DE69329824T2

DE69329824T2 - Nachweis und amplifikation bestimmter nukleinsäuren mittels exonukleolytischer aktivität

Info

Publication number: DE69329824T2
Application number: DE69329824T
Authority: DE
Inventors: J. Carrinno; K. Pabich; A. Rinehardt; Uwe Spies
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1993-07-21
Publication date: 2001-08-09
Anticipated expiration: 2013-07-22
Also published as: DE69329824D1; ES2154648T3; EP0654093B1; EP0654093A4; EP0654093A1; CA2140331C; CA2140331A1; WO1994003636A1; JP3516953B2; JPH08501212A; AU4687393A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Techniken zur Amplifikation von Nukleinsäuren und genauer die Reduktion und bevorzugt die Elimination der zielunabhängigen Hintergrundamplifikation in Assays, unter Verwendung der Ligasekettenreaktion (LCR). Die Erfindung betrifft ebenfalls den Nachweis von Unterschieden in Zielnukleinsäuresequenzen.

HINTERGRUND

Die Ligasekettenreaktion (LCR) ist ein Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz (Ziel) in einer Probe. LCR kann verwendet werden um einzel- oder doppelsträngige DNA-Ziele nachzuweisen. Üblicherweise werden zwei ligierbare Paare von Sonden im Überschuß über das Ziel verwendet, wobei ein Paar der Sonden mit dem anderen hybridisierbar ist. Die Ziel-DNA wird zunächst denaturiert (falls doppelsträngig) um die Hybridisierung der ligierbaren Sondenpaare zu ihren jeweiligen komplementären Strängen zu gestatten. Die hybridisierten Sonden werden dann durch die DNA- Ligase ligiert. Als nächstes werden die ligierten Sonden von dem Ziel dissoziiert und funktionieren ihrerseits als Zielsequenzen. Durch wiederholte Zyklen der Hybridisierung und Ligierung wird eine Amplifikation der Zielsequenz erzielt. Das Verfahren der LCR ist in der Literatur beschrieben, einschließlich unter anderem in EP-A-320,308, EP-A-439,182, EP-A-336,731, WO 89/09835, WO 89/12696 und WO 90/01069.
Ein übliches Problem der LCR ist unspezifische (z. B. zielunabhängige) Amplifikation welche zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Dies kann beispielsweise auftreten, wenn ein Paar aneinanderliegender LCR-Sonden aneinanderligiert wird in Abwesenheit des Ziels. Da LCR-Sonden üblicherweise verglichen mit dem Ziel in hoher Konzentration verwendet werden, ist die Wahrscheinlichkeit von zielunabhängiger Ligierung groß und daher gibt es ein dringendes Bedürfnis dieses Problem zu bewältigen.
Verfahren zur Reduktion von zielunabhängigen Ligationsereignissen wurden beschrieben. Beispielsweise beschreibt EP-A- 439,182 eine Variation der LCR wobei eine Probe des ligierbaren Paares verändert wird, so daß sie nicht ligiert werden kann bis ein Korrekturereignis stattfindet. Das Korrekturereignis findet nur statt, wenn die Probe an das Ziel hybridisiert ist. Konkret beschreibt diese Anmeldung Modifikationen an den 3'-Enden der stromaufwärts gerichteten Sonde, wobei stromaufwärts diejenigen Sonden bezeichnet deren 3'-Enden an der Ligationsreaktion teilnehmen. Beschriebene Modifikationen sind eine 3' blockierende Gruppe, wie z. B. Phosphat; ein 3'-Überhang von Ribonukleotiden (an einer Deoxyribonukleotidsonde); 3'-Überhänge die eine nichtbasische Stelle umfassen; und 3'-Lücken, welche gefüllt werden müssen um die Sonden angrenzend und ligierbar zu machen. Keine der beschriebenen Ausführungen betreffen Modifikationen des 5'- Endes der stromabwärts gerichteten Sonde.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung liefert Verfahren zur Reduktion und vorzugsweise Elimination, zielunabhängiger Amplifikation durch die Verwendung modifizierter stromabwärts gerichteter Sonden mit 5'- Enden, welche unfähig sind ligiert zu werden ohne einen zielabhängigen Korrekturschritt; z. B. können diese Enden erst ligiert werden wenn sie enzymatisch abgebaut sind nach der Hybridisierung der Sonde an eine Zielnukleinsäuresequenz.
Daher umfaßt das Verfahren der Erfindung folgende Schritte:
(a) das Aussetzen einer Probe von der vermutet wird das sie die Zielnukleinsäuresequenz in einsträngiger Form enthält unter Hybridisierungsbedingungen einem Überschuß eines ersten Satzes von Oligonukleotiden welche eine erste stromaufwärts gerichtete Sonde und eine erste stromabwärts gerichtete Sonde umfassen, wobei beide Sonden Sequenzen aufweisen, welche im wesentlichen komplementär sind zu Anteilen einer Zielnukleinsäuresequenz, wobei das 3'-Ende der ersten stromaufwärts gerichteten Sonde in der Nähe des 5'-Endes der ersten stromabwärts gerichteten Sonde hybridisiert, wobei das 5'-Ende der ersten stromabwärts gerichteten Sonde verändert ist, um ligationsunfähig zu sein ohne Korrektur, wodurch der erste Satz von Oligonukleotiden an die Zielnukleinsäuresequenz hybridisiert, falls diese Vorhanden ist.
(b) das Korrigieren des 5'-Endes der stromabwärts gerichteten Sonde im wesentlichen nur falls die stromabwärts gerichtete Sonde an das Ziel hybridisiert ist, wobei die Korrektur einen exonukleolytischen Abbau des 5'-Endes umfaßt, wodurch die Korrektur dieses 5'-Ende ligationsfähig macht;
(c) das Ligieren der korrigierten stromabwärts gerichteten Sonde zu der stromaufwärts gerichteten Sonde um ein ligiertes Produkt zu bilden; und
(d) das Bestimmen zu welchem Ausmaß die Korrektur und Ligationsschritte auftreten als ein Maß für die Zielnukleinsäure in der Probe.
Die Mittel um das 5'-Ende der stromaufwärts gerichteten Sonde ligationsunfähig zu machen, fallen in zwei allgemeine Gruppen. Erstens wird ein ligationsunfähiges Ende erzielt durch ein nicht-phosphoryliertes 5'-Ende, welches korrigiert wird durch das Abspalten der terminalen Nukleoside, um einen neuen 5' phosphorylierten Terminus an der stromabwärts gerichteten Sonde zu erzeugen. Zweitens wird ein ligationsunfähiges Ende erzielt durch die Auswahl einer Sondensequenz, welche mindestens eine Nukleotidbase in dem 5'-Ende enthält, welches nicht zusammenpassend ist in Bezug auf die Zielsequenz, an welche es hybridisiert. Diese Modifikation wird korrigiert durch das Abtrennen des nicht zusammenpassenden Nukleotids um einen neuen 5' phosphorylierten Terminus an der stromabwärts gerichteten Sonde zu erzeugen. Eine solche nicht zusammenpassende Nukleotidbase kann direkt am 5'-Ende liegen oder innerhalb liegen, z. B. von 1 bis ungefähr S Resten von dem 5'-Terminus. Bei der Korrektur der nicht zusammenpassenden Basen wurde herausgefunden, daß die passende Base, welche an die Fehlpaarung an seiner 3'-Stelle angrenzt, ebenfalls abgetrennt wird.
Bei einigen Ausführungen wird der Abbau des 5'-Endes beendet zu dem Zeitpunkt, wenn das 3'-Ende der stromaufwärts gerichteten Sonde anstößt, z. B. angrenzend ist. In anderen Ausführungen findet der Abbau über diesen Punkt hinaus statt, und die stromaufwärts gerichtete Sonde wird ebenfalls verlängert um an das neu entstandene 5' phosphorylierte Ende der korrigierten stromabwärts gerichteten Sonde anzustoßen. Diese Abtrennungs- und Verlängerungsaktivität wird schön durchgeführt durch bestimmte Polymerasen welche eine 5'- zu 3'- Exonukleaseaktivität besitzten, aber die beiden Vorgänge können durch unterschiedliche Reagenzien ebenfalls durchgeführt werden.
Die Ligationsereignisse, welche abhängig sind von dem Vorhandensein und/oder der Menge von Ziel in der Probe können nachgewiesen werden durch einen Assay für das Ligationsprodukt, z. B. durch sein größeres molekulares Gewicht oder durch eine Kombination von unterschiedlich markierten Sonden in ein doppelt markiertes Molekül; oder durch die Überwachung der Freisetzung von abgetrennten Fragmenten von den korrigierten 5'-Enden, z. B. durch Fluoreszenzpolarisation oder Fluoreszenzlöschung.
Vorzugsweise wird die Menge von Zielsequenzen in der Probe vor der Detektion erhöht, durch das Einsetzen eines Überschusses eines zweiten Satzes von Oligonukleotiden, welche eine zweite stromaufwärts gerichtete Sonde und eine zweite stromabwärts gerichtete Sonde umfassen, wobei beide Sonden Sequenzen aufweisen, welche im wesentlichen komplementär sind zur der ersten stromaufwärts gerichteten Sonde bzw. der ersten stromabwärts gerichteten Sonde (und insofern auch komplementär dem Komplement der Zielsequenz), wobei der 3'-Terminus der zweiten stromaufwärts gerichteten Sonde nahe des 5'-Endes der zweiten stromabwärts gerichteten Sonde hybridisiert wird. In einem solchen Fall wird die Amplifikation durchgeführt durch das Wiederholen der Hybridisierungs-, Korrektur- und Ligationsschritte (a-c). Die Wiederholung wird im allgemeinen 10 bis etwa 50 Zyklen umfassen. In der Amplifikationsvariation kann aber muß nicht die zweite stromabwärts gerichtete Sonde eine 5'- Modifikation aufweisen, welche sie ligationsinkompetent macht.
Wenn dem so ist, kann die Modifikation die gleiche sein oder unterschiedlich als die der ersten stromabwärts gerichteten Sonde. Korrektur, Ligation und Nachweis sind die gleichen wie zuvor.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Zeichnungen zeigen im allgemeinen verschiedene bevorzugte Ausführungen gemäß der Erfindung. In jeder Figur zeigt Rahmen a die beiden Sondensätze, einschließlich einer bevorzugten Modifikation an dem 5'-Ende der stromabwärts gerichteten Sonden; Rahmen b zeigt den ersten Satz von Sonden, die an einen Strang der Ziel-DNA hybridisiert sind; und Rahmen c zeigt die ersten beiden Sonden nach Korrektur der modifizierten Sonde aber vor der Ligation von Sonde 1 an Sonde 2. Obwohl Rahmen a Modifikationen beider stromabwärts gerichteter Sonden zeigt, erfordert die Erfindung nur daß eine stromabwärts gerichtete Sonde modifiziert wird. In jeder Zeichnung zeigt das schattierte Rechteck eine Markierungs- oder Nachweisgruppe, üblicherweise ein erstes Hapten; wogegen das schattierte Oval eine zweite Markierungs- oder Nachweisgruppe darstellt, welche ein zweites Hapten sein oder nicht sein kann.
Fig. 1 ist ein schematisches Beispiel einer Nukleinsäureamplifikationstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen von glatt begrenzten Sonden, wobei die stromabwärts gerichteten Sonden 5'- Hydroxyltermini anstelle des 5'-Phosphates aufweisen, welches für die Ligationskompetenz erforderlich ist.
Fig. 2 ist ein schematisches Beispiel von einer Nukleinsäureamplifikationstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen von glatt begrenzten Sonden, wobei jede stromabwärts gerichtete Sonde ein 5'-Hydroxylende und eine einbasige terminale Fehlpaarung hat, hinsichtlich der komplementären Sonde und dem Ziel. Die Ligationsinkompetenz wird nicht nur durch die 5'-Hydroxyltermini vermittelt, aber auch durch geschwächte Wasserstoffbindung an die Matrize aufgrund der ungepaarten terminalen Base.
Fig. 3 ist ein schematisches Beispiel einer Nukleinsäureamplifikationstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen glatt begrenzter Sonden wobei jede stromabwärts gerichtete Sonde ein 5'-Hydroxylterminus hat und eine einbasige interne Fehlpaarung hinsichtlich der komplementären Sonde und dem Ziel. Wie in Fig. 2 ist die zielunabhängige Ligation reduziert sowohl durch das 5'-Hydroxyl und die geschwächte Wasserstoffbindung aufgrund der internen Fehlpaarung.
Fig. 4 ist ein schematisches Beispiel einer Nukleinsäureamplifikationstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen von nicht glatt begrenzten Sonden welche stromabwärts gerichtete Sonden mit 5'-Verlängerungen haben. Diese 5'-Verlängerungen sind nicht aneinander oder an ihre jeweiligen Ziele hybridisierbar. Diese stromabwärts gerichteten Sonden haben ebenfalls 5'-Hydroxylenden wie gezeigt. Die Ligationsinkompetenz wird durch sterische Behinderungen erzeugt, die durch die Verlängerungen und durch das 5'-Hydroxyl auferlegt werden.
Fig. 5 ist ein schematisches Beispiel einer Nukleinsäureamplifiaktionstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen von nicht glatt begrenzten Sonden wobei jede stromabwärts gerichtete Sonde eine einbasige 5'-Verlängerung hat, und die Verlängerungen sind komplementär zueinander aber nicht mit dem Ziel. Die stromabwärts gerichteten Sonden haben ebenfalls wie gezeigt 5'-Hydroxylenden. Die Ligationsinkompetenz am Ziel wird erzeugt durch geschwächte Wasserstoffbindung aufgrund der terminalen Fehlpaarung und dem 5'-Hydroxyl.
Fig. 6 ist ein schematisches Beispiel einer Nukleinsäureamplifikationstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen von glatt begrenzten Sonden wobei die stromabwärts gerichteten Sonden jeweils ein 5'-Hydroxylende aufweisen und die 5'-terminale-Base ist fehlgepaart zur komplementären Sonde und dem Ziel. Die Ligationsinkompetenz wird durch geschwächte Wasserstoffbindung aufgrund der terminalen Fehlpaarungen und durch das 5'-Hydroxyl erzeugt.
Fig. 7 ist ein schematisches Beispiel einer Nukleinsäureamplifikationstechnik unter Verwendung von zwei Sätzen nicht glatt begrenzter Sonden mit 3'-Verlängerungen (in den stromaufwärts gerichteten Sonden) welche untereinander und mit dem Ziel passend sind. Die stromabwärts gerichteten Sonden haben 5'-Hydroxyltermini. Die Ligationsinkompetenz wurde durch das 5'-Hydroxyl erzeugt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die Erfindung wird nun im Detail beschrieben gemäß der folgenden allgemeinen Gliederung:
I. Definitionen
II. Ligationsunfähigkeitsmodifikationen und deren Korrekturen
A. nicht-phosphorylierte 5'-Termini
B. ungepaarte Basen, terminal und interne
III. Sondenkonfigurationen
A. glatt begrenzt
B. nicht glatt begrenzt
IV. Verfahren der Anwendung
A. Nachweisverfahren
B. Amplifikationsverfahren
C. polymerisationsunabhängige Verfahren
V. Nachweismethoden
A. ligierte Komplexe
B. freigesetzte Fragmente
VI. Zusammensetzungen und Testsätze
VII. Beispiele
VIII. Sequenzauflistung

I. Definitionen

Wie in dieser Anmeldung verwendet, haben die folgenden Ausdrücke die angegebenen Bedeutungen.
"Ziel" oder "Zielsequenz" bezeichnet die Nukleinsäure deren Vorhandensein oder deren Fehlen nachgewiesen oder differenziert werden soll von anderen Nukleinsäuren, deren Sequenz sehr eng verwandt sein kann. Die Zielnukleinsäure umfaßt Deoxyribonukleinsäure (DNA), oder weniger üblich Ribonukleinsäure (RNA). Für den Zweck dieser Erfindung wird das Ziel als einzelsträngig beschrieben. Jedoch sollte verstanden werden, daß dies den Fall einschließt, in dem das Ziel eigentlich doppelsträngig ist, aber einfach getrennt wird von seinem komplementären Strang (ebenfalls bezeichnet als "Zielkomplement") vor der Hybridisierung mit den Sonden. Im Falle eines doppelsträngigen Ziels kann das zweite Set von Sonden ebenfalls im inizialen Schritt verwendet werden, um das Zielkomplement zu hybridisieren. Im Falle eines einzelsträngigen Ziels würde der zweite Satz von Sonden nicht im initialen Hybridisierungsschritt teilnehmen, allerdings würde es teilnehmen in den folgenden Hybridisierungsschritten, beispielsweise in dem das ligierte Produkt hybridisiert wird.
"Sonden" bezeichnet die Oligonukleotidsegmente die in der Erfindung verwendet werden. Diese sind von 10 bis etwa 100 Nukleotide lang, vorzugsweise von etwa 15-35 und haben eine definierte Basensequenz, welche geeignet ist für das gewünschte Ziel. Sonden sind normalerweise DNA, können aber auch RNA oder von gemischter DNA-/RNA-Zusammensetzung sein. Bestimmte Sonden sind verändert an ihrem 5'-Ende, wie hierin beschrieben. Sonden können von natürlichen oder synthetischen Quellen herstammen.
"Basen" bezeichnet die Pyrimidin- und Purinverbindungen Guanin (G), Cytosin (C), Adenin (A) und Thymin (T) im Falle von DNA und im Falle der RNA ersetzt das Uracil (U) Thymin. "Basen" umfaßt ebenfalls Analoga, Derivate und modifizierte Basen, wie jene die anerkannt sind in 37 CFR §l,822(p)(1), welche in der Lage sind an das Ziel unter Assaybedingungen zu hybridisieren. Falls der Kontext nichts anderes vorgibt, wird "Base" ebenfalls verwendet um den kompletten Nukleotidrest zu bezeichnen, einschließlich der Zucker und Phosphatanteile, wie z. B. wenn vom Ausfüllen der Lücke mit geeigneten Basen gesprochen wird.
Basen bilden bekanntermaßen zusammen Paare in zylindrischer Form: A mit T und C mit G bei der DNA, und im Fall von RNA, A mit U und C mit G. Hinsichtlich einzelner Basen bezeichnet "komplementär" das Paarbilden oder "matching" gemäß der obigen Beschreibung. Demzufolge ist A gepaart mit G oder C "fehlgepaart" oder "nicht-komplementäre" Basen. Hinsichtlich der Oligonukleotidsonden kann eine Sonde, welche "komplementär" zu einer anderen Sonde oder einem Ziel ist, besagen, daß das Oligonukleotid mit der komplementären Sonde oder Ziel unter Hybridisationsbedingungen hybridisieren kann. Demzufolge können komplementäre Sonden Sequenzen umfassen, welche fehlgepaarte Basenpaare in dem hybridisierbaren Bereich aufweisen, sofern sichergestellt ist, daß die Sequenzen hybridisiert werden können unter Hybridisationsbedingungen. Vorzugsweise sind die Sonden ausreichend komplementär um selektiv mit ihren Zielen oder komplementären Sonden zu hybridisieren.
Eine "Stopbase" bezeichnet das Nukleotid, an welchem ein nukleolytischer Vorgang oder Polymerisationsvorgang endet. Beispielsweise kann eine Stopbase existieren als eine Matrizenbase für welche die komlementäre Base aus dem dNTP Pool fehlt. Alternativ kann eine Stopbase als eine nukleaseresistente Verknüpfung in einer stromabwärts liegenden Sonde vorliegen. Alternative Stopbasen können ebenfalls in Kombination verwendet werden.
"Assaybedingungen" bezeichnet die Bedingungen der LCR hinsichtlich der Temperatur, Ionenstärke, Sondenkonzentration und ähnliches. Diese sind im allgemeinen im Fachgebiet bekannt. Die LCR umfaßt im allgemeinen zwei Zustände oder Bedingungen: die Schmälz- oder Hybridisationbedingungen, und die Denaturierungsbedingungen.
"Hybridisationsbedingungen" wird allgemein definiert als Bedingungen welche die Nukleation und das Schmelzen fördern. Es ist im Fachgebiet jedoch gut bekannt, daß solches Schmelzen und Hybridisieren abhängig ist in einer vorhersagbaren Art von verschiedenen Parametern, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Sondenlänge und G : C Gehalt der Sonden. Beispielsweise führt das Senken der Temperatur der Reaktion zu einem verstärkten Tempern. Für jeden gegebenen Sondensatz kann die Schmelztemperatur, oder Tm geschätzt werden durch eine von verschiedenen bekannten Verfahren. Üblicherweise umfassen die Hybridisationsbedingungen Temperaturen welche leicht unterhalb der Schmelztemperatur sind. Die Ionenstärke oder "Salz" Konzentration beinflußt ebenfalls die Schmelztemperatur, da kleine Kationen zur Stabilisierung der Bildung von Duplexen neigen in dem die negative Ladung auf die Phosphodiesterhauptkette abgeschirmt wird. Typische Salzkonzentrationen sind abhängig von der Natur und Valenz des Kations aber werden leicht verstanden durch jene die im Fachgebiet bewandert sind. Ähnlich ist ein hoher G : C Gehalt und eine erhöhte Sondenlänge ebenfalls bekannt für die Stabilisierung der Duplexbildung aufgrund der Tatsache, daß G : C Paarungen 3 Wasserstoffbindungen umfassen, wogegen A : T Paare nur zwei aufweisen, und da längere Sonden mehr Wasserstoffbindungen aufweisen, welche die Stränge zusammenhalten. Demzufolge beeinflussen ein hoher G : C Gehalt und längere Sondenlängen die "Hybridisationsbedingungen" in dem die Schmelztemperatur erhöht wird. Sobald Sonden gewählt sind, ist der G : C Gehalt und die Länge bekannt und können berücksichtigt werden zur genauen Bestimmung der umgebenden "Hybridisationsbedingungen". Da die Ionenstärke üblicherweise optimiert ist für die enzymatische Aktivität ist der einzige Parameter der beeinflußt werden kann die Temperatur und das Erzielen geeigneter "Hybridisationsbedingungen" für einen bestimmten Sondensatz und das System liegt innerhalb den üblichen Fähigkeiten.
"Denaturierungsbedingungen" ist im allgemeinen definiert als die Bedingungen, welche eine Dissoziation von doppelsträngiger Nukleinsäure zur einzelsträngigen Form fördern. Diese Bedingungen umfassen hohe Temperatur und/oder niedrige Ionenstärke; im allgemeinen das Gegenteil der Parameter die oben beschrieben sind, wie es im Fachgebiet wohl bekannt ist.
"Ligation" ist ein allgemeiner Ausdruck welcher jedes Verfahren der kovalenten Anheftung zweier Sonden umfaßt. Das bevorzugte Verfahren ist die enzymatische Ligation. Für Zwecke dieser Anmeldung bezeichnet "ligationskompetent" Sondenenden welche in der Lage sind ligiert zu werden durch die enzymatische Ligase. Für bekannte enzymatische Ligasen erfordert die Ligationskompetenz Nukleinsäuresegmente so daß ein 3'- Hydroxylterminus angrenzend an ein 5' phosphorylierten Terminus liegt. Dem gegenüber zeigen "ligationsinkompetente" Sonden keine für Ligation geeigneten Enden, üblicherweise aufgrund eines Mangels von 3'-Hydroxyl, eines Mangels von 5'-Phosphat oder eines Mangels von Annäherung. Viele Beispiele der Ligationsinkompetenz werden später beschrieben. Die Ligationsinkompetenz ist ein temporärer Status in dieser Erfindung, welcher nur existiert bis eine "Korrektur" eintritt. Dies wird manchmal bezeichnet als "Ligationsinkompetenz mangels Korrektur".
"Korrektur" bezeichnet die Reperatur der Modifikation welche die Sonde anfangs ligationsinkompetent gemacht hat. Bestimmte Korrekturmechanismen werden später in Verbindung mit bestimmten Modifikationen diskutiert, bezeichnen im allgemeinen aber ein oder mehrere von: 1) das Erzeugen oder Wiederherstellen eines 3'-Hydroxyls; 2) das Erzeugen oder Wiederherstellen eines 5'-Phosphats; oder das Erzeugen von Annäherung, entweder durch Abtennen von einer überhängigen Verlängerung oder durch das Ausfüllen einer Lücke. Es ist eine wichtige Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, daß die Korrektur "zielabhängig" ist, d. h. daß es im wesentlichen nur in Anwesenheit eines Ziels oder Zieläquivalents auftritt, und nicht in Anwesenheit der anderen Sonden. "Matrizenabhängig" ist gleichbedeutend mit "zielabhängig" insofern, daß die Matrize nur ligiertes Sondenprodukt ist, und nicht unligierte Sonden. Vorzugsweise ist eine hybridisierte Sonde enzymatisch korrigiert durch ein Mittel welches eine geeignete exonukleolytische Aktivität aufweist, welche abhängig ist von der Sequenzinformation welche in dem Ziel enthalten ist.
"Nukleolytische Aktivität" bezeichnet die Aktivität vorzugsweise eines Enzyms, welches DNA- oder RNA-Substrat ausschneidet oder abbaut. Nukleolytische Aktivität kann exonukleolytisch (von einem Ende nach innen) oder endonukleolytisch (von innerhalb) sein. Für Zwecke dieser Erfindung ist die Art der nukleolytischen Aktivität nicht wichtig, sofern gesichert ist, daß es das modifizierte 5'-Ende in einer zielabhängigen Art und Weise korrigieren kann. Zur Einfachheit wird die nukleolytische Aktivität, die hierin beschrieben ist, im allgemeinen als "exonukleolytische" Aktivität beschrieben, die soll aber nicht die nukleolytische Aktivität auf einem bestimmten Mechanismus einschränken. Daher wie hierin verwendet schließen die Ausdrücke "exonukleolytisch" oder "Exonuklease" Nukleinsäureabbau ein, ob vom Ende oder von innerhalb, ob monomere oder größere Fragmente das Abbauprodukt sind, und entweder durch enzymatische oder chemische Mittel.
Geeignete exonukleolytische Aktivität kann gefunden werden bei einem Exonukleaseenzym, oder in der 5'-3'- Exonukleaseaktivität welche traditionell verknüpft ist mit einigen DNA-Polymerasen. Beispielsweise wurde eine DNA- Polymerase mit DNA-Synthese abhängig, strangersetzender 5' zu 3'- Exonukleaseaktivität wie auch eine 5'- zu 3'- Polymerisationsaktivität beschrieben in Gelfand, D., Tag DNA Polymerase in PCR Technology: Principles and Applications für DNA Amplification, Erlich, H. A., Ed., Stockton Press, N. Y. (1989) Kapitel 2). Eine ähnliche Aktivität wurde demonstriert für die thermostabile DNA-Polymerase der Herkunft Thermus, kommerziell erhältlich von Molecular Biology Resourses (MBR) Milwaukee, Wisconsin. Im Anwesenheit der geeigneten dNTP(s), werden diese DNA-Polymerasen eine Synthese von dem 3'- Hydroxylterminus einer Sonden, die an eine Ziel-DNA hybridisiert ist, beginnen, entlang der DNA-Zielmatrize voranschreiten, wobei stromabwärts gelegene hybridisierte DNA-Sequenzen abgebaut werden, und in dem Vorgang ersetzt werden.
Zur Annehmlichkeit werden Sonden bezeichnet, als "stromaufwärts gelegene" oder "stromabwärts gelegene". Wenn zwei Sonden an unterschiedliche Bereiche der gleichen linearen Nukleinsäure hybridisieren, und der 3'-Terminus einer Sonde auf den 5'-Terminus der anderen Sonde weist, wird die erstere als "stromaufwärts gelegene" Sonde bezeichnet und die letztere wird die "stromabwärts gelegene" Sonde genannt. Unabhängig davon ob der Strang/die Stränge eine "Richtung" besitzen für die Codierung. Diese beiden Oligonukleotidsonden werden zusammen bezeichnet als ein Satz von Sonden oder Oligonukleotiden oder als ein "ligierbares Paar" (zur Unterscheidung von einem komplementären Paar). In Rahmen a jeder Figur sind zwei solcher Sondensätze gezeigt. Der erste Satz besteht aus Sonden 1 (ebenfalls bezeichnet als "erste stromaufwärts gelegene Sonde") und 2 ("erste stromabwärts gelegene Sonde"). Der zweite Satz besteht aus den Sonden 4 ("zweites stromaufwärts gelegene Sonde") und 3 ("zweite stromabwärts gelegene Sonde"). Abhängig vom Kontext kann ein Sondensatz auch alle vier Sonden bezeichnen, oder zwei Sonden, welche an gegenüberliegende Stränge hybridisieren.
Eine Unterscheidung wird hierin gemacht zwischen dem "Ende" einer Sonde und seinem "Terminus". Ein 3'- oder 5'- "Terminus" bezeichnet den Nukleosidkohlenstoff, welcher als 3' bzw. 5' bezeichnet ist und somit den terminalen Punkt eines Oligonukleotids bezeichnet. Im Gegensatz dazu bezeichnet ein 3'- oder 5'- "Ende" allgemeiner den Bereich nahe des 3'- bzw. 5'- Terminus. Das "Ende" umfaßt den "Terminus" kann aber ebenfalls zahlreiche angrenzende Basen umfassen, bis zu einem Viertel oder einem Drittel des gesamten Oligonukleotids. Der Ausdruck "glatt begrenztes Ende" bezeichnet jedoch coterminale Sonden wie später definiert.
Wenn ein Satz von stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Sonden an ihr Ziel hybridisieren, liegen sie "nahe" zueinander. Der Ausdruck "nahe" bezeichnet, daß die Termini innerhalb etwa 20 Nukleotiden voneinander getrennt sind und umfaßt diese Situationen in welchen: (1) der 3'-Terminus einer Sonde, den 5'- Terminus einer anderen Sonde anstößt, z. B. die Sonden sind direkt angrenzend; (2) es gibt eine "Lücke" welche gebildet wird durch fehlende Base(n) zwischen dem 3'-Terminus einer hybridisierten stromaufwärts gelegenen Sonde und dem 5'-Terminus der hybridisierten stromabwärts gelegenen Sonde; und (3) das 5'- Ende der stromabwärts gelegenen Sonde ist nicht-komplementäre oder nur partiell komplementär zu einem begrenzten Bereich des Ziels, wogegen das 3'-Ende der stromaufwärts gelegenen Sonde, komplementär ist zum gleichen Bereich. Wenn zwei solche Sonden an das Ziel hybridisieren, wird eine "Überlappung" gebildet an dem 5'-Ende der stromabwärts gelegenen Sonde in diesem begrenzten Bereich, wie es gezeigt ist in Fig. 4b.
Der Ausdruck "WRTP" ist eine Abkürzung für "with respect to probes (hinsichtlich der Sonden)" welcher verwendet wird um eine Fehlpaarung (terminale oder innere Fehlpaarung) zwischen zweier hybridisierbarer Sonden zu beschreiben. Im Falle von glatt begrenzten Sonden kann die Fehlpaarung auftreten zwischen Sonden 1 und 3; und/oder zwischen Sonden 2 und 4. Zusätzlich können nicht glatt begrenzte Sonden andere Bereiche aufweisen für mögliche Fehlpaarungen. Bei 5'-Verlängerung nicht glatt begrenzter Sonden kann die Fehlpaarung auftreten zwischen den 5'-Verlängerungen der Sonden 2 und 3. Bei 3'-Verlängerung nicht glatt begrenzter Sonden kann die Fehlpaarung aufteten zwischen den 3'-Verlängerungen von Sonden 1 und 4.
Der Ausdruck "WRTT" ist eine Abkürzung für "with respect to target (hinsichtlich des Ziels)" welches verwendet wird um eine Fehlpaarung (terminal oder interne Fehlpaarung) zwischen einer Sonde und seinem Ziel zu beschreiben. Sonden können so entwickelt sein, daß sie ein oder mehrere Fehlpaarungen WRTT und WRTP enthalten, oder sie können die Fehlpaarungen WRTT aber nicht WRTP enthalten.
Wie hierin verwendet bezeichnet "Markierung" jede Komponente, welches in der Lage ist, das Vorhandensein einer Sonde, an welches es angeheftet ist, anzuzeigen oder zu berichten. Die Markierung kann direkt sein, wie z. B. bei chemilumineszenten Verbindungen, fluoreszierenden Verbindungen oder radioaktiven Isotopen, oder er kann indirekt sein, wie z. B. bei Biotin oder einem anderen Liganden oder Hapten. Im Falle indirekter Markierungen wird eine weitere Reaktion verwendet um ein meßbares Signal zu erzeugen. Diese weitere Reaktion kann eine Reaktion mit einem konjugierten Marker umfassen, der einen spezifischen Bindungspartner für das Hapten und einen geeigneten direkten Marker enthält. Beispielhafte Radioisotope umfassen 32p und Tritium; Fluorescein, FITC, Rhodamin und Texas Rot sind fluoreszierende Markierungen; Acridin und Chinolin sind Beispiele für chemilumineszente Markierungen. Einige typische Haptene umfassen viele Arzneistoffe (z. B. Digoxin, Theophyllin, Phencyclidin (PCP), Salicylat, usw.), T3, Biotin, Fluorescein (FITC), Dansyl, 2,4-Dinitrophenol (DNP); und modifizierte Nukleotide wie Bromuracil und Basen modifiziert durch den Einschluß einer N-Acetyl-7-jod-2-fluorenylamino (AlF) Gruppe; wie auch viele andere. Viele andere Beispiele von jeder Art von Markierung sind denen die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt.
Von Carbazol und Adamantan abgeleitete Haptene werden in den Beispielen besprochen. Verfahren zum Zusatz einer Haptenmarkierung zu einem Oligonukleotid durch die Verwendung eines Phosphoramiditreagenzes sind beschrieben in Thuong, N. T. et al., Tet. Letters, 29(46): 5905-5908 (1988), oder EP-A- 0,436,582 (1991).

II. Ligationsinkompetente Modifikationen und Korrektur dessen

Diese Erfindung betrifft stromabwärts gelegene Sonden mit 5'-Enden, welche Ligationsinkompetent sind bei fehlender Korrektur. Wie erwähnt kann die Korrektur die Entfernung, Ersetzung oder weitere Modifikation dieses Endes sein, um es ligierbar zu machen, und kann gleichzeitig Veränderungen der stromaufwärts gelegenen Sonde umfassen.

A. Nicht-phosphorylierte 5'-Termini

Eine erste Form von ligationsinkompetenten Enden ist ein nicht-phosphorylierter 5'-Terminus, welcher nicht ligiert werden kann an einen. 3'-Hydroxylterminus der stromaufwärts gelegenen Sonde, aber welcher korrigiert werden kann, und zwar in einer zielabhängigen Art und Weise, um es ligierbar zu machen (von hier ab bezeichnet als "nicht-phosphorylierter 5'-Terminus", "nicht-phosphorylierter 5'-Terminus", oder beschrieben als "nicht-phosphoryliert" bezüglich des 5'-Terminus der stromabwärts gelegenen Sonde. Während die ligationsinkompetente Sonde an das Ziel hybridisiert ist, wird der 5'-Terminus "korrigiert" durch die Entfernung der Nicht-Phosphatgruppen und die Ersetzung mit oder die Exponierung einer Phosphatgruppe. Üblicherweise wird dies durchgeführt durch Entfernung des gesamten Nukleotids, welches die 5'-Nicht-Phosphatgruppe trägt, und zwar unter Verwendung eines Wirkstoffes, welcher ein exonukleolytische Aktivität besitzt und welcher einen 5'- Phosphatterminus an den nächsten angrenzenden Nukleotid exponiert läßt.
Das entfernte Nukleotid wird typischerweise ersetzt, in dem an den 3'-Terminus der stromaufwärts gelegenen Sonde eine vergleichbaren Nukleotid hinzugefügt wird. Demnach ist eine DNA- Polymerase mit einer 5'- zu 3'-exonukleolytischen Aktivität ein idealer korrigierender Wirkstoff, da beide der notwendigen Aktivitäten in einem Enzym verwirklicht sind. Dieser Korrekturvorgang durch Abtrennen von einem 5'-Ende einer stromabwärts gelegenen Sonde und das Ersetzen an einem 3'-Ende der entsprechenden stromaufwärts gelegenen Sonde ähnelt einer "Bruchstellentranslations"-Reaktion, obwohl ein markiertes Ersetzungsnukleotid nicht benötigt wird. Im wesentlichen wird "eine Bruchstelle" zwischen ligationsinkompetenten Sonden stromabwärts um eine oder mehrere Basen verschoben, und indem dies geschiet, wird ein ligationsinkompetentes Ende korrigiert, um ligationskompetent zu werden. Jedoch beginnen nicht alle Ausführungen als einfache "Bruchstellen".
Das 5'-nicht-phosphorylierte Ende bezeichnet einfach das kein Phosphat an den 5'-Terminus einer Nukleinsäurekette über das exozyklische (5') Kohlenstoffatom angeheftet ist. Anstelle dessen, kann das 5'-Kohlenstoffatom an H, OH oder eine andere chemische Gruppe anheften, welche unfähig ist, als ein Substrat zur Ligation zu dienen, aber welches die korrigierende Aktivität einer Polymerase oder Exonuklease nicht beobachtbar verhindert, welche darin besteht, daß das Nukleotid, welches die "Nicht- Phosphatgruppe" enthält aus der hybridisierten stromabwärts gelegenen Sonde zu entfernen und/oder welches die hybridisierte stromaufwärts gelegene Sonde verlängert. Daher sollte die Nicht- Phosphatgruppe ein molekulares Gewicht von mindestens einem aber weniger als einem Molekulargewicht, das eine Tertiärstruktur hervorrufen würde, aufweise, welche eine Korrektur der hybridisierten Sonden verhindern würde. Sie kann Phosphatderivate mit den erwähnten Charakteristika umfassen. Die Nicht-Phosphatgruppe kann direkt oder über ein verknüpfendes Molekül mit dem 5'- Terminus der stromabwärts gelegenen Sonde verbunden sein, oder sie kann alleine die verknüpfende Gruppe sein. Sie kann ebenfalls einen Teil eines Markierungs- oder Berichtsystems umfassen, wie dies später beschrieben ist. Die Nicht- Phosphatgruppe umfaßt, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden Gruppen: Chromophore, Haptene, radiomarkierte Verbindungen, Peptide, magnetische Partikel, Kohlenhydrate und Amino-tragende Gruppen wie z. B. Aminomodifikatoren. Andere Beispiele der Nicht-Phosphatgruppe sind: -hydryl; -hydroxyl; -sulfhydryl (Thiole); Kohlenwasserstoffe einschließlich -methyl; -acyl; -halogenide, -primäre Amine; -nitro; und -zyklische Verbindungen. Verknüpfende Gruppen, welche verwendet werden können, umfassen folgendes: Alkene, Alkine, Amide, Amine, Ester, Ether, Ketone, Sulfide, Sulfone, Sulfoxide und Imine. Das 5'- nicht-phosphorylierte Ende ist vorzugsweise ein Hydroxyl, ein Methyl oder ein aminomodifizierter Terminus oder ein Ende, welches ein fluoreszierende Markierung oder eine Verbindung eines fluoreszierenden Markierungssystems enthält.

B. Basenfehlpaarung

Ein zweiter Typ von ligationsinkompetenten 5'-Ende ist eine terminale oder interne Fehlpaarung WRTT und WRTP innerhalb der stromabwärts gelegenen Sonde. Eine "terminale" Fehlpaarung tritt in dem allerletzten Rest der Sonde auf, wogegen eine "interne" Fehlpaarung nur in der Nähe des Endes üblicherweise zwischen 1 bis etwa 5-β Basenpaaren von dem 5'-Terminus auftritt. Jede Art von Fehlpaarung kann aus 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 2 Basen Länge bestehen, wobei üblicherweise alle aneinander angrenzend sind. Es wurde herausgefunden, daß Sonden, die eine solche Nichtübereinstimmung zeigen, nicht so effizient ligiert werden wie ligationskompetente Sonden, insbesondere in einer bevorzugten Ausführung wo das 5'-Ende ebenfalls einen nicht-phosphoryliertes Terminus aufweist. Vermutlich erzeugen Terminale oder interne Fehlpaarungen ein "loses" 5'-Ende aufgrund von reduzierter Wasserstoffbindung, welche ein geeignetes Substrat für die Aktivität der Exonuklease ist.
Ein Beispiel einer terminalen Fehlpaarung ist in Fig. 2 gezeigt, wobei zwei Sätze von glatt begrenzten Sonden gezeigt sind, wobei die stromabwärts gelegenen Sonden jeweils einen 5'- Hydroxylterminus und eine einbasige terminale Fehlpaarung hinsichtlich der komplementären Sonde und ihrem Ziel aufweist. in Anwesenheit einer Polymerase, einer Ligase und einem dNTP Pool, welcher 2'-Deoxythymidin 5'-Triphosphat (dTTP) enthält, tritt die Korrektur auf durch das Entfernen des fehlgepaarten G's mit der ligationsinkompetenten 5'-Hydroxylterminus aus der stromabwärts gelegenen Sonde und durch das Verlängern der stromaufwärts gelegenen Sonde mit dTTP bis die Sonden aneinanderstoßen und ligiert werden können. Die Polymerase wird fortfahren, die stromaufwärts gelegene Sonde zu verlängern und die stromabwärts gelegene Sonde zu degradieren bis es eine stromabwärts gelegene Stopbase erreicht, in diesem Fall das G in dem Ziel. Nach der Degradation und der Entfernung des 5'- Hydroxylterminus der stromabwärts gelegenen Sonde, exponiert die Polymerase das G in der stromabwärts gelegenen Sonde, welches ein 5'-Phosphatterminus aufweist, was durch "p" dargestellt wird und was ligationskompetent ist. Das "TT" zeigt die Thymidylatreste von den dTTP, welche verwendet werden, um die stromaufwärts gelegene Sonde zu verlängern. Mit den aneinanderstoßenden zwei Sonden und der korrigierten, ein 5'- Phosphatterminus enthaltenden, stromabwärts gelegenden Sonde können die beiden Sonden dann ligiert werden.
Unter den vorliegenden Assaybedingungen scheint es, daß die Korrektur einer fehlgepaarten Base die Ersetzung von mindestens einem hybridisiertem Nukleotid unmittelbar an einer Stelle stromabwärts von der fehlgepaarten Base erfordert, um eine effiziente LCR-Amplifikation mit Polymerisation zu erzielen. Daher sollte, damit eine effiziente Amplifikation auftritt der dNTT Pool mindestens die Base enthalten, welche für diese Ersetzung erforderlich ist. Dies ist in Fig. 6 dargestellt, in der sowohl dATP und dCTP vorhanden für das Auftreten einer wirksamen Amplifikation sein sollten.
Ein Beispiel für eine interne Fehlpaarung ist in Fig. 3 gezeigt. In dieser Figur hat jede stromabwärts gelegene Sonde einen 5'-Hydroxylterminus und eine einbasige interne Fehlpaarung hinsichtlich der komplementären Sonde und des Ziels. In Sonde 2 komplementiert das C das T, in Sonde 4 und im Ziel nicht. Ähnlich komplementiert das zweite A der Sonde 3 das G in Sonde 1 und im Ziel nicht. Diese inneren Fehlpaarungen in Kombination mit den 5'-Hydroxyltermini führt zu ligationsinkompetenten Sonden. Die Korrektur tritt in Anwesenheit einer Polymerase, einer Ligase und einem dNTT Pool auf, welcher 2'-Deoxyadenosin 5'-Triphosphat (dATP) und 2'-Deoxycytidin 5'-Triphosphat (dCTP) enthält. Der gleiche Mechanismus wie in Fig. 2 gezeigt, tritt hier auf. Sobald die Sonden in einem Sondensatz an ihr Ziel hybridisiert sind, entfernt die Polymerase den 5'- Hydroxylterminus aus der stromabwärts gelegenen Sonde, der internen Fehlpaarung, und einer hybridisierten Base, die unmittelbar eine Position stromabwärts von der fehlgepaarten Base liegt, um einen 5'-phosphorylierten Terminus zu exponieren, während die stromaufwärts gelegene Sonde verlängert wird, um an die korrigierte stromabwärts gelegene Sonde anzustoßen, um so eine Ligation der stromaufwärts gelegene Sonde an die stromabwärts gelegene Sonde zu gestatten. In Fig. 3 werden drei C's von dem 5'-Ende der Sonde 2 entfernt und drei A's werden entfernt aus der Sonde 3. Praktisch gleichzeitig wird Sonde 1 durch den Zusatz von CAC verlängert. Die Sonde 4 wird ebenfalls durch den Zusatz von ACA verlängert. In Sonde 4 dient das A als Stopbase für die Verlängerung der Sonde 1. Obwohl nicht gezeigt, könnte entweder A oder C als Stopbase in Sonde 1 dienen.
Falls eine zielabhängige 5'- zu 3'-Exonuklease oder eine Polymerase mit einem 5'- zu 3'-zielabhängiger Exonukleaseaktivität verwendet wird, darf das 3'-Ende einer stromaufwärts liegenden Sonde keine Fehlpaarung WRTT enthalten oder die Korrektur tritt nicht wirksam ein. Jedoch kann das 3'-Ende der stromaufwärts gelegene Sonde eine Fehlpaarung WRTP enthalten. Aufgrund der antiparallelen Natur der DNA-Bindung ist jedoch die Sonde, mit der die 3'-stromaufwärts liegende Sonde fehlgepaart ist, in Wirklichkeit das 5'-Ende einer stromabwärts liegenden Sonde des anderen Sondensatzes Daher wird diese Fehlpaarung als die gleiche wie eine 5'-Fehlpaarung der stromabwärts gelegene Sonde angesehen.
Eine Untergruppe von fehlgepaarten ligationsinkompetenten Enden besteht, wenn die Sonden eines ligierbaren Paares überlappen. In diesem Fall muß das 5'-Ende der stromabwärts gelegenen Sonde die gleiche Position auf dem Ziel besetzen wie das 3'-Ende der stromaufwärts gelegenen Sonde. Da jedoch das 5'- Ende fehlgepaart ist, wird es durch die stromaufwärts gelegene Sonde und das 5'-Ende versetzt, dissoziiert oder wird "lose" von dem Ziel, wodurch es ein geeignetes Substrat exonukleolytischer Aktivität wird. Überlappungen, die hinsichtlich des ligierbaren Partners von jedem Sondensatz definiert werden, sollten nicht mit Verlängerungen (siehe unterhalb) verwechselt werden, welche hinsichtlich der komplementären Sonde definiert werden.
Eine überlappende Ausführung ist in Fig. 4 dargestellt und wird unterhalb diskutiert.
Die Sonden sind vorzugsweise so entwickelt, daß die Termini, welche nicht zur Ligation gedacht sind ("Außenseite Termini") nicht ligiert werden können und diese Ligationsinkompetenz kann nicht korrigiert werden. Ein Beispiel dieser unerwünschten Ligationen ist die Ligation des 5'-Terminus der stromaufwärts gelegene Sonde an den 3'-Terminus der stromabwärts gelegene Sonde. Der äußere Terminus von mindestens einer dieser Proben kann mit einem "Haken" oder einer Markierung, die Hapten, Biotin und Fluoreszein umfaßt, geblockt werden. In den folgenden Beispielen sind die Haken oder die Markierungen von Adamantan abgeleitete Haptene, von Carbazol abgeleitete Haptene, von Biotin abgeleitete Haptene und von Fluorescein abgeleitete Haptene. Das von Carbazol abgeleitete Hapten und das von Adamantan abgeleitete Hapten werden als verdunkelte runde Kreise und verschattete Quadrate dargestellt, und zwar jeweils an den äußeren Termini der Sonden in den Fig. 1 bis 4 und 6 bis 7. In Fig. 5 sind diese blockierenden Gruppen Fluorescein und Biotin. Diese blockierenden Gruppen können einen doppelten Zweck dienen in dem sie ebenfalls als Markierung zum folgenden Nachweis oder zum Fang der Sonden dienen. Eine weitere Beschreibung wird in den Beispielen unterhalb geliefert.

III. Konfigurationen der Sonden

Obwohl verschiedene Mittel zur Erzeugung von ligationsunfähigen Modifizierten Enden beschrieben wurden, sollte es klar sein, daß es weiter Variationen gibt, die hinsichtlich der Konfiguration der Sonden möglich sind. Demzufolge können Enden, welche ligationsunfähig sind, in vielen Sondenkonfigurationen gefunden werden, einschließlich glatt begrenzter und nicht glatt begrenzter Sonden, wie unten diskutiert.

A. Glatt begrenzte Konfigurationen

"Glatt begrenzte Sonden" beschreibt Sonden, welche coterminal an jenen Enden sind, welche zur Ligation vorgesehen sind. Das bedeutet, daß das 3'-Ende der Sonde 1 co-terminal ist mit dem 5'-Ende der Sonde 3; und/oder das 5'-Ende der Sonde 2 ist co-terminal mit dem 3'-Ende der Sonde 4. Die Fig. 1 bis 3 und 6 zeigen Beispiele von glatt begrenzten Sonden. Es sollte verstanden werden, daß die Sonden an einer Seite (z. B. Sonden 1 und 3) glatt begrenzt sein können, während die Sonden an der anderen Seite nicht glatt begrenzt sind, wobei die Fig. 1 und die folgende Beschreibung glatt begrenzte Sonden an den beiden Seiten voraussetzen.
Fig. 1 zeigt zwei Sätze von glatt begrenzten Sonden, wobei die stromabwärts gelegene Sonden (2 und 3) 5'-nichtphosphatmodifizierte Termini in der Form von Hydroxylgruppen haben. Der Rahmen 1a zeigt die beiden Sätze von Sonden, so daß das erste Satz von Sonden komplementär zu dem zweiten Satz ist, und die komplementären Sonden sind demgemäß in Fig. 1a aufgereiht. Zur Einfachheit zeigt Rahmen 1b nur den ersten Satz von Sonden an seine Ziel DNA-Sequenz hybridisiert. Die Basen dieser Sonden sind komplementär zu ihren jeweiligen Zielen. Wie in dem Fall von Rahmen 1b zu 1c gezeigt, wird die Korrektur in Anwesenheit einer Polymerase, einer Ligase, und einem Deoxyribonukleosid 5'-Triphosphat (dNTP) Pool durchgeführt, der 2'-Deoxythymidin 5'-Triphosphat (dTTP) enthält. Unter Verwendung der Information, die in der Zielmatrize enthalten ist, entfernt die Polymerase das ligationsinkompetente Hydroxylgruppe der stromabwärts gelegene Sonde (2) und verlängert die stromaufwärts gelegene Sonde (1), so daß die stromaufwärts gelegene Sonde und die stromabwärts gelegene Sonde einander anstoßen und ligiert werden können. Die Polymerase wird potentiell fortfahren die stromaufwärts gelegene Sonde zu verlängern und die stromabwärts gelegene Sonde abbauen, bis sie eine stromabwärts gelegene Stopbase erreicht. In diesem Fall entspricht dies dem G in dem Ziel. Nach Degradation und der Entfernung des 5'-Hydroxylendes der stromabwärts gelegene Sonde, exponiert die Polymerase das C in der stromabwärts gelegene Sonde, das einen 5'-Phosphatterminus besitzt, was ' durch "p" angezeigt wird, der ligationskompetent ist. Das "TT" zeigt die Thymidylatreste von dem dTTP an, die verwendet werden, um die stromaufwärts gelegene Sonde zu verlängern. Mit den beiden aneinanderstoßenden Sonden und der korrigierten stromabwärts gelegenen Sonde, die somit ein 5'-Phosphatterminus besitzt, können die beiden Sonden dann ligiert werden. Der Ort der Ligation wird mit einem Pfeil in Rahmen 1c gezeigt.
In dem einfachsten Fall mit glatten Enden ohne Fehlpaarung muß der 5'-Terminus der stromabwärts gelegenen Sonde nichtphosphoryliert sein. Andernfalls ist ein 5'-nicht-phosphorylierter Terminus nicht erforderlich, obwohl er bevorzugt ist, wie oben in Verbindung mit den bevorzugten Ausführungen der Fig. 2 und 3 definiert. In glatten Sondenkonfigurationen mit terminalen oder internen Fehlpaarungen diktiert eine Fehlpaarung WRTT in der stromabwärts gelegenen Sonde notwendigerweise eine Fehlpaarung WRTP, aber dies ist die einzige Situation, wo dies notwendigerweise wahr ist. Wie zuvor kann die Antwort der fehlgepaarten Basen an den 5'-Ende zwischen 1 und 5 liegen, und bevorzugt 1 oder 2.
Die derzeit bevorzugte Variante von glatt begrenzten Sonden ist eine stromabwärts liegende Sonde mit einem 5'-nicht-phosphoryliertem Terminus und terminalen oder internen Fehlpaarungen WRTP und WRTT wie in den Fig. 2 und 3 gezeigt.

B. Nicht glatt begrenzte Konfigurationen

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls nicht glatt begrenzte Sonden. Hier ist zumindest eine stromaufwärts gelegene Sonde nicht mit seiner komplementären stromabwärts gelegenen Sonde co-terminal. Es gibt zwei Möglichkeiten: (1) 3'- Verlängerungen (in der stromaufwärts gelegenen Sonde) und (2) 5'-Verlängerungen (in der stromabwärts gelegenen Sonde). Es ist zu bemerken, daß "Verlängerungen" definiert werden bezüglich einem Komplement der Sonde und nicht bezüglich seines Ligationspartners und daß diese nicht von der gleichen Art oder Länge an den gegenüberliegenden Seiten sein müssen. Wenn zwei Sätze von Sonden verwendet werden und beide Sätze den gleichen Typ (z. B. entweder 5' oder 3') von Verlängerungen verwenden, können die Verlängerungen zueinander hybridisierbar sein, (wobei klebrige Enden gebildet werden) oder nicht-hybridisierbar sein (wobei keine klebrige Enden gebildet werden). Falls die Verlängerungen nicht-hybridisierbar miteinander sind, sind die Verlängerungen vorzugsweise zwischen einer bis etwa zehn Basen stärker bevorzugt zwischen einer bis etwa fünf Basen, und am meisten bevorzugt zwischen einer oder zwei Basen Länge. Falls die Verlängerungen hybridisierbar miteinander sind, sind die Verlängerungen vorzugsweise kürzer; z. B. von einer bis etwa vier Basen, vorzugsweise nur eine oder zwei Basen lang. Dort wo die Sonden eine 3' - oder 5' -Verlängerungen haben und wenn diese hybridisierbar sind, wird es bevorzugt, daß die stromabwärts gelegene Sonde nicht-phosphorylierte 5'-Termini zusätzlich zu jeder anderen Art von Ligationsinkompetenz hat.

(1) 3'-Verlängerungen

Mit 3'-Verlängerungen kann die erste und die zweite stromabwärts gelegene Sonde ebenfalls 5'-terminale oder -interne Fehlpaarungsbasen hinsichtlich der jeweiligen komplementären Sonden aufweisen. Wenn eine 5'- zu 3'-Polymerase verwendet wird, sollten die Basen in den 3'-Verlängerungen komplementär zu dem Ziel sein, wogegen alle oder einige der Basen in den 5'- Verlängerungen entweder komplementär oder nicht-komplementär zu dem Ziel sein können.
Ein Beispiel von Sonden mit hybridisierbaren 3'-Verlängerungen wird in Fig. 7 dargestellt. Wie in Fig. 7a gezeigt sind die Verlängerungen: ein "T" auf Sonde 1 und ein "A" auf Sonde 4. Da "A" komplementär ist, sind die Verlängerungen zueinander hybridisierbar und die Sonden könnten unabhängig vom Ziel ligiert werden, außer wenn das 5'-Ende nicht-phosphoryliert ist. Die Korrektur wird in Anwesenheit einer Polymerase, einer Ligase und einem dNTP Pool durchgeführt, der 2'-Deoxythymidin 5'- Triphosphat (dTTP) und 2'-Deoxyguanosin 5'-Triphosphat (dGTP) enthält. Die Polymerase entfernt das 5'-Hydroxylende der stromabwärts gelegenen Sonde, um ein verfügbares 5'-Phosphat freizustellen, "p", während die stromaufwärts gelegene Sonde verlängert wird, bis sie an die korrigierte stromabwärts gelegene Sonde anstößt, um so die Ligation der beiden Sonden zu gestatten.
In einer weiteren Ausführungsform, die 3'-nicht-hybridisierbare Verlängerungen (nicht gezeigt) umfaßt, sind die 3'- Verlängerungen miteinander nicht-hybridisierbar. Die Verlängerungen können nicht-hybridisierbar miteinander gemacht werden, in dem eine ausreichende Anzahl von Basen enthalten ist, welche nicht-komplementär sind. Da 3'-Enden mit dem Ziel hybridisierbar sein sollten, um das bevorzugte Polymerasemittel aufzunehmen, führt das nicht-hybridisierbar Machen dieser Verlängerungen miteinander dazu, daß es notwendigerweise eine Lücke geben wird, die zwischen den aufeinanderfolgenden hybridisierten Sonden liegt. Falls Lücken enthalten sind, können diese zwischen 1 und 20 Basen lang sein; praktischer Weise werden jedoch viel kürzere Lücken bevorzugt, beispielsweise von 1 bis 3 oder 5 Basen, Die Ziele, Sonden und dNTP-Reagenzien sollten so gewählt werden, daß diese Lücke mit der Ersetzung jeder "korrigierten" Base von dem 5'-Ende der modifizierten stromabwärts gelegenen Sonde gefüllt werden kann.

(2) 5'-Verlängerungen

Eine Beispiel für nicht glatt begrenzte Sonden mit 5'- hybridisierbare Verlängerungen ist in Fig. 5 gezeigt. Wie im Rahmen 5a gezeigt, sind die Verlängerungen "A" an der Sonde 2 und "T" an der Sonde 3. In diesem Fall werden die Verlängerungen miteinander hybridisierbar, da "A" komplementär zu "T" ist, aber keins ist komplementär mit dem G : C Paar in dem Ziel. Die stromabwärts gelegenen Sonden 2 und 3 haben ebenfalls 5'- Hydroxyltermini. Die Korrektur erfolgt mittels einer Polymerase, einer Ligase und eine dNTP Pool, welcher 2'-Deoxycytidin 5'- Triphosphat (dCTP) und 2'-Deoxyguanosin 5'-Triphosphat (dGTP) enthält. Die Polymerase entfernt jeden 5'-Hydroxylterminus zusammen mit der Base, die ein Fehlpaar mit dem Ziel bildet und mit der passenden Base, die unmittelbar stromabwärts von der fehlgepaarten terminalen Base liegt. Die Polymerase verlängert ebenfalls die stromabwärts gelegene Sonden 1 und 4 mit dCTP und dGTP, um die ligationskompetenten Enden zu erzeugen.
In einer weiteren Ausführung, jene von 5'-nicht-hybridisierbaren Verlängerungen, sind die Verlängerungen miteinander nicht-hybridisierbar. Für alle der Sondenpaare mit 5'-Verlängerungen, falls eine 5'- zu 3'-DNA-Polymerase und eine Deoxyribonukleosid 5'-Triphosphat (dNTP) Pool in der Reaktionsmischung verwendet werden, ist es vorzuziehen, daß die 5'-Verlängerung nicht-komplementär mit dem Ziel ist. Falls dies zutrifft, wird der dNTP Pool, der zur Korrektur verwendet wird, die Basen beinhalten, welche komplementär zu der Verlängerung sind, und die DNA-Polymerase kann die stromaufwärts gelegene Sonde unabhängig vom Ziel "end-polieren". "Endpolieren" kann auftreten bei 5'-Verlängerungen, unter Verwendung der Verlängerung als eine Matrize für die Polymerase, um die komplementäre stromaufwärts gelegene Sonde zu verlängern. End- Polierung ist zwar nicht fatal für die Erfindung, aber es kann im Fall von 5'-Verlängerungen dazu kommen, daß der Fall von glatten End-Sonden erzeugt wird. Demzufolge in dem Fall, wenn eine stromabwärts gelegene Sonde mit einer 5'-Verlängerung verwendet wird, sollte das 5'-Ende dieser Sonde eins- oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweisen: (1) einen nichtphosphoryliertes Terminus; (2) falls ein anderer Satz von Sonden ebenfalls eine stromabwärts gelegene Sonde mit einer 5'- Verlängerung enthält, sollten diese beiden Verlängerungen miteinander nicht-hybridisierbar sein, und zwar unter einer spezifischen Testbedingung; und (3) nicht-komplementäre Basen WRTT.
Unter Verwendung von Fig. 4 als ein Beispiel, sind die 5'- Verlängerungen, die gezeigt sind (GGG) weder miteinander noch mit dem Ziel hybridisierbar. Der Rahmen 4b zeigt, was passieren wird, wenn die Sonden 1 und 2 mit dem Ziel hybridisieren. Aufgrund der Tatsache, daß die 5'-Verlängerung eine Fehlpaarung mit dem Ziel bildet, dissoziiert sie und wird "lose", womit sie ein gutes Substrat für eine exonukleolytische Aktivität ist. Die Korrektur verwendet Polymerase, dTTP und Ligase. Die exonukleolytische Aktivität trennt die drei G-Reste ab und mindestens einen T-Rest, um eine 5'-Phosphatgruppe offenzulegen. Die Polymerase fügt mindestens einen T-Rest an den 3'-Terminus der Sonde 1 (zwei hinzugefügte sind gezeigt), aber stopt an der Matrize G, da dCTP nicht bereitgestellt ist. Die Ligation tritt an den Pfeil von Rahmen 4b auf.
Obwohl in den Figuren die komplementären Sondenpaare (Sonden 1 und 3; und Sonden 2 und 4) die gleichen Formate modifizierter Sonden zeigen, können die beiden Sondenpaare unterschiedlich sein. Beispielsweise können die Sonden 1 und 3 in einem Format von glatt begrenzenten Sonden sein, wogegen die Sonden 3 und 4 ein unterschiedliches Format von glatt begrenzten Sonden sein oder ein Format von nicht glatt begrenzten Sonden, und umgekehrt. Die Variationen werden beschränkt beispielsweise durch das Bedürfnis einen dNTP Pool zu verwenden, welcher einen oder mehr Basentypen vermeidet, um eine "Stopbase" zur Verfügung zu stellen und/oder um End-Polierung zu vermeiden, wie oben diskutiert.

IV. Verfahren, die eine 5' zu 3' Exonuklease/Polymeraseaktivität verwenden

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet eine DNA- Polymerase mit DNA-Synthese abhängiger, strangersetzender 5' zu 3' Exonukleaseaktivität ebenso wie eine 5' zu 3' Polymerisationsaktivität (Gelfand, D., Tag DNA Polymerase in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, H. A., Ed., Stockton Press, N. Y. (1989) Kapitel 2). Tag DNA-Polymerase hat nachweislich diese Aktivität, und eine ähnliche Aktivität wurde demonstriert in der thermostabilen DNA- Polymerase vom Thermus Stamm, kommerziell erhältlich von Molecular Biology Resourses (MBR), Milwaukee, Wisconsin. Im Anwesenheit der geeigneten dNTP(s), werden diese DNA-Polymerasen eine Synthese von dem 3'-Hydroxylterminus einer Sonde, die an eine Ziel-DNA hybridisiert ist, beginnend, entlang der DNA-Ziel- Matrize fortschreiten, wobei stromabwärts gelegene hybridisierte DNA-Sequenzen abgebaut werden, und diese in dem Vorgang ersetzt werden. In der vorliegenden Erfindung ist die stromabwärts gelegene DNA die stromabwärts gelegene Sonde.

A. Nachweisverfahren

Die Verfahren der Erfindung können verwendet werden als einfacher Nachweis von Zielnukleinsäure oder als eine Amplifikationstechnik. Zum Nachweis müssen nur zwei Sonden (ein Satz), wobei das stromabwärts gelegene an seinem 5'-Ende verändert ist, verwendet werden. In Anwesenheit von Ziel wird die Veränderung korrigiert wie oben beschrieben und die Sonden werden ligiert. Das Ligationsereignis kann überwacht werden als ein Maß des Vorhandenseins von Ziel durch jedes der veröffentlichten Verfahren. Die Nachweistechnik ist analog zu jenen beschrieben, beispielsweise in EP 185 494 und EP 246 864 aber haben die Verbesserung der reduzierten Ziel unabhängigen Ligation. Die Hybridisierung-, Korrektur- und Ligationsschritte sind identisch mit jenen, die in Verbindung mit Amplifikationsverfahren nachfolgend diskutiert werden, aber müssen nur auf einem Satz von Sonden durchgeführt werden. Wiederholungen sind nicht notwendig.

B. Amplifikationsverfahren

Diese Erfindung ist jedoch am Besten angepaßt zur Verwendung in einem Verfahren, welches die Amplifikation der Zielsequenz umfaßt, wie z. B. die Ligasekettenreaktion (LCR). Die Amplifikation liefert verbesserte Sensitivität und erlaubt den Nachweis viel niedrigerer Spiegel der Ziel DNA. Die lineare Amplifikation ist erzielbar durch das Wiederholen mit nur einem Sondensatz, wogegen eine exponentielle Amplifikation zwei Sondensätze verwendet, wobei eines komplementär ist zu dem anderen. Wie angewendet bei der LCR wird eine stromabwärts gelegene Sonde, welche ein 5'-Ende umfaßt, welches ligationsinkompetent ohne Korrektur ist, verwendet. Diese Modifikation verhindert die zielunabhängige Ligation der Sonden. Zusätzlich hybridisieren in Anwesenheit einer Zielnukleinsäuresequenz nahe LCR-Sonden, sind jedoch nicht ligierbar. Sequenzinformationen welche in der Ziel-DNA enthalten sind, werden verwendet als eine Matrize zur Korrektur des ligationsinkompetenten Endes. Eine DNA-Polymerase mit syntheseabhängiger, strangersetzender 5' zu 3' Exonukleaseaktivität kann verwendet werden um die stromaufwärts liegende Sonde zu verlängern und um die stromabwärts liegende Sonde zu hydrolysieren unter Verwendung der Zielnukleinsäure als eine Matrize. Durch Verwendung eines Untersatzes von vier dNTPs, welche benötigt werden zur DNA-Synthese, kann die Verlängerung einer stromaufwärts gelegenen Sonde (und daher die Hydrolyse einer stromabwärts gelegenen Sonde) gesteuert werden, insofern daß wenn eine Matrizenbase in dem Ziel erreicht wird, zu welcher keine komplementäre dNTP vorhanden ist, die Synthese (und Hydrolyse) endet. Die entstehende stromabwärts gelegene Sonde enthält ein 5'-Phosphat, welches angrenzend ist zu dem 3'- Hydroxylterminus der verlängerten stromaufwärts gelegenen Sonde. Angrenzende Sonden bilden somit ein geeignetes Substrat zur Ligation durch eine DNA-Ligase.
In einem folgenden Schritt werden die ligierten Sonden getrennt und werden zu einem "Ziel" für einen zweites Satz von Sonden, welche komplementär sind zu dem ersten Satz. Der zweite Satz benutzt vorzugsweise auch die modifizierten Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren von Hybridisierung, (wahlweise Korrektur) und Ligation werden wiederholt für den zweite Sondensatz.
Im allgemeinen umfaßt das bevorzugte Amplifikationsverfahren wiederholte Schritte von (a) Hybridisieren der ligationsinkompetenten modifizierten Sonden an das Ziel; (b) Korrigieren der Modifikation in einer zielabhängigen Art und Weise, um die Sonden bindungsfähig zu machen; (c) das Ligieren der korrigierten Sonde an seinem Partner um ein fusioniertes oder ligiertes Produkt zu bilden; und (d) das Dissoziieren des fusionierten Produktes von dem Ziel und das Wiederholen der Hybridisaton-, Korrektur- und Ligationsschritte für mehrere Male für jeden Sondensatz um die gewünschte Zielsequenz zu amplifizieren. Wenn das Ziel doppelsträngig ist, werden die obigen Schritte ebenfalls angewendet auf das Zielkomplement, unter Verwendung der Sonden 3 und 4 des zweiten Satzes. Aber selbst ohne ein doppelsträngiges Ziel, werden die Sonden 3 und 4 vorzugsweise verwendet um die ligierten Sonden 1 und 2 zu amplifizieren und/oder nachzuweisen. Ähnlich dienen die ligierten Sonden 3 und 4 als Ziel für die Sonden 1 und 2 zum weiteren Nachweis. Demgemäß kann eine Amplifikation der Zielsequenz erzielt werden durch Verwendung eines Überschusses der Sonden 1, 2, 3 und 4 und Assaybedingungen, welche Wiederholungen umfassen.

1. Hybridisation der Sonden an die Ziele

Die Hybridisation der Sonden an ihre Ziele (und wahlweise an die Zielkomplemente) wird ausreichend erklärt in dem Stand der Technik; z. B. EP-320,308 und EP-439,182. Die Sondenlänge, Sondenkonzentration und die Strenge der Bedingungen beinflussen alle das Ausmaß um die Geschwindigkeit bei welcher Hybridisation auftreten wird. Vorzugsweise sind die Sonden ausreichend lang um die gewünschte Spezifität zu liefern; z. B. um zu verhindern an zufällige Sequenzen in der Probe hybridisierbar zu sein. Üblicherweise können Sonden der Größenordnung von 10 bis 100 Basen diesen Zweck dienen. Derzeit bevorzugt sind Sonden, mit einer Länge von ungefähr 15 bis ungefähr 40 Nukleotiden, üblicherweise etwa 20 Nukleotiden.
Die Sonden werden vorzugsweise in etwa äquimolarer Konzentration hinzugefügt, da von ihnen erwartet wird stoichiometrisch zu reagieren. Mehr bevorzugt ist jede Probe in einer Konzentration von etwa 5 Nanomolar (nM) bis etwa 90 nM vorhanden; vorzugsweise von etwa 10 nM bis etwa 50 nM. Die optimale Menge, einer Sonde, die für jede Reaktion verwendet wird, hängt ebenfalls ab von der Anzahl von Wiederholungen, welche durchgeführt werden müssen. Die optimalen Konzentrationen können von jedem, der im Fachgebiet bewandert ist, bestimmt werden.
Die Strenge der Bedingungen ist im allgemeinen jenen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt und ist abhängig von der Temperatur, dem Lösungsmittel und anderen Parametern. Möglicherweise ist das am leichtesten zu kontrollierede, dieser Parameter die Temperatur und daher ist es im allgemeinen der Reaktionsparameter, der in der Durchführung der LCR variiert wird. Temperaturen zur Hybridisation sind üblicherweise so gewählt, daß sie nur gering (z. B. 1 bis etwa 10ºC) unterhalb der Schmelztemperatur der verwendeten Sonden liegt. Die Hybridisationsbedingungen, die erforderlich sind zur Durchführung dieser Erfindung sind ähnlich zu jenen der normalen LCR, und können bestimmt werden durch jene, die im Fachgebiet bewandert sind.

2. Korrektur der Sonden

Die Korrekturmechanismen wurden oben beschrieben, und werden hier angewendet als Verfahrensschritte. Die bevorzugten Korrekturreagenzien sind matrizenabhängige DNA-Polymerasen (wie ebenfalls als "zielabhängige DNA-Polymerasen" bezeichnet) welche sowohl 5' zu 3' Exonuklease- und Polymerisationsaktivitäten aufweisen. Diese umfassen Thermus aquaticus (Taa) und andere Thermus sp. DNA-Polymerasen. Es ist zu bevorzugen Polymerasen zu verwenden welche den Hochtemperaturwiederholungen wiederstehen können, die für LCR benötigt werden. Wenn die Polymerase nicht thermisch stabil ist, muß sie üblicherweise bei jeder LCR- Wiederholung erneut hinzugefügt werden. Die Polymerase kann natürlich auftretend oder nicht natürlich auftretend sein, z. B. rekombinant hergestellt sein. Polymerasen, welche verwendet werden können, um diese Erfindung auszuführen, umfassen ebenfalls Fragmente von Polymerasen und Polymerasen mit Polymerisationsaktivität, mit oder ohne zielabhängiger Exonukleaseaktivität. Die Polymerasen müssen keine zielabhängige Exonukleaseaktivität besitzen, wenn ebenfalls ein separater exonukleolytischer Wirkstoff verwendet wird.
Die Korrektur in dieser Art und Weise erfordert das Vorhandensein in der Reaktionsmischung von dNTP's welche komplementär sind zu den Basen des Ziels. Die dNTP's sind kommerziell erhältlich von einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Pharmacia (Piscataway, NJ) und Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD). Wie oben erwähnt kann ein Untersatz von dNTP's verwendet werden, so daß eine Stopbase die Synthese und Degradierungsreaktionen an zuvor festgelegten Endpunkten limitieren wird. Als eine Alternative oder in Verbindung können Verknüpfungen, welche resistent sind gegen Hydrolyse durch Nukleasen, wie z. B. die obige Exonuklease oder Polymerase mit Exonukleaseaktivität, verwendet werden, in der stromabwärts gelegenen Sonde. Beispiele von nukleaseresistenten Verknüpfungen sind Phosphothioat- und
Methylphosphonatverknüpfungen. Diese Arten von Verknüpfungen können in LCR-Sonden eingebracht werden, während der Synthese dieser Sonden, an Positionen wo die Degradierung und Synthese beendet werden soll, und die Korrektur könnte somit eingeschränkt werden ohne den dNTP Pool zu limitieren, oder zusätzlich zur Limitation des dNTP Pools.

3. Ligation der korrigierten Sonden

Die enzymatische Ligation ist das bevorzugte Verfahren der kovalenten Anheftung der korrigierten Sonden. Jedoch kann die Ligation erzielt werden durch jedes Verfahren zur kovalenten Anheftung zweier Sonden wie z. B. die Fotoligation wie beschrieben in EP-A-324,616.
Die Bedingungen und Reagenzien für den bevorzugten enzymatischen Ligationsschritt sind durch jene die im Fachgebiet bewandert sind bekannt und sind beschrieben in den Referenzen erwähnt in dem "Hintergrund" Abschnitt. Beispiele von ligierenden Reagenzien umfassen prokaryotische Ligasen wie die E. coli Ligase, T4 Ligase, Thermus thermophilus Ligase (z. B., ATCC 27634) wie beschrieben in EP-320,308 und Thermus aauaticus Ligase (z. B. wie beschrieben in WO 91/17239). Die beiden letzteren Ligasen sind bevorzugt, da sie ihre Ligaseaktivität erhalten, während der thermischen Wiederholung der LCR. Ohne eine thermisch stabile Ligase muß die Ligase erneut eingebracht werden, jedesmal wenn der Zyklus wiederholt wird. Ebenfalls nützlich sind eukaryotische Ligasen, einschließlich DNA-Ligase der Drosophilia, beschrieben durch Rabin, et al., J. Biol. Chem. 261: 10637-10647 (1986).
Einmal ligiert, wird die fusionierte Sonde dissoziiert von dem Ziel und wie bei der konventionellen LCR wird der Vorgang wiederholt für mehrere Zyklen. Die Anzahl der Wiederholungszyklen kann variieren von 1 bis etwa 100, vorzugsweise von etwa 15 bis 70. Nach der Amplifikation werden die Ligationsereignisse nachgewiesen durch jedes der bekannten oder veröffentlichten Verfahren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt Verfahren, unter Verwendung der obigen modifizierten Sonden zur Detektion der Unterschiede in der Nukleinsäuresequenz der Ziele. Dieses Verfahren kann verwendet werden um Mutationen zu suchen, wie z. B. Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Rasterverschiebungen; zur Identifikation von DNA-Polymorphismen, welche nützlich sind z. B. zum genetischen Mapping; und um selbst zwischen Arzneistoff resistenten und Arzneistoff sensitiven Strengen von Mikroorganismen zu unterscheiden wie z. B. Bakterien ohne das Bedürfnis diese zunächst zu kultivieren.
Der Nachweis wird durchgeführt, beispielsweise, unter Verwendung von Sonden mit fehlgepaarten Basen (WRTT) und dNTP Pool, bei welchem die komplementären Basen der fehlgepaarten Basen fehlen. Als Beispiel falls das T-A-Basenpaar an der Position 378 in der Chlamydia MOMP 354-401 Sequenz (Zhang, Y.- X., et al. Nucleic Acid Res., 18: 1061 (1990)) (siehe Tabelle 1) getauscht wurde gegen ein C-G Basenpaar, würde die Korrekturreaktion welche die Sonden 354.1, 354.2B, 354.3B und 354.4 verwendet nicht weiter fortschreiten wie beschrieben in Beispiel 2. Die Verlängerung der Sonde 354.1 (erste stromaufwärts gelegene Sonde) würde verhindert werden da nur dTTP in der Reaktion vorhanden ist. Deshalb folgt daraus, daß das ligationsinkompetente 5'-Ende der Sonde 354.2B (erste stromabwärts gelegene Sonde) nicht korrigiert werden könnte. Zusätzlich wäre die Wirksamkeit der Verlängerung der Sonde 354.4 (zweite stromaufwärts gelegene Sonde) beeinträchtig sein, da sein 5'-Ende fehlgepaart wäre hinsichtlich des Ziels. Als ein Ergebnis wäre die Amplifikation der Zielsequenz, welche die Punktmutation enthält, komplett eliminiert oder stark reduziert. Daraus folgt das abhängig von dem verwendeten Sondenformat die Position der Punktmotation verändert werden kann. Beispielsweise unter Verwendung des terminal fehlgepaarten Formates wäre ein Unterschied in der Base in der Position 378 oder 379 nachweisbar da das derzeitige Verfahren für dieses Format die Ersetzung mindestens einer der gepaarten Basen über diese Fehlpaarung wie oben beschrieben hinaus erfordert.
Es wurde beschrieben in WO 92/02638 das die polymerisationsunabhängige Abtrennung von Oligonukleotiden durch Tag Polymerase möglich ist. Die vorliegende Erfindung zeigt ein Verfahren welches diese berichtete Aktivität zum Nachweis von ligierten Sonden in der Abwesenheit von Polymerisation verwendet.
Dieses Verfahren verwendet Sonden mit 5'-Verlängerungen, welche nicht-hybridisierbar sind mit dem Ziel (analog zur Fig. 4, um ein "loses", überlappendes Ende zu erzeugen). Diese Sonden können oder können nicht 5'-nicht-phosphorylierte Termini umfassen. Gemäß dem Verfahren sind die Sonden so entwickelt, daß die zielabhängige Exonuklease (oder Polymerase mit zielabhängiger Exonuklease) den Überhang entfernt, so daß die hybridisierten Sonden angrenzend werden und eine Ligation auftreten kann.
Die Amplifikation kann erzielt werden durch den Zusatz eines zweiten Satzes von Sonden, welche Überlappungen bilden können, wenn sie mit dem Zielkomplement hybridisiert werden. Die obigen Schritte der Hybridisation, Korrektur und Ligation werden durchgeführt in Anwesenheit eines Überschusses aller 4 Sonden, aber kein dNTP Pool wird verwendet und eine einfache Exonuklease kann verwendet werden. Wie zuvor umfaßt die Amplifikation den zusätzlichen Schritt des Trennens der hybridisierten und ligierten Sonden von ihren Zielen oder Zielkomplementen, wodurch die ligierten Sonden als Zielkomplemente oder selbst als Ziele dienen für weitere Wiederholungen der Hybridisation, Korrektur und Ligation.

V. Detektionsarten

Nach der Korrektur und Ligation können die LCR- Reaktionsprodukte, unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind detektiert werden. Beispielsweise kann das Ligationsereignis überwacht werden durch Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von ligiertem Produkt. Da es länger ist, als die einzelnen Sonden kann diese Bestimmung durchgeführt werden auf der Basis des Molekulargewichtes. Selbst ohne, daß Markieren der Proben kann ein gefärbtes Band an der genauen Länge oder mit dem Molekulargewicht das Ligationsereignis und damit das Vorhandensein von Ziel anzeigen.
Alternativ können eins oder beide Sonden eines Satzes markiert werden unter Verwendung der meisten der bekannten Techniken. Beispielsweise können die LCR-Sonden markiert werden, entweder als ein Teil des synthetischen Verfahrens (unter Verwendung beispielsweise der Linkerarmtechnologie beschrieben in US 4,948,882); manuell unter Verwendung reaktiver Gruppen (wie z. B. Aminomodifizierer IITM, Clontech, Palo Alto, California) welche hinzugesetzt werden während der Synthese der Sonden; oder enzymatisch nach der Synthese der Sonden. In einer weiteren bevorzugten Ausführung werden die komplementären Sonden 1 und 3 synthetisiert mit einer Art von Marker (z. B. das 5'- Ende der Sonde 1 und das 3'-Ende der Sonde 3) und die komplementären Sonden 2 und 4 sind wie in den Figuren gezeigt, synthetisiert mit einem zweiten unterschiedlichen Marker (z. B. das 3'-Ende der Sonde 2 und das 5'-Ende der Sonde 4). Dadurch hätten die unligierten komplementären Sonden nur eine Art von Marker, wogegen die ligierten Produkte beide Arten von Marker tragen würden. Die amplifizierten LCR-Reaktionsprodukte können dann nachgewiesen werden, in dem der erste Marker mit einer festen Phase gefangen wird, die feste Phase von der Lösung getrennt wird und indem der zweite Marker, der mit der festen Phase assoziiert ist, detektiert wird. Unvollständige Produkte, wie z. B. individuelle unligierte Sonden oder komplementäre Sondenduplexe, die während der Reaktion gebildet werden, wären unfähig, um an der festen Phase gefangen zu werden, oder für den Markernachweis, oder beides.
Ein alternatives Markierungsverfahren bringt einen Marker in die dNTP's ein, welche zur Korrektur verwendet werden. Eine solche Markierung ist im allgemeinen eine Art der konventionellen organischen Chemie. Linker oder Spacer können verwendet werden, sind jedoch nicht essentiell. Es ist nur wichtig, das die modifizierten dNTP's eingebracht werden gegenüber seinem Komplement auf dem Zielstrang. In einer weiteren Nachweisalternative wird das Ligationsereignis überwacht durch die Überwachung der nukleolytischen Degradation der stromabwärts gelegenen DNA-Sequenzen. Wie erwähnt führt diese nukleolytische Aktivität zur Freisetzung von mono, di und größeren Nukleotidfragmenten. Daher kann die vorliegende Erfindung ebenfalls verwendet werden um das Vorhandensein eines Ziels nachzuweisen durch den Nachweis solcher freigesetzter Fragmente. Verschiedene Strategien können verwendet werden. Dies könnte erreicht werden, beispielsweise durch das markieren des 5'-Endes der stromabwärts gelegenen Sonde mit einer chemischen Gruppe, welche nachgewiesen werden könnte. Das freigesetzte Fragment wäre von einem viel niedrigeren Molekulargewicht als die Sonde und sollte leicht unterscheidbar sein unter Verwendung einer Vielzahl von Nachweismethodiken, wie z. B. Gelelektophorese, oder chromatographische Techniken. Es wird im allgemeinen bevorzugt ein homogenes Nachweissystem zu verwenden, soweit möglich. Das Ligationsereignis kann homogen nachgewiesen werden falls ein fluoreszierender Marker an das abgeschnittene Fragment angeheftet ist. Die Spineigenschaften eines solchen Markers werden ausreichend variieren zwischen dem dem abgetrennten und nicht abgetrennten Zustand, um einen Nachweis durch Fluoreszenzpolarisation zu gestatten. Dies ist nicht nur eine homogene Nachweismethode, aber es kann ebenso verwendet werden zur Überwachung des Abblaufes einer Amplifikationsreaktion in Zwischenstadien. Ein spezifisches Beispiel welches den Nachweis von freigesetzten Fragmenten durch Fluorisationspolarisation zeigt, ist unterhalb beschrieben in Beispiel 6.
Ein zweites homogenes Verfahren umfaßt die Anheftung eines fluoreszierenden "Donors" zu der stromabwärts gelegenen Sonde an einer 3'-Position der Stopbase und die Anheftung eines geeigneten Auslöschers oder Blockerverbindung in dem abgetrennten Bereich an dem 5'-Ende. Selbstverständlich ist die umgekehrte Ausrichtung von Fluoreszenzgeber und Ausschlöschstoff ebenfalls möglich. In jeder Ausrichtung wird die Fluoreszenz ausgelöscht oder geblockt bei nicht reagierten Sonden bis die Korrektur eintritt. Nach dem Abtrennen des 5'-Fragmentes durch nukleolytische Aktivität werden der Auslöschstoff und der Fluoreszenzgeber getrennt und damit kann Fluoreszenz beobachtet werden.
Die Fluoreszenzauslöschung als eine Immunoassaytechnik ist im Fachgebiet wohl bekannt und ist beschrieben, beispielsweise in US 4,174,384. Beispiele von
Fluoreszenzgeber/Auslöschstoffpaaren umfassen die folgenden Verbindungen.
a) Fluorescein (Isothiocyanat oder andere Derivate) mit jeder der folgenden Auslöschstoffe: Sulforhodamin 101, Sulfonylchlorid (Texas Rot); Succinimidyl 1- Pyrenbutyrat; Tetramethylrhodamin (TMR); Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC); Eosin-5- isothiocyanat (EITC); Erythrosin-5-isothiocyanat;
b) Texas Rot mit Malachitgrün Isothiocyanat; und
c) 7-Amino-4-methylcoumann-3-essigsäure, N- Hydroxysuccinimidylester mit entweder 4-(Dimethylaminophenylazo)benzoesäure, N-Hydroxysuccinimidylester (DABCYL NHS-Ester) oder 4- Dimethylaminoazobenzensulfonylchlorid (Dabsylchlorid).
Diese und andere Fluoreszenzstoff/Auslöscherpaare sind leicht verfügbar, entweder kommerziell oder aus der Literatur.

VI. BEISPIELE

Die Erfindung wird nun weiter beschrieben durch die Beispiele. Die Beispiele sind illustrativ für die Erfindung und sollen sie nicht in irgendeiner Art und Weise einschränken. In den folgenden Beispielen werden die Mengen von Polymerase in Einheiten ausgedrückt, wie definiert durch den Hersteller (Melocular Biology Resources). Die Einheiten des Ligaseenzyms werden hierin definiert als 1 mg von 95%iger gereinigter Thermus thermophilus DNA Ligase mit einer spezifischen Aktivität von etwa 1 · 10&sup8; Einheiten. Obwohl es nicht präzise standartisiert ist und bis zu 20% variieren kann, liegt die Optimierung leicht innerhalb des Kenntnisstandes des routinierten Praktiker.

BEISPIEL 1

Das Folgende stellt beispielhaft die Amplifikation unter Verwendung von zwei Sätzen von Sonden dar, wobei jeder Satz von Sonden eine stromabwärts gelegene Sonde mit einer 5'- Verlängerung hat, welche aus drei Basen und einem 5'- Hydroxylterminus besteht. Die 5'-Verlängerungen der ersten und zweiten stromabwärts gelegenen Sonden sind nicht-hybridisierbar miteinander, auch nicht zu ihren jeweiligen Zielen (Analog zu Fig. 4).
LCR wurde durchgeführt für 75 Zyklen bestehend aus einer 30 sekündigen Inkubation bei 85ºC und einer 40 sekündigen Inkubation bei 55ºC in einem Coy Thermozykler. Die Reaktionen wurden vorbereitet mit entweder 10 Mikrogramm menschlicher Plazenta DNA (negative Kontrolle) oder 10 Mikrogramm menschlicher Plazenta DNA welche verschiedene Verdünnungen eines Chlamydia trachomatis positiven McCoy Zellysates (positive Kontrolle) enthielten. Eine 10&supmin;²-Terdünnung von McCoy Lysat enthält ca. 104 genomische Äquivalente von Chlamydia trachomatis DNA. Die LCR-Sonden, die verwendet wurden sind unten aufgelistet in Tabelle 1. Diese Sonden sind spezifisch für die Kartenposition 354-401 innerhalb des MOMP1 Gens von Chlamydia trachomatis (wie beschrieben in Zhang, Y.-X. et al., Nucleic Acid Res., 18: 1061 (1990).
Tabelle 1
Außer wenn anders angegeben, sind die folgenden Sequenzen aufgelistet in 5' zu 3' Richtung (links nach rechts). Sequenzidentifikationsnr. 1: Ziel: Chlamydia MOMP 354-401
*.1, .2, .3 und .4 nach jeder numerischen Bezeichnung geben jeweils die Sonden 1, 2, 3 bzw. 4 an.
Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem Puffer, welcher 50 mM EPPS pH 7, 8, 30 mM MgCl&sub2;, 20 mM KCl, 1 uM dTTP, 1 · 10¹² Moleküle jeweils von den Oligonukleotiden, bezeichnet als 354.1, 354.2A, 354.3A und 354.4 in Tabelle 1, 1 Einheit von Thermus DNA Polymerase (Molecular Biology Resources, Inc., Milwaukee, Wisconsin), und 5000 Einheiten von Thermus thermophilus DNA- Ligase in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern enthielt. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen 1 : 1 mit IMx® Verdünnerpuffer verdünnt und die LCR-Amplifikationsprodukte wurden nachgewiesen über einen Sandwichimmunoassay, der durchgeführt wurde unter Verwendung des Abbott IMx® automatisierten Immunoassaysystems.
Der Nachweis wutde durchgeführt wie folgt. In der Tabelle bezeichnet "Carb." Carbazol abgeleitetes Hapten und "Adam." bezeichnet Adamantan abgeleitetes Hapten. Diese Haptene wurden verwendet um die Oligonukleotide mit verschiedenen Markern zu markieren, wie zuvor beschrieben. Demgemäß wurden die ligierten Oligonukleotide ein Carbazol an einem Terminus aufweisen und ein Adamantan an den anderen Terminus zum Nachweis durch das IMx® Instrument (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) unter Verwendung der Mikropartikelenzymimmunoassaytechnologie (MEIA). Das Assayprotokoll ist ähnlich zu jenem verwendet in dem kommerziell verfügbaren alpha-Fetoproteinassay, mit den folgenden Anpassungen: (1) die anti-alpha-Fetoproteinantikörper beschichteten Mikropartikel werden ersetzt durch anti- Carbazolantikörper beschichtete Mikropartikel; und (2) die Konjugate von anti-alpha Fetoprotein Antikörper: alkalische Phosphatase werden ersetzt mit Konjugaten von anti-3-Phenyl-1- adamantanessigsäure Antikörper: alkalische Phosphatase.
Das Protokoll für die IMx® MEIA-Assays ist weiter beschrieben in EP-A-439,182 oberhalb. Kurz gesagt ist das Protokoll wie folgt. 100 ul von der Probe welche amplifiziert wurde durch LCR wurde pipettiert in die Probenkammer. 30 ul dieser Probe werden dann pipettiert in die Inkubationskammer, die anti-carbazolbeschichteten Mikropartikel werden dann der Kammer hinzugefügt. Eine geeignete Inkubationszeit folgt, welche die Bildung eines Komplexes gestattet, der aus Anticarbazol und Nukleinsäuresequenzen besteht, mit den Carbazolenden. Nach der Inkubation wird die Mischung pipettiert in die Glasfasereinfangmatrix der IMx® Reaktionszelle, und Antiadamantane konjugiert an alkalische Phosphatasen werden hinzugefügt. Das führt zu einem Mikropartikel-Oligonukleotid- Enzymkomplex welcher auf der Oberfläche der Glasfasereinfangmatrix bleiben wird. Nach der Entfernung des überschüssigen Reagenzes in einem Waschschritt (in diesem Protokoll absorbiert der Blotter unterhalb der Glasfasereinfangmatrix die Reagenzienlösungen welche andernfalls die Glasfasereinfangmatrix übergießen würden), die Glasfasereinfangmatrix wird behandelt mit 4- Methylumbelliferylphosphat (MUP). Das oberflächengebundene Enzym wandelt das nicht fluorogene MUP in 4-Methylumbelliferon (MU) um, dessen Fluoreszenz gemessen werden kann. Die numerischen Werte die in den folgenden Beispielen gegeben werden, sind die Geschwindigkeitsablesungen dieses Vorgangs, ausgedrückt in Zähler/Sekunde/Sekunde (cpss). Die Menge ligierter Sonden ist direkt bezogen auf diese Geschwindigkeitsablesung. Dieses Konzept der MEIA-Auslesung von markierten Oligonukleotiden ist beschrieben in der europäischen Patentanmeldung, Publikationsnr. 357,011, veröffentlicht 7. März 1990, "Detection und Amplification of Ziel Nucleic Acid Sequences" von Laffler, T. G., et al.
Doppelte Assays wurden durchgeführt und das durchschnittliche Resultat ist wie folgt:
Ziel IMx® Geschwindigkeit
0 11.23 ± 1
10&supmin;³ Verdünnung 1139.34 ± 100
10&supmin;&sup4; Verdünnung 359.99 ± 21
10&supmin;&sup5; Verdünnung 36.88 ± 9
Die obigen Resultate zeigen, das als die Menge der Zielsequenzen stieg, die Zahl der ligierten Sonden ebenfalls stieg.

Beispiel 2

Die folgende Zielamplifikation verdeutlicht die Verwendung von zwei Sätzen von glatt begrenzten Sonden, wobei die stromabwärts gelegenen Sonden 5'-Hydroxyltermini besitzten. Die LCR wurde durchgeführt für 100 Wiederholung bestehend aus einer 30 sekündigen Inkubation bei 85ºC und einer 40 sekündigen Inkubation bei 55ºC in einem Coy Thermocycler. Die Reaktionen wurden aufgestellt mit entweder 1 Mikrogramm menschlicher Plazenta DNA (negative Kontrolle) oder 1 Mikrogramm einer menschlichen Plazenta DNA welche verschiedene Verdünnungen von einem Chlamydia trachomatis positiven McCoy Zellysat (positive Kontrolle) enthielten. Die LCR Oligonukleotide, die verwendet wurden, waren wie aufgelistet in Tabelle 1 von Beispiel 1 oberhalb. Diese Oligonukleotide sind spezifisch für die Kartenposition 354-401 innerhalb des MOMP1 Gens von Chlamydia trachomatis. Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem Puffer, welcher 50 mM EPPS pH 7, 8, 30 mM MgCl&sub2;, 20mM KCl, 1uM dTTP, 1 · 1012 Moleküle von jedem der Oligonukleotide bezeichnet in Tabelle 1 als 354.1, 354.2B, 354.3B und 354.4 enthielt, 1 Einheit von Thermus DNA Polymerase und 5000 Einheiten von Thermus thermophilus DNA Ligase in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 Mikroliter.
Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen 1 : 1 verdünnt mit IMx® Verdünnerpuffer, und die LCR-Amplifikationsprodukte wurden nachgewiesen über einen Sandwichimmunoassay, der durchgeführt wurde unter Verwendung des Abbott IMx® automatischen Immunoassaysystems, wie beschrieben in Beispiel 1.
Dreifache Assays wurden durchgeführt und das durchschnittliche Resultat ist wie folgt:
Ziel IMx® Geschwindigkeit
0 17.18 ± 3
10&supmin;² Verdünnung 794.83 ± 130
10&supmin;³ Verdünnung 81.80 ± 23

Beispiel 3

Das Folgende verdeutlicht die Amplifikation mit zwei Sätzen von glatt begrenzten Sonden, wobei jede stromabwärts gelegene Sonde einen 5'-Hydroxylterminus aufweist, und eine einbasige terminale Fehlpaarung WRTT und WRTP.
Die LCR wurde durchgeführt für 70 Zyklen, bestehend aus einer 30 sekündigen Inkubation bei 85ºC und einer 40 sekündigen Inkubation bei 55ºC in einem Coy Thermocycler. Die Reaktionen wurden aufgestellt mit jeweils 1 Mikrogramm menschlicher plazentaler DNA (negative Kontrolle) oder 1 Mikrogramm menschlicher plazentaler DNA welcher eine 10&supmin;&sup4; Verdünnung eines Chlamydia trachomatis positiven McCoy Zellysates (positive Kontrolle) enthielt. Die LCR Oligonukleotide, die verwendet wurden, sind wie aufgelistet in Tabelle 1 von Beispiel 1 oberhalb. Diese Oligonukleotide sind spezifisch für die Kartenposition 354-401 innerhalb des MOMP1 Gens von Chlamydia trachomatis. Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem Puffer bestehend aus 50 mM EPPS pH 7, 8, 30 mM MgCl&sub2;, 20 mN KCl, 1uM dTTP, 1 · 10¹² Moleküle jeweils von den Oligonukleotiden bezeichnet in Tabelle 1 als 354.1, 354.2C 354.3C und 354.4, 1 Einheit von Thermus DNA-Polymerase und 5000 Einheiten von Thermus thermophilus DNA-Ligase in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern.
Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen 1 : 1 verdünnt mit IMx® Verdünnerpuffer und die LCR-Amplifikationsprodukte wurden nachgewiesen über einen Sandwichimmunoassay unter Verwendung des Abbott IMx® automatisierten Immunoassaysystems, wie beschrieben in Beispiel 1.
Doppelte Assays wurden durchgeführt und das durchschnittliche Resultat ist unterhalb gezeigt:
Ziel IMx® Geschwindigkeit
0 11.1 8± 1
10&supmin;&sup9; Verdünnung 1648.87 ± 120

Beispiel 4

Die folgende Amplifikation verwendete glatt begrenzte Sonden des gleichen Formates wie verwendet in Beispiel 3, aber mit unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen.
Die LCR wurde durchgeführt für 40, 50 oder 60 Zyklen bestehend aus einer 30 sekündigen Inkubation bei 85ºC und einer 25 sekündigen Inkubation bei 55ºC in einem Perkin-Elmer 480 Thermocycler (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). Die Reaktionen wurden aufgestellt mit entweder 1 Mikrogramm menschlicher plazentaler DNA (negativer Kontrolle) oder 1 Mikrogramm menschlicher plazentaler DNA, die 102 Chlamydia trachomatis Elementarkörper enthielt (positive Kontrolle). Die verwendeten LCR- Oligonukleotide sind wie aufgelistet in Tabelle 1 von Beispiel 1 oberhalb. Diese Oligonukleotide sind spezifisch für die Kartenposition 270-315 innerhalb des MOMP1 Gens von Chlamydia trachomatis. Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem Puffer bestehend aus 50 mM EPPS pH 7, 8, 30 mM MgCl&sub2;, 20 mM KCl, 1 uM MgCl&sub2;, 20 mM KCl, 1 uM dCTP, 1 · 10¹² Moleküle jeweils von den Oligonukleotiden bezeichnet in Tabelle 1 als 270.1, 270.2, 270.3 und 270.4 2 Einheiten Thermus DNA Polymerase und 5000 Einheiten von Thermus thermophilus DNA Ligase in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern.
Nach der Amplifikation wurden die Reaktonen 1 : 1 verdünnt mit IMx® Verdünnerpuffer und die LCR-Amplifikationsprodukte wurden nachgewiesen über einen Sandwichimmunoassay durchgeführt unter Verwendung von Abbott IMx® automatisierten Immunoassaysystems, wie beschrieben in Beispiel 1.
Doppelte Assays wurden durchgeführt und das durchschnittliche Resultat ist wie folgt:

Beispiel 5

Das folgende Beispiel verwendete zwei Sätze von Sonden wobei jede stromabwärts gelegene Sonde einen 5'-Hydroxylterminus und eine 5'-Verlängerung enthält, bestehend aus einer Base. Diese Verlängerungen waren aneinander hybridisierbar, jedoch nicht an ihre jeweiligen Ziele. Diese Sonden wurden verwendet um Hepatitis B Virus (HBV) spezifische Sequenzen in Serumproben nachzuweisen.
Die HBV spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die für die Sonden verwendet werden, wurden innerhalb dieses Beispiels verzeichnet gemäß Ono Y. et al., Nucleic Acid Res., 11, 1747- 1757 (1983). Falls nicht anders angegeben, sind die Sequenzen aufgelistet in 5' zu 3' Richtung (von links nach rechts) wobei "F" den Marker Fluorescein-5-isothioxyanat (FITC Isomer, Molecular Probes Inc.) bezeichnet und "B" stellt ein Biotinmolekül (Biotin-xx-NHS Ester, Clontech Laboratories Inc.) dar. Die Sondensequenz ist Base 666 bis Base 709 des HBV Subtyps ADW. Tabelle 2
Die Reaktionen wurden durchgeführt mit entweder HBV negativem Serum (negative Kontrolle) oder Serum welches entweder 1,4 · 10&sup5; oder 1,0 · 10³ HBV Genome enthielt. Die Serumproben wurden behandelt mit Proteinase K (50ºC, 3 Std.) und wurden auf 100ºC 15 Minuten lang erhitzt.
Die modifizierte LCR wurde durchgeführt für 55 Wiederholungen bestehend aus einer 30 sekündigen Inkubation bei 85ºC und 40 sekündiger Inkubation bei 50ºC in einem Perkin-Elmer 480 Thermozykler. Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem Puffer bestehend aus 50 mM EPPS pH 7,8, 30 mN MgCl&sub2;, 20 mM KCl, 1uM jeweils von dCTP und dGTP, 1 · 1012 Moleküle jeweils der Oligonukleotide bezeichnet als 666 : 1, 666 : 2, 666 : 3 und 666 : 4, 2 Einheiten Thermus DNA Polymerase, und 5000 Einheiten von Thermus thermophilus DNA-Ligase in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 Mikroliter. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen 1 : 1 verdünnt mit H&sub2;O und spezifische Ligationsprodukte wurden nachgewiesen über einen Sandwichimmunoassay auf einem Abbott IMx® automatisierten Immunoassaysystem. Das MEIA Protokoll zum Nachweis der ligierten Sonden war ähnlich zu den verwendet in Beispiel 1 oberhalb, außer daß folgendes verwendet wurde: (1) anti-Biotin Antikörper beschichtete Mikropartikel; und (2) die Konjugate von anti-Fluorescein Antikörper: alkalische Phosphatase. Die Resultate sind unterhalb gezeigt:
Zielmoleküle IMx® Geschwindigkeiten
0 13.37
1 · 10³ 32.19
1.4 · 10&sup5; 331.24

Beispiel 6

Die folgende Zielamplifikation verdeutlicht den Nachweis von freigesetzten Fragmenten von hybridisierten Sonden. Es verwendete stromabwärts gelegene Sonden mit einer einbasigen 5'- Verlängerung welche eine nachweisbare Fluoresceingruppe an ihren 5'-Termini enthielt. Diese Verlängerungen waren nicht aneinander und ihre jeweiligen Ziele hybridisierbar.
Die LCR wurde durchgeführt für 85 Zyklen bestehend aus einer 30 sekündigen Inkubation bei 85ºC und einer 40 sekündigen Inkubation bei 55ºC in einem Coy Thermocycler. Die Reaktionen wurden aufgestellt mit jeweils 1 Mikrogramm menschlicher plazentaler DNA (negativer Kontrolle) oder 1 Mikrogramm menschlicher plazentaler DNA welche 10&supmin;² Verdünnungen eines Chlamydia trachomatis positiven McCoy Zellysates (positive Kontrolle) enthielten. Die LCR-Oligonukleotide, die verwendet wurden, waren wie gelistet in Tabelle 1 von Beispiel 1 oberhalb. Diese Oligonukleotide sind spezifisch für die Kartenposition 354-401 innerhalb des MOMP1 Gens von Chlamydia trachomatis. Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem Puffer bestehend aus 50 mM EPPS pH 7,8, 30 mN MgCl&sub2;, 20 mM KCl, 1uM dTTP, 1 · 10¹² Moleküle jeweils der Oligonukleotide bezeichnet in Tabelle 1 als 354.1, 354.2D, 354.3D und 354.4, 1 Einheit von Thermus DNA-Polymerase, und 5000 Einheiten von Thermus thermophilus DNA-Ligase in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 Mikrolitern.
Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen 1 : 1 mit IMx® Verdünnerpuffer verdünnt, und die LCR-Amplifikationsprodukte wurden nachgewiesen über ein Sandwichimmunoassay durchgeführt unter Verwendung des Abbott IMx® automatisierten Immunoassaysystems, wie beschrieben in Beispiel 1.
Doppelte Assays wurden durchgeführt und das mittlere Resultat ist wie folgt:
Ziel IMx® Geschwindigkeiten
0 146.88 ± 95
10&supmin;² Verdünnung 2030.83 ± 50
Die freigesetzten Fragmente wurden nachgewiesen unter Verwendung von Fluoreszenzpolarisationstechnik unter Verwendung eines Abbott TDx® Fluoreszenzpolarisationsimmunoassayanalyzers (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Die Amplifikationsprodukte, die aus dem IMx® Detektionsassay verblieben, wurden verdünnt auf 200 ul mit IMx® Verünnerpuffer und die Fluoreszenzpolarisatonswerte für jede Probe wurden festgestellt. Die mittleren Resultate sind wie folgt:
Ziel TDx® Resultate
0 201.9 ± 0.5
10&supmin;² Verdünnung 93.07 ± 3
Die Polarisation einer fluoreszierenden Verbindung ist umgekehrt proportional zur Größe des Moleküls an welches es angeheftet ist. Daher wird von der Polarisation eines fluoreszierenden Moleküls, welches an ein intaktes Oligonukleotid angeheftet ist, erwartet werden, daß es größer ist als die Polarisation des Fluorophors welches angeheftet ist an ein Degradationsprodukt mit geringerem Molekulargewicht, welches von dem Oligonukleotid abgeleitet ist, in diesem Fall von dem freigesetzten Fragmenten. Daraus folgt das eine Abnahme des Polarisationswertes eine Korrektur der stromabwärts liegenden Sonden anzeigt.
Obwohl die vorliegende Erfindung in einigen Details durch die Mittel der Illustration und der Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß die obigen Verfahren zur Reduktion von zielunabhängiger Amplifikation bei anderen Nukleinsäureamplifikationstechniken neben der LCR verwendet werden können. Darüber hinaus sind zahlreiche Modifikationen und Veränderungen, die in den Fähigkeiten jener liegen, die im Fachgebiet bewandert sind, im Bereich des Schutzumfanges der angehängten Ansprüche. Zukünftige technologische Fortschritte, welche offensichtliche Veränderungen der grundliegenden Erfindung gestatten, liegen ebenfalls innerhalb der Ansprüche.
SEQUENZLISTE
(1) Allgemeine Information
(i) Anmelder: ABBOTT LABORATORIES
(ii) Titel der Erfindung: NACHWEIS UND AMPLIFIKATION BESTIMMTER NUKLEINSÄUREN MITTELS EXONUKLEOLYTISCHER AKTIVITÄT
(iii) Anzahl von Sequenzen: 21
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: Modiano, Josif, Pisanty & Staub
(B) Straße: Baaderstrasse 3
(C) Stadt: München
(D) Staat:
(E) Land: Deutschland
(F) Postleitzahl: 80469
(v) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Floppy disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Programm: PatentIn Release / Wordperfect
(vi) Daten der vorliegenden Anmeldung:
(A) Anmeldenummer: 93 917 324.1
(B) Anmeldetag: 21.07.93
(C) Klassifizierung:
(vii) Vorige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer: US 07/925,402
(B) Anmeldetag: 03.08.92
(viii) Angaben zum Anwalt/Agenten:
(A) Name: Modiano, Guido, et al.
(B) Registrierungsnummer:
(C) Aktenzeichen/Aktennummer: 409/GM/ms
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: (004989) 221 216
(B) Telefax: (004989) 225 809
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 1:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 48 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: genomische DNA
(vi) Original Quelle:
(A) Organismus: Chlamydia trachomatis
(viii) Position im Genom:
(B) Kartenposition: 354-402
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 1:
GATAGCGAGC ACAAAGAGAG CTAATTATAC AATTTAGAGG TAAGAATG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 2:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 2:
GATAGCGAGC ACAAAGAGAG CTAA
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 3:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 27 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 3:
CCCTTATACAAT TTAGAGGTAA GAATG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 4:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 27 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 4:
CCCTTAGCTC TCTTTGTGCT CGCTATC
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 5:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 5:
CATTCTTACC TCTAAATTGT ATAA
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 6:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 6:
TTATACAATT TAGAGGTAAG AATG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 7:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 7:
TTAGCTCTCT TTGTGCTCGC TATC
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 8:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 8:
GTATACAATT TAGAGGTAAG AATG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 9:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 9:
GTAGCTCTCT TTGTGCTCGC TATC
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 10:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 10:
CTTATACAAT TTAGAGGTAA GAATG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 11:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 11:
CTTAGCTCTC TTTGTGCTCG CTATC
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 12:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 46 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: genomische DNA
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 12:
TTACTTGCAA GACATTCCTC AGGCCATTAA TTGCTACAGG ACATCT
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 13:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 13:
TTACTTGCAA GACATTCCTC AGG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 14:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 14:
ACATTAATTG CTACAGGACA TCT
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 15;
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 15:
ACTGAGGAAT GTCTTGCAAG TAA
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 16:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 16:
AGATGTCCTG TAGCAATTAA TGG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 17:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 17:
CTCTTGGCTC AGTTTACTAG TG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 18:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 18:
ACATTTGTTC AGTGGTTCGT AG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 19:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 19:
TCACTAGTAA ACTGAGCCAA GAG
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 20:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: einzeln
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: andere (synthetische DNA)
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 20:
CTACGAACCA CTGAACAAAT G
(2) Information für Sequenzidentifikationsnummer 21:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 44 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: genomische DNA
(vi) Original Quelle:
(A) Organismus: Hepatitis B Virus
(viii) Position im Genom:
(B) Kartenposition: 666-709
(xi) Sequenzbeschreibung: Sequenzidentifikationsnummer 21:
CTCTTGGCTC AGTTTACTAG TGCCATTTGT TCAGTGGTTC GTAG

Claims

1. Ein Verfahren zur Untersuchung einer Targetnukleinsäuresequenz, das die Schritte umfaßt:

(a) Eine Probe, von der vermutet wird, daß sie die Targetnukleinsäuresequenz in einzelsträngiger Form enthält, unter hybridisierenden Bedingungen einem Überschuß an einem ersten Oligonukleotidset aussetzen, das eine erste Sonde stromaufwärts gelegen und eine erste Sonde stromabwärts gelegen umfaßt, wobei beide Sonden Sequenzen enthalten, die im wesentlichen komplementär sind zu Abschnitten einer Targetnukleinsäuresequenz, wobei der 3'-Terminus der ersten stromaufwärts gelegenen Sonde unmittelbar am 5-Terminus der ersten stromabwärts gelegenen Sonde hybridisiert, worin das 5'- Ende der ersten stromabwärts gelegenen Sonde modifiziert ist, um ohne Korrektur bindungsunfähig zu sein, wodurch das erste Oligonukleotidset an die Targetnukleinsäuresequenz, falls anwesend, hybridisiert wird;

(b) Korrigieren des 5'-Endes der stromabwärts gelegenen Sonde' im wesentlichen nur, wenn die stromabwärts gelegene Sonde an den Target hybridisiert ist, wobei die Korrektur nukleolytische Degradation des 5'-Endes einschließt, wobei die Korrektur dieses 5'-Ende bindungssfähig macht;

(c) Binden der korrigierten stromabwärts gelegenen Sonde an die stromaufwärts gelegene Sonde, um ein gebundenes Produkt zu bilden; und

(d) Bestimmen, in welchem Ausmaß die Korrektur- oder Bindungsschritte als ein Maß für die Targetnukleinsäure in der Probe vorkommen umfassend das Überwachen der Freisetzung von abgespaltenen Fragmenten vom 5'-Ende der stromabwärts gelegenen Sonde.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bestimmung des Ausmaßes an Korrektur oder Bindung das Abtrennen gebundenen Produkts von ungebundenen Sonden und das Bestimmen der Menge an gebildetem, gebundenen Produkt umfaßt.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das bindungsunfähige 5'-Ende im wesentlichen aus einem nichtphosphorylierten 5'-Terminus besteht und worin der Korrekturschritt das Abspalten des terminalen Nukleosids umfaßt, um einen neuen 5'-phosphorylierten Terminus an der stromabwärts gelegenen Sonde zu bilden.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, worin der Korrekturschritt weiterhin die Verlängerung des 3'-Terminus der stromaufwärts gelegenen Sonde durch Addition von einem oder mehreren Nukleosidtriphosphaten in einer matrizenabhängigen Art und Weise umfaßt, um den verlängerten 3'-Terminus in Nachbarschaft zu dem neu geschaffenen 5'-phosphorylierten Terminus zu bringen.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin sowohl der Abspaltungs- als auch der Verlängerungsschritt durch eine matrizenabhängige Polymerase mit 5 zu 3' nukleolytischer Aktivität durchgeführt wird.

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das abgespaltene Fragment eine fluoreszierende Markierung beinhaltet und das Überwachen Fluoreszenzpolarisation beinhaltet.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das bindungsunfähige 5'-Ende zumindest eine Nukleotidbase in dem 5- Ende umfaßt, die in Bezug auf die Targetsequenz, an die sie hybridisiert, unpassend ist, und worin der Korrekturschritt die Abspaltung des unpassenden Nukleotids umfaßt, um einen neuen 5- phosphorylierten Terminus an der stromabwärts gelegenen Sonde zu schaffen.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, worin der Korrekturschritt weiterhin die Verlängerung des 3-Terminus der stromaufwärts gelegenen Sonde durch Addition von einem oder mehreren Nukleosidtriphosphaten in einer matrizenabhängigen Art und Weise, um den verlängerten 3'-Terminus in Nachbarschaft zu dem neu geschaffenen 5'-phosphorylierten Terminus vi bringen.

9. Das Verfahren nach Anspruch 7, worin die mindestens eine unpassende Base im Bereich von 1 bis 5 Nukleotiden innerhalb des 5'-terminalen Nukleotids angeordnet ist.

10. Das Verfahren nach Anspruch 7, worin das bindungsunfähige 5'-Ende der stromabwärts gelegenen Sonde weiterhin einen nicht-phosphorylierten 5'-Terminus umfaßt.

11. Das Verfahren nach Anspruch 7, worin die Bestimmung des Ausmaßes an Korrektur und Bindung die Abtrennung gebundenen Produktes von ungebundenen Sonden und die Bestimmung der Menge an gebildetem, gebundenen Produkt umfaßt.

12. Das verfahren nach Anspruch 7, worin der abgespaltene Abschnitt des 5< -Endes der stromabwärts gelegenen Sonde eine Markierung trägt, und worin das Bestimmen des Ausmaßes an Korrektur und Bindung ein Überwachen der Freisetzung der Markierung von der stromabwärts gelegenen Sonde beinhaltet.

13. Das Verfahren nach Anspruch 1, das desweiteren einen Überschuß eines zweiten Oligonukleotidsets umfaßt, das eine zweite stromaufwärts gelegene Sonde und eine zweite stromabwärts gelegene Sonde umfaßt, wobei beide Sonden Sequenzen haben, die im wesentlichen komplementär zur ersten stromabwärts gelegenen Sonde beziehungsweise ersten stromaufwärts gelegenen Sonde sind, wobei der 3'-Terminus der zweiten stromaufwärts gelegenen Sonde in der Nähe des 5'-Terminus der zweiten stromabwärts gelegenen Sonde hybridisiert ist, und

worin die Hybridisierungs-, Korrektur- und Bindungsschritte (a-c) wiederholt werden, um eine Amplifizierung der Targetnukleinsäuresequenz zu erzielen.

14. Das Verfahren nach Anspruch 13, worin das bindungsunfähige 5'-Ende der ersten stromabwärts gelegenen Sonde im wesentlichen aus nicht-phosphoryliertem 5'-Terminus besteht und worin der Korrekturschritt das Abspalten des terminalen Nukleosids umfaßt, um einen neuen 5'-phosphorylierten Terminus an der stromabwärts gelegenen Sonde zu schaffen.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, worin das 5-Ende der zweiten stromabwärts gelegenen Sonde ebenfalls modifiziert ist, um ohne Korrektur bindungsunfähig zu sein, durch eine Modifikation gewählt aus: (a) einem nicht-phosphorylierten 5- Terminus; und (b) mindestens einer Nukleotidbase am 5'-Ende, die in Bezug auf die Matrizensequenz, an die sie hybridisiert, unpassend ist, und worin der Korrekturschritt das Abspalten des 5'-Endes der zweiten stromabwärts gelegenen Sonde einschließt, um einen neuen phosphorylierten 5-Terminus zu bilden, wobei der Korrekturschritt die 5'-Enden beider stromabwärts gelegenen Sonden bindungsfähig macht.

16. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin der Korrekturschritt desweiteren die Verlängerung des 3'-Terminus beider stromaufwärts gelegenen Sonden durch Addition eines oder mehrerer Nukleosidtriphosphate in einer mätrizenabhängigen Art und Weise umfaßt, um die verlängerten 3'-Termini in Nachbarschaft zu den neugebildeten 5-phosphorylierten Termini zu bringen.

17. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin die Bestimmung des Ausmaßes an Korrektur und Bindung das Trennen gebundenen Produkts von ungebundenen Sonden und die Bestimmung der Menge an gebildetem gebundenen Produkt umfaßt.

18. Das Verfahren nach Anspruch 15, worin das terminale Nukleotid der stromabwärts gelegenen Sonde eine Markierung trägt und worin die Bestimmung des Ausmaßes an Korrektur und Bindung das Überwachen der Freisetzung der Markierung von der stromabwärts gelegenen Sonde umfaßt.

19. Das Verfahren nach Anspruch 13, worin das bindungsunfähige 5'-Ende der ersten stromabwärts gelegenen Sonde zumindest eine Nukleotidbase an dem 5-Ende umfaßt, die in Bezug auf die Matrizensequenz, an die sie hybridisiert, unpassend ist, und worin der Korrekturschritt das Abspalten des unpassenden Nukleotids umfaßt, um einen neuen 5'- phosphorylierten Terminus an der stromabwärts gelegenen Sonde zu bilden.

20. Das Verfahren nach Anspruch 19, worin das 5'-Ende der zweiten stromabwärts gelegenen Sonde ebenfalls modifiziert ist1 um ohne Korrektur bindungsunfähig zu sein, durch eine Modifikation gewählt aus: (a) einem nicht-phosphorylierten 5'- Terminus; und (b) mindestens einer Nukleotidbase am 5'-Ende, die in Bezug auf die Matrizensequenz, an die sie hybridisiert, unpassend ist, und worin der Korrekturschritt das Abspalten des 5'-Endes der zweiten stromabwärts gelegenen Sonde einschließt, um einen neuen phosphorylierten 5'-Terminus zu bilden, wobei der Korrekturschritt die 5'-Enden beider stromabwärts gelegenen Sonden bindungsfähig macht.

21. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin der Korrekturschritt desweiteren die Verlängerung des 3'-Terminus beider stromaufwärts gelegenen Sonden durch Addition eines oder mehrerer Nukleosidtriphosphate in einer matrizenabhängigen Art und Weise umfaßt, um die verlängerten 3'-Termini in Nachbarschaft zu den neugebildeten 5'-phosphorylierten Termini zu bringen.

22. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin die mindestens eine unpassende Base einer oder beider stromabwärts gelegenen Sonden am 5'-terminalen Nukleotid positioniert ist, oder im Bereich von 1 bis 5 Nukleotiden innerhalb des 5'-terminalen Nukleotids.

23. Das Verfahren nach Anspruch 22, worin der Abspaltungsschritt das Abspalten eines Nukleotids in Nachbarschaft des unpassenden Nukleotids auf seiner 3'-Seite einschließt.

24. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin die Bestimmung des Ausmaßes an Korrektur und Bindung das Trennen gebundenen Produkts von ungebundenen Sonden und Bestimmung der Menge an gebildetem gebundenen Produkt umfaßt.

25. Das Verfahren nach Anspruch 20, worin das terminale Nukleotid der stromabwärts gelegenen Sonde eine Markierung trägt, und worin die Bestimmung des Ausmaßes an Korrektur und Bindung das Überwachen der Freisetzung der Markierung von der stromabwärts gelegenen Sonde umfaßt.