DE69512003T2

DE69512003T2 - Oligonukleotid verwendbar als Primer in einem Amplifikationsverfahren auf der Basis einer Strangverdrängungsreplikation

Info

Publication number: DE69512003T2
Application number: DE69512003T
Authority: DE
Inventors: Philippe Cleuziat; Francoise Guillou-Bonnici; Pierre Levasseur; Francois Mallet
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2000-05-25
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: US5874260A; FR2726277A1; EP0713922A1; FR2726277B1; CA2161577C; DK0713922T3; EP0713922B1; CA2161577A1; ATE184324T1; DE69512003D1; ES2137468T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonucleotide, die zur Bildung einer Stem-Loop-Struktur (Haarnadelschleifenstruktur) fähig sind, welche die Eigenschaft aufweist, durch eine DNS- oder eine RNS-Polymerase nicht vollständig transkribierbar zu sein und als Primer zur Replikation durch diese Enzyme dienen kann. Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Amplifikationsverfahren von Nukleinsäuren mit Hilfe dieser Primer.
In der sich auf Nucleinsäuren und genetisches Material beziehenden Technologie ist es häufig notwendig zu bestimmen, ob ein Gen, ein Genbereich oder eine Nucleotidsequenz in einem lebenden Organismus, in einem Zellextrakt dieses Organismus oder in einer biologischen Probe vorkommt.
Das Interesse an der Erforschung von spezifischen Nucleotidsequenzen ist immens, vor allem für den Nachweis von pathogenen Organismen, die Ermittlung des Vorhandenseins von Allelen, den Nachweis des Vorhandenseins von Schädigungen in einem Wirtsgenom und den Nachweis des Vorhandenseins einer besonderen mRNS oder der Modifikation einer Wirtszelle. Die genetischen Krankheiten wie die Huntington-Krankheit, die Duchenne-Erblähmung, die Phenylketonurie und die β- Thalassämie können auf dem Umweg über die DNS-Analyse des Individuums diagnostiziert werden. Weiterhin kann die Diagnose oder Identifizierung der Viren, Viroiden, Bakterien, Pilze, Protozoen oder irgendwelche andere Formen von pflanzlichem oder tierischem Leben durch Hybridisierungsexperimente mit Nucleinsäuresonden realisiert werden.
Nachdem man eine spezifische Sequenz eines Organismus oder einer Krankheit identifiziert hat, ist es in den zuvor zitierten Beispielen zweckmäßig, die Nucleinsäuren einer Probe zu extrahieren und zu bestimmen, ob diese Sequenz vorhanden ist. Zahlreiche Nachweismethoden wurden zu diesem Zweck entwickelt. Diese Methoden und im Besonderen diejenigen, welche den Nachweis von Polynucleotiden erfordern, beruhen auf der Eigenschaft der Purin-Pyrimidin-Paarung der Nucleinsäure-Komplementärstränge in den DNS-DNS-, DNS-RNS- und RNS-RNS-Doppelsträngen. Dieser Paarungsprozess erfolgt durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen Adenin-Thymin (A-T) und Guanin-Cytosin (G-C) des DNS-Doppelstrangs; Basenpaare Adenin-Uracil (A-U) können sich ebenfalls durch Wasserstoffbrückenbindungen in den DNS-RNS- oder RNS-RNS-Doppelsträngen bilden. Die Paarung von Nucleinsäuresträngen für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines gegebenen Nucleinsäuremoleküls wird allgemein als "Nucleinsäurehybridisierung" oder einfach als "Hybridisierung" bezeichnet.
Für die erfindungsgemäße Anwendung ist im Allgemeinen notwendig, dass eine oder mehrere spezifische Zielsequenzen zuvor identifiziert wurden. Die direkteste Methode für den Nachweis der Anwesenheit einer Zielsequenz in einer Nucleinsäureprobe ist das Erhalten einer "Sonde", deren Sequenz ausreichend komplementär zu einem Bereich des Nucleinsäuretargets ist, um mit diesem zu hybridisieren. Die so synthetisierte Sonde kann auf eine Probe angewendet werden, die Nucleinsäuren enthält, und, wenn die Zielsequenz vorhanden ist, hybridisiert die Sonde unter Bildung eines Reaktionsprodukts. In Abwesenheit der Zielsequenz und unter Vermeidung aller nicht spezifischen Hybridisierungsphänomene wird kein Reaktionsprodukt gebildet. Wenn die synthetisierte Sonde an einen detektierbaren Marker gekoppelt ist, kann das Reaktionsprodukt nachgewiesen werden, indem die Menge des anwesenden Markers gemessen wird. Der Southern- Blot (Southern E. M., 1975, J. Mol. Biol., 98: 503) oder Northern-Blot oder die Dot-Blot-Technik oder Sandwich-Hybridisierung (Dunn, A. R. und Hassel, J. A., 1977, Cell, 12: 23) verkörpern Beispiele verwendbarer Methoden.
Die prinzipielle Schwierigkeit dieses Ansatzes ist jedoch, dass dieser nicht direkt auf Fälle anwendbar ist, bei denen die Anzahl der in einer Probe anwesenden Kopien der Zielsequenz gering ist. Es ist also schwierig, ein signifikantes Signal zu unterscheiden, das heißt zu unterscheiden zwischen der spezifischen Fixierung einer Sonde auf seiner Zielsequenz und der unspezifischen Fixierung der Sonde auf einer von der Zielsequenz unterschiedlichen Sequenz. Eine der Lösungen dieses Problems besteht in der Erhöhung bzw. Verstärkung des Detektionssignals durch eine zusätzliche Reaktion, welche zuvor auf spezifische Weise anstrebt, die Anzahl der in der Probe anwesenden Kopien eines Nucleinsäurefragments, als Zielsequenz bezeichnet, zu erhöhen. Diese Technik wird üblicherweise als "Amplifikation" bezeichnet.
Mehrere Amplifikationstechniken des Targets sind in der Literatur beschrieben. Grundsätzlich beruhen diese entweder auf der Wiederholung von DNS-Synthesezyklen durch Verlängerung des auf der zu amplifizierenden Zielsequenz hybridisierten Nucleotidprimers durch eine DNS-Polymerase ("Polymerase Chain Reaction", als PCR bezeichnet, US- Patente der Nummern 4 683 195, 4 683 202 und 4 800 159; europäische Patentanmeldung Nr. 0 201 184; "Ligase Chain Reaction", als LCR bezeichnet, europäische Patentanmeldung Nr. 0 320 308; "Repair Chain Reaction", als RCR bezeichnet, internationale Patentanmeldung Nr. WO 90/01069) oder durch Wiederholung von in vitro RNS-Synthesezyklen durch Transkriptionsreaktion mit einer DNS- oder RNS-abhängigen RNS-Polymerase, deren Aktivität obligatorisch mit einem spezifischen Bereich, als Promotorbereich bezeichnet, verknüpft ist, umfassend eine Sequenz oder eine Struktur, welche die Rolle des Promotors spielt (als TAS bezeichnete Technik, beschrieben in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 88/10315; "Self-Sustained Sequence Replication", als 3SR bezeichnet, beschrieben in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 90/06995 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 373 960; "Nucleic Acid Sequence-Based Amplification", als NASBA bezeichnet, beschrieben in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 91/02818 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 329 822; "Single Primer Sequence Replication", als SPSR bezeichnet, beschrieben im US-Patent Nr. 5 194 370 und "Ligation Activated Transcription", als LAT bezeichnet, beschrieben im US-Patent Nr. 5 194 370).
Dennoch besitzen all diese Amplifikationstechniken mindestens einen wichtigen Nachteil. Der wichtigste Nachteil in bestimmten Fällen (PCR, LCR oder RCR) ist die Notwendigkeit, zahlreiche Temperaturzyklen zu realisieren, um die Reaktionsprodukte von Targets zu trennen bzw. dissoziieren. Die Durchführung dieser aufeinander folgenden Temperaturzyklen verkörpert einen Nachteil bezüglich der Automatisierung dieser Techniken und erhöht die für die Amplifikation benötigte Reaktionszeit beträchtlich. Ein anderer Nachteil bestimmter Amplifikationstechniken ist die Begrenzung der Größe des Reaktionsprodukts der Amplifikation. Die Techniken wie RCR und LCR erlauben die Amplifikation von Zielsequenz nicht, welche mit den im Amplifikationsverfahren verwendeten Primern und Nucleotidsonden übereinstimmen. Das nicht spezifische Hintergrundrauschen (das heißt in Abwesenheit des Targets) ist ebenfalls ein ernster Nachteil von Techniken wie LCR. Ein weiterer, schwerwiegender Nachteil bestimmter Amplifikationstechniken besteht in der erhöhten Anzahl von Enzymaktivitäten, die in das Amplifikationsverfahren involviert sind. Die von TAS abgeleiteten Methoden wie 3SR oder NASBA benötigen mindestens vier Enzymaktivitäten (DNS-abhängige DNS-Polymerase, RNS-abhängige DNS-Polymerase, DNS-abhängige RNS-Polymerase, RNase H), sogar fünf im Fall von LAT, das zusätzlich eine DNS-Ligase verwendet. Auf Grund der Schwierigkeit, Reaktionsbedingungen zu erreichen, die gleichzeitig diesen vier oder fünf enzymatischen Aktivitäten genügen, ist es daher sehr schwierig, diese Techniken leistungsfähig zu machen. Falls schließlich diverse Amplifikationstechniken auf Nucleaseaktivitäten (Exonuclease, Endonuclease, RNase) als Möglichkeit zur Trennung von Nucleinsäuresträngen zurückgreifen (europäische Patentanmeldung Nr. 0 500 224), ist ihre Verwendung dennoch nachteilig, auf Grund des Risikos des Abbaus des Targets oder des Reaktionsprodukts durch parasitäre bzw. verunreinigende Aktivitäten, wie sie gelegentlich in der Herstellung von Nucleasen vorkommen. Daraus folgt, dass die Aktivität dieser Nucleasen genauestens dosiert werden muss, um ein Gleichgewicht zwischen der Wirkung der verschiedenen enthaltenen Enzyme aufrechtzuerhalten. Angesichts dieser zahlreichen Einschränkungen wurden andere Amplifikationsmethoden als Alternative zu diesen Methoden vorgeschlagen.
Die Methode "Strand Displacement Amplification", als SDA bezeichnet, beschrieben im US-Patent Nr. 5 270 184, erlaubt die isotherme Vervielfältigung (37ºC) einer DNS-Zielsequenz mit Hilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms und einer DNS-abhängigen DNS-Polymerase ohne Exonucleaseaktivität (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392- 396). Sie basiert auf der Hybridisierung von Oligonucleotidprimern, welche eine Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms an ihrem 5'-Ende enthalten. In Anwesenheit von mindestens einem modifizierten Nucleotid (5'[-thio]- dNTP) führt man eine Elongation dieser Primer mit der DNS- Polymerase durch. Der DNS-Abbau durch die Restriktionsendonuclease bewirkt die Freisetzung eines mit dem Primer korrespondierenden Strangs, wobei der modifizierte Komplementärstrang in Takt bleibt. Die DNS-Polymerase kann also die Erweiterung der generierten Primer ermöglichen und setzt durch die Eigenschaft der Verdrängung eines DNS-Polymerstrangs einen DNS-Strang im Reaktionsmedium frei. Dieser Strang kann einen neuen Primer fixieren, der eine Bindungssequenz des Restriktionsenzyms enthält und der Cyclus kann erneut beginnen. Eine dem SDA ähnliche Methode, welche anstelle einer Endonuclease- eine Exonucleaseaktivität verwendet und sich "Exonuclease-mediated Strand Displacement Amplification" nennt, wird im europäischen Patent Nr. 0 500 224 beschrieben.
Dennoch weisen diese Methoden Nachteile auf, die ihre Wirksamkeit beeinträchtigen. Folglich sind diese durch den zu amplifizierenden Zielsequenztyp eingeschränkt, da diese Sequenz den der im Verfahren verwendeten Endonuclease entsprechenden Restriktionsort nicht enthalten darf. Wenn man die Nucleinsäuresequenz des zu amplifizierenden Fragments schon nicht kennt, so ist es unerlässlich, wenigstens die Restriktionskarte dieses Fragments zu kennen. Außerdem vergrößert sich dieser Nachteil durch die Wahl der Restriktionsendonucleasen, die sich auf diejenigen beschränkt, welche die Fähigkeit haben, Hemiphosphorthioat-Erkennungsstellen oder allgemeiner Bereiche, die modifizierte Nucleotide umfassen, zu spalten. Außer den mit der chemischen Synthese der modifizierten Nucleotiden verbundenen Nachteilen hat dieses Amplifikationsverfahren auf Grund der geringen Effizienz des enzymatischen Einbaus der modifizierten Nucleotide eine begrenzte Ausbeute.
Eine andere isotherme Amplifikationstechnik, welche wie die PCR zwei Primer und eine DNS-Polymerase verwendet, ist beschrieben worden (US-Patent Nr. 5 223 414). In Anwesenheiten von ATP verwendet diese Technik das Protein Rec A, um einen ersten Nucleotidprimer an einem 3'-Ende eines Nucleinsäurestrangs und einen zweiten Primer am 3'-Ende des Komplementärstrangs dieser Nucleinsäure zu komplexieren. Die so realisierten Komplexe werden dann in Gegenwart einer DNS-Polymerase und von Desoxyribonucleosidtriphosphaten eingesetzt. Mehrere Amplifikationszyklen werden so unter isothermen Bedingungen realisiert. Die erhalten Amplifikationsausbeute ist jedoch geringer als die der PCR, denn der Trennschritt der Nucleinsäurekomplementärstränge erfordert ein Rekombinationsverfahren, das langsamer und aleatorischer ist als die thermische Denaturierung. Weiterhin beruht diese Methode auf der Verwendung eines Proteins (Rec A) gemeinsam mit einer Polymerase, was die Optimierung schwierig macht.
Bestimmte Amplifikationstechniken haben Primer oder Nucleinsäuresonden eingesetzt, die in speziellen Strukturen vorhanden sind. Im Fall der als LAT bezeichneten Methode (US-Patent Nr. 5 194 370) beruht die auf der Transkription basierende Amplifikation der Zielsequenzen auf dem Aufbau einer DNS-artigen Haarnadelschleifenstruktur durch Ligation, welche innerhalb der Sequenz, die den Haarnadelabschnitt bildet, einen funktionellen Promotor für eine RNS- Polymerase umfasst. Außerdem ist das 3'-Ende des Oligonucleotids, welches die Haarnadelschleifenstruktur trägt, blockiert und kann dementsprechend nicht als Primer für eine DNS-Polymerase dienen. Andere Arbeiten beschreiben eine ähnliche Verwendung einer Promotorsequenz, die eine Haarnadelschleifenstruktur enthalten (europäische Patentanmeldungen Nrn. 0 4S1 591, 0 534 345, deutsche Patentanmeldung Nr. 42 13 029, Carpenter et al., 1993, Clin. Chem., 39: 1934-1938, Krupp und Söll, 1987, FEBS Lett. 2: 271-275). Die PCT-Patentanmeldung Nr. WO 93/17127 beschreibt die Verwendung von eine Haarnadelschleifenstruktur bildenden DNS-Oligonucleotiden, die sich in den Endbereichen der Ziel-DNS in einem Amplifikationsverfahren vom Typ PCR mit Hilfe eines einzigen Primers zusammenschließen. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 530 112 beschreibt eine Amplifikationstechnik, die ein Zusammenwirken von einem Replikationsorigin und einer inversen Wiederholungssequenz, die geeignet ist, eine Haarnadelschleifenstruktur auszubilden, einsetzt. Die Verwendung von Primern, die eine Haarnadelschleifenministruktur enthalten, wurde auch durch Caetano und Gresshoff beschrieben (1994, Bio/Technology 12: 619- 623). Die Verwendung dieser beliebig definierten, aber in Haarnadeischleifenministrukturen vorliegenden, an die PCR- Amplifikationstechnik gekoppelten Primer erlaubt es, eine große Anzahl von amplifizierten Nucleinsäurefragmenten zu erhalten, die uneinheitlich groß sind und die einen elektrophoretischen Trennschritt benötigen, um einen genetischen Fingerabdruck zu realisieren.
Die oben beschriebenen, unterschiedlichen Verfahren setzen spezielle Oligonucleotide, die eine Haarnadelschleifenstruktur aufweisen können, einzig mit dem Ziel ein, entweder in einem einzigen Schritt stromaufwärts von der zu amplifizierenden Sequenz einen funktionellen Promotor anzubringen oder die Hybridisierung von spezifischen Primern in der Schleife zu erlauben, die stromaufwärts von der Zielsequenz lokalisiert sind, gefolgt von der Amplifikation durch Elongation des Primers, wie im Fall der PCR. So kann keine dieser Techniken den diversen Nachteilen der anderen, weiter oben erwähnten Techniken entgehen.
Berücksichtigt man die vorangegangene Analyse, erscheint der Entwurf von neuen Amplifikationsmethoden wünschenswert und die vorliegende Erfindung betrifft vor allem eine cyclische Amplifikationsmethode einer Nucleotidzielsequenz, die isotherm arbeiten kann und den Vorteil aufweist, keine Nucleinsäurepolymerase in Anwesenheit von Nucleosidtriphosphaten zu verwenden.
In der vorliegenden Anmeldung bezeichnet der Ausdruck "stromaufwärts" einen Bereich, der sich auf der Seite des 5'-Endes der Nucleinsäure oder Polynucleotidsequenz, um die es sich handelt, befindet und der Ausdruck "stromabwärts" bezeichnet einen Bereich, der sich auf der Seite des 3'- Endes der Nucleinsäure oder Polynucleotidsequenz befindet.
Als zu einer anderen Sequenz homolog bezeichnet man eine Sequenz, die in der Lage ist, mit einer zu der anderen Sequenz strikt komplementären Sequenz zu hybridisieren.
Mit "autohybridisiertem" Nucleinsäuremolekül bezeichnet man ein Molekül, von dem mindestens eine Nucleinsäuresequenz, die dieses ausmacht, mit einer Nucleinsäuresequenz des gleichen Nucleinsäuremoleküls hybridisiert ist; im Gegensatz zur intermolekularen Paarung, die zwei verschiedene Nucleinsäuremoleküle einsetzt, spricht man demnach von einer Autohybridisierung oder intramolekularen Paarung.
Der Ausdruck "Nucleosidtriphosphate" (NTP) bezeichnet unterschiedslos Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP) und/oder Ribonucleosidtriphosphate (rNTP).
Die Ausdrücke "Nucleinsäurefragment", "Nucleinsäuresegment", "Nucleinsäurebereich" oder "Oligonucleotid", wie sie in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, bezeichnen ein natürliches DNS- oder RNS-Fragment, ein natürliches oder synthetisches Polynucleotid, welches gegebenenfalls mindestens eine modifizierte Base wie Inosin, 5-Methyldesoxycytidin, 5-Dimethylaminodesoxyuridin, Desoxyuridin, 2,6-Diaminopurin, 5-Bromdesoxyuridin, Pseudouridin, Pseudoisocytidin oder jede andere modifiziert, die Hybridisierung gestaltende Base enthalten kann. Dieses Polynucleotid kann auch auf der Ebene der Internucleotidbindungen (wie z. B. die Phosphorthioat-, H-Phosphonat-, Alkylphosphonatbindungen), auf der Ebene des Skeletts modifiziert sein, wie es z. B. bei den Alpha-Oligonucleotiden (französisches Patent Nr. 2 607 507) oder dem PNA (Egholm et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895-1897) der Fall ist. In einem modifizierten Polynucleotid können mehrere der eben erwähnten Modifikationen kombiniert miteinander vorliegen.
Der Begriff "Nucleinsäuresequenz" bezeichnet eine präzise Abfolge (Kette) von modifizierten oder nicht modifizierten Nucleotiden, die es erlauben, ein Fragment, ein Segment oder einen Bereich einer wie oben festgelegten Nucleinsäure zu definieren.
Der Begriff "Primer" bezeichnet ein Molekül, das eine einsträngige Oligonucleotidstruktur umfasst, bestehend aus mindestens fünf Nucleotiden. Diese Nucleotide können Desoxyribonucleotide und/oder Ribonucleotide sein. Wie zuvor in dem Abschnitt, der sich auf die Beschreibung des Begriffs "Nucleinsäurefragment" bezieht, beschrieben, können diese Nucleotide modifiziert sein. Die Oligonucleotidprimer, einmal auf einer ungefähr komplementären Nucleinsäuresequenz hybridisiert (DNS, RNS oder ein chimäres DNS-RNS- Molekül), stellen Substrate für Polymerasen dar. Die auf einer Nucleinsäuresequenz hybridisierten Oligonucleotidprimer haben die Eigenschaft, an ihrem 3'-OH-Ende eine Polymerase zu binden. Die Polymerase kann also in Anwesenheit eines geeigneten Nucleotids den Primer von seinem 3'- OH-Ende an ausweiten, was zu der Synthese eines Komplementärstrangs der Matrixsequenz führt, auf der der Primer hybridisiert ist. Ein Primer kann auch durch Hybridisierung des Endes einer einsträngigen Nucleinsäuresequenz mit sich selbst gebildet werden, was zu der Bildung einer Sekundärstruktur, als Haarnadelschleife oder Stem-Loop bezeichnet, führt.
Als "Haarnadelschleifen"-Struktur bezeichnet man jede Sekundärstruktur, die mindestens ein Nucleotidteilstück mit einschließt, in dessen Inneren sich ein Strang einer Nucleinsäuresequenz über intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen mit einem anderen Teilstück des gleichen Nucleinsäuremoleküls paart, um einen "autohybridisierten" Bereich in der Art eines Doppelstrangs als "Stem (Stamm)" bezeichnet und einen nicht gepaarten, am Ende der Haarnadel lokalisierten Schleifenbereich (Loop) zu bilden. Wenn "die Schleife" von der Länge Null ist, findet man in diesem besonderen Fall eine Haarnadelschleifenstruktur vor, die als "Haarnadel" oder Palindrom bezeichnet wird. Diese "Haarnadelschleifen"-Strukturen können sich vor allem dann bilden, wenn eine Nucleotidsequenz zwei wiederholte, inverse, getrennte, z. B. durch ein Nucleotid oder einen natürlichen Kohlenwasserstoffarm, Sequenzen aufweist.
Als "Blockierungsmittel" bezeichnet man ein Mittel, das in der Lage ist, die Replikation einer Nucleinsäurematrix durch eine Nucleinsäurepolymerase (DNS-Polymerase, RNS- Polymerase, inverse Transkriptase oder Replikase) zu blockieren. Solche Mittel sind bekannt. Ein Blockierungsmittel kann eine Nucleinsäureverbindung (z. B. ein modifiziertes Nucleotid) oder eine nicht nucleinsäureartige Verbindung sein, die durch die betreffende Polymerase nicht als Matrix erkannt wird. Das Blockierungsmittel kann ein Kohlenwasserstoffarm sein, der dort zwischen zwei Nucleotiden der Nucleinsäurematrix eingefügt ist, wo man die Replikation stoppen möchte. Der Ausdruck "Kohlenwasserstoffarm" bedeutet hier "im Wesentlichen kohlenwasserstoffhaltiger Arm": es handelt sich z. B. um einen Polymethylenarm, der zwischen zwei Nucleotiden eingebaut werden kann, z. B. durch Reaktion eines Diols oder eines Diamins (siehe unten aufgeführten experimentellen Teil). Eine derartige Polymethylengruppierung kann Substituenten tragen oder durch ein oder mehrere Heteroatome, wie z. B. Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff, unterbrochen sein.
Als "Replikation" bezeichnet man jede durch eine Nucleinsäurepolymerase katalysierte Reaktion, die eine Kopie einer Nucleinsäurematrix ergibt, im Allgemeinen in der komplementären Form. Die Polymerase ist vor allem eine DNS-Polymerase, eine RNS-Polymerase, eine inverse Transkriptase oder eine Replikase.
Mit "Strangverdrängungsaktivität" bezeichnet man das Phänomen, daß ein biologisches, chemisches oder physikalisches Mittel, z. B. eine DNS-Polymerase, die progressive Dissoziation einer Nucleinsäure von ihrem Komplementärstrang, mit dem sie gepaart ist, in Verbindung mit der Neusynthese einer Komplementärnucleinsäure des Komplementärstrangs (Matrix) bewirkt. Die Strangverdrängung beginnt am 5'-Ende der so abgelösten Nucleinsäure und wird in 5' → 3' Richtung fortgeführt, während die Neusynthese der Nucleinsäure unmittelbar stromaufwärts der Verdrängungsstelle fortschreitet. Die neu synthetisierte Nucleinsäure (welche ein Duplex mit der Matrix bildet) und die in Form eines Einzelstrangs erhaltene, abgelöste Nucleinsäure haben im Allgemeinen die gleiche Nucleotidsequenz, die komplementär zum Strang der Matrixnucleinsäure ist. Die Strangverdrängungsaktivität kann auf dem gleichen Molekül beruhen, das die Aktivität einer Nucleinsäuresynthese und im Besonderen einer DNS-Synthese besitzt, oder es kann eine getrennte und unabhängige Aktivität sein. DNS-Polymerasen, wie die DNS- Polymerase I von E.coli, das Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I, die DNS-Polymerase des Bakteriophagen T7 oder T5, die inverse Transkriptase des HIV-Virus sind Enzyme, die gleichzeitig die Polymeraseaktivität und die Strangverdrängungsaktivität besitzen. Mittel wie die Helicasen können in Verbindung mit Induktionsmitteln, die keine Strangverdrängungsaktivität aufweisen, verwendet werden, um den Effekt der Strangverdrängung zu erzeugen, das heißt die Verdrängung einer Nucleinsäure, verknüpft mit der Synthese einer Nucleinsäure gleicher Sequenz. Ebenso können Proteine wie Rec A oder das Single Strand Binding (SSB)-Protein von E.coli oder von einem anderen Organismus in Verbindung mit anderen Induktionsmitteln zur Erzeugung oder Bevorzugung der Strangverdrängung verwendet werden. Für weitere Einzelheiten und eine Diskussion der Strangverdrängung kann man Kornberg und Baker konsultieren (1992, DNS-Replikation, 2. Auflage, Seiten 113-225, Freeman, New York). Die Strangverdrängungskapazität erlaubt vor allem die Öffnung einer Haarnadelschleifenstruktur in Verbindung mit der Synthese von mindestens einem Teil dieser Struktur vom Haarnadelschleifentyp.
Mit "Promotor" einer RNS-Polymerase bezeichnet man eine Sequenz oder eine Struktur, die in der Lage ist, die Transkriptionsinitiierung zu steuern. Die Promotorsequenzen (in Form eines Doppelstrangs) unterschiedlicher Typen von RNS- Polymerasen sind wohlbekannt. Außer den natürlichen Promotoren der RNS-Polymerasen kann man gleichermaßen verkürzte Sequenzen benutzen, die sich von natürlichen Promotoren ableiten und deren Funktionalität bewahrt haben. Andere zur Transkriptionsinitiierung fähige Strukturen sind z. B. "Blasen" oder "Schleifen", wie sie von Møllegaard et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3892-3895) und Aiyar et al. (1994, J. Biol. Chem. 269: 13179-13184) beschrieben werden.
Mit "Sens"-Sequenz einer RNS-Promotorpolymerase bezeichnet man eine Strangsequenz des (Doppelstang-)Promotors, deren 3'-Ende an die Transkriptionsinitiierungsstelle angrenzt, welche durch den gleichen Promotor definiert ist.
Mit "Antisens"-Sequenz einer RNS-Promotorpolymerase bezeichnet man eine Strangsequenz des (Doppelstrang-)Promotors, deren 5'-Ende an die Transkriptionsinitiierungsstelle angrenzt, welche durch den gleichen Promotor definiert ist.
Die Erfindung betrifft demnach ein Oligonucleotid, umfassend von seinem 5'-Ende gegen sein 3'-Ende:
- einen zur Autohybridisierung fähigen ersten Teil zur Bildung einer Stem-Loop-Struktur (Haarnadelschleife), umfassend ein stromaufwärts und ein stromabwärts gepaartes Segment, und
- einen zweiten Teil, der nicht zur Autohybridisierung befähigt ist,
dadurch gekennzeichnet, dass der erste Teil mindestens ein Blockierungsmittel umfasst, das fähig ist, die Replikation des Oligonucleotids durch eine Polymerase auf die Weise zu blockieren, dass mindestens ein Teil des stromabwärtigen Segments repliziert wird und das stromaufwärtige Segment weder vollständig noch teilweise repliziert wird.
Das Blockierungsmittel ist beispielsweise so beschaffen, dass der replizierbare Teil des stromabwärtigen Segments eine Länge von mindestens zwei Nucleotiden, im Besonderen von mindestens drei Nucleotiden oder mindestens fünf Nucleotiden hat.
Das stromabwärtige Ende des stromaufwärtigen Segments und das stromaufwärtige Ende des stromabwärtigen Segments können durch eine nucleinsäurehaltige oder nicht nucleinsäurehaltige Schleife verbunden sein.
Die stromaufwärtigen und stromabwärtigen Segmente enthalten jeweils 2 bis 30 und im Besonderen 3 bis 15 Nucleotide.
Das Blockierungsmittel umfasst beispielsweise mindestens ein modifiziertes, durch eine Polymerase nicht kopierbares, transkribierbares Nucleotid oder einen Kohlenwasserstoffarm.
Das Oligonucleotid kann zwischen seinem ersten und zweiten Teil einen dritten Teil aufweisen, der eine Promotorsenssequenz für eine RNS-Polymerase aufweist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Teil 5 bis 40 Nucleotide enthält.
Das erfindungsgemäße Oligonucleotid kann als Primer in einem Amplifikationsverfahren einer Nucleinsäurezielsequenz verwendet werden, wobei die Zielsequenz eine stromabwärtige Sequenz von mindestens 5 Nucleotiden umfasst und in diesem Fall der zweite Teil an einem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, mit der stromabwärtigen Sequenz des Ziels oder Targets zu hybridisieren.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein cyclisches Amplifikationsverfahren einer Nucleinsäurezielsequenz, wobei die Zielsequenz an ihrem 5'-Ende einen stromaufwärtigen Bereich und an ihrem 3'-Ende einen stromabwärtigen Bereich umfasst, umfassend die Schritte, bestehend aus:
- Erhalten eines einsträngigen Polynucleotids, umfassend ein erstes, der zu amplifizierenden Zielsequenz entsprechendes Segment, ein zweites Segment, das sich stromaufwärts vom 5'-Ende des ersten Segments befindet, und ein drittes Segment, das sich stromabwärts vom 3'-Ende des ersten Segments befindet,
wobei das zweite Segment des einsträngigen Polynucleotids zum ersten Teil eines wie oben definierten Oligonucleotids homolog ist
und wobei das dritte Segment des einsträngigen Polynucleotids eine beliebige Sequenz aufweist,
- Einsetzen des Polynucleotids in Anwesenheit von:
- (a) einem ersten, wie oben definierten Primer, der in der Lage ist, mit dem stromabwärtigen Bereich der Zielsequenz zu hybridisieren, wobei wiederum mindestens der stromabwärtige Teil des stromabwärtigen Segments vom ersten Teil des ersten Primers komplementär ist zum dritten Segment des einsträngigen Polynucleotids,
gegebenenfalls einem zweiten wie oben definierten Primer, der in der Lage ist, mit einem von der Komplementärsequenz der Zielsequenz stromabwärtigen Bereich zu hybridisieren,
wobei dieser stromabwärtige Bereich komplementär ist zum stromaufwärtigen Bereich der Zielsequenz, wobei wiederum der erste Teil des zweiten Primers derjenige ist, zu dem das zweite Segment des einsträngigen Polynucleotids homolog ist,
(b) einem dritten Primer, wobei die Sequenz homolog ist zu mindestens einem stromabwärtigen Teil der Sequenz des stromabwärtigen Segments vom ersten Teil des ersten Primers,
(c) einem vierten Primer, wobei die Sequenz homolog ist zu mindestens einem Teil der Sequenz des stromabwärtigen Segments des ersten Teils, der das zweite Segment des einsträngigen Polynucleotids bildet,
und
(d) eines enzymatischen Systems, das mindestens eine Replikationsaktivität der Nucleinsäure und eine Strangverdrängungsaktivität enthält,
- und das Inkubieren eines Gemisches, das unter Bedingungen erhalten wurde, die die Hybridisierung und die Funktionstüchtigkeit der Enzymaktivitäten erlauben.
In einer besonderen Ausführungsform kann der erste Primer, wie oben erwähnt, die Senssequenz eines Promotors enthalten und das Verfahren ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass das einsträngige Polynucleotid zwischen seinem ersten Segment und seinem dritten Segment ein viertes Segment enthält, das zu der im ersten Primer enthaltenen Senssequenz komplementär ist, und dadurch, dass das Enzymsystem außerdem eine von dem Promotor abhängige RNS-Polymeraseaktivität enthält.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform, die die vorangegangene besondere Ausführungsform nicht ausschließt, ist der zweite Primer anwesend und enthält ebenfalls eine Senssequenz eines Promotors und das Verfahren ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass das einsträngige Polynucleotid zwischen seinem ersten Segment und seinem zweiten Segment ein zusätzliches Segment enthält, dessen Sequenz die im zweiten Primer enthaltene Senssequenz ist, und dass das System außerdem eine von dem Promotor, der dieser im zweiten Primer enthaltenen Senssequenz entspricht, abhängige RNS- Polymeraseaktivität enthält.
Besondere Ausführungsformen werden nun beschrieben, gegebenenfalls unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Abb. 1 ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid beschreibt, zusammengesetzt aus einer Sequenz, die in der Lage ist, eine autohybridisierte Haarnadelschleifenstruktur zu bilden, und das mindestens ein Mittel zur Blockierung der Elongation durch eine Nucleinsäurepolymerase umfasst. Die vertikalen Linien, Segmente (a) und (a'), zeigen eine Nucleinsäuresequenz, die der Haarnadel angehört (autohybridisierter Bereich) und einen halbkreisförmigen Teil einer Struktur aus Nucleinsäure und/oder Kohlenwasserstoff, die die Schleife, Segment (e), bildet. Die feinen, unterbrochenen, horizontalen Linien symbolisieren die Wasserstoffbrückenverbindungen, die sich zwischen den komplementären, innerhalb der Haarnadel hybridisierten Nucleotide ausgebildet haben. Die Polarität der Nucleinsäuren wird durch ihre 5'- und 3'-Enden angezeigt.
Abb. 2 die Replikation eines Moleküls beschreibt, das eine Haarnadelschleifenstruktur aufweist und mindestens ein Mittel zur Blockierung der Elongation durch eine Nucleinsäurepolymerase aufweist, z. B. mit Hilfe einer DNS-Polymerase oder einer RNS-Polymerase (DNS- und/oder RNS-abhängig) in Anwesenheit von Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTP) bzw. von Ribonucleosidtriphosphaten (rNTP). Die Replikation vollzieht sich beispielsweise durch Elongation von 5' nach 3' eines Oligonucleotidprimers, der in der Nähe des 3'-Endes einer Nucleinsäurematrix, die eine Haarnadelschleifenstruktur enthält, hybridisiert ist. Die geraden Linien zeigen eine Nucleinsäuresequenz und der halbkreisförmige Teil eine Struktur, die eine Schleife bildet. Der quer verlaufende Strich, der sich im Bereich der Schleife befindet, bezeichnet die Ablösestelle, bei der die Replikation der Haarnadelschleife blockiert ist. Hieraus ergibt sich eine Verdrängung der Polymerase (symbolisiert durch die gestrichelte Ellipse) von der Matrix. Das stark verdickte Segment bezeichnet einen Bereich der Haarnadel, der durch die Polymerase abgeschrieben wird. Die punktierten Striche zeigen die nicht definierten Enden der Nucleinsäuren.
Abb. 3 beschreibt, wie man durch Verdrängung des thermodynamischen Gleichgewichts einen Teil A der Oligonucleotide in Form einer autohybridisierten Haarnadelschleifen- Molekülstruktur erhalten kann, ausgehend von einem Duplex- bzw. Doppelstrangmolekül. Die geraden Linien zeigen eine Nucleinsäuresequenz und der halbkreisförmige Teil eine Struktur, die eine Schleife bildet. Der kurze, quer durch den Bereich der Schleife gezeichnete Strich bezeichnet die Stelle, über die hinaus die Replikation der Haarnadelschleife sich nicht fortsetzen kann. Der stark verdickte Strich bezeichnet den Bereich der Haarnadel, der durch die Polymerase abgeschrieben wird. Die punktierten Linien zeigen die nicht definierten Enden der Nucleinsäuren.
Abb. 4 schematisch einen besonderen Fall der Amplifikation von Nucleinsäuren gemäß der Erfindung zeigt, der ein Oligonucleotid verwendet, das eine Haarnadelschleifenstruktur umfasst. Die geraden Linien zeigen eine Nucleinsäuresequenz und der halbkreisförmige Teil eine Struktur, die eine Schleife bildet. Das stark verdickte Segment bezeichnet einen Bereich der Haarnadel, der durch die Polymerase abgeschrieben wird, wie bezüglich Abb. 3 angezeigt.
Abb. 5 schematisch einen anderen besonderen Fall der Amplifikation von Nucleinsäuren in Übereinstimmung mit der Erfindung unter Verwendung eines Oligonucleotids zeigt, umfassend eine Haarnadelschleifenstruktur und außerdem umfassend eine Senssequenz eines Promotors für eine RNS-Polymerase. Die geraden Linien der Schlussstriche zeigen eine DNS-Sequenz, die dicken Striche zeigen die RNS. Das stark verdickte Segment zeigt einen Bereich, der eine Senssequenz eines RNS-Polymerasepromotors enthält. Der halbkreisförmige Bereich zeigt eine Struktur, die eine Schleife bildet.
Abb. 6 ein Histogramm von Ergebnissen zeigt, die gemäß Beispiel 2 erhalten wurden. Die auf der Ordinate angegebene optische Dichte (OD) ist in Tausendstel beziffert. Der Matrixtyp ist auf der Abszisse angegeben: RNS (1) oder DNS (2). Die Säule 1 (schwarz) repräsentiert die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien, umfassend die inverse Transkriptase und den Verdrängungsprimer. Die Säule 2 (schraffiert) repräsentiert die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien mit Ausnahme des Verdrängungsprimers DIS5. Die Säule 3 (grau) repräsentiert die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien mit Ausnahme der inversen Transkriptase.
Abb. 7 ein Histogramm von Ergebnissen zeigt, die gemäß dem Beispiel 5 erhalten wurden. Die auf der Ordinate angegebene optische Dichte (OD) ist in Tausendstel beziffert. Die logarithmierte Anzahl von Zielkopien pro Versuch ist auf der Abszisse angegeben. Die Säule 1 (schwarz) zeigt die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien, umfassend die inverse Transkriptase und den Verdrängungsprimer. Die Säule 2 (schraffiert) zeigt die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien mit Ausnahme der Verdrängungsprimer E220 und DIS8.
Die Abb. 8 schematisch das Untersuchungsprinzip der Verdrängung von Strängen zeigt, die Haarnadelschleifenstrukturen innerhalb einer DNS-Duplex enthalten, mit Hilfe einer DNS-Polymerase, wie sie im Beispiel 9 beschrieben ist. Die stark verdickten Striche bezeichnen einen Haarnadelbereich der Haarnadelschleifenstruktur, die durch eine Polymerase abgeschrieben wird.
Abb. 9 einen anderen besonderen Fall der Nucleinsäureamplifikation gemäß der Erfindung zeigt, der ein Oligonucleotid verwendet, das eine Haarnadelschleifenstruktur umfasst und außerdem eine Senssequenz eines Promotors für eine RNS-Polymerase umfasst. Die geraden Linien in feinen Strichen zeigen eine Sequenz einer DNS, die dicken Striche zeigen die einer RNS. Der halbkreisförmige Teil zeigt eine Struktur, die die Schleife bildet.
Abb. 10 ein Histogramm von Ergebnissen repräsentiert, die gemäß Beispiel 10 erhalten wurden. Die auf der Ordinate angegebene optische Dichte (OD) wird in Tausendstel beziffert. Die logarithmierte Anzahl von Zielkopien pro Versuch wird auf der Abszisse angegeben. Die Säule 1 (schwarz) zeigt die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien mit Ausnahme von Enzymen. Säule 2 (schraffiert) zeigt die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien mit Ausnahme des Verdrängungsprimers DIS22. Die Säule 3 (grau) zeigt die Versuche in Anwesenheit aller Reagenzien, umfassend den Haarnadelschleifenprimer.
Abb. 11 ein Histogramm von Ergebnissen zeigt, die gemäß Beispiel 11 erhalten wurden. Die auf der Ordinate angegebene optische Dichte (OD) ist in Tausendstel beziffert. Die logarithmierte Anzahl der Zielkopien pro Versuch ist auf der Abszisse angegeben. Die Säule 1 (schwarz) zeigt die Versuche in Gegenwart aller Reagenzien. Die Säule 2 (schraffiert) zeigt die Versuche aller Reagenzien mit Ausnahme des Enzyms.
Das Verfahren, das unten beschrieben wird, kann bei konstanter Temperatur und vor allem bei der für die verwendete DNS-Polymerase optimalen Temperaturen arbeiten. Zudem werden die erfindungsgemäßen Primer, die für die Durchführung dieses Verfahrens verwendet werden, im Folgenden mit dem Buchstaben H bezeichnet, gegebenenfalls versehen mit einer Nummerierung, wenn mehrere dieser Primer beteiligt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft vor allem ein Oligonucleotid, wie es in Abb. 1 aufgezeigt wird, umfassend vom 5'-Ende zum 3'-Ende aufeinander folgend:
- einen ersten Teil A, zumindest teilweise nucleinsäurehaltig, umfassend von 5' nach 3' zwei autokomplementären Nucleinsäuresegmente (a) und (a'), die fähig sind zur Autohybridisierung, um eine Haarnadel zu bilden, getrennt durch ein wahlweises und nicht obligatorisches drittes Nucleinsäuresegment (e), das nach der Bildung der Haarnadel vor allem eine nicht gepaarte Schleife aufbauen kann, wobei die Gesamtheit des Teils A eine als Haarnadelschleife bezeichnete, autohybridisierte Molekularstruktur bildet und wobei der Teil A mindestens ein Mittel zur Blockierung der Elongation durch eine Nucleinsäurepolymerase umfasst,
- einen zweiten nucleinsäureartigen Teil B, der von 5' nach 3' ein erstes wahlweises Segment (b) und ein zweites Segment (b') umfasst, von denen mindestens das Segment (b') zur Hybridisierung mit einer Nucleinsäurezielsequenz fähig ist.
Unter den festgelegten experimentellen Bedingungen verbinden sich die Segmente (a) und (a') unter Bildung einer Haarnadel, während, falls vorhanden, das Segment (e) vor allem eine nicht gepaarte Schleife bilden kann; dieses Ensemble wird als Haarnadelschleife bezeichnet. Natürlich ist es für den Fachmann naheliegend, die Zusammensetzung von Segment (e) so anzupassen, dass das Segment, wenn die Segmente (a) und (a') autohybridisiert sind, eine beliebige, von einer Schleife abweichende Struktur einnehmen kann, sei es in der Komplexität, der Anzahl der Schleifen und/oder der Paarungen, die an der Bildung der Struktur beteiligt sind.
Erfindungsgemäß umfasst dieser Teil A des Oligonucleotids mindestens ein Mittel zur Blockierung der Elongation durch eine Nucleinsäurepolymerase, das heißt ein Mittel, das in der Lage ist, die Replikation oder Transkription zu blockieren, die sich nicht obligatorisch über das 3'-Ende des durch das Segment (a) des Oligonucleotids definierten Bereichs (Abb. 2) hinaus erstrecken darf und in einer bevorzugten Art ist nur die Sequenz (a') abschreibbar. Außerdem ist der Teil A, der in einer Duplex mit seinem neusynthetisierten Komplementärstrang enthalten ist, in der Lage, eine molekulare Struktur zu bilden, die zumindest teilweise autohybridisiert ist zum Zweck der Blockierung der Replikation oder der Transkription (Abb. 3).
Die Segmente (a) und (a') sind Nucleinsäuresequenzen, DNS und/oder RNS, die eine Autokomplementarität aufweisen, das heisst es handelt sich um zwei wiederholte inverse Sequenzen (verglichen mit einer Achse 5'-3' oder 3'-5'). Dennoch können die Sequenzen von (a) und (a') in dem Maße nicht komplementäre Nucleotide aufweisen, das die Bildung der Haarnadel nicht verhindert. Außerdem kann jede dieser Sequenzen (a) und (a') modifizierte Nucleotide oder nicht nucleinsäureartige Bestandteile umfassen, unter der Bedingung, daß diese Modifikationen die Bildung der Haarnadel nicht verhindern.
Das Segment (e) ist fakultativ und umfasst entweder eine Nucleinsäuresequenz oder eine nicht nucleinsäureartige Struktur. Die Zusammensetzung dieses Segments darf die Bildung der autohybridisierten Haarnadelschleifenstruktur gemäß der Erfindung nicht hemmen. Wenn dieses Segment mindestens eine Nucleotidsequenz umfasst, sollte diese derart ausgewählt werden, dass sie keinerlei Komplementarität mit sich selbst oder mit den Segmenten (a) und (a') aufweist.
Im Grunde ist die Wahl der Komponenten dieser Segmente (a), (a') und (e) durch die Notwendigkeit bestimmt, mindestens ein Mittel zur Blockierung der Elongation durch eine Nucleinsäurepolymerase zu haben, die sich in einem Bereich von dem dritten Nucleotid an befindet, das definiert ist ab dem 3'-Ende des Segments (a') bis zum Nucleotid des 3'- Endes des Segments (a) des Oligonucleotids und bevorzugt an einer beliebigen Stelle des Segments (e), falls dieses vorhanden ist. Falls das Segment (e) frei von Oligonucleotiden ist, müssen nur das Segment (a') oder mindestens ein Teil von (a') durch eine Nucleinsäurepolymerase abschreibbar sein. In diesem Fall kann das die Polymerisation blockierende Element z. B. am 3'-Ende des Segments (a) lokalisiert sein.
Dieses Stoppen der Replikation oder der Transkription durch eine Polymerase kann durch die Anwesenheit von modifizier ten, durch eine Polymerase nicht abschreibbaren Basen erreicht werden, durch Strukturen, deren Zucker modifiziert sind, oder mit Strukturen, die mit Nucleinsäuren hybridisieren können, deren Natur aber unterschiedlich ist, wie bei dem PNA (Nielsen et al., 1991, Sience 254: 1497-1500; rum et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 5332-5336). Diese Blockierung kann gleichermaßen durch die Insertion eines Kohlenwasserstoffarms, wie z. B. eines Hexaethylenglykolarms (Zhang et al., 1991, Nucleic Acid Res. 19, 3929-3936) oder in der Art eines primären aliphatischen Amins (Kessler, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, ed. Kricka, Academic Press Inc., New York, Seite 58) erreicht werden. Andere verwendbare Arme sind durch Uhlmann und Peyman beschrieben (1990, Chemical Reviews, 90, 544-584). Abasische Stellen können ebenfalls zur Blockierung der Elongation verwendet werden (Zhou und Doetsch, 1993, Proc. Natl. acad. Sci. USA 90, 6601-6605). Man kann auch durch UV-Bestrahlung induzierte Schädigungen einführen, wie z. B. Cyclobutan- Pyrimidindimere, die als Blockierungsmittel für RNS- Polymerasen bekannt sind.
Das Erhalten von erfindungsgemäßen Oligonucleotiden in einer autohybridisierten Form wird durch Bedingungen ermöglicht, die es erlauben, eine Verdrängung des thermodynamischen Gleichgewichts einer nicht autohybridisierten Struktur gegenüber einer autohybridisierten Haarnadelschleifenstruktur, die, falls die Schleife auf eine Größe von null Nucleotiden reduziert wurde, eine Haarnadelstruktur bildet, zu erzielen. Diese Bedingungen sind bekannt oder können in jedem speziellen Fall durch Routineexperimente bestimmt werden, z. B. durch Variation der Puffer- und Temperaturbedingungen. Diese Gleichgewichtseigenschaften werden in der Literatur für einige spezielle Oligonucleotidsequenzen beschrieben (Hirao et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 576-582; Yoshizawa et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 2217-2221; Durand et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 6353-6359). Es konnte gezeigt werden, dass sogar sehr kurze Oligodesoxynucleotide, wie z. B. d(GCGAAGC), in der Lage sind, Haarnadelstrukturen zu bilden, die extrem stabil sind und Wärme und Nucleasen widerstehen können. Außerdem ist der Einfluss der Sequenz auf den Übergang von der nicht autohybridisierten Form zu der autohybridisierten Haarnadelschleifenform von Oligonucleotiden untersucht worden (Xodo et al., 1981, Biochimie 71: 793-803). Diese Autoren haben außerdem gezeigt, dass die Trennung von Oligonucleotiden nicht durch die Anwesenheit von nicht gepaarten Nucleotiden induziert wird, die sich zwischen den wiederholten invertierten Sequenzen befinden, denn Oligonucleotide, die die Sequenz (&sup5;'CG³') n aufweisen, besitzen eine starke Neigung zur Bildung einer intramolekularen Struktur. Weiterhin hat es sich gezeigt, dass die Sequenzen, die am wenigsten zur Bildung von Haarnadelschleifenstrukturen neigen, diejenigen sind, deren Haarnadel durch eine Serie von A-T-Paaren und von G-C-Paaren an den Enden der Schleife gebildet wird.
Die Basenzusammensetzung der Haarnadel beeinflusst in wichtiger Weise die thermische Stabilität der Haarnadel; speziell senkt die Substitution eines C-G-Paares durch ein A-T- Paar auf dem Niveau der Verbindungsstelle von Haarnadel und Schleife die Stabilität der Struktur um 9ºC. Andere Autoren haben die Bedeutung der Schleife für die Stabilität der Haarnadelschleifenstruktur aufgezeigt. Im Fall einer Schleife von vier Nucleotiden wird diese Stabilität verringert, wenn das Basenpaar &sup5;'C-G³', das die Schleife schließt, durch &sup5;'G-C³' ersetzt wird, falls es sich um DNS- oder RNS- Moleküle handelt (Antao und Tinoco, 1992, Nucleic Acids Res. 20: 819-824). Die Schleifen vom Typ &sup5;'GNRA³' sind diejenigen, deren Sequenz die beste Stabilität der RNS-Haar nadelschleifenstruktur gewährleisten. Der Einfluss von nicht nucleotidartigen Schleifen auf die Stabilität von Haarnadelschleifenstrukturen wurde ebenfalls untersucht. Im Speziellen wurden Strukturen vom Typ Oligodesoxyribonucleotid beschrieben, die eine Haarnadelschleife bilden, deren Schleife eine Kette ist, die von einer Kopplung mit Hexaethylenglykol herrührt (Durand et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 6353-6359).
Die Länge der Schleife ist ebenfalls ein wichtiger Faktor für die Stabilität der Haarnadelschleifenstruktur. Rentzeperis et al. (1993, Nucleic Acids Res. 21: 2683-2689) haben die Länge einer Poly-T-Schleife von 3, 5 oder 7 Nucleotiden variiert und haben dann gezeigt, dass für eine gegebene Schleife die Stabilität der untersuchten Strukturen mit zunehmender Größe der Schleife abnimmt. Groebe und Uhlenbeck (1988, Nucleic Acids Res. 16: 11725-11731) haben außerdem gezeigt, dass eine Schleife von 4 bis 5 Nucleotiden einer Haarnadelschleifenstruktur vom RNS-Typ eine maximale Stabilität verleiht.
Außerdem wurde gezeigt, dass die autohybridisierte Form einer Haarnadelschleife bevorzugt ist bei schwacher Ionenstärke und in Anwesenheit von MgCl&sub2; (Boulard et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 5159-S167).
Sofern es die Größe der Segmente (a), (a') und (e) der Oligonucleotide betrifft, wählt man beispielsweise Größen, die zwischen 2 bis 30 Nucleotiden variieren und bevorzugt von 3 bis 15 Nucleotide für das Segment (a), 2 bis 30 Nucleotide und bevorzugt 3 bis 15 Nucleotide für das Segment (a') und 0 bis 20 Nucleotide und bevorzugt 2 bis 8 Nucleotide für das Segment (e).
Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Oligonucleotide umfassen einen Teil B (Abb. 1), der sich unmittelbar am 3'-Ende des Segments (a') von Teil A dieser Oligonucleotide befindet. Dieser Teil B umfasst von 3' nach 5' folgend mindestens ein Segment (b'), gegebenenfalls verknüpft mit einem Segment (b).
Die Segmente (b) und (b') sind DNS- und/oder RNS-Nucleinsäuresequenzen. Das Segment (b) ist fakultativ und, falls es vorhanden ist, kann es bevorzugt einen Promotor für eine RNS-Polymerase, eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym und ein Enzym, das einen Replikationsursprung erkennt, umfassen. Die Promotorsequenzen, die auch als Senssequenzen oder Anitsenssequenzen eines Promotors bezeichnet werden, können bevorzugt Promotorsequenzen von Phagen-RNS- Polymerasen sein (z. B. von Bakteriophagen T7, T3 oder SP6, die durch die Sequenzen SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 16 bzw. SEQ ID Nr. 20 repräsentiert werden). Außerdem ist bekannt, dass die RNS-Polymerase des T7-Phagen die Anwesenheit eines spezifischen Promotors auf der DNS für eine effektive Transkription der RNS benötigt. Die Sequenz dieses spezifischen Promotors ist vollständig charakterisiert (Dunn und Studier, 1983, J. Mol. Biol. 166: 477-535) und die große Transkriptionsspezifität der T7-RNS-Polymerase, ausgehend von ihrem Promotor, konnte aufgezeigt werden (Bailey et al., 1983, Proc. Natl. acad. Sci. 80: 2814-2818). Diese Eigenschaften können verwendet werden, um in vitro RNS mit Hilfe von T7-RNS-Polymerasen von Matrizen aus zu erzeugen, die einen funktionellen Doppelstrangpromotor enthalten (Krupp und Söll, 1987, FEBS Lett. 2: 271-275; Milligan et al., 1987, Nucl. acids Res. 15: 8783-8798). Der Artikel von Krupp (1988, Gene 72. 75-89) beinhaltet eine gute Übersicht über Verwendungsarten von Phagen-RNS-Polymerasen und von Strategien, die für die in vitro Synthese von RNS verwendet werden. Weiterhin kann diese Promotorsequenz, sofern sie vorhanden ist, passend zu einer Sequenz sein, als Initiierungssequenz bezeichnet, die eine Sequenz umfasst, die natürlicherweise in der Nähe des Nucleotids +1 vorliegt, auf dem sich die Initiierung der Transkription vollzieht und das stromabwärts vom Promotor T7, T3 oder SP6 auf dem Segment (b) lokalisiert ist. Diese Sequenzen werden für T7 als SEQ ID Nr. 29 bezeichnet, für T3 als SEQ ID Nr. 30 bezeichnet und für SP6 als SEQ ID Nr. 31 bezeichnet.
Das Segment (b') wird für seinen Teil mit jeder Sequenz gebildet, die in der Lage ist, in spezifischer und stabiler Weise mit einer gegebenen Sequenz einer Target- oder Zielnucleinsäure zu hybridisieren. Obwohl die Länge dieser Sequenz kein Hauptfaktor bezüglich der Stabilität oder der Eigenschaften der vorher beschriebenen Oligonucleotide ist, kann das Segment (b') eine Länge von 5 bis 40 Nucleotiden haben und bevorzugt von 10 bis 20 Nucleotiden, um eine schnelle, für dieses Segment (b') stabile und spezifische Hybridisierung mit einer Zielsequenz zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid, das als Primer verwendbar ist, bevorzugt in einem Amplifikationsverfahren einer Zielsequenz einer Nucleinsäure, umfassend an seinem 3'-Ende eine stromabwärtige Sequenz von mindestens fünf Nucleotiden, dadurch charakterisiert, dass zumindest das Segment (b') des Oligonucleotids in der Lage ist, mit der stromabwärtigen Sequenz zu hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Primer erlauben vor allem die Entwicklung eines cyclischen Amplifikationverfahrens einer Zielsequenz aus einer Nucleinsäure und/oder einer Komplementärsequenz dieser Zielsequenz, wie oben angegeben.
Dieses Amplifikationsverfahren besitzt die Vorteile, isotherm zu sein, nur ein einziges Enzym verwenden zu können, ausgehend von Target-RNS wie auch von Target-DNS gut realisierbar zu sein, mit oder ohne definierte Enden, nicht begrenzt zu sein durch die Zielsequenz und keine Nucleaseaktivität für die Trennung der Duplexstränge oder den Einbau von modifizierten Nucleotiden in die Amplifikationsprodukte durch die verwendete Polymerase zu benötigen.
Diese Methode, als "RDS" oder "Verdrängungsreaktion von Sekundärstrukturen" bezeichnet, benötigt beispielsweise die Verwendung einer DNS-Polymerase (RNS- oder DNS-abhängig), verknüpft mit einer Strangverdrängungsaktivität, diese Aktivität kann durch die Polymerase selbst eingebracht werden (Masamune und Richardson, 1971, J. Biol. Chem. 246: 2992- 2701; Lundquist und Olivera, 1992, Cell 31: 53-60).
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Polymerase ist bevorzugt mit einer Strangverdrängungsaktivität versehen. Diese Aktivität ist eine wohlbekannte Eigenschaft von bestimmten DNS-Polymerasen (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Auflage, Seiten 5.33- 5.35, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Die Eigenschaften von DNS-Polymerasen und vor allem die Strangverdrängungsaktivität von einigen unter diesen werden detailliert beschrieben durch Kornberg und Baker (1992, DNA Replication, 2. Auflage, Seiten 113-225, Freeman, New York). Die Strangverdrängungsaktivität wurde erstmals für das Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I von Escherichia coli nachgewiesen (Masamune und Richardson, 1971, J. Biol. Chem. 246: 2692-2701), die die Initiierung der Replikation einer Nucleinsäure ermöglicht, ausgehend vom 3'OH-Ende einer Unterbrechung auf einem DNS-Doppelstrang. Diese Eigenschaft der Strangverdrängung ist auf den Fall begrenzt, wo die DNS-Polymerasen eine 5'-3'-Exonucleaseaktivität besitzen (Lundquist und Olivera, 1982, Cell 31: 53-60). Diese Strangverdrängungsaktivität ist gleichermaßen für thermostabile DNS-Polymerasen belegt, wie die Tli-DNS-Polymerase (Kong et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1965-1975). In diesem Fall konnte auch gezeigt werden, dass mutierte Formen dieses Enzyms, die keine 5'-3'-Exonucleaseaktivität aufweisen, eine größere Strangverdrängungskapazität besitzen. Die Strangverdrängung ist keine gemeinsame Eigenschaft aller DNS-Polymerasen, da bestimmte unter ihnen, wie die T4-DNS- Polymerase, nicht in der Lage sind, selbst die Strangverdrängung zu realisieren. Diese Strangverdrängungsaktivität ist gleichermaßen für die T7-DNS-Polymerase (Lechner et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 11174-11184) und für die inverse Transkriptase des HIV (Huber et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 4669-4678) belegt. Bevorzugt wird eine DNS- Polymerase ohne 5'-3'-Exonucleaseaktivität für die erfindungsgemäße Realisierung des Amplifikationscyclus verwendet. Das Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I von Escherichia coli verkörpert ein Beispiel einer Polymerase ohne 5'- 3'-Exonucleaseaktivität, ebenso wie Polymerasen wie die T4- DNS-Polymerase, die T7-DNS-Polymerase oder die SequenaseTM (US Biochemical), die T5-DNS-Polymerase oder die Phi29-DNS- Polymerase, die ebenfalls verwendet werden können. Enzyme wie Vent(exo-)TM (New England Biolabs), das Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I von Escherichia coli (Boehringer Mannheim), das Stoffel-Fragment der Taq-Polymerase (applied Biosystems) oder die Bca-DNS-Polymerase (Takara Shuzo) können ebenfalls verwendet werden. Diese Enzyme haben insbesondere das Vermögen, die Polymerisation der Nucleinsäuren ausgehend von Matrizen mit wichtigen Sekundärstrukturen wie der Haarnadelschleifenstruktur zu ermöglichen. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass das große Fragment der DNS-Polymerase I von Bacillus stearothermophilus eine große Kapazität beim Auflösen von Haarnadelschleifenstrukturen besitzt (Ye und Hong, 1987, Sci. Sin. 30: 503-506). Die Wahl der verwendeten Polymerase kann gleichermaßen als Funktion der Temperatur, bei der man zu arbeiten wünscht, und als Funktion des anfänglichen Nucleinsäuretyps (RNS oder DNS) variiert werden. Insbesondere kann man die inverse Transkriptase MMLV SuperscriptIITM ohne die RNase-H-Aktivität (Gibco-BRL) verwenden, deren Prozessivität gut ist und von der wir die Strangverdrängungskapazität überprüfen konnten, um eine DNS-Amplifikation zu realisieren, ausgehend von einem ursprünglichen RNS-Target. Jedes Enzym, das eine RNS- und/ oder DNS-abhängige DNS-Polymeraseaktivität besitzt, kann demnach in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wenn dieses eine Strangverdrängungsaktivität besitzt. Im entgegengesetzten Fall kann die Strangverdrängungsaktivität durch ein Induktionsmittel, eine Aktivität vom Typ Helicase oder Rec A verliehen werden. Die Eigenschaften von Rec A, vor allem im Prozess der Reassoziierung der einsträngigen DNS, des Strangeinfangprozesses oder der Strangassimilierung werden detailliert von McEntee und Weinstock geschildert (1981, The Enzymes, 14: 445-470).
Wenn außerdem mindestens einer der im Amplifikationsverfahren, das oben beschrieben wurde, verwendeten Primer ein Segment (b) beinhaltet, umfassend die Senssequenz eines Promotors für eine RNS-Polymerase, kann eine RNS-Polymeraseaktivität mit DNS-Polymeraseaktivitäten und der Strangverdrängung verknüpft sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann die Ausgangsnucleinsäure beispielsweise ein DNS- oder RNS-Extrakt einer biologischen Probe sein. In diesem Fall ist es möglich, eine Amplifikationsreaktion, wie sie vorstehend definiert ist, am Anfang der Ausgangsnucleinsäure in einem einzigen Schritt durch Hinzufügen aller Reagenzien (Primer, Polymerasen etc.) schon von Reaktionsbeginn an, gegebenenfalls nach der Denaturierung des Ausgangsmoleküls zu erhalten. Diese bevorzugte Art der Durchführung ist dadurch gekennzeichnet, dass man am Anfang einer Nucleinsäure manipuliert, die die zu amplifizierende Zielsequenz enthält, und sie über das 5-Ende der Zielsequenz hinaus mit einem stromaufwärtigen Bereich und sich über das 3'-Ende der Zielsequenz hinaus mit einem stromabwärtigen Bereich ausdehnt. In diesem Verfahren bringt man die Ausgangsnucleinsäure in Anwesenheit eines Systems von DNS-Polymeraseaktivität oder von DNS-Polymerase- und RNS-Polymeraseaktivitäten in Kontakt mit einer Strangverdrängung und einem Primerensemble, das die oben beschriebenen Primer enthält und außerdem einen fünften Primer enthält, der in der Lage ist, mit dem stromabwärtigen Bereich der Ausgangsnucleinsäure zu hybridisieren und/oder einem sechsten Primer, der in der Lage ist, mit dem stromaufwärtigen Bereich der Ausgangsnucleinsäure zu hybridisieren.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Primerensemble oder Primersatz zur cyclischen Amplifikation einer Zielsequenz einer Nucleinsäure und/oder einer der Zielsequenz komplementären Sequenz, das Ensemble umfassend:
- einen ersten Primer H, der gemäß der Erfindung definiert ist,
- einen zweiten Primer S, umfassend eine Sequenz, die dem Segment (a') des Primers H mindestens zum Teil homolog ist.
Die Amplifikationsmethode der Erfindung kann auf jede zu analysierende Probe angewendet werden, die aus einer beliebigen Ausgangsmaterie isoliert werden kann, welche geeignet ist, eine Sequenz einer Targetnucleinsäure zu enthalten. Die von Tieren, z. B. von Säugetieren, stammenden Proben können Blut, Knochenmark, Lymphe, hartes Gewebe (Leber, Milz, Niere, Lunge, Ovarium etc.), Speichel, Kot, Urin sein. Die Ausgangsproben können von Pflanzen, Bodenproben, Lebensmitteln sowie von allen anderen Quellen stammen, von denen angenommen wird, dass sie biologische Organismen enthalten.
Die Isolierung der Nucleinsäuren dieser Ausgangsmaterialien kann gemäß bekannter Verfahren realisiert werden, die vor allem die Verwendung von Detergenzien, die zu Lysaten führen, die Verwendung von Enzymen (z. B. Lysozym, Proteinase K), Ultraschallbehandlung, mechanisches Rühren in Anwesenheit von Kugeln oder die Verwendung einer French-Presse umfassen. In bestimmten Fällen kann es notwendig sein, die Nucleinsäureextrakte zu reinigen, um eventuelle Verunreinigungen, wie Nucleasen, zu eliminieren. In diesem Fall kann die Reinigung der Nucleinsäuren z. B. durch Extraktion mit Phenol-Chloroform, Chromatografie, Ionenaustausch, Elektrophorese, Gleichgewichtszentrifugieren und/oder Einfangen durch Hybridisierung auf einem festen Träger geschehen.
Wenn die Nucleinsäuren isoliert sind, kann ihre beschleunigte Fragmentierung mit Mitteln wie Ultraschallbehandlung durchgeführt werden, um Fragmente geringerer Größe von 20 Kilobasen zu erhalten. Dieser nicht obligatorische Vorbereitungsschritt erlaubt es, im bevorzugten Fall einer Doppelstrangnucleinsäure, die Anfangsdenaturierung zu erleichtern. Außerdem kann die Denaturierung von Doppelstrangnucleinsäuren oder von einsträngigen Nucleinsäuren, die eine starke Sekundärstruktur aufweisen, durch thermische Behandlung oder durch Erhöhung des pH-Wertes und Neutralisa tion des Mediums realisiert werden, um die Hybridisierung des Primers gemäß der Erfindung auf der Zielsequenz zu ermöglichen.
Im Fall des in Abb. 4 beschriebenen Verfahrens lag die Ausgangsnucleinsäure, die vor allem die Zielsequenz umfasst, die man zu amplifizieren sucht, in Form eines Doppelstrangs vor; dennoch bleibt mit Ausnahme des Ausgangsschritts der Denaturierung das Prinzip das Gleiche, wenn diese Nucleinsäuren in einsträngiger Form vorliegen.
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren einer Zielsequenz von einem Molekül der Ausgangsnucleinsäure, wobei die Zielsequenz an ihrem 3'-Ende eine stromabwärtige Sequenz und an ihrem 5'-Ende eine stromaufwärtige Sequenz umfasst, verwendet:
- zwei erfindungsgemäße Primer H1 und H2 vom Typ Haarnadelschleife,
- zwei Verdrängungsprimer D1 und D2,
- zwei Verdrängungsprimer S1 und S2.
Die Primer H&sub1; und H&sub2; sind gemäß den Angaben konstruiert, die die zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Primer betrifft. Diese zwei Primer H1 und H2 umfassen von 5' nach 3' sukzessive vier Arten von Segmenten, bezeichnet als (a) (e), (a') bzw. (b'). Die ersten und dritten Segmente (a) und (a') sind von nucleinsäureartiger Natur und ihre Sequenzen, obwohl beliebig, weisen die Besonderheit auf, wiederholt und eine in Bezug auf die andere invertiert zu sein, was die Autohybridisierung von Segment (a) mit Segment (a') und die Bildung einer Haarnadel erlaubt. Das zweite Segment (e), das hier von nucleinsäureartiger Natur und von beliebiger Sequenz ist, weist keine Autokomplementarität auf und bildet eine Schleife bei der Paarung von (a) mit (a'). Weiterhin besitzt dieses Segment (e) an seinem 3'-Ende mindestens ein modifiziertes Nucleotid oder jegliches andere Molekül, das es erlaubt, die Elongationsreaktion durch eine Nucleinsäurepolymerase zu stoppen. Diese Sequenzen (a), (a') und (e) können H1 und H2 gegebenenfalls gemeinsam sein, können aber genauso gut unterschiedlich sein. Es ist offensichtlich, dass die Sequenzen keine signifikante Homologie mit der Ausgangsnucleinsäure enthalten dürfen und keinen Anlass geben zu der Bildung von Sekundärstrukturen, die sich von der autohybridisierten Haarnadelschleifenstruktur unterscheiden, wie sie vorstehend definiert wurde. Das vierte Segment (b') der Primer H1 und H2 ist von nucleinsäureartiger Natur und von unterschiedlicher Sequenz für beide Primer. Tatsächlich ist das Segment (b') des Primers H1 komplementär zu der stromabwärtigen Sequenz der zu amplifizierenden Zielsequenz, während das Segment (b') des Primers H2 homolog zu der stromaufwärtigen Sequenz der Zielsequenz ist. Man muss außerdem feststellen, dass bei Einführung der Primer H1 und H2 in das Reaktionsmedium diese in ihrer stabilsten Form vorliegen, das heißt in der autohybridisierten Haarnadelschleifenform.
Die Verdrängungsprimer D1 und D2 haben eine Größe, die von 5 bis 50 Nucleotiden und bevorzugt von 10 bis 35 Nucleotiden variieren kann und ihre Sequenz ist komplementär zu der Sequenz auf der Ausgangsnukleinsäure oder ihrem Komplementärstrang, die sich stromabwärts von der Sequenz, die sich mit Segment (b') der Primer H1 bzw. H2 paart, befindet.
Die Verdrängungsprimer S1 und S2 sind von nucleinsäureartiger Natur, ihre Größe kann beispielsweise von 2 bis 30 Nucleotiden und bevorzugt von 3 bis 15 Nucleotiden variieren und ihre Sequenz ist zumindest zu einem Teil von Segment (a') der Primer H1 bzw. H2 homolog. Die Primer S1 und S2 können außerdem stromaufwärts der Sequenz ein Nucleotidsegment umfassen, das den Sensstrang eines Promotors für eine RNS-Polymerase enthält, die es erlaubt, eine zusätzliche Amplifikation durch Bildung von Transkripten zu erhalten.
Nach der Denaturierung der Ausgangsnucleinsäure werden die Primer H1 und D1 eines Teils und H2 und D2 eines anderen Teils mit der denaturierten Nucleinsäure hybridisiert (Strang I und I') (Abb. 4). In Anwesenheit einer DNS- Polymerase, die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, und dNTP bewirkt die Elongation der Primer D1 und D2 die Strangverdrängung und die Freisetzung von einsträngiger DNS, die durch Elongation der Primer H1 bzw. H2 erhalten wurde, in das Reaktionsmedium. Die so freigesetzten Produkte (II und II') weisen an ihrem 5'-Ende die Sequenz, die entweder dem Primer H1 oder dem Primer H2 entspricht, und an ihrem 3'-Ende Sequenzen auf, die bereits im Ausgangsmolekül vorhanden sind, welches die Hybridisierung entweder der Primer H2 und D2 auf Produkt II oder der Primer H1 und D1 auf dem Produkt II' erlaubt. Die Elongation von jedem dieser Primer, falls diese hybridisiert sind, vollzieht sich unter Freisetzung der Strandprodukte durch Elongation der Primer H1 und H2. Wenn die Replikation auf dem Niveau des 5'-Endes der Matrix erreicht wird (II bzw. II'), schreibt die Polymerase die Sequenz der Primer H1 bzw. H2, die zuvor in diese Matrizen eingeführt wurden, ab. Aber die laufende Strangsynthese der DNS wird auf dem Niveau der modifizierten Nucleotide oder jeden anderen äquivalenten Moleküls, das ursprünglich in das Segment (e) der Primer H1 und H2 eingeführt wurde, gestoppt. Die freigesetzten Produkte (IV und IV') weisen an ihrem 5'-Ende die komplette Sequenz des Primers H1 oder H2 und an ihrem 3'-Ende eine zu Segment (a') des Primers H2 oder H1 komplementäre Sequenz auf. Wie Abb. 4 aufzeigt, können die erhaltenen einsträngigen Polynucleotide IV und IV' zum einen mit den Primern H1 und S1 (wobei S1 zumindest zu einem Teil von Segment (a') des Primers H1 homolog ist) und zum anderen mit den Primern H2 und S2 (wobei S2 zumindest zu einem Teil von Segment (a') des Primers H2 homolog ist) hybridisieren. Die Elongation dieser Primer durch die DNS-Polymerase führt über Verdrängung zu den Produkten IV und IV', die durch die Strangverdrängung freigesetzt werden, und zu den Produkten V und VI, resultierend aus der Elongation der Primer S1 und S2 auf den Matrices IV bzw. IV'. Die Produkte IV und IV', die bezüglich ihrer Sequenz ähnlich den Produkten IV und IV' sind, die im vorherigen Schritt erhalten wurden, können erneut mit den Primern S1 und H1 bzw. S2 und H2 hybridisieren und wie vorhergehend zum Erhalt der gleichen Reaktionsprodukte führen (IV, IV', V und V'). Die Produkte V und V entsprechen einem Doppelstrangmolekül. Sie weisen auf:
- eine Duplex an einem ihrer Enden, gebildet durch eine Sequenz, die dem Primer S1 oder S2 entspricht, und dessen Komplementärstrang,
- eine Duplex an ihrem anderen Ende, gebildet durch eine Sequenz, die dem Primer H2 oder H1 entspricht, und den Komplementärstrang der Segmente (a') und (b') dieser Primer.
Man erhält diese Produkte V und V' in einer durch VI und VI' repräsentierten Form, aufweisend:
- eine Duplex an einem ihrer Enden, gebildet durch den Primer S1 oder S2 und seinem Komplementärstrang,
- eine autohybridisierte Haarnadelschleifenstruktur an ihrem anderen Ende, die homolog zu derjenigen ist, die die Primer H1 oder H2 aufweisen. Die Trennung der Doppelstrangmoleküle V und V' erlaubt das Freisetzen eines einsträngigen Bereichs, auf dem der Verdrängungsprimer S2 bzw. S1 hybridisieren kann.
Die Elongation des Verdrängungsprimers S2 oder S1 durch die DNS-Polymerase wird begleitet durch die Verdrängung des gepaarten Strangs, der die Haarnadelschleifenstruktur trägt. Man erhält einen abgelösten Strang, der dem vorher beschriebenen Molekül IV oder IV' entspricht, und ein Molekül VII oder VII', das der Zielsequenz der Ausgangsnucleinsäure, die man zu amplifizieren wünscht, entspricht. Die Cyclisierung des Verfahrens erscheint deutlich auf Abb. 4, das dieses aufzeigt. Die Amplifikation vollzieht sich bei Raumtemperatur in autokatalytischer Weise bis zum Abbau der Reagenzien (bevorzugt Enzyme, Nucleotide) und führt zu der Ansammlung der Produkte VII oder VII'. Diese amplifizierten Produkte weisen außerdem an jedem ihrer Enden eine Sequenz auf, die der Co-Amplifikation von mindestens einem Teil des Segments (a') des erfindungsgemäßen Primers entspricht, der in der Lage ist, sich mit S1 oder S2 zu paaren. Die Anwesenheit dieses co-amplifizierten Fragments ist bevorzugt vorteilhaft, wenn man wünscht, die amplifizierte Zielsequenz zu isolieren, zu reinigen oder zu detektieren.
Das zur Durchführung der Amplifikation gemäß der Erfindung notwendige Reaktionsgemisch kann vor allem Polyole, wie Glycerol, Sorbitol oder Polyethylenglykol (PEG) oder Denaturierungsmittel und/oder Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid (DMSO) enthalten, die es ermöglichen, die nicht spezifischen Hybridisierungsreaktionen, die verantwortlich sind für die Erzeugung von Untergrundrauschen, zu reduzieren. Außerdem kann es die Wahl der Temperatur erlauben, Bedingungen zu definieren, die die Hybridisierung unterdrücken, wobei die spezifische Hybridisierung von unterschiedlichen Primern auf ihren Targets und die Verschiebung des thermodynamischen Gleichgewichts zwischen der nicht autohybridisierten Form und der autohybridisierten Haarnadelschleifenform (VI und VI') der Produkte, wie die Moleküle V und V', zugelassen wird. Diese Temperatur kann mit konventionellen enzymatischen Reagenzien bevorzugt zwischen 30ºC und 55ºC variiert werden und von 60 bis 80ºC, wenn man auf thermostabile Enzyme oder Reagenzien zurückgreift.
Die Anzahl der verwendeten Primer kann vorteilhaft reduziert sein, wenn man eine Struktur wählt, die die Primer H1 und H2 gemeinsam haben. In diesem Fall können die Verdrängungsprimer S1 und S2 ähnlich sein. Ebenso erlauben es spezielle Fälle der zu amplifizierenden Zielsequenz, einen Verdrängungsprimer D1, der dem Verdrängungsprimer S1 ähnlich ist, und einen Verdrängungsprimer D2 auszuwählen, der dem Verdrängungsprimer S2 ähnlich ist, und folglich können die Verdrängungsprimer S1, S2, D1 und D2 ähnlich sein. Man bezeichnet die Primer als ähnlich, wenn die Primer entweder identisch sind oder die Primer eine gemeinsame Sequenz besitzen (im Besonderen zwei Primer unterschiedlicher Länge, wobei der längere die Sequenz des kürzeren enthält).
Um die Effektivität des Amplifikationssystems zu erhöhen, können die Primer S1 und S2 durch Zugabe eines intercalierten Mittels, das auf kovalente Art und Weise fixiert wird, modifiziert werden (Telser et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111. 7226-7232). Dies erlaubt es, die Hybridisierung der Verdrängungsprimer S1 und S2, ohne jegliche Störung der Elongation des 3'-Endes durch eine Polymerase zu begünstigen. Ebenso können die Moleküle auf das 5'-Ende der Primer S1 und S2 gepfropft werden, wie im französischen Patent Nr. FR 91 09057 und in der Patentanmeldung PCT Nr. WO 91 19812, die die Kopplung eines Proteins wie des Rinderserumalbumins (BSA) beschreiben. Die Verknüpfung von sterisch anspruchsvollen Molekülen auf dem 5'-Ende der Primer S1 und S2 bevorzugt die Bildung der autohybridisierten Haarnadelschleifenform zum Nachteil der nicht autohybridisierten Form der Primer H1 und H2 in den Molekülen V und V'.
Abb. 5 beschreibt eine Variante der Amplifikationsmethode von Nucleinsäuren, die die erfindungsgemäßen Primer verwendet. In diesem Fall wird ein Transkriptionsschritt hinzugefügt, um mehrheitlich RNS-Moleküle herzustellen. Um dies auszuführen, sind die erfindungsgemäßen Primer H1 und H2 gemäß des Modells konstruiert, das in der oben dargelegten Technik beschrieben ist, enthalten aber außerdem ein Segment (b), das sich zwischen dem Segment (b') und dem Segment (a') befindet, umfassend eine RNS- Polymerasepromotorsequenz, bevorzugt einen Phagen-Promotor (T7, T3 oder SP6). Gemäß der Abb. 5 werden die Moleküle V und V' nach einer Serie von Primerhybridisierungen und Elongationen mit Strangverdrängung, die analog sind zu denjenigen, die in Abb. 4 beschrieben werden, im Reaktionsmedium erhalten. Dennoch besitzen die Primer H1 und H2 bevorzugt ein Segment (b), die Produkte V und V' weisen an jedem ihrer Enden einen funktionellen Promotor in der Form einer Doppelstrang-DNS auf. In Anwesenheit eines Überschusses an Ribonucleosidtriphosphaten und einer RNS-Polymerase, die dem Promotor entspricht, kann eine Transkriptionsreaktion, ausgehend von diesen Produkten, initiiert werden. Die synthetisierte RNS VI und VI' kann mit den erfindungsgemäßen Primern H2 und H1 und den Verdrängungsprimern S2 bzw. S1 hybridisieren. Die abgelösten Produkte VII und VII', die aus der Elongation der Primer H2 bzw. H1 resultieren, können mit den erfindungsgemäßen Primern H1 bzw. H2 hybridisieren. Die Elongation dieser Primer durch die DNS-Polymerase führt in diesen zwei Fällen zu einem einzigen und dem gleichen Produkt VIII. Das Produkt entspricht einer bevorzugt zu amplifizierenden Zielsequenz, in 5' und in 3' durch einen funktionellen Promotorbereich flankiert, der die Transkription von zahlreichen Transkripten dirigieren kann, deren Sequenz den RNS-Molekülen VI und VI' entspricht, die zuvor erhalten wurden und die erneut mit den Primern H2 und S2 bzw. H1 und S1 hybridisieren können. Die RNS, die aus einem der beiden Wege der beschriebenen Amplifikationsmethode hervorgegangen ist, bildet das Substrat für den zweiten und vice versa; es scheint also, dass die erfindungsgemäße Methode eine cyclische Amplifikationstechnik ist, die die Vermehrung der Reaktionsprodukte in exponentieller Weise bewirkt.
Es ist offensichtlich, dass die Promotorsequenzen auf den erfindungsgemäßen Primern H1 und H2 identisch oder unterschiedlich sein können; dennoch sind in dem zweiten Fall zwei RNS-Polymerasen für die Amplifikationsreaktion notwendig. Ebenso ist es möglich, eine Amplifikation einer Nucleinsäurezielsequenz durchzuführen, indem man einen erfindungsgemäßen Primer, der einen Promotorbereich umfasst, und einen zweiten erfindungsgemäßen Primer, der diesen nicht umfasst, verwendet.
Die Art und die Menge der in dieser Amplifikationsmethode verwendeten Primer, die verwendeten Promotorsequenzen und die RNS-Polymerasekonzentrationen, relativ zu jedem Promotortyp, können derart ausgewählt werden, dass ein Amplifikationsweg im Vergleich zu den anderen bevorzugt wird, um bevorzugt eine Form oder eine andere von DNS oder RNS zu erhalten.
Falls gewünscht, können die amplifizierten Produkte von den für die Amplifikation verwendeten Enzymen (DNS-Polymerase und/oder RNS-Polymerase) getrennt werden, um in zukünftigen Verfahren verwendet zu werden, die z. B. andere enzymatische Reaktionen, andere Amplifikationssysteme, Sequenzierungsmethoden oder Methoden der Nucleinsäuresynthese, um nur einige Beispiele zu nennen, einschließen.
Natürlich kann das erfindungsgemäße Verfahren z. B. von Trennschritten und/oder von der Quantifizierung der Amplifikationsprodukte gefolgt werden, diese Schritte können in bekannter Weise angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit (Primer, Enzyme) für die Detektion einer Target-Nucleinsäure, die in einer Probe vorliegen kann, der die Anwendung der oben beschriebenen Amplifikationsmethode erlaubt.
Die Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf ein Herstellungsverfahren eines Oligonucleotids, das bevorzugt als Primer in einem Amplifikationsverfahren einer Nucleinsäure verwendbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass man gemäß bekannter Methoden ein Oligonucleottid, wie es erfindungsgemäß definiert ist, synthetisiert.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie dabei einzuschränken. Abgesehen von gegenteiligen Angaben wurden die Methoden bezüglich der Anwendung dieser Beispiele in Übereinstimmung mit ihrer Beschreibung durch Sambrook et al. realisiert (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor).

BEISPIEL 1:

Die Oligodesoxyribonucleotide werden durch eine Festphasensynthese mit einem Applied-Biosystems-Synthetisator erhalten. Die Synthese wird unter Verwendung von 2-Cyanoethyl- N,N-Diisopropylamidophosphit-Derivaten von unterschiedlichen Monomeren unter Berücksichtigung der vom Hersteller festgelegten Beschreibung durchgeführt. Alle verwendeten Reagenzien oder Lösungsmittel sind in der Regel käuflich erwerbbar.
Die Synthese der Oligonucleotidkette wird ausgehend von einem Controlled-Pore-Glass-Träger mit einer Porenweite von 1000 Å, der das Nucleosid an der 3'-Stelle der Sequenz trägt, realisiert. Während der Synthese wird das nicht nucleotidartige Glied (Blockierungsmittel) entweder unter Verwendung des Aminomodifier II (Clontech ref: S203), im Folgenden als N bezeichnet, oder des Spacer Phosphoramidite (Clontech ref: S260), im Folgenden als N' bezeichnet, eingebaut. Die Kettenelongation wird augenblicklich mit der Dimethoxytritylgruppierung fortgesetzt, die die 5'-Hydroxylfunktion des letzten Nucleosids blockiert. Die Abspaltung vom Träger und die Aufhebung des Schutzes des Oligonucleotids werden durch eine Behandlung mit einer 33%igen wässrigen Ammoniaklösung über 12 Stunden realisiert. Nach der Zugabe einer 0,1 M Lösung von Triethylaminacetat und Aufkonzentrieren des Elongationsprodukts unter reduziertem Druck wird eine Reinigung mit der HPLC-Technik unter Verwendung einer Säule mit inverser Phase (RPMC C&sub8; 10 · 250 mm) durchgeführt. Die Eluierung wird mit einem Acetonitrilgradienten durchgeführt (Puffer A: 0,1 M Triethylaminacetat pH: 7; Puffer B: 50% Puffer A/50% Acetonitril. Durchflussmenge 4,7 ml/min. von 10% B bis 50% B in 20 Minuten, spektrofotometrische Detektion bei 260 nm). Die unterschiedli chen positiven Fraktionen werden kombiniert und unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Eine Behandlung mit 80%iger wässriger Essigsäurelösung während 30 Minuten bei Raumtemperatur erlaubt die Freisetzung der 5'-Hydroxylfunktion. Die Essigsäure wird in Anwesenheit von Ethanol verdampft. Das Ausfällen mit Ethanol ermöglicht die Isolierung der gewünschten Verbindung. Eine HPLC-Analyse wird anschließend durchgeführt, um die Reinheit der Produkte zu kontrollieren (RPMC-Säule C&sub8; 4,6 · 25 mm, Durchflussmenge 1 ml/min. von 10 bis 14% B in 18 Minuten, dann von 24 bis 30% B in 17 Minuten).

BEISPIEL 2:

Die Strangverdrängungskapazität einer DNS-Polymerase auf einem DNS- oder RNS-Target in Anwesenheit von erfindungsgemäßen Haarnadelschleifenprimern wurde durch einen Versuch in homogener Phase demonstriert, das heißt, dass das einsträngige Elongationsprodukt, das ausgehend von den erfindungsgemäßen Haarnadelschleifenprimern erhalten wurde, im Anschluss an seine Verdrängung durch die Elongation eines Primers, der stromaufwärts auf dem einsträngigen Target hybridisiert wurde, ohne einen Denaturierungsschritt nach gewiesen wurde. Das gewählte Untersuchungsmodell ist die Gensequenz tem, die für die β-Lactamase kodiert, das Enzym, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin verleiht. Die Sequenz dieses Gens ist in der Sequenz SEQ ID Nr. 9 beschrieben. Diese Sequenz ist im Klonierungsvektor pBR322 kloniert.
Um die Strangverdrängungskapazität einer DNS-Polymerase auf Target-RNS zu analysieren, werden die RNS, welche der Gensequenz tem (SEQ ID Nr. 9) entsprechen, ausgehend von 1012 Kopien der Doppelstrang-DNS-Matrix, mit der RNS-Polymerase T7 in vitro unter Reaktionsbedingungen, wie sie im Kit ME- GAscriptTM (Ambion) empfohlen werden, transkriptiert. Zuerst wird die Doppelstrang-DNS-Matrix über die Technik der Polymerase Chain Reaction (PCR) synthetisiert, ausgehend vom Klon pBR322, mit Hilfe der Primer 1588 (SEQ ID Nr. 10) und 1562 (SEQ ID Nr. 11). Das erhaltene Produkt aus 889 Basenpaare enthält bevorzugt an einem seiner Enden den Promotor des Phagen T7. In Anwesenheit der T7-RNS-Polymerase wird eine RNS von 867 Basen erhalten, die der Komplementärsequenz der Sequenz SEQ ID Nr. 9 entspricht. Diese RNS werden mit DNase I behandelt, durch Extraktion mit Phenol/Chloroform gereinigt und in Ethahol in Anwesenheit von Ammoniumacetatsalzen ausgefällt. Die RNS werden in Wasser aufgenommen, das vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt wurde, durch Elektrophorese in einem denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert und qualitativ bzw. quantitativ durch Absorption bei 260 nm bestimmt. Eine Menge, die 10¹² Kopien der Target-RNS entspricht, wird pro Strangverdrängungsversuch verwendet.
Um die Strangverdrängungsversuche auf der DNS-Matrix durchzuführen, wird ein Oligonucleotid von 100 Basen, das mit 2585 (SEQ ID Nr. 12) bezeichnet wird und dem Komplementär bereich der Nucleotide 303 bis einschließlich 402 in SEQ ID Nr. 9 entspricht, auf chemischem Wege synthetisiert und mit HPLC gereinigt.
Die Verdrängungsversuche werden in einem Endvolumen von 50 ul durchgeführt, das 10¹² Zielkopien (RNS oder DNS), 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP und 1 mM dTTP (Pharmacia) und 5% Glycerol enthält. Das Reaktionsgemisch umfasst gleichermaßen 500 nM eines Oligonucleotidprimers 2810 (SEQ ID Nr. 6), der dem Primer entspricht, den man ersetzen möchte, und wahlweise 500 nM eines Verdrängungsprimers, der als DIS5 (SEQ ID Nr. 13) bezeichnet wird. Das Reaktionsgemisch wird während 3 Minuten auf 65ºC aufgeheizt, dann 10 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Das Enzym, das heißt 200 U der inversen Transkriptase "SupercriptII" (Gibco-BRL) wird hinzugefügt. Die inverse Transkriptionsreaktion wird während einer Stunde bei 37ºC durchgeführt, dann friert man bei -20ºC ein. Eine Fraktion von 5 ul wird ohne Denaturierungsschritt gemäß der modifizierten Methode des Einfangprozesses und der spezifischen Detektion ELOSA (Enzyme Linked Oligo Sorbent Assay) analysiert. Diese Methode verwendet die Fixierung eines Einfang-Oligonucleotids auf einem Festkörperträger (Mikrotitrationsplatte), die Hybtidisierung eines bei der Reaktion abgelösten und elongierten Produkts auf einer für dieses Produkt spezifischen Einfangsonde und seine Entdeckung durch eine Detektionssonde, die an eine Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Das Oligonucleotid des Einfangprozesses A25 (SEQ ID Nr. 14) wird in passiver Weise in den Bohrungen einer Mikrotitrationsplatte Nung-Immuno-Plate (Maxisorp) gemäß der bereits im französischen Patent NR. 91 09057 beschriebenen Methode fixiert, die die Fixierung von etwa 5 pMol eines Oligonucleotids in einer Bohrung ermöglicht. Nach der Fixierung werden drei Waschungen mit dem Puffer PBS Tween 1X durchgeführt. Der Nachweis des einge fangenen Verdrängungsprodukts wird entsprechend der Technik, wie sie im französischen Patent Nr. 91 09057 beschrieben ist, durchgeführt. Die zu analysierende Fraktion von 5 ul wird einem Volumen von 45 ul eines Puffers mit Natriumphosphat 0,2 M pH 7, Natriumchlorid 1 M, EDTA 2 mM, SDS 1,3%, Lachs-DNS 0,24 mg/ml, Polyethylenglykol (PEG) 6000 4% hinzugefügt. Jede Probe wird in eine Bohrung einer Mikrotitrationsplatte gegeben, die, wie vorher beschrieben, mit einer Einfangsonde A25 (SEQ ID Nr. 14) behandelt wurde. Unmittelbar danach werden 50 ul des Puffers mit Natriumphosphat 0,2 M pH 7, Natriumchlorid 1 M, EDTA 2 mM, SDS 1,3%, Lachs-DNS 0,24 mg/ml, Polyethylenglykol (PEG) 6000 4%, enthaltend 5 ng der Oligonucleotid-Detektionssonde A28 (SEQ ID Nr. 15), die an die Meerrettichperoxidase gekoppelt ist, hinzugefügt. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37ºC werden die Bohrungen mit PBS Tween 1X gespült. Die Entdeckung bzw. Aufdeckung der A28-Peroxidasesonde, die mit dem abgelösten Produkt hybridisiert ist, wird durch die Zugabe von 100 ul einer Lösung durchgeführt, die das Substrat Orthophenylendiamin (OPD) enthält. Die colorimetrische Reaktion wird nach 20 Minuten durch Zugabe von 100 ul 1 M Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte bei 492 nm wird durch das Lesegerät AXIA-Microreader (bioMérieux) abgelesen.
Die erhaltenen Resultate werden in Abb. 6 aufgeführt. Zum einen zeigen sie, dass es die Anwesenheit eines Verdrängungsprimers (SEQ ID Nr. 13) ermöglicht, eine konsequente Freisetzung des aus der Elongation des abgelösten Primers (Oligonucleotid 2810) hervorgegangenen Strangs, das heißt auf der DNS- oder RNS-Matrix, ins Medium zu erhalten. In Abwesenheit des Verdrängungsprimers ist das Signal, das der Elongation des Primers 2810 entspricht, ungefähr 2-mal geringer. Dies belegt die Strangverdrängungseffektivität auf einer RNS- und DNS-Matrix mit Hilfe der inversen Tran skriptase SuperscriptIITM. Man kann außerdem diese Resultate quantifizieren, was es erlaubt aufzuzeigen, dass diese inverse Transkriptase, ohne die RNase-H-Aktivität, eine bessere Verdrängungseffektivität eines DNS-Strangs auf einer RNS-Matrix besitzt als auf einer DNS-Matrix.

BEISPIEL 3:

Dieses Beispiel soll zeigen, dass die Matrizen, die eine autohybridisierte Haarnadelschleifenstruktur stromaufwärts von einer Promotorsequenz umfassen, durch eine RNS-Polymerase transkribtiert werden können. Dieser Matrizentyp wird ausgehend von pBR322 mit der PCR-Technik synthetisiert, mit Hilfe der Oligonucleotide 2801 (SEQ ID Nr. 1) und 1028 (SEQ ID Nr. 18) einerseits und andererseits mit 2806 (SEQ ID Nr. 2) und 1028 (SEQ ID Nr. 18), in Anwesenheit des Stoffel- Fragments der Taq-Polymerase (Applied Biosystems) ohne die 5'-3'-Exonucleaseaktivität. Die Abwesenheit dieser Exonucleaseaktivität erlaubt es, sich vom möglichen Abbau des Haarnadelteils der Haarnadelschleifenstruktur bei den unterschiedlichen, zur Synthese dieser Matrizen notwendigen PCR-Zyklen zu befreien. Die erhaltenen PCR-Produkte (Matrizen), die auf Agerosegel Nusieve 3% (FMC) analysiert wurden, weisen ein scheinbares Molekulargewicht von 130 Basenpaaren auf. Stromabwärts von einer autohybridisierten Haarnadelschleifenstruktur enthalten sie den Promotor der RNS- Polymerase des Phagen T7 (SEQ ID Nr. 19). Die Banden, die diesen Produkten entsprechen, werden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die PCR-Produkte elektro-eluiert. Sie werden in Anwesenheit von Natriumacetat in Ethanol ausgefällt und bei 260 nm quantitativ bzw. qualitativ bestimmt. Die Transkriptionsversuche wurden bei 37ºC über zwei Stunden in einem Endvolumen von 50 ul in dem von Milligan et al. (1987, Nucl. Acids Res. 15: 8783-8798) beschriebenen Reaktionspuffer durchgeführt, in Anwesenheit von ATP, CTP, GTP und UTP (jeweils 4 mM, Boehringer), 1 U/ul RNS guard (Pharmacia), 1 U/ul T7-RNS-Polymerase (New England Biolabs) und von 10¹¹ Kopien der gereinigten PCR-Matrix.
Eine Fraktion des Reaktionsgemisches (10 ul) wird mit 10 ul einer Lösung mit 0,035% Xylolcyanol, 0,035% Bromphenolblau, 1 mM EDTA, 98% Formamid gemischt, bevor es durch Elektrophorese in einem denaturierenden Polyacrylamidgel mit 15% Acrylamid, 7 M Harnstoff, 0,26% Bisacrylamid, 90 mM Trisborat, 2 mM EDTA, pH 8,3 analysiert wird. Diese Gele werden in die Elektrophoresegeräte mini-protean II electrophoresis cellTM (Biorad) gegossen und haben eine Dicke von 1 mm. Vor dem Aufbringen auf das Gel werden die Proben 2 Minuten bei 65ºC denaturiert und auf Eis schnell abgekühlt. Die Elektrophorese wird bei 150 Volt durchgeführt, bis das Bromphenolblau auf 1 cm an die Gelunterseite herangewandert ist. Die Gele werden 10 Minuten lang in einer Lösung von 0,6 ug/ml Ethidiumbromid eingefärbt und mit einem MP4-Apparat (Polaroid) auf einem UV-Tisch (312 nm) fotografiert.
Die durch die Elektrophorese getrennten Produkte werden in einem Puffer mit 45 mM Trisborat, 1 mM EDTA, pH 8,3 bei 4ºC unter einem elektrischen Feld von 35 Volt Stunde&supmin;¹ cm&supmin;¹ und mit dem Gerät mini trans-blot electrophoretic transfert cellTM (Biorad) auf eine Nylonmembran Hybond NTM (Amersham) transferiert. Die Membrane werden 5 Minuten lang bei 80ºC getrocknet und die Nucleinsäuren werden durch eine 3 Minuten andauernde UV-Bestrahlung (312 nm) auf der Membran fixiert.
Diese Membrane werden 60 Minuten lang bei 37ºC in 4 ml eines Puffers mit Natriumphosphat 0,1 M, pH 7,0, Natriumchlorid 0,5 M, EDTA 1 mM, SDS 0,65%, Lachs-DNS 0,14 mg/ml und Polyethylenglykol 6000 (PEG) 2% vorhybridisiert. Die Hybridisierung wird durch Inkubieren für 60 Minuten bei 37ºC in 5 ml des gleichen Puffers durchgeführt, wobei dieser in einer Konzentration von 200 ng/ml das Oligonucleotid A28 (SEQ ID Nr. 15) enthält, das mit Meerrettichperoxidase durch Kopplung in 5' markiert ist, gemäß des zuvor im internationalen Patent Nr. WO 91/19812 beschriebenen Verfahrens. Nach drei Waschprozessen von 30 Sekunden mit 50 ml des Puffers PBS 1X (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), der 0,5%a Tween 20 enthält, wird das hybridisierte Oligonucleotid durch die Peroxidaseaktivität in Anwesenheit von 10 mg Diaminobenzidintetrahydrochlorid- Dihydrat (DAB) in 20 ml des Puffers mit Natriumphosphat 20 mM pH 7,2 Natriumchlorid 150 mM, Rinderserumalbumin 2 mg/ml angezeigt. Nach Inkubieren bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz für 15 Minuten wird die Reaktion durch Spülen mit destilliertem Wasser gestoppt.
Eine Kontrollaktivität der T7-RNS-Polymerase wurde zuvor hergestellt, indem ein Doppelstrang-DNS-Fragment durch PCR erzeugt wurde, ausgehend von Targets pBR322 und mit Hilfe der Primer A24 (SEQ ID Nr. 17) uüd 1028 (SEQ ID Nr. 18). Das daraufhin erhaltene Produkt von 285 Basenpaaren enthält an einem Ende den Promotor der Phagen T7 und seine Transkription durch die T7-RNS-Polymerase ermöglicht es, eine RNS mit 263 Basen zu erhalten. Die Kontrollaktivität der T7-RNS-Polymerase wird durch Inkubieren von 1011 Kopien des Fragments von 285 Basenpaaren unter den zuvor beschriebenen Bedingungen realisiert. Die Reaktion wird 2 Stunden lang bei 37ºC durchgeführt, parallel zu den Transkriptionsversuchen auf den Matrizen, die die Haarnadelschleifenstrukturen der vorliegenden Erfindung enthalten.
Die erhaltenen Ergebnisse belegen die Fähigkeit von Matrizen, welche eine autohybridisierte Haarnadelschleifenstruktur stromaufwärts von einem Promotor einer RNS-Polymerase enthalten, in vitro transkribtiert zu werden. Die Art der Schleife scheint keinen Einfluss zu haben, da es die Matrizen, die eine Schleife mit zwei aminoModifier IITM-Resten (Amin, das in dem Primer 2801 SEQ ID Nr. 1 enthalten ist) oder einem Spacer PhosphoramiditeTM-Rest (Polyethylenglycol, enthalten in dem Primer 2806; SEQ ID Nr. 2) enthalten, ermöglichen, ein Transkript der erwarteten Größe mit einer in beiden Fällen identischen Ausbeute zu erhalten.

BEISPIEL 4:

Die erfindungsgemäßen Haarnadelschleifenprimer müssen durch eine Polymerase von Nucleinsäuren teilweise abschreibbar sein. Angesichts dieses Ziels wurden mehrere DNS-Polymerasen getestet: thermostabile Enzyme wie die Taq-Polymerase (Applied Biosystems), das Stoffel-Fragment der Taq-Polymerase (Applied Biosystems), die Bca-Polymerase (Takara), die VentTM-Polymerase (New England Biolabs) und thermostabile Enzyme wie das Klenow-Fragment (Boehringer), die inverse Transkriptase SuperscriptTM (Gibco-BRL) und die DNS-Polymerase T4 (New England Biolabs). Diese Polymerasen werden bezüglich ihrer Fähigkeit einer Primerelongation auf einer Matrix, die gemäß der Erfindung durch Haarnadelschleifen- Oligonucleotide gebildet wird sowie auf einer Kontrollmatrix 2799 (SEQ ID Nr. 21), die keine Struktur dieses Typs umfasst, getestet. Der zum 3'-Ende dieser Matrices komplementäre Primer A26 (SEQ ID Nr. 22) wird mit dem Isotop ³²P an seinem 5'-Ende durch die T4-Polynucleotidkinase in Anwesenheit von [γ-³²P] ATP markiert. Der markierte Primer wird durch Filtration auf dem Gel Séphadex G25 (Pharmacia) gereinigt und das Äquivalent von 10 pMol des markierten Pri mers, entsprechend 2 · 10&sup7; cpm, wird mit 20 pMol der Matrix in einem kommerziellen, dem Enzym entsprechend Puffer (Endvolumen 20 ml) hybridisiert. Das Enzym wird hinzugefügt (3 U T4-DNS-Polymerase oder 200 U inverse Transkriptase oder 5 U Klenow oder 1 U wärmebeständige Polymerase), dann wird eine einstündige Inkubation bei 37ºC für die thermophilen Enzyme und bei 50ºC für die thermostabilen Enzyme durchgeführt. Die Reaktionen werden durch Einfrieren bei -20ºC gestoppt. Die Produkte werden dann durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Acrylamidgel analysiert. Die Gele werden durch Polymerisation einer Lösung, die 20% Acrylamid, Harnstoff 7 M, 0,26% Bisacrylamid, 90 mM Trisborat, 2 mM EDTA, pH 8,3 enthält, polymerisiert und in einer Dicke von 1 mm in die Elektrophoresegeräte The SturdierTM (Hoefer Scientific Instruments) gegossen. Die Analysenproben werden durch Mischen von 10 ul Reaktionsgemisch und 10 ul einer Lösung mit 0,035% Xylolcyanol, 0,035% Bromphenolblau, 1 mM EDTA, 98% Formamid hergestellt. Vor dem Aufbringen auf das Gel werden die Proben 2 Minuten bei 95ºC denaturiert und dann auf Eis schnell abgekühlt. Die Elektrophorese wird bei 450 V durchgeführt, bis das Bromphenolblau bis auf 1 cm an die Gelunterseite herangewandert ist. Die Gele werden auf Whatman-3MM-Papier getrocknet und dann 2 Stunden autoradiografiert. Die Größe der Extensionsprodukte wird mit Hilfe eines Molekulargewichtsmarkers bestimmt, der aus, wie die Primer, in 5'-markierten, unterschiedlichen Oligonucleotiden besteht und parallel auf dem Gel aufgebracht wird.
In Anwesenheit unterschiedlicher Typen von verwendeten Enzymen, die zu einem Extensionsprodukt von 59 Basen führen, zeigt die Analyse eine komplette Elongation des Primers auf der Kontrollmatrix SEQ ID Nr. 21. Auf den Matrizen 2801 (SEQ ID Nr. 1) und 2804 (SEQ ID Nr. 21) werden in Anwesenheit der Enzyme Stoffel, SuperscriptTM, VentTM und Klenow Elongationsprodukte von 60 bzw. 30 Basen erhalten. Diese Produkte entsprechen einer Elongation der Primer auf den Targets, die die autohybridisierten Haarnadelschleifenstrukturen umfassen, bis zur letzten Base vor der chemischen Modifikation durch aminoModifier II""TM. Dies belegt zum einen, dass die so gebildete autohybridisierte Haarnadelschleifenstruktur durch die Strangverdrängungsaktivität dieser Enzyme geöffnet werden kann und dass diese autohybridisierten Haarnadelschleifenstrukturen auf Grund der Anwesenheit der chemischen Modifikation nur teilweise abschreibbar sind, denn die Replikation dieser Strukturen wird durch die Modifikation gestoppt. Die gleichen Resultate werden mit den Matrizen 2806 (SEQ ID Nr. 2) und 2810 (SEQ ID Nr. 6) erhalten, wonach Elongationsprodukte von 60 bzw. 30 Basen in Anwesenheit der Enzyme Stoffel, SuperscriptIITM VentTM und Klenow erhalten werden. Diese Produkte entsprechen einer Elongation des Primers A26 auf den Targets, die autohybridisierte Haarnadelschleifenstrukturen umfassen, bis zur letzten Base vor der chemischen Modifikation durch Spacer PhosphoramiditeTM. Die Verwendung der Enzyme Taq und Bca ermöglicht es nicht, die angestrebten Extensionsprodukte zu erhalten, wie die des verwendeten Haarnadelschleifenstrukturtyps. Diese Enzyme besitzen eine (5'- 3') Exonucleaseaktivität, die wahrscheinlich die Matrix abbaut, bevor sie abgeschrieben werden kann. Es ist zweckdienlich anzumerken, dass in dem Fall, wo die T4-DNS-Polymerase verwendet wird, kein Extensionsprodukt in Anwesenheit der Matrizen 2804 und 2810 beobachtet wird und dass im Gegensatz dazu ein Extensionsprodukt von ungefähr 50 Nucleotiden in Anwesenheit der Matrizen 2801 und 2806 erhalten wird. Dies scheint zu zeigen, dass die T4-DNS- Polymerase nicht in der Lage ist, die im vorliegenden Beispiel verwendeten Haarnadelschleifenstrukturen zu öffnen, um diese zu kopieren.

BEISPIEL 5:

Eine Amplifikation gemäß der in Abb. 5 beschriebenen Methode wird realisiert. Dafür wird ein Fragment von 167 Basenpaaren mit der PCR-Technik mit Hilfe der Primer DTA7 (SEQ ID Nr. 23) und DTA8 (SEQ ID Nr. 24) und ausgehend von pBR322 synthetisiert, das folglich einen Teil der Sequenz des Gens tem enthält, das den in SEQ ID Nr. 9 enthaltenen Nucleotiden 336 bis 402 entspricht. Dieses Fragment enthält an jedem seiner Enden eine Promotorsequenz einer RNS-Polymerase (insbesondere der Promotor des Phagen T7), der in 5' eine zur Sequenz E220 (SEQ ID Nr. 25) homologe Sequenz voransteht. Um den exponentiellen Charakter dieser Methode hervorzuheben, werden parallel unterschiedliche Amplifikationsreaktionen in der Anwesenheit abnehmender Mengen eines Zielmoleküls, das durch das vorhergehend gereinigte PCR- Fragment gebildet wird, durchgeführt: von 10¹¹ bis 10&sup7; Kopien pro Versuch. Die Reaktionen werden in einem Endvolumen von 50 ul in Anwesenheit von d'ATP, CTP, GTP und UTP (jeweils 4 mM), dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 1 mM), 1 U/ul RNS-Polymerase des Phagen T7 (New England Biolabs), 4 U/ul inverse Transkriptase MMLV SuperscriptIITM (Gibco-BRL), ohne RNase-H-Aktivität, und mit 1 U/ul RNA guard (Pharmacia) durchgeführt. Das Reaktionsmedium enthält außerdem die erfindungsgemäßen Primer H1 und H2, die den Oligonucleotiden 2806 und 2808 entsprechen (SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 4), in einer Konzentration von 1 uM und die Verdrängungsprimer E220 (SEQ ID Nr. 25) und S1 (oder S2), die dem Oligonucleotid DIS8 (SEQ ID Nr. 26) entsprechen, in einer Konzentration von 0,1 uM. Nach 2 Stunden inkubieren bei 37ºC wird die Amplifikationsreaktion durch Einfrieren des Reaktionsmediums bei -20ºC gestoppt. Eine Fraktion von 5 ul, das heißt 1/10 des Reaktionsvolumens wird durch einen Einfangprozess und spezifische Detektion gemäß der ELOSA- Methode (Enzyme Linked Oligo Sorbent Assay) quantitativ analysiert. Die Methode benutzt die Fixierung eines Einfangnucleotids auf einem festen Träger (Mikrotiterplatte), die Denaturierung des Reaktionsprodukts, seine Hybridisierung auf der spezifischen Einfangsonde der amplifizierten Sequenz und das Auffinden durch eine Detektionssonde, die an die Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Das Einfangoligonucleotid A20 (SEQ ID Nr. 27) ist in passiver Weise in den Bohrungen der Mikrotiterplatte Nung-Immuno-Plate von Maxisorp angebracht, gemäß der im französischen Patent Nr. 91 09057 bereits beschriebenen Methode, die die Fixierung von ungefähr 5 pMol eines Oligonucleotids in einer Bohrung ermöglicht. Nach der Fixierung werden drei Waschprozesse mit dem Puffer PBS Tween 1X durchgeführt. Der Nachweis des eingefangenen Amplifikationsprodukts wird gemäß der zuvor im französischen Patent Nr. 91 09057 beschriebenen Technik durchgeführt. Die zu analysierende Fraktion von 5 jil wird einem Volumen von 35 ul eines Puffers mit Natriumphosphat 0,2 M pH 7,0, Natriumchlorid 1 M, EDTA 2 mM, SDS 1,3%, Lachs-DNS 0,24 mg/ml, Polyethylenglykol (PEG) 6000 4% hinzugefügt. Die in dieser Probe enthaltenen Nucleinsäuren werden durch Zugabe von 5 ul 2 M Natriumhydroxid bei Raumtemperatur denaturiert und nach 3 Minuten durch Zugabe von 5 ul 2 M Essigsäure neutralisiert. Zur Kontrolle und Eichung werden zwei RNS-Verdünnungsreihen, entsprechend den erwarteten Amplifikationsprodukten, hergestellt. Jede Probe wird in der Bohrung einer Mikrotiterplatte angebracht, in der zuvor die Oligonucleotideinfangsonde A20 (SEQ ID Nr. 27) fixiert wurde. Entweder werden 50 ul einer unverdünnten Probe oder das gleiche Volumen einer Probe, die um das 10- fache oder 100-fache verdünnt wurde, angebracht. Sofort wird ein Volumen von 50 ul eines Puffers mit Natriumphosphat 0,2 M pH 7,0, Natriumchlorid 1 M, EDTA 2 mM, SDS 1,3%, Lachs-DNS 0,24 mg/ml, Polyethylenglykol (PEG) 6000 4%, der 5 ng einer an die Meerrettichperoxidase gekoppelten Oligonucleotid-Detektionssonde A19 (SEQ ID Nr. 28) enthält, hinzugefügt. Nach dem Inkubieren für 60 Minuten bei 37ºC werden die Bohrungen mit PBS Tween 1X gewaschen. Das Auffinden der A19-Peroxidasesonde, die mit dem Amplifikationsprodukt hybridisiert ist, wird durch Zugabe von 100 ul einer Lösung durchgeführt, die das Substrat Orthophenylendiamin (OPD) enthält. Die colorimetrische Reaktion wird nach 20 Minuten durch Zugabe von 100 ul 1 M Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte bei 492 nm wird mit Hilfe des Ablesegeräts AXIA-Microreader (bioMérieux) abgelesen. Die erhaltenen Resultate werden durch das Histogramm in Abb. 7 dargestellt. Für jede der Targetverdünnungen wurden zwei Versuche durchgeführt: vollständiger Versuch (wie zuvor beschrieben) und Versuch ohne Verdrängungsprimer E220 und DIS8. Die Resultate zeigen, dass es die Amplifikationsmethode (vollständiges System) unter diesen Bedingungen ermöglicht, ein spezifisches Signal zu detektieren, das bis zu einer Ausgangstargetmenge von 10&sup8; Kopien pro Versuch signifikant ist, das heißt eine Empfindlichkeit von 10&sup7; Kopien, da unter diesen Bedingungen eine Fraktion analysiert wurde, die äquivalent ist zu 1/10 des Reaktionsmediums. Diese Empfindlichkeit ist nur relativ und kann stark verbessert werden, wenn man ein von der Colorimetrie abweichendes Detektionssystem verwendet (z. B. Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz). Die Resultate zeigen vor allem, dass in Abwesenheit der Verdrängungsprimer E220 und DIS8 ein spezifisches Signal nur für eine Targetmenge von 10&sup9; Kopien pro Versuch erhalten wird. Der Unterschied in der Detektionsempfindlichkeit zwischen "mit" und "ohne" Verdrängungsprimer liegt also bei einem Faktor von 10² oder 2 Einheiten des dekadischen Logarithmus. Dies belegt, dass die Methode eine wichtige Anreicherung des Amplifikations produkts ermöglicht, wobei dieses nur aus der Realisierung des Amplifikationscyclus stammen kann. Die Realisierung des Cyclus ist also nur in Anwesenheit von Verdrängungsprimern möglich. Diese Daten zeigen, dass die Methode bis zum Transkriptionsschritt auf dem Umweg über einen enzymatischen Verdrängungsschritt auf der Cyclisierung des Verfahrens beruht, insbesondere mit Hilfe eines Verdrängungsprimers in Anwesenheit einer DNS-Polymerase, wie z. B. einer inversen Transkriptase. Die qualitative Analyse der Amplifikationsversuche durch elektrophoretische Trennung, Transfer auf eine Nylonmembran und Hybridisierung, wie im Beispiel 3 beschrieben, zum einen mit Hilfe der Sonde A28 (SEQ ID Nr. 15) und zum anderen mit der Sonde A19 (SEQ ID Nr. 28), die an die Meerrettichperoxidase gekoppelt sind, ermöglicht es, zwei Moleküle einer RNS, komplementär zu 110 Basen dem erwarteten Amplifikationsprodukt entsprechend, nachzuweisen.

BEISPIEL 6:

Um die Blockierungsfähigkeit der Polymerisation durch verschiedene, nicht nucleotidartige Arme zu belegen, wurden verschiedene Typen von Haarnadelschleifenprimern synthetisiert (gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Methode): die einen umfassen als nicht nucleotidartigen Arm Aminomodifier IITM (Clontech ref: S203), umfassend 2 (3116; SEQ ID Nr. 33) oder 4 Kohlenstoffe (2804; SEQ ID Nr. 5), die anderen als Arm den Spacer PhosphoramiditeTM (Clontech ref: S260) mit 12 Kohlenstoffen (2810; SEQ ID Nr. 6) oder ein Nucleosid α-Thymidin, als αdT bezeichnet, 3531 (SEQ ID Nr. 32) (das zum Einbau des Nucleosids notwendige Phosphoramidit wird ausgehend vom kommerziellen Nucleosid Sigma ref: T3763 hergestellt). Der Polymerisationsstopp entlang diesen besonderen Haarnadelschleifenstrukturen wird mit mehreren Polymerasen analysiert: a) thermostabilen Enzymen wie das Stoffel-Fragment der Taq-Polymerase (Applied Biosystems) oder das 9ºNmTM (New England Biolabs) und b) thermostabilen Enzymen wie das Klenow-Fragment der Polymerase I von Escherichia coli (Boehringer) oder die inverse Transkriptase Superscript IITM (Gibco BRL).
Zuerst wird der Primer A26 (SEQ ID Nr. 22), der komplementär ist zum 3'-Ende jeder dieser Matrizen, an seinem 5'- Ende durch die T4-Polynucleotidkinase in Anwesenheit von [γ-³²P]ATP markiert, dann durch Filtration über Séphadex-Gel G-25 (Pharmacia) gereinigt. Dann werden 10¹² Kopien der Haarnadelschleifenprimer (SEQ ID Nr. 33, 5, 6 oder 32) und 10¹² Kopien des markierten Oligonucleotids A26 (SEQ ID Nr. 22) in Anwesenheit eines jeden der dNTPs (am Ende 1 mM) in einem Reaktionsvolumen von 20 ul (kommerzieller Puffer (1X final) entsprechend jedem der Enzyme, die man verwenden möchte) und in Anwesenheit von 200 U inverse Transkriptase, 50 U Klenow-Fragment, 1 U Stoffel-Fragment der Taq-Polymerase oder 2 U von 9ºNm gemischt. Nach einstündigem Inkubieren bei 37ºC werden die Reaktionen durch Einfrieren bei -20ºC gestoppt und die Produkte werden durch Elektrophorese in denaturierendem Polyacrylamidgel analysiert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Größe der Elongationsprodukte wird mit Hilfe eines Molekulargewichtmarkers bestimmt, der aus unterschiedlichen, in 5'-markierten Oligonucleotiden besteht und parallel auf dem Gel angebracht wird.
Die erhaltenen Resultate zeigen, dass die Elongation des Primers A26 unterbrochen ist durch den nicht nucleotidartigen Arm auf den die Haarnadelschleifenstruktur bildenden Matrizen 2804 (SEQ ID Nr. 5), 2810 (SEQ ID Nr. 6), 3239 (SEQ ID Nr. 34) und 3531 (SEQ ID Nr. 32), wenn die Replikation mit dem Klenow-Fragment durchgeführt wird; auf den die Haarnadelschleifenstruktur bildenden Matrizen 2810 (SEQ ID Nr. 6), 3239 (SEQ ID Nr. 34) und 3531 (SEQ ID Nr. 32), wenn die Replikation mit der inversen Transkriptase durchgeführt wird; auf den die Haarnadelschleifenstruktur bildenden Matrizen 2804 (SEQ ID Nr. 5), 2810 (SEQ ID Nr. 6), 3116 (SEQ ID Nr. 33), 3239 (SEQ ID Nr. 34) und 3531 (SEQ ID Nr. 32), wenn die Replikation mit dem Stoffel-Fragment durchgeführt wird. Die Verwendung von Haarnadelschleifenstrukturen, die einen nicht nucleotidartigen Polyethylenglykolarm mit 12 Kohlenstoffen (Spacer Phosphoramidites) aufweisen, beispielsweise die Strukturen 2810 (SEQ ID Nr. 6) und 3239 (SEQ ID Nr. 34), ist eine vorteilhafte Lösung für die Realisierung der vorliegenden Erfindung, denn sie erlaubt nicht die Polymerisation über die nicht nucleotidartige Stelle hinaus, welche Enzyme auch immer verwendet werden. Außerdem scheint eine Beziehung zwischen der Länge und/oder der Art des nicht nucleotidartigen Arms mit der Fähigkeit des Stoppens der Polymerase mit diesem Element durch ein gegebenes Enzym zu bestehen.

BEISPIEL 7:

Um die Fähigkeit eines Fragments von einem DNS-Doppelstrang zu belegen, eine erfindungsgemäße Haarnadelschleifenstruktur zu bilden, wird ein Fragment eines DNS-Doppelstrangs mit 135 Basenpaaren synthetisiert. Dazu wird ein im Plasmid pBR322 enthaltener Teil des Gens tem (SEQ ID Nr. 9) mit der PCR-Technik mit Hilfe des Haarnadelschleifenprimers 3336 (SEQ ID Nr. 35), der einen nicht nucleotidartigen Arm vom Typ AminoModifier IITM umfasst, und des Primers 1863 (SEQ ID Nr. 39) amplifiziert, in Anwesenheit des Stoffel-Fragments der Taq-Polymerase (Applied Biosystems), ohne die 5'- 3'-Exonucleaseaktivität. Das erhaltene Fragment enthält an einem seiner 5'-Enden eine Sequenz, die fähig ist, eine Haarnadelschleifenstruktur zu bilden. Parallel dazu wird eine Kontroll-PCR in Anwesenheit des Primers 3215 (SEQ ID Nr. 43) und des Primers 1863 (SEQ ID Nr. 39) durchgeführt. Das durch PCR so erhaltene Amplifikationsprodukt umfasst nur die Sequenz der Haarnadel und stellt eine Kontrolle des Molekulargewichts von 135 Basenpaaren in Duplexform dar.
Nach der PCR werden die Produkte auf dem Agarosegel SeaKem LE 2% (FMC) analysiert. Nach Migration von 2 Stunden bei 80 V in einer Lösung des Puffers TBE 1X (89 mM Tris-HCl pH 8,3, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) wird das Gel in Anwesenheit von Ethidiumbromid (0,6 ug/ml) gefärbt. Die Analyse der PCR-Produkte offenbart zwei Banden unterschiedlicher Größe, die zwei Migrationsformen der erhaltenen Produkte entsprechen, wenn man vom Haarnadelschleifenprimer 3336 (SEQ ID Nr. 35) ausgeht, und einer einzigen Migrationsform im Fall der Molekulargewichtskontrolle. Die beiden Formen der elektrophoretischen Mobilität visualisieren zwei unterschiedliche Konformationen, Haarnadelschleife oder Duplex, an einem der 5'-Ende des DNS-Fragments. Die Form, deren elektrophoretische Migration die schnellste ist, entspricht einem Molekül, in dessen Innerem die Sequenz des Primers 3336, die in das PCR-Fragment eingeführt wurde, in Duplexform vorliegt; die Form, deren elektrophoretische Migration die langsamste ist, entspricht einem Molekül, in dessen Innerem die Sequenz des Primers 3336 in Form einer Haarnadelschleife repliziert ist.
Die auf dem Agarosegel beobachteten Banden werden mit Hilfe eines Extraktionskits auf dem Gel Qiaex IITM (Qiagen, ref: 20021) aufgetrennt und gereinigt. Die gereinigten Produkte werden auf dem Agarosegel SeaKem LE 2% (FMC) unter Bedingungen aufgereinigt, die identisch sind mit den oben beschriebenen. Die der schnellen Form entsprechende Produktmigration äußert sich in einer einzigen Migrationsbande, auf eine Weise, die identisch ist mit dem Ergebnis der Reinigung des Produkts der Kontroll-PCR. Das Produkt, das der zuvor isolierten langsamen Form entspricht, führt im Vergleich zum Ergebnis der Reinigung der Kontroll-PCR zum Erhalt einer einzigen, retardierten Bande.
Um zu bestätigen, dass die beiden erhaltenen Banden auf dem Agarosegel den beiden isomeren Formen des gleichen Amplifikationsprodukts durch PCR entsprechen, wird jede dieser zuvor isolierten und gereinigten Banden, ausgehend vom Produkt dieser PCR, mit Hilfe eines Kits Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) sequenziert. Die Sequenzierungsreaktion benötigt eine erste Amplifikation, die, ausgehend von 10¹¹ Kopien des gereinigten Produkts, in Anwesenheit von 10 ul des Sequenzierungsreaktionsgemisches und von 5 ul des Primers 1863 (SEQ ID Nr. 39) der Ausgangs- PCR durchgeführt wird. Die Sequenzierungsreaktion wird in einem Gerät Thermocycler 480 (Perkin Elmer) gemäß des folgenden Cyclus durchgeführt: 30 Sekunden bei 96ºC, 15 Sekunden bei 40ºC und 4 Minuten bei 60ºC, das Ganze 25-mal wiederholt. Dieses PCR-Produkt wird danach auf einer Séphadex G-50 Säule (Pharmacia) gereinigt, dann mit einem automatischen Sequenzierer (Applied Biosystems 373 A) sequenziert.
Die Analyse der Resultate zeigt, dass, ausgehend vom Produkt der Kontroll-PCR, kein Unterschied zwischen den Sequenzen der schnellen Form oder der langsamen, zuvor gereinigten Form besteht. Weiterhin bestätigt die Einheitlichkeit der Sequenz zwischen einerseits dem Produkt der Kontroll-PCR und andererseits den beiden isolierten, isomeren Formen, dass der Haarnadelteil der Haarnadelschleifenstruktur in zuverlässiger Weise durch das Stoffel-Fragment der Taq-Polymerase repliziert wird. Wie zuvor in Beispiel 6 belegt, wird diese Replikation durch den nicht nucleotidarti gen Teil der Schleife der erfindungsgemäßen Primer unterbrochen.
Das Ensemble bzw. der Satz dieser Elemente zeigt, dass der Einbau eines Primers, der erfindungsgemäß in der Lage ist, eine Sekundärstruktur vom Typ Haarnadelschleife zu bilden, die Bildung von zwei isomeren Formen ermöglicht, die an ihrem Ende eine gleiche Sequenz umfassen, entweder in der Form einer Haarnadelschleife oder in Duplexform.

BEISPIEL 8:

Die Verdrängungsversuche (gemäß des Modells von Abb. 9) wurden an einer transkribtierten RNS durchgeführt, ausgehend vom Amplifikationsprodukt durch PCR von 572 Basenpaaren, die zuvor mit den Primern 2434 (SEQ ID Nr. 40), einen Promotor der Phage T7 an seinem 5-Ende enthaltend, und 3239 (SEQ ID Nr 34), der einen Rest Spacer PhosphoramiditeTM (Hexaethylenglykol) aufweist, erhalten wurden. Diese RNS besitzt an ihrem 3'-Ende eine zum Haarnadelteil des Primers 3239 komplementäre Sequenz, die die Hybridisierung eines Verdrängungsprimers Dis 22 [γ-³²P]ATP (SEQ ID Nr. 44) erlaubt. Diese RNS kann außerdern mit dem Haarnadelschleifenprimer A21 (SEQ ID Nr. 41) an seinem 3'-Ende hybridisieren. Eine Kontrollreaktion kann durchgeführt werden, indem man den Haarnadelschleifenprimer 3239 durch den Primer 3215 (SEQ ID Nr. 43), der die Haarnadelsequenz stromaufwärts (5') von der Sequenz A21 aufweist, substituiert. Die Verdrängungsreaktionen werden in einem Endvolumen von 20 ul in Anwesenheit der inversen Transkriptase Superscript IITM (GIBCO-BRL) in einem für den Zulieferer optimierten Puffer von dNTPs (jeweils 1 mM, Pharmacia), von 10¹¹ Kopien des Targets pro Versuch und von 5 · 10¹² Kopien des Primers pro Versuch durchgeführt. Nach Inkubieren für 30 Minuten bei 37ºC werden die Reaktionen durch Zugabe von 20 ul des Puffers mit 0,02% Xylolcyanol, 0,02% Bromphenolblau, 25 mM EDTA, 90% Formamid gestoppt. Die Proben werden bei 65ºC während 3 Minuten denaturiert, auf Eis schnell abgekühlt und durch Elektrophorese in einem denaturierenden Polyacrylamidgel 8% (7 M Harnstoff) in dem Puffer TBE (Trisborat 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) analysiert. Die Elektrophorese wird bei 300 V durchgeführt, bis die Migrationsfront auf 1 cm an die Gelunterseite herangekommen ist.
Eine Kontrolle der Elongation des Haarnadelschleifenprimers 3239 (SEQ ID Nr. 34) durch die inverse Transkriptase auf der RNS-Matrix wird in Anwesenheit des Verdrängungsprimers Dis 22 (SEQ ID Nr. 44) realisiert, indem der Primer 3239 (SEQ ID Nr. 34), in 5' durch [γ-³²P]ATP markiert, in Anwesenheit des nicht markierten Verdrängungsprimers Dis 22 (SEQ ID Nr. 44) unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert wird. Die Elektrophorese bestätigt, dass die Haarnadelschleifenstruktur bis zum 5'-Ende der RNS-Matrix abgeschrieben wird. Ebenso wird die Hybridisierung und Elongation des Verdrängungsprimers Dis 22 (SEQ ID Nr. 44) auf der synthetisierten RNS-Matrix durch Inkubieren dieses Primers, markiert in 5' mit [γ-³²P]ATP, verifiziert. Diese Elongation erlaubt die Synthese von cDNS, deren Länge vergleichbar ist mit der RNS-Matrix. Zudem spiegelt sich in der Intensität der sichtbar gemachten Produkte der Trennungsgrad von einem der 5'-Enden der hergestellten Moleküle in Form einer Haarnadelschleife wider.
Die Verdrängungsversuche offenbaren ein Primerelongationsprodukt der Verdrängung auf der RNS-Matrix, das die Strangverdrängung, entstanden aus der Elongation des verwendeten Haarnadelschleifenprimers, bestätigt. Dies zielt darauf ab zu beweisen, dass der verwendete Haarnadelschleifenprimer, wenn er auf der RNS-Matrix hybridisiert ist, in Form einer gebogenen Haarnadelschleife vorliegt, die es auch dem Verdrängungsprimer ermöglicht, auf dem 3'-Teil der RNS zu hybridisieren. Wenn die Verdrängungsversuche realisiert werden, indem man den Primer 3239 (Haarnadelschleife) durch den Primer 3215 (Abwesenheit einer Haarnadelschleifenstruktur) ersetzt, bestätigt die schwache Intensität des Elongationsprodukts des Verdrängungsprimers, dass die im Primer 3215 enthaltene Haarnadelsequenz die Hybridisierung des Verdrängungsprimers durch ein Konkurrenzphänomen auf der Ebene der gleichen Hybridisierungsstelle verhindert. Der in diesem besonderen Fall untersuchte Haarnadelschleifenprimer zeigt, dass die Stabilität dieser Haarnadelschleifenstruktur derjenigen des entsprechenden DNS/RNS-Heteroduplex, das sich durch Verdrängung des thermodynamischen Gleichgewichts bilden kann, überlegen ist. Diese Resultate zeigen die Möglichkeit der erfindungsgemäßen Verwendung von Haarnadelschleifenprimern auf einer RNS-Matrix.
Der Einfluss eines intercalierten Mittels vom Typ Acridin, das am 5'-Ende eines Haarnadelschleifenprimers fixiert ist, auf die Strangverdrängungseffektivität auf der RNS-Matrix wurde ebenfalls untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine RNS- Matrix transkribtiert, ausgehend von einem PCR-Produkt, das den Primer 3215 (SEQ ID Nr. 43) und den Promotorprimer 2709 (SEQ ID Nr. 42) enthält. Die Verdrängungsversuche wurden, wie zuvor beschrieben, in Anwesenheit des Verdrängungsprimers Dis 22 (SEQ ID Nr. 44), der in 5' mit [γ-³²P]ATP markiert ist, auf der RNS-Matrix durchgeführt.
Die Versuche werden gemäß zweier unterschiedlicher Arten durchgeführt. Gemäß einer ersten Art wird die cDNS, welche aus der Elongation der untersuchten Haarnadelschleifenprimer entstanden ist, in Anwesenheit geeigneter Reagenzien (inverse Transkriptase, Nucleotide) vorgebildet und der Verdrängungsprimer wird dem Reaktionsgemisch in einem Abstand von 15 Minuten hinzugefügt; gemäß einer zweiten Art wird die Analyse wie zuvor mit allen Reagenzien, die im Reaktionsmedium zeitgleich vorhanden sind, durchgeführt. In diesen zwei Arten werden die Reaktionsprodukte 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Zwei Haarnadelschleifenprimer wurden untersucht: 3221 (SEQ ID Nr. 36) und 3S16 (SEQ ID Nr. 38), letzterer entspricht dem Primer 3221 mit einer Acridingruppierung (6-Chloro-2- methoxyacridin, Clontech ref S236) an seinem 5-Ende. Eine Verdrängungskontrolle besteht aus dem Primer A21 (SEQ ID Nr. 41). Unterschiedslos liegen die Primer in einer Konzentration von 5 · 10¹² Kopien pro Versuch und die verwendeten RNS-Matrizen in einer Konzentration von 10¹¹ Kopien pro Versuch vor. Die Analyse der Produkte wird, wie zuvor beschrieben, durch Elektrophorese in einem denaturierenden Polyacrylamidgel 8% durchgeführt. Elongationsprodukte gleicher Intensität werden ausgehend von dem durchgeführten Kontrolltest mit dem Primer A21 erhalten, mit oder ohne Vorbildungsschritt, die Abwesenheit der Konkurrenzsituation auf der Ebene dieses Systems bestätigend. Die Realisierung des Vorbildungsschritts im Fall des Haarnadelschleifenprimers 3221 (SEQ ID Nr. 36) führt nicht zum Erhalt eines Elongationsprodukts des Verdrängungsprimers, während, wie zuvor beschrieben, der gleiche Versuch, ausgeführt ohne Vorbildungsschritt, ein positives Resultat liefert. Signale gleicher Intensität werden bei Verwendung des Primers 3516 (SEQ ID Nr. 38) erhalten, mit oder ohne Vorbildungsschritt. Die Intensität dieses Signals ist identisch mit derjenigen, die bei Verwendung des Primers 3221 ohne Vorbildung erhalten wird.
Diese Resultate zeigen, dass die Anwesenheit einer intercalierenden Gruppe vom Typ Acridin am 5'-Ende des untersuchten Primers die Bildung der Haarnadelschleifenstruktur durch intramolekulare Trennung innerhalb einer vorgebildeten langen RNS : DNS-Heteroduplex ermöglicht. In Abwesenheiten von Acridin scheint die mit der entsprechenden Haarnadelschleife verknüpfte RNS : DNS-Duplexform zu überwiegen, da kein Verdrängungssignal beobachtet wird. Diese Resultate zeigen die Bedeutung, die die Anwesenheit eines intercalierenden Mittels für die Primer besitzen kann, um die intramolekulare Trennung der Haarnadelschleifenstruktur zu begünstigen.

BEISPIEL 9:

Die Amplifikationsprodukte durch PCR werden unter den zuvor beschriebenen Bedingungen synthetisiert mit Hilfe des Primers 1863 (SEQ ID Nr. 39) und einem der folgenden Primer: dem Haarnadelschleifenprimer 3514 (SEQ ID Nr. 37), der eine Acridingruppierung in 5' und einen nicht nucleotidartigen Arm aus Spacer Hexaethylenglykol (Clontech ref: 5260) aufweist, oder dem Haarnadelschleifenprimer Nr. 3239 (SEQ ID Nr. 34), der einen Phosphoramidit-Spacer, aber keine Acridingruppierung aufweist, oder den Kontrollprimer 3215 (SEQ ID Nr. 43), der eine Haarnadelsequenz, aber keine Haarnadelschleifenstruktur enthält. Die Amplifikationsprodukte werden, wie zuvor beschrieben, gereinigt.
Die Verdrängungsversuche der Haarnadelschleifenstruktur werden gemäß des in Abb. 8 beschriebenen Prinzips durchgeführt. 10¹¹ Kopien des gereinigten PCR-Targets werden bei 37ºC mit dem kommerziellen Puffer des Klenow- Fragments der DNS-Polymerase I von Escherichia coli gemischt, in Anwesenheit von dNTPs (1 mM) und des Verdrän gungsprimers Dis 9 (SEQ ID Nr. 45), dessen Sequenz identisch ist mit derjenigen der Haarnadel der Haarnadelschleifenstruktur. Dieses Oligonucleotid wird in 5' mit [γ-³²P]ATP markiert. Das Reaktionsendvolumen beträgt 20 ul.
Die Versuche werden mit oder ohne anfängliche thermische Denaturierung (3 Minuten bei 95ºC) durchgeführt. 5 U des Klenow-Fragments der DNS-Polymerase I von Escherichia coli werden hinzugefügt. Nach einer Stunde bei 37ºC werden die Reaktionen durch Einfrieren gestoppt und die Elongationsprodukte werden durch Elektrophorese in einem denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert. Die Produkte werden autoradiografisch aufgespürt bzw. aufgefunden.
Die Resultate offenbaren Elongationsprodukte der erwarteten Größe von 141 Basen in Anwesenheit von PCR-Amplifikationsmatrizen, die ausgehend von den Primern 3215, 3239 und 3S16 synthetisiert wurden, falls die Versuche nach der thermischen Denaturierung durchgeführt wurden. Ohne den vorherigen thermischen Denaturierungsschritt des Targets wird ein Elongationsprodukt erwarteter Größe für die PCR-Amplifikationsmatrizen erhalten, die mit den Haarnadelschleifenprimern 3S16 und 3239 synthetisiert wurden, aber im Fall der mit dem Primer 3215 ausgeführten PCR wird kein Produkt detektiert (negative Kontrolle). Diese Elemente zeigen, dass die Anwesenheit einer Haarnadelschleifenstruktur innerhalb einer DNS-Duplex die Freisetzung einer einsträngigen Stelle durch Trennung dieser Struktur ermöglicht, die dann mit einem Verdrängungsprimer hybridisieren kann. Dieser Primer kann dann elongiert werden und den sich stromabwärts befindenden, eine Haarnadelschleifenstruktur an seinem 5'-Ende umfassenden Strang ersetzen (Abb. 8). In Abwesenheit der Haarnadelschleifenstruktur (Fall des Primers 3215) ver hindert die Doppelstrangform der Matrix die Hybridisierung aller Verdrängungsprimer für die Hybridisierung.

BEISPIEL 10:

Die Amplifikationsversuche gemäß der in Abb. 9 beschriebenen Technik wurden ausgeführt. Ein Target von 83 Basenpaaren wurde mit der PCR-Technik mit Hilfe der Primer 3215 (SEQ ID Nr. 43) und 2709 (SEQ ID Nr. 42) synthetisiert, ausgehend vom Plasmid pBR322. Dieses Target enthält an einem 5'-Ende die Promotorsequenz der RNS-Polymerase des Phagen T7 und am anderen 5'-Ende die Haarnadelsequenz, die in dem Haarnadelschleifenprimer enthalten ist, der in den Amplifikationsversuchen verwendet wird. Das Target wird unter Bedingungen abnehmender Konzentration verwendet, ausgehend von 10¹&sup0;, 10&sup9;, 10&sup8;, 10&sup7; und 10&sup6; Kopien. Das Reaktionsmedium (25 ul) enthält den Haarnadelschleifenprimer 3S14 (SEQ ID Nr. 37), der eine Hexaethylenglykolgruppierung sowie ein Acridin in 5' enthält, und den Promotorprimer 2709 (SEQ ID Nr. 42) in einer Endkonzentration von 1 uM. Der Verdrängungsprimer Dis 22 (SEQ ID Nr. 44), dessen Sequenz identisch ist mit der im Haarnadelschleifenprimer enthaltenen Haarnadelsequenz, wird in einer Endkonzentration von 1 uM verwendet. Der verwendete Reaktionspuffer ist derjenige, der von Milligan et al. für die Aktivität der T7-RNS-Polymerase optimiert wurde, erweitert durch 50 mM Kaliumglutamat, und der rNTPs (Pharmacia) (4 mM) und dNTPs (Pharmacia) (1 mM) enthält. Die verwendeten Enzyme sind 50 U T7-RNS- Polymerase (Biolabs) oder 200 U inverse Transkriptase Superscript IITM (GIBCO BRL). Für jede der Targetverdünnungen werden drei Versuche durchgeführt: ein kompletter Versuch (wie zuvor beschrieben), ein Versuch ohne Verdrängungsprimer Dis22 und ein Versuch ohne Enzyme. Nach Inkubation für 2 Stunden bei 37ºC werden die Amplifikationsreaktionen durch Einfrieren des Reaktionsmediums bei -20ºC gestoppt. 1/5 des Reaktionsvolumens wird durch einen Einfangprozess und spezifische Detektion gemäß der ELOSA-Methode quantitativ analysiert. Die Fixierungstechnik des Einfangoligonucleotids A20 (SEQ ID Nr. 27) sowie die Detektion des eingefangenen Amplifikationsprodukts ist im obigen Beispiel Nr. 5 beschrieben. Die zu analysierende Fraktion von 5 ul wird einem Volumen von 35 ul Polyethylenglykol (PEG) hinzugefügt. Die in dieser Probe enthaltenen Nucleinsäuren werden durch Zugabe von 5 ul 1 M Natriumhydroxid denaturiert. Jede Probe wird in der Bohrung einer Mikrotiterplatte angebracht, in der zuvor die Einfangsonde A20 (SEQ ID Nr. 27) fixiert wurde. Die Zugabe der Detektionssonde A19 (SEQ ID Nr. 28), das Inkubieren und die Abtastung der Mikroplatte werden gemäß der Technik durchgeführt, die zuvor im Beispiel 5 beschrieben wurde.
Die erhaltenen Resultate (Abb. 10) zeigen, dass die Amplifikationsmethode die Detektion eines spezifischen Signals ermöglicht, das bis zu einer Targetanfangsmenge von 10&sup8; Kopien pro Versuch signifikant ist, das heißt eine absolute Empfindlichkeit von 2 · 10&sup7; Kopien, da unter diesen Bedingungen eine Fraktion analysiert wurde, die äquivalent ist zu 1/5 des Reaktionsmediums. In Abwesenheit des Verdrängungsprimers Dis22 wird ein signifikantes, spezifisches Signal bis zu einer Targetausgangsmenge von 10&sup9; Kopien pro Versuch erhalten, das heißt eine absolute Empfindlichkeit von 2 · 10&sup8; Kopien. Diese Resultate zeigen die Möglichkeit auf, eine Anreicherung des Amplifikationsprodukts durch Cyclisierung des Verfahrens in Anwesenheit eines Verdrängungsprimers zu erreichen. In Abwesenheit von Enzym beträgt die Detektionsempfindlichkeit 10¹&sup0; Kopien pro Versuch.

BEISPIEL 11:

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Haarnadelschleifenprimers in einer Amplifikationsmethode, wie sie in Abb. 4 beschrieben ist, wurde untersucht. Die PCR-Produkte von 91 Basenpaaren, die an jedem Ende Haarnadelschleifenstrukturen mit einem nicht nucleotidartigen Phosphoramiditarm umfassen, wurden als Amplifikationstargets verwendet. Sie wurden mit Hilfe der Primer 2810 (SEQ ID Nr. 6) und 2811 (SEQ ID Nr. 8) synthetisiert. Die gleichen Primer wurden bei einer Endkonzentration von 1 uM in den Amplifikationsversuchen verwendet; das verwendete Verdrängungsoligonucleotid Dis9 (SEQ ID Nr. 52) ist in 5' mit [γ-³²P]ATP markiert und wird bei einer Endkonzentration von 1 uM verwendet. Die Amplifikationen werden auf Verdünnungen des Targets von 10¹¹ bis 0 Kopien des Targets pro Versuch in dem kommerziellen, für dieses Enzym empfohlenen Puffer angewendet, in Anwesenheit von 5 U des Klenow-Fragments der DNS-Polymerase von Escherichia coli (Boehringer) und in Anwesenheit von 1 mM dNTPs (Pharmacia). Die Versuche werden in einem Gesamtvolumen des Reaktionsmediums von 50 ul durchgeführt und werden 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ein Testversuch ohne Enzym wurde ebenfalls unter den gleichen Bedingungen durchgeführt.
1/10 des Reaktionsvolumens wird quantitativ durch einen Einfangprozess und spezifische Detektion gemäß der ELOSA- Methode analysiert. Gemäß der in Beispiel 5 beschriebenen Methode erfolgt die Detektion des Amplifikationsprodukts mit Hilfe des Einfangoligonucleotids A25 (SEQ ID Nr. 14) und der Detektionssonde A28 (SEQ ID Nr. 15).
Die Analyse der erhaltenen Resultate (Abb. 11) zeigt, dass unter diesen experimentellen Bedingungen ein signifikantes Amplifikationssignal für die Targetausgangsmengen von 10¹¹ und 10¹&sup0; Kopien pro Versuch erhalten wird, das heißt eine absolute Empfindlichkeit von 10&sup9; Kopien, da unter diesen Bedingungen eine Fraktion analysiert wurde, die äquivalent ist zu 1/10 des Reaktionsmediums. In Abwesenheit des Enzyms wird kein signifikantes Signal erhalten, das ursprüngliche Target wird ebenfalls nicht detektiert. Unter Berücksichtigung der Detektionsspezifität der ELOSA-Methode zeigen diese Ergebnisse, dass sich eine spezifische Produktanreicherung vollzieht.

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN

(i) HINTERLEGERIN:
(A) NAME: BIO MÉRIEUX
(B) STRASSE: Cheniln de l'Orme
(C) STADT: MARCY L'ETOILE
(E) LAND: FRANKREICH
(F) POSTLEITZAHL: 69280
(G) TELEFON: 78872000
(H) FAX: 78872090
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Oligonucleofid verwendbar als Primer in einem Amplifikationsverfahren auf der Basis einer Strangverdrängungsreplikation
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 43
(iv) DURCH COMPUTER ENTSCHLÜSSELBARE FORM:
(A) TRÄGERTYP: Diskette 31/2
(B) COMPUTER: kompatibler PC
(C) COMPUTERSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: MSWORD 6.0 FÜR MS-DOS 6.20/WINDOWS 3.10
(v) DATEN DER AKTUELLEN ANMELDUNG:
NUMMER DER ANMELDUNG: EP 95 402 411.3
(vi) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) NUMMER DER ANMELDUNG: FR 9413010
(B) DATUM DER HINTERLEGUNG: 28. OKT.1994

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 1:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 76
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 3-Amino-1,2-propandiol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 1

TCCATCGCTT CGGGNNAACG AAGCGATGGA AGTAATTTAA TACGACTCAC TATAGAAAGA 60
GGATGGATG ACAGTA 76

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 2

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 75
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = Hexaethylenglykol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 2:

TCCATCGCTT CGGGNAACGA AGCGATGGAA GTAATTTAAT ACGACTCACT ATAGAAAGAG 60
GATGGCATGA CAGTA 75

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 3:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 77
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 3-Amino-1,2-propandiol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 3:

TCCATCGCTT CGGGNNAACG AAGCGATGGA AGTAATTTAA TACGACTCAC TATAGAAAGA 60
GTTGGCCGCA GTGTTAT 77

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 4:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 76
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = Hexaethylenglykol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 4:

TCCATCGCTT CGGGNAACGA AGCGATGGAA GTAATTTAAT ACGACTCACT ATAGAAAGAG 60
TTGGCCGCAG TGTTAT 76

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 5:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 46
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN
(ix) EIGENSCHAFT
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 3-Amino-1,2-propandiol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 5:

TCCATCGCTT CGGGNNAACG AAGCGATGGA GGATGGCATG ACAGTA 46

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 6:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 45
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN
(ix) EIGENSCHAFT
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = Hexaethylenglykol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 6:

TCCATCGCTT CGGGNAACGA AGCGATGGAG GATGGCATGA CAGTA 45

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 7:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 47
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 3-Amino-1,2-propandiol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 7:

TCCATCGCTT CGGGNNAACG AAGCGATGGA GTTGGCCGCA GTGTTAT 47

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 8:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 46
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ic) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = Hexaethylenglykol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 8:

TCCATCGCTT CGGGNAACGA AGCGATGGAG TTGGCCGCAG TGTTAT 46

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 9:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 861
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 9:

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 10:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 45
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 10:

AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGATT ACCAATGCTT AATCA 45

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 11:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 18
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 11:

ATGAGTATTC AACATTTC 18

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 12

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 100
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 12:

GTTGGCCGCA GTGTTACTAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT 60
GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA 100

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 13:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 17
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 13:

AGTACTCACC AGTCACA 17

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 14:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 14:

GCACTGCATA ATTCTCT 17

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 15:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 17
(8) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 15:

CACTCATGGT TATGGCA 17

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 18:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 16:

AATTAACCCT CACTAAAG 18

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 17:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 17:

AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC CCGAAGAACG TTTTC 45

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 18:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 19
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(v) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENS: NEIN

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 18:

CTCCTTCGGT CCTCCGATC

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 19:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 19:

TAATACGACT CACTATAG 18

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 20:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 18
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 20:

ATTTAGGTGA CACTATAG 18

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 21:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 58
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 21:

NATANATANN NNCATTTNNT AATACGACTC ACTATAGAAA GAGGATGGCA TGACAGTA 58

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 22:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 16
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 22:

TACTGTCATG CCATCC 16

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 23:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 66
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 23:

TCTAATCCTG TTTGCTCCCC AGTAATTTAA TACGACTCAC TATAGAAAGA GGATGGCATG 60
ACAGTA G6

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 24:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 67
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 24:

TCTAATCCTG TTTGCTCCCC AGTAATTTAA TACGACTCAC TATAGAAAGA GTTGGCCGCA 60
GTGTTAT 67

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 25:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 20
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 25:

TCTAATCCTG TTTGCTCCCC 20

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 26:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 14
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 26:

AACGAAGCGA TGGA

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 27:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 17
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 27:

AGAGAATTAT GCAGTGC 17

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 28:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 28:

TGCCATAACC ATGAGTG 17

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 29:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 54
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
T-Positionen 16 bis 19 = α-Thymidin

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 29:

CCAACCACTC ACTCCYFFITG GAGTGAGTGG TTGGTTACGG ATGGCATGAC AGTA 54

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 30:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 44
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 3-Amino-1,2-propandiol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 30:

ATGACAGTAC GGTAGGAGGT AGCGAAGCTT TTNCTTCGCT ACCT 44

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 31:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 51
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = Hexaethylenglykol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 31:

CCAACCACTC ACTCCNGGAG TGAGTGGTTG GTTACGGATG GCATGACAGT A 51

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 32:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 62
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 3-Amino-1,2-propandiol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 32:

CCAACCACTC ACTCCGCCGG TAANGGCGGA GTGAGTGGTT GGTTACGGAT GGCATGACAG 60
TA 62

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 33:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 54
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 33:

CCAACCACTC ACTCCTTTTG GAGTGAGTGG TTGGTACGG ATGGCATGAC AGTA 54

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 34:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 52
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N in Position 1 = 6-Chlor-2-methoxyacridin
N in Posdon 17 = Hexaethylenglykol-Rest

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 34:

NCCAACCACT CACTCCNGGA GTGAGTGGTT GGTTACGGAT GGCATGACAG TA 52

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 35:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 55
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(ix) EIGENSCHAFT:
(D) WEITERE INFORMATIONEN:
N = 6-Chlor-2-methoxyacridin

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 35:

NCCAACCACT CACTCCTTrr GGAGTGAGTG GTTGGTTACG GATGGCATGA CAGTA 55

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 36:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 43
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 36:

TAATACGACT CACTATAGGG AGACTCCTTC GGTCCTCCGA TCG 43

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 37:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 45
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 37:

AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGATT ACCAATGCTT AATCA 45

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 38:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 38:

GGATGGCATG GACAGTA 17

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 39:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 40
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 39:
TAATACGACT CACTATAGAA AGAGTTGGCC GCAGTGTTAT 40

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 40:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 35
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 40:

GGAGTGAGTG GTTGGTTACG GATGGCATGA CAGTA 35

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 41:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 13
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 41:

GGAGTGAGTG GTT 13

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 42:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 12
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 42:

AACGAAGCGA TG 12

(2) INFORMATIONEN BEZÜGLICH SEQ ID NR. 43:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ;
(A) LÄNGE: 20
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGANZAHL: einfach
(D) KONFIGURATION: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNS

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 43:

TTGGTATGGC TTCATTCAGC 20

Claims

1. Oligonucleotid, umfassend von seinem 5'-Ende gegen sein 3'-Ende folgend:

- einen zur Autohybridisierung fähigen ersten Teil zur Bildung einer Stem- Loop-Struktur (Haarnadelschleife), umfassend ein stromaufwärts und ein stromabwärts gepaartes Segment, und

- einen zweiten Teil, der nicht zur Autohybridisierung befähigt ist,

dadurch gekennzeichnet, daß das erste Teil mindestens ein Blockierungsmittel umfaßt, das fähig ist, die Replikation des Oligonucleotids durch eine Polymerase auf die Weise zu blockieren, daß mindestens ein Teil des stromabwärtigen Segments repliziert wird und das stromaufwärtige Segment weder vollständig noch teilweise repliziert wird.

2. Oligonucleotid nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockierungsmittel so beschaffen ist, daß der replizierbare Teil des stromabwärtigen Segments eine Länge von mindestens zwei Nucleotiden, im besonderen von mindestens drei Nucleotiden hat.

3. Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das stromabwärtige Ende des stromaufwärtigen Segments und das stromaufwärtige Ende des stromabwärtigen Segments durch eine Schleife verbunden sind.

4. Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die stromaufwärtigen und stromabwärtigen Segmente je 2 bis 30, im besonderen 3 bis 15 Nucleotide enthalten.

5. Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockierungsmittel entweder mindestens ein modifiziertes, durch eine Polymerase nicht kopierbares/transkribierbares Nucleotid oder einen Kohlenwasserstoffzweig umfaßt.

6. Oligonucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen dem ersten und zweiten Teil einen dritten Teil aufweist, der eine Senssequenz für eine RNS-Polymerase aufweist.

7. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Teil 5 bis 40 Nucleotide aufweist.

8. Oligonucleotid-Primer zur Verwendung in einem Amplikationsverfahren einer Zielsequenz einer Nucleinsäure, wobei die Zielsequenz eine stromabwärtige Sequenz von mindestens von 5 Nucleotiden aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch ein Oligonucleotid, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, gebildet wird und daß der zweite Teil an seinem 3'-Ende eine Sequenz aufweist, die mit der stromabwärtigen Zielsequenz hybridisieren kann.

9. Cyclisches Amplifikationsverfahren der Zielsequenz einer Nucleinsäure, wobei die Zielsequenz an ihrem 5'-Ende eine Region stromaufwärts und an ihrem 3'- Ende eine Region stromabwärts aufweist, umfassend folgende Stufen:

- Erhalt eines einzelsträngigen Polynucleotids umfassend ein erstes Segment entsprechend der zu amplifizierenden Zielsequenz, ein zweites Segment oberhalb des 5'-Endes des ersten Segments und ein drittes Segment unterhalb des 3'-Endes des ersten Segments,

wobei das zweite Segment des einzelsträngigen Polynucleotids auf gleiche Weise definiert ist wie der erste Teil eines Oligonucleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7,

und wobei das dritte Segment des einzelsträngigen Polynucleotids eine beliebige Sequenz aufweist,

- Belassen des Polynucleotids in Gegenwart von:

(a) einem ersten Primer, wie in Anspruch 8 definiert, der mit einer stromabwärtigen Region der Zielsequenz hybridisieren kann, wobei mindestens der abwärtige Teil des abwärtigen Segments des ersten Teils des ersten Primers dem dritten Segment des einzelsträngigen Polynucleotids komplementär ist,

(b) gegebenenfalls einem zweiten Primer, wie in Anspruch 8 definiert, der mit einer stromabwärtigen Region der zur Zielsequenz komplementären Sequenz hybridisieren kann,

wobei diese stromabwärtige Region zu der aufwärtigen Region der Zielsequenz komplementär ist,

wobei der erste Teil des zweiten Primers der ist, der dem zweiten Segment des einzelsträngigen Polynucleotids homolog ist,

(c) einen dritten Primer, dessen Sequenz homolog zu mindestens einem Teil der Sequenz des abwärtigen Segments des ersten Teils des ersten Primers ist,

(d) einen vierten Primer, dessen Sequenz homolog zu mindestens einem Teil der Sequenz des abwärtigen Segments des ersten Teils ist, der das zweite Segment des einzelsträngigen Polynucleotids bildet, und

(e) ein enzymatisches System, enthaltend mindestens eine Replikationsaktivität der Nucleinsäure und eine Umlagerungsaktivität des Stranges,

- und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter Bedingungen, die die Hybridisierung und das Funktionieren der enzymatischen Aktivität erlauben.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Primer wie in Anspruch 6 definiert ist, daß das einzelsträngige Polynucleotid zwischen seinem ersten Segment und seinem dritten Segment ein viertes Segment aufweist, das zu der im ersten Primer enthaltenen Sequenz komplementär ist und dadurch, daß das enzymatische System außerdem eine RNS-Polymeraseaktivität unter Kontrolle des Promotors aufweist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Primer anwesend und wie in Anspruch 6 definiert ist, daß das einzelsträngige Polynucleotid zwischen seinem ersten Segment und seinem zweiten Segment ein zusätzliches Segment enthält, dessen Sequenz der Sequenz entspricht, die im zweiten Primer enthalten ist, und daß das System außerdem eine RNS-Polymeraseaktivität aufweist, abhängig vom Promotor, entsprechend der im zweiten Primer enthaltenen Senssequenz.