒間のインキュベーションからなるＬＣＲを８５サイクル実施した。ヒト胎盤ＤＮＡ（陰性対照）１μｇ、又は１０^-2希釈度のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｈｏｍａｔｉｓ陽性ＭｃＣｏｙ細胞溶解物を含むヒト胎盤ＤＮＡ（陽性対照）１μｇを用いて反応を生起した。使用したＬＣＲオリゴヌクレオチドは前記実施例１の表１に記載した通りである。これらのオリゴヌクレオチドは、ＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのＭＯＭＰ１遺伝子内のマップ位置３５４−４０１に特異的である。５０ｍＭＥＰＰＳｐＨ７．８、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭＫＣｌ、１μＭｄＴＴＰ、表１に示す各オリゴヌクレオチド分子（３５４．１，３５４．２Ｄ，３５４．３Ｄ，３５４．４）１×１０¹²個、１単位のＴｈｅｒｍｕｓＤＮＡポリメラーゼ、及び５０００単位のＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を生起した。最終反応容量は５０μｌであった。増幅後、反応物を１Ｍｘ（登録商標）希釈緩衝液で１：１に希釈し、ＬＣＲ増幅産物を、実施例１に記載したようにＡｂｂｏｔｔＩＭｘ（登録商標）自動化イムノアッセイ系を用いて実施されるサンドイッチイムノアッセイにより検出した。２回のアッセイを実施した。平均結果を以下に示す：標的 IMx（登録商標）速度 0 146.88±95 10^-2希釈度 2030.83±50 ＡｂｂｏｔｔＴＤｘ（登録商標）蛍光偏光イムノアッセイ分析機（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬ）を用いる蛍光偏光技術により、離脱断片を検出した。ＩＭｘ（登録商標）検出アッセイで残存する増幅産物をＩＭｘ（登録商標）希釈緩衝液で２００μｌに希釈し、各試料の蛍光偏光値を測定した。平均結果を以下に示す：標的 TDx（登録商標）結果 0 201.9±0.5 10^-2希釈度 93.07±3 蛍光化合物の偏光は、この化合物と結合する分子の寸法に反比例する。従って、無傷のオリゴヌクレオチドに結合した蛍光分子の偏光は、オリゴヌクレオチドに由来する分子量がより小さい分解産物（この場合は離脱断片）に結合した発蛍光団の偏光よりも大きいと予想される。結果として偏光値の減少は下流プローブの修正を示すものとなる。本発明は、分かりやすくするために実施例によりある程度詳しく説明したが、前述の方法、組成物及びキットが、ＬＣＲ技術以外の核酸増幅技術で標的非依存性増幅を低減するために使用できることは明白である。更には、当業者による種々の変形及び変更は添付のクレームの範囲内にあると考えられる。本明細書に記載の基本的発明の明白な変更を考慮に入れた将来の技術的進歩もクレームの範囲内である。配列表（1）一般情報：（i）出願人：CARRINO，JOHN J． SPIES，UWE RINEHARDT，LAURIE A． PABICH，EDWARD K．（ii）発明の名称：エキソヌクレオリチック活性を用いた標的核酸の検出及び増幅（iii）配列の数：21 （iv）連絡先：（A）宛名：ABBOTT LABORATORIES （B）通り：D-377，AP6D，ONE ABBOTT PARK ROAD （C）市：ABBOTT PARK （D）州：ILLINOIS （E）国：U.S.A. （F）郵便番号：60064-3500 （v）コンピューターの読取り可能形態：（A）媒体の型：フロッピーディスク（B）コンピューター：IBM PCコンパチブル（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/ MS-DOS （D）ソフトウェア：PatentIn/Wordperfect （vi）現出願データ：（A）出願番号：（B）出願日：（C）分類：（vii）先願データ：（A）出願番号：US 07/925,402 （B）出願日：1992年8月3日（viii）弁理士/代理人情報：（A）氏名：Thomas D．Brainard （B）登録番号：32,459 （C）参照/事件整理番号：4773.PC.03 （ix）電気通信情報：（A）電話：708-937-4884 （B）ファクシミリ：708-938-2623 （2）配列番号１の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：48塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ゲノムDNA （vi）起源：（A）生物名：Chlamydia trachomatis （viii）ゲノム内での位置：（B）染色体上の位置：354-401 （xi）配列番号１の配列：（2）配列番号2の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：24塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号2の配列：（2）配列番号3の情報．（i）配列の特徴：（A）長さ：27塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号3の配列：（2）配列番号4の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：27塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号4の配列：（2）配列番号5の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：24塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号5の配列：（2）配列番号6の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：24塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号6の配列：（2）配列番号7の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：24塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号7の配列：（2）配列番号8の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：24塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号8の配列：（2）配列番号9の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：24塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号9の配列：（2）配列番号10の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：25塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号10の配列：（2）配列番号11の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：25塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号11の配列：（2）配列番号12の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：46塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ゲノムDNA （xi）配列番号12の配列：（2）配列番号13の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：23塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号13の配列：（2）配列番号14の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：23塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号14の配列：（2）配列番号15の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：23塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号15の配列：（2）配列番号16の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：23塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状．（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号16の配列：（2）配列番号17の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：22塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号17の配列：（2）配列番号18の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：22塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号18の配列：（2）配列番号19の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：23塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号19の配列：（2）配列番号20の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：21塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：その他（合成DNA）（xi）配列番号20の配列：（2）配列番号21の情報：（i）配列の特徴：（A）長さ：44塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ゲノムDNA （vi）起源：（A）生物名：肝炎B型ウイルス（viii）ゲノム内での位置：（B）染色体上の位置：666-709 （xi）配列番号21の配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラインハード，ローリー・エイアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、ケノーシヤ、シツクステイーフイフス・アベニユー・8104 (72)発明者パビツク，エドワード・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60639、シカゴ、ノース・マツクビツカー・アベニユー・2450

Claims

【特許請求の範囲】１．標的核酸配列のアッセイ方法であって、（ａ）ハイブリダイゼーション条件下にて、一本鎖形態の標的核酸配列を含むと思われる試料を、第１の上流プローブ及び第１の下流プローブを含む、第１組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブが標的核酸配列の部分と実質的に相補的な配列を有し且つ第１の上流プローブの３’末端が第１の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズするものである過剰の前記第１組のオリゴヌクレオチドに暴露し、ここにおいて第１の下流プローブの５’ エンドを改変させて連結インコンピーテント不在修正とし、これにより第１組のオリゴヌクレオチドを任意に存在する標的核酸配列とハイブリダイズさせ、（ｂ）実質的に下流プローブが標的とハイブリダイズするときにのみ下流プローブの５’エンドに該５’エンドのヌクレオリチック分解を含む修正を施して、この５’エンドを連結コンピーテントにし、（ｃ）修正した下流プローブを上流プローブに連結して連結産物を生成し、（ｄ）修正及び連結段階がどの程度生起するかを試料中の標的核酸の尺度として決定する段階を包含する前記方法。２．修正及び連結の程度の決定が、非連結プローブから連結産物を分離し、生成した連結産物の量を決定することからなる請求項１に記載の方法。３．修正及び連結の程度の決定が、前記下流プローブの５’エンドからの開裂断片の離脱を監視することからなる請求項１に記載の方法。４．前述の連結インコンピーテント５’エンドが本質的に非リン酸化５’末端からなり、前記修正段階が、末端ヌクレオシドを開裂して、前記下流プローブ上に新しい５’リン酸化末端を生成することからなる請求項１に記載の方法。５．前記修正段階が更に、鋳型依存的に１個以上のヌクレオチドトリホスフェートを加えて前記上流プローブの３’末端を伸長し、前記の伸長した３’末端を新たに生成された前記５’リン酸化末端と隣接させることを含む請求項４に記載の方法。６．前記の開裂及び伸長の両段階が、５’→３’ヌクレオリチック活性を有する鋳型依存性ポリメラーゼにより行われる請求項５に記載の方法。７．修正及び連結の程度の決定が、非連結プローブから連結産物を分離し、生成した連結産物の量を決定することからなる請求項４に記載の方法。８．下流プローブの前記末端ヌクレオチドがラベルを有し、修正及び連結の程度の決定が、下流プローブからのラベルの離脱を監視することからなる請求項４に記載の方法。９．前記ラベルが蛍光ラベルであり、前記監視が蛍光偏光からなる請求項８に記載の方法。１０．連結インコンピーテント５’エンドが、該エンドとハイブリダイズする標的配列とは非対合のヌクレオチド塩基を少なくとも１個前記５’エンドに含んでおり、前記修正段階が非対合ヌクレオチドを開裂して、前記下流プローブ上に新しい５’リン酸化末端を生成することからなる請求項１に記載の方法。１１．前記修正段階が更に、鋳型依存的に１個以上のヌクレオチドトリホスフェートを加えて前記上流プローブの３’末端を伸長し、前記の伸長した３’末端を新たに生成された前記５’リン酸化末端と隣接させることを含む請求項１０に記載の方法。１２．前記の開裂及び伸長の両段階が、５’→３’ヌクレオリチック活性を有する鋳型依存性ポリメラーゼにより行われる請求項１１に記載の方法。１３．前記の少なくとも１個の非対合塩基が５’末端ヌクレオチドに位置する請求項１０に記載の方法。１４．前記の少なくとも１個の非対合塩基が前記５’末端ヌクレオチドの１〜約５ヌクレオチド内側に位置する請求項１０に記載の方法。１５．前記開裂段階が、非対合ヌクレオチドに隣接する３’側のヌクレオチドを開裂することからなる請求項１３又は１４に記載の方法。１６．前記下流プローブの連結インコンピーテントな５’エンドが更に非リン酸化５’末端を含んでいる請求項１０に記載の方法。１７．修正及び連結の程度の決定が、非連結プローブから連結産物を分離し、生成した連結産物の量を決定することからなる請求項１０に記載の方法。１８．下流プローブの５’エンドの開裂部分がラベルを有し、修正及び連結の程度の決定が、下流プローブからのラベルの離脱を監視することからなる請求項１０に記載の方法。１９．前記ラベルが蛍光ラベルであり、前記監視が蛍光偏光からなる請求項１８に記載の方法。２０．上流及び下流プローブが標的とハイブリダイズして、下流プローブの非対合５’エンドが少なくとも１個の重複塩基により上流プローブの３’エンドと重複し、修正段階が、前述の少なくとも１個の重複塩基を除去して新しい５’リン酸化末端を生成することにより、新たに生成された下流プローブの５’末端を上流プローブを伸長させずに上流プローブの３’エンドと当接させて２個のプローブを直接連結させ得ることからなる請求項１０に記載の方法。２１．前記下流プローブの非対合５’エンドが更に非リン酸化５’末端を含んでいる請求項２０に記載の方法。２２．第２の上流プローブ及び第２の下流プローブを含む第２組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブがそれぞれ第１の下流プローブ及び第１の上流プローブと実質的に相補的な配列を有し、第２の上流プローブの３’末端が第２の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズするものである過剰の前記第２組のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記のハイブリダイゼーション、修正及び連結の段階（ａ−ｃ）を繰り返して標的核酸配列の増幅を行う請求項１に記載の方法。２３．前記第１の下流プローブの連結インコンピーテント５’エンドが本質的に非リン酸化５’末端からなり、前記修正段階が、末端ヌクレオシドを開裂して前記下流プローブ上に新しい５’リン酸化末端を生成することからなる請求項２２に記載の方法。２４．第２の下流プローブの５’エンドも改変して連結インコンピーテント不在修正とし、前記修正段階が、前記第２の下流プローブの５’エンドをヌクレオリチック分解して新しいリン酸化５’末端を生成して、両方の下流プローブの５’ エンドを連結コンピーテントにすることからなる請求項２３に記載の方法。２５．第２の下流プローブの前記改変が、（ａ）非リン酸化５’末端；又は（ｂ）前記下流プローブとハイブリダイズする鋳型配列とは非対合の５’エンドの少なくとも１個のヌクレオチド塩基の中から選択され、前記修正段階が、前記非リン酸化ヌクレオチド又は前記非対合ヌクレオチドを開裂することからなる請求項２４に記載の方法。２６．前記修正段階が更に、鋳型依存的に１個以上のヌクレオチドトリホスフェートを加えて前記の両上流プローブの３’末端を伸長し、前記の伸長した３’末端を新たに生成された前記５’リン酸化末端と隣接させることを含む請求項２４に記載の方法。２７．前記の開裂及び伸長の両段階が、５’→３’ヌクレオリチック活性を有する鋳型依存性ポリメラーゼにより行われる請求項２６に記載の方法。２８．修正及び連結の程度の決定が、非連結プローブから連結産物を分離し、生成した連結産物の量を決定することからなる請求項２４に記載の方法。２９．下流プローブの前記末端ヌクレオチドがラベルを有し、修正及び連結の程度の決定が、下流プローブからのラベルの離脱を監視することからなる請求項２４に記載の方法。３０．前記第１の下流プローブの連結インコンピーテント５’エンドが、前記下流プローブとハイブリダイズする鋳型配列とは非対合のヌクレオチド塩基を少なくとも１個５’エンドに含み、前記修正段階が、非対合ヌクレオチドを開裂して前記下流プローブ上に新しい５’リン酸化末端を生成することからなる請求項２２に記載の方法。３１．第２の下流プローブの５’エンドも改変して連結インコンピーテント不在修正とし、前記修正段階が、前記第２の下流プローブの５ ’エンドをヌクレオリチック分解して新しいリン酸化５’末端を生成して、両方の下流プローブの５’ エンドを連結コンピーテントにすることからなる請求項３０に記載の方法。３２．第２の下流プローブの前記改変が、（ａ）非リン酸化５’末端；又は（ｂ）前記下流プローブとハイブリダイズする鋳型配列とは非対合の５’エンドの少なくとも１個のヌクレオチド塩基の中から選択され、前記修正段階が、前記非リン酸化ヌクレオチド又は前記非対合ヌクレオチドを開裂することからなる請求項３１に記載の方法。３３．前記修正段階が更に、鋳型依存的に１個以上のヌクレオチドトリホスフェートを加えて前記の両上流プローブの３’末端を伸長し、前記の伸長した３’末端を新たに生成された前記５’リン酸化末端と隣接させることを含む請求項３１に記載の方法。３４．前記第１の下流プローブの５’エンドが更に非リン酸化５’末端を含んでいる請求項３２に記載の方法。３５．前記の開裂及び伸長の両段階が、５’→３’ヌクレオリチック活性を有する鋳型依存性ポリメラーゼにより行われる請求項３３に記載の方法。３６．前記下流プローブの一方又は両方の少なくとも１個の非対合塩基が５’末端ヌクレオチドに位置する請求項３２に記載の方法。３７．前記下流プローブの一方又は両方の少なくとも１個の非対合塩基が前記５ ’末端ヌクレオチドの１〜約５ヌクレオチド内側に位置する請求項３２に記載の方法。３８．前記開裂段階が、非対合ヌクレオチドに隣接する３’側のヌクレオチドを開裂することからなる請求項３６又は３７に記載の方法。３９．修正及び連結の程度の決定が、非連結プローブから連結産物を分離し、生成した連結産物の量を決定することからなる請求項３１に記載の方法。４０．下流プローブの前記末端ヌクレオチドがラベルを有し、修正及び連結の程度の決定が、下流プローブからのラベルの離脱を監視することからなる請求項３１に記載の方法。４１．（ａ）第１の上流プローブ及び第１の下流プローブを含む第１組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブが標的核酸配列の部分と実質的に相補的な配列を有し、且つ第１の上流プローブの３’末端が第１の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズする、前記第１組のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）第２の上流プローブ及び第２の下流プローブを含む第２組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブがそれぞれ第１の下流プローブ及び第１の上流プローブと実質的に相補的な配列を有し、且つ第２の上流プローブの３’末端が第２の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズする、前記第２組のオリゴヌクレオチドとを含み、第１又は第２の下流プローブの少なくとも一方の５’エンドを改変して連結インコンピーテント不在修正とすることを特徴とする前記（ａ）、（ｂ）を含む物質の組成物。４２．連結インコンピーテントな５’エンドが本質的に非リン酸化５’末端からなる請求項４１に記載の組成物。４３．非リン酸化５’末端がヒドロキシル、ヒドリル及びアミノからなる群の中から選択される請求項４２に記載の組成物。４４．非リン酸化５’末端が、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光ラベル、発色団ラベル及びハプテンラベルからなる群の中から選択されるラベルを含んでいる請求項４２に記載の組成物。４５．連結インコンピーテント５’エンドが、該エンドとハイブリダイズする標的配列又は相補的上流プローブと非対合のヌクレオチド塩基を少なくとも１個前記５’エンドに含んでいる請求項４１に記載の組成物。４６．前述の少なくとも１個の非対合塩基が５’末端ヌクレオチドに位置する請求項４５に記載の組成物。４７．非リン酸化５’末端を更に含んでいる請求項４５に記載の組成物。４８．両方の下流プローブが連結インコンピーテントな５’エンドを有する請求項４１に記載の組成物。４９．（ａ）上流プローブ及び下流プローブを含む１組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブが標的核酸配列の部分と実質的に相補的な配列を有し、第１の上流プローブの３’末端が第１の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズし、前記下流プローブの５’エンドを改変して連結インコンピーテント不在修正とする、前記１組のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）連結インコンピーテントな下流プローブを標的依存的に修正して下流プローブを連結可能とし、上流及び下流プローブを連結コンピーテントとするための１種以上の修正試薬と、（ｃ）修正した下流プローブを上流プローブに連結するための連結試薬とを１個以上の適切な容器内に含んでいるキット。５０．前述の連結インコンピーテント５’エンドが本質的に非リン酸化５’末端からなる請求項４９に記載のキット。５１．連結インコンピーテント５’エンドが、該エンドとハイブリダイズする標的配列とは非対合のヌクレオチド塩基を少なくとも１個前記５’エンドに含んでいる請求項４９に記載のキット。５２．非リン酸化５’末端を更に含んでいる請求項３２に記載のキット。５３．前記修正試薬が、標的依存性５’→３’ヌクレオリチック活性を有する物質からなる請求項５１に記載のキット。５４．前記修正試薬が標的依存性ポリメラーゼからなる請求項５３に記載のキット。５５．第２の上流プローブ及び第２の下流プローブを含む第２組のオリゴヌクレオチドであって、ここで両プローブがそれぞれ第１の下流プローブ及び第１の上流プローブと実質的に相補的な配列を有し、第２の上流プローブの３’末端が第２の下流プローブの５’末端に近接してハイブリダイズする、前記第２組のオリゴヌクレオチドを更に含んでいる請求項４９に記載のキット。５６．前記下流プローブの少なくとも一方の連結インコンピーテント５’エンドが本質的に非リン酸化５’末端からなる請求項５５に記載のキット。５７．前記下流プローブの少なくとも一方の連結インコンピーテント５’エンドが、該エンドとハイブリダイズする標的配列とは非対合のヌクレオチド塩基を少なくとも１個前記５’エンドに含んでいる請求項５５に記載のキット。５８．前記の少なくとも一方の下流プローブ上の連結インコンピーテント５’エンドが更に非リン酸化５’末端を含んでいる請求項５７に記載のキット。５９．前記修正試薬が、標的依存性５’→３’ヌクレオリチック活性を有する標的依存性ポリメラーゼからなる請求項５５に記載のキット。