DE69829328T2 - Strangverdrängungsamplifikation von RNA - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Amplifikation von Nucleinsäure-Zielsequenzen und insbesondere auf die Amplifikation von RNA-Zielsequenzen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Nucleinsäureamplifikationstechniken lieferten leistungsstarke Werkzeuge für die Detektion und Analyse von geringen Mengen an Nucleinsäuren. Die extreme Empfindlichkeit solcher Verfahren führte zu Bestrebungen, diese für die Früherkennung von infektiösen und genetischen Erkrankungen, die Isolierung von Genen für eine Analyse und die Detektion von spezifischen Nucleinsäuren in der Gerichtsmedizin zu entwickeln. Die Nucleinsäureamplifikationstechniken können entsprechend den Temperaturanforderungen des Verfahrens in Gruppen eingeteilt werden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR) und die Amplifikation auf Transcriptionsbasis erfordern eine wiederholte Kreislaufführung der Reaktion zwischen hohen und niedrigen Temperaturen, um einzelsträngige Zielmoleküle für nachfolgende Amplifikationszyklen zu regenerieren. Im Gegensatz dazu sind Verfahren wie z.B. die Strangverdrängungsamplifikation (SDA), die sich selbst erhaltende Sequenzreplikation (3SR), die auf Nucleinsäuresequenzen basierende Amplifikation (NASBA) und das Qβ-Replikasesystem isotherme Reaktionen, die bei konstanter Temperatur durchgeführt werden können.
  • Bei der PCR wird die Temperatur der Reaktion nach der Primerverlängerung angehoben, um den neu synthetisierten Strang von der Matrize zu trennen. Die Temperatur wird danach abgesenkt, um die Primer wiederzuverbinden und den Verlängerungsvorgang zu wiederholen. Daher finden die Schritte der PCR-Reaktion infolge der Temperaturbeschränkungen der Reaktion in getrennten Phasen oder Zyklen statt. Im Gegensatz dazu finden bei der Strangverdrängungsamplifikation (SDA) und bei anderen isothermen Amplifikationsreaktionen die Primerverlängerung, die Verdrängung von einzelsträngigen Verlängerungsprodukten, das Wiederverbinden von Primern mit den Verlängerungsprodukten (oder der ursprünglichen Zielsequenz) und die anschließende Verlängerung der Primer gleichzeitig in der Reaktionsmischung statt. Eine herkömmliche SDA (bei niedrigeren Temperaturen, üblicherweise bei etwa 35–45°C, durchgeführt) wird von G. T. Walker, et al. (1992a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392–396 und 1992b, Nuc. Acids Res. 20, 1691–1696) beschrieben. Eine thermophile Version der SDA-Reaktion (tSDA) wurde unlängst entwickelt und wird unter Verwendung von thermostabilen Polymerasen und Restriktionsendonucleasen bei einer höheren, aber immer noch konstanten Temperatur durchgeführt. Die tSDA hat den Vorteil einer erhöhten Spezifität und einer rascheren Reaktionszeit. Die Reaktion wird im Wesentlichen als herkömmliche SDA durchgeführt, und zwar mit Substitution einer thermostabilen Polymerase und einer thermostabilen Restriktionsendonuclease. Die Temperatur der Reaktion wird an eine für die ausgewählten thermophilen Enzyme geeignete, höhere Temperatur angepasst (typischerweise zwischen etwa 45°C und 60°C), und die herkömmliche Restriktionsendonuclease-Erkennungs/Spaltstelle wird durch die passende Restriktionsendonuclease-Erkennungs/Spaltstelle für die ausgewählte thermostabile Endonuclease ersetzt. Ebenfalls im Gegensatz zur herkömmlichen SDA kann ein praktischer Anwender die Enzyme vor dem anfänglichen Wärmedenaturierungsschritt in die Reaktionsmischung einbringen, falls diese bei dieser Temperatur genügend stabil sind.
  • Die Ziele für eine Amplifikation durch SDA können durch Fragmentierung größerer Nucleinsäuren hergestellt werden, wobei die in der SDA-Reaktion verwendete Endonuclease zur Anwendung kommt. Wird das Ziel jedoch nicht von den für die Fragmentierung notwendigen Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen flankiert, so können Zielnucleinsäuren mit geeigneten Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen zum Einführen von Einzelstrangbrüchen in der SDA-Reaktion erzeugt werden, wie von Walker et al. beschrieben (1992b, siehe oben, und U.S.-Patent Nr. 5,270,184). Wie bei der SDA finden die einzelnen Schritte der Zielbildungsreaktion gleichzeitig und fortlaufend statt, wobei Ziele mit jenen terminalen Erkennungssequenzen gebildet werden, die für das Einführen von Einzelstrangbrüchen durch das Restriktionsenzym in der SDA erforderlich sind. Da alle Komponenten der SDA-Reaktion in der Zielbildungsreaktion vorhanden sind, treten geschaffene Ziele automatisch und fortlaufend in den SDA-Zyklus ein und werden amplifiziert.
  • Da die mRNA-Transcripte eines exprimierten Gens in der Zelle im Allgemeinen in einer größeren Kopienzahl als das Gen selbst vorhanden sind, kann eine Detektion allein von RNA-Zielen oder sowohl von RNA-Zielen als auch von DNA-Zielen bei manchen Amplifikationsreaktionen die Probleme einer mangelhaften Empfindlichkeit überwinden. Die Amplifikation von RNA- und DNA-Zielen ist bei einer diagnostischen Anwendung von Amplifikationstechnologien häufig erwünscht, da dies die größte Anzahl von amplifizierbaren Zielen pro Probe und in der Folge die größte diagnostische Empfindlichkeit ergibt. Eine Amplifikation von RNA-Zielen ist ebenfalls nützlich für das diagnostische Überwachen von RNA-bezogenen Zuständen wie z.B. bestimmten Virämien, einer Hochregulation von Krebsgenen etc.. Die Amplifikation von RNA-Zielen wird als „Reverse-Transcription-Amplifikation" bezeichnet, wobei das bekannteste Verfahren die Reverse-Transcription-PCR ist (rtPCR, J. W. Larrick 1992, Trends Biotechnology 10, 146–152). Eine rtPCR wird häufig in aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt, wobei der erste eine Reaktion ist, bei der eine Reverse-Transcriptase verwendet wird, um eine cDNA-Kopie der RNA-Zielsequenz zu erzeugen. Die Reverse-Transcriptase wird danach inaktiviert, und im zweiten Schritt wird DNA-Polymerase hinzugefügt und die cDNA in einer herkömmlichen PCR-Reaktion amplifiziert. Dieses Format stimmt mit der PCR-Reaktion selbst überein, die in getrennten Phasen eines Temperaturwechsels stattfindet. Jüngst wurde eine rtPCR unter Verwendung einer einzigen Polymerase sowohl für die Reverse-Transcription als auch für die DNA-Polymerisation durchgeführt ( EP 0 632 134 A2 ). Es wurde berichtet, dass thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerasen, wie z.B. Taq und Tth, eine signifikante Reverse-Transcriptase-Aktivität aufweisen (U.S.-Patent Nr. 5,322,770), wenn sie unter Reaktionsbedingungen bewertet werden, die für eine Reverse-Transcription geeignet sind. Diese Analysen erforderten nicht, dass die DNA-abhängige DNA-Polymerase die cDNA aus der RNA-Matrize verdrängt oder unter Verwendung einer RNA-Matrize modifizierte dNTPs einbaut.
  • Reverse-Transcriptasen (typischerweise Virusenzyme) sind sehr aktiv hinsichtlich der Produktion von cDNA unter Verwendung von RNA als Matrize für die Replikation. Es zeigte sich, dass auch eine AMV-Reverse-Transcriptase thiolierte dNTPs in die cDNA einbaut (P. A. Bartlett und F. Eckstein, 1982, J. Biol. Chem. 257, 8879–8884), obwohl zuvor nicht bekannt war, ob andere Reverse-Transcriptasen diese Fähigkeit besaßen. Ebenso wurde über eine Strangverdrängungsaktivität bei bestimmten Reverse-Transcriptasen berichtet, zuvor war allerdings nicht bekannt, ob diese Enzyme eine cDNA, die modifizierte Nucleotide enthält, aus einer RNA-Matrize strangverdrängen würden, wie es für SDA erforderlich ist.
  • Die folgenden Begriffe sind hier wie folgt definiert.
  • Ein Amplifikationsprimer ist ein Primer für die Amplifikation einer Zielsequenz durch Hybridisierung und Verlängerung des Primers. Für die SDA ist das 3'-Ende des Amplifikationsprimers eine Zielbindesequenz, die am 3'-Ende der Zielsequenz hybridisiert. Der Amplifikationsprimer umfasst weiters eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease 5' zur Zielbindesequenz, im Allgemeinen in der Nähe ihres 5'-Endes. Die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle ist eine Nucleotidsequenz, die von einer Restriktionsendonuclease erkannt wird, welche an einer doppelsträngigen Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease Einzelstrangbrüche einführt, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert wird, wie von Walker, et al. (1992a), siehe oben, beschrieben. Eine hemimodifizierte Erkennungsstelle ist eine doppelsträngige Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease, bei der ein Strang zumindest ein derivatisiertes Nucleotid enthält, welches verhindert, dass einer der Stränge des Doppelstrangs durch die Restriktionsendonuclease abgeschnitten wird. „Einführen von Einzelstrangbrüchen" bezieht sich auf diese modifizierte Aktivität, bei der nur ein Strang des Doppelstrangs durch die Restriktionsendonuclease abgeschnitten wird, im Gegensatz zur typischen doppelsträngigen Furchungsteilung. Jede hemimodifizierte Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle, an der durch eine Restriktionsendonuclease Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, ist zur Verwendung in einer SDA geeignet. Amplifikationsprimer für SDA werden von Walker, et al. (1992b), siehe oben, als S1 und S2 bezeichnet. Alpha-Thio-modifizierte Desoxyribonucleosidtriphosphate sind als „dNTPαS", „dATPαS", „dCTPαS" etc. abgekürzt.
  • Die Struktur von Amplifikationsprimern, die für die Verwendung in anderen Amplifikationsreaktionen als der SDA angepasst sind, ist im Stand der Technik ebenfalls bekannt. Da eine PCR beispielsweise keine spezialisierte Struktur oder Sequenz zum Aufrechterhalten einer Amplifikation erfordert, enthält der PCR-Amplifikationsprimer typischerweise nur Zielbindesequenzen. Die Amplifikationsprimer einer 3SR und NASBA enthalten jedoch zusätzlich zu den Zielbindesequenzen eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz, da zum Aufrechterhalten dieser Amplifikationsreaktionen ein Transcriptionsschritt erforderlich ist.
  • Ein „Bumper-" oder äußerer Primer ist ein Primer, der sich mit einer Zielsequenz stromaufwärts von (d.h. 5' zu) einem Amplifikationsprimer wiederverbindet, so dass eine Verlängerung des äußeren Primers den stromabwärts gelegenen Primer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt, d.h. eine Kopie der Zielsequenz, enthaltend die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle, verdrängt wird. Die Bumperprimer bestehen daher nur aus Zielbindesequenzen und sind dazu ausgelegt, sich stromaufwärts von den Amplifikationsprimern wiederzuverbinden und diese bei Verlängerung zu verdrängen. Äußere Primer werden von Walker, et al. (1992b), siehe oben, als B1 und B2 bezeichnet. Die Verlängerung von äußeren Primern ist ein Verfahren zur Verdrängung der Verlängerungsprodukte von Amplifikationsprimern, in bestimmten Fällen kann aber auch eine Erhitzung zweckmäßig sein.
  • Ein Reverse-Transcription-Primer besteht ebenfalls nur aus Zielbindesequenzen. Er wird am 3'-Ende einer RNA-Zielsequenz hybridisiert, um die Reverse-Transcription des Ziels auszulösen. Eine Verlängerung des Reverse-Transcription-Primers produziert eine Heteroduplex, umfassend das RNA-Ziel und die durch Reverse-Transcription produzierte cDNA-Kopie des RNA-Ziels. Die cDNA wird (z.B. durch Erwärmung, RNase H oder Strangverdrängung) vom RNA-Strang getrennt, um sie einzelsträngig und für die Amplifikation verfügbar zu machen. Gegebenenfalls kann ein zweiter Reverse-Transcription-Primer am 3'-Ende der Zielsequenz in der cDNA hybridisiert werden, um vor der Amplifikation eine zweite Strangsynthese auszulösen.
  • Die Begriffe „Ziel" oder „Zielsequenz" beziehen sich auf Nucleinsäuresequenzen (DNA und/oder RNA), die zu amplifizieren, replizieren oder detektieren sind. Diese umfassen die ursprüngliche, zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz und ihren komplementären zweiten Strang sowie beide Stränge einer Kopie der ursprünglichen Zielsequenz, die durch Amplifikation oder Replikation der Zielsequenz produziert wurde.
  • Amplifikationsprodukte, Verlängerungsprodukte oder Amplikone sind Oligonucleotide oder Polynucleotide, welche Kopien der Zielsequenz umfassen, die während der Amplifikation oder Replikation der Zielsequenz produziert wurden.
  • Der Begriff „thermostabil" oder „thermophil" unter Bezugnahme auf DNA-abhängige DNA-Polymerasen und andere Enzyme bedeutet, dass die enzymatische Aktivität der DNA-Polymerase oder eines anderen Enzyms innerhalb des Temperaturbereichs von tSDA, der typischerweise von etwa 45°C bis 60°C reicht, stabil ist.
  • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Strangverdrängungsamplifikation wurde an die Reverse-Transcription-Amplifikation von RNA-Zielen angepasst. Das erfindungsgemäße Verfahren wird als Reverse-Transcription-SDA (rtSDA) bezeichnet und wird in einem einstufigen Verfahren durchgeführt, bei dem cDNA-Kopien einer RNA-Zielsequenz gleichzeitig erzeugt und amplifiziert werden. Bei thermophilen DNA-abhängigen DNA-Polymerasen wurde über eine Reverse-Transcriptase-Aktivität berichtet. Es wurde jedoch herausgefunden, dass die für die Verwendung in einer thermophilen SDA (tSDA) bevorzugten DNA-Polymerasen unter typischen SDA-Reaktionsbedingungen keine nachweisbaren cDNA-Pegel produzieren. Anfänglich schien dies rtSDA als einstufiges Verfahren auszuschließen, da eine einzelne DNA-Polymerase nicht sowohl den Schritt der Reverse-Transcription als auch jenen der DNA-Amplifikation durchführen konnte. Dieses Problem wurde nunmehr durch Anpassung der SDA-Reaktionsbedingungen gelöst, so dass eine herkömmliche Reverse-Transcriptase und eine DNA-abhängige Polymerase in einer einzigen Reaktion zusammenwirken, um cDNA zu produzieren und zu amplifizieren.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 veranschaulicht das rtSDA-Reaktionsschema für das erfindungsgemäße Zwei-Polymerase/Binstufen-Verfahren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerasen wurden in einer Reverse-Transcription-(RT)-Primerverlängerungsanalyse hinsichtlich ihrer potentiellen Nützlichkeit in einer rtSDA bewertet. In der RT-Primerverlängerungsanalyse wurde ein kloniertes Fragment des HIV-gag-Gens unter der Kontrolle eines T7-Promotors zwecks Produktion von RNA-Zielen in vitro transcribiert. Ein Reverse-Transcription-Primer, der mit dem Zielbereich der RNA hybridisierte, wurde synthetisiert. Das RNA-Ziel (1010 Moleküle) und 160 nM kinasierter Primer wurden entweder in einem Phosphat-Reaktionspuffer (35 mM KPO4, 0,2 mM dNTP, 15% Glycerin, 0–4 mM MgCl2, 0–4 mM MnSO4) oder in einem TRIS- Reaktionspuffer (10 mM TRIS, 50 mM KCl, 0,2 mM dNTPs, 15% Glycerin, 0–4 mM MgCl2 oder MnSO4) denaturiert und auf 53°C äquilibriert. Die Reverse-Transcription-Reaktion wurde durch Hinzufügen von 11 U exo– Bca in Gang gesetzt und 25 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf Polyacrylamidgels analysiert, wobei die vorausberechnete Größe des Verlängerungsprodukts (238 Nucleotide) verwendet wurde, um zu bestimmen, ob der Primer unter den Bedingungen der Reaktion verlängert wurde. Das Unvermögen, den Primer zu verlängern, zeigte, dass die Polymerase wenig oder keine Reverse-Transcriptase-Aktivität besaß.
  • Eine PCR-Amplifikation der Primerverlängerungsprodukte der RT-Analyse zeigte, dass bei hohen Zielpegeln (1010 Kopien) weder exogenes Magnesium noch Mangan für die Reverse-Transcription erforderlich war. Bei niedrigeren Zielpegeln (≤ 104 Kopien) benötigte die Reverse-Transcription zusätzliches Magnesium in beiden Puffersystemen. Mangan war im TRIS-Puffer erforderlich, in Phosphat jedoch offensichtlich nicht notwendig. Es ist allerdings möglich, dass Mangan im Phosphatpuffersystem als Komponente eines anderen Reagens vorhanden war, also kann ein Bedarf an Mangan nicht endgültig ausgeschlossen werden.
  • Exo– Bst, exo– Bca und Tth produzierten in der RT-Primerverlängerungsanalyse eine cDNA in voller Länge, Taq hingegen nicht. Die exo– Bst- und exo– Bca-Polymerasen werden üblicherweise in einer thermophilen SDA (tSDA) verwendet. Im Vergleich zu herkömmlichen Reverse-Transcriptasen wies exo– Bca im Allgemeinen eine etwas reduzierte Reverse-Transcriptase-Aktivität auf, zeigte jedoch eine 100- bis 1000-fach bessere Reverse-Transcriptase-Aktivität als exo– Bst. Im Gegensatz dazu war im Vergleich zu einer herkömmlichen Reverse-Transcriptase (Superscript IITM) mindestens die fünfzigfache Menge an exo– Bst erforderlich, um einen DNA-Primer auf einer RNA-Matrize zu verlängern. Obwohl die DNA-abhängigen DNA-Polymerasen als Reverse-Transcriptasen weniger aktiv als herkömmliche Reverse-Transcriptasen waren, wurde erwartet, dass sie für die Verwendung in einer rtSDA genügend aktiv sein würden. Bei der Untersuchung hinsichtlich einer Reverse-Transcriptase-Aktivität unter typischen SDA-Reaktionsbedingungen wurde jedoch herausgefunden, dass die DNA-abhängigen DNA-Polymerasen eine geringe Reverse-Transcription förderten. Das Amplifizieren der Reverse-Transcription-Produkte durch PCR zeigte eine 109- und 106-Molekül-Nachweisempfindlichkeit hinsichtlich exo– Bst bzw. exo– Bca. Im Gegensatz dazu zeigte eine Reverse-Transcription unter Verwendung einer AMV-Reverse-Transcriptase mit anschließender PCR-Amplifikation eine 100-1000-Molekül-Nachweisempfindlichkeit. Die verminderte Empfindlichkeit kann den im Vergleich zur RT-Analyse reduzierten Mengen an Polymerase in der SDA sowie möglichen hemmenden Wirkungen der anderen Komponenten der SDA-Reaktion (z.B. modifiziertes dNTP, dUTP, Primer etc.) zugeschrieben werden.
  • Obwohl die Nachweispegel für klinische Diagnoseanalysen nicht genügend empfindlich waren, beweisen diese Versuche eine geringe Stärke an Reverse-Transcription unter diesen spezifischen Bedingungen. Es wurde auch beobachtet, dass bei fehlender Erwärmung vor der Amplifikation keine Amplifikation der Reverse-Transcription-Produkte nachweisbar war, was darauf hinweist, dass die DNA-abhängige DNA-Polymerase den cDNA-Strang nicht aus der RNA-Matrize verdrängte. Ein im Wesentlichen völliges Unvermögen zur Strangverdrängung wurde bei geringeren Konzentrationen an Ziel-RNA festgestellt und bei hohen Zielkonzentrationen konnte nur eine minimale Strangverdrängung nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen führen zur Schlussfolgerung, dass exo– Bca und exo– Bst im Wesentlichen unfähig sind, Verlängerungsprodukte aus der RNA-Matrize bei klinisch nutzbaren Zielkonzentrationen zu verdrängen.
  • In vollständigen in vitro-rtSDA-Reaktionen, welche die typischen SDA-Primer und Reagentien enthielten, konnte keine Amplifikation von RNA-Zielen nachgewiesen werden, wenn als einzige Polymerase exo– Bst oder exo– Bca verwendet wurde. Im Gegensatz dazu ermöglichte das Hinzufügen von SuperscriptTM-Reverse-Transcriptase zu den exo– Bca- oder exo– Bst-SDA-Reaktionen eine effiziente Amplifikation der RNA-Ziele. Eine weitere Untersuchung legte nahe, dass die SDA-Amplifikationsprimer (jene, welche die Restriktionsstelle enthalten, an der Einzelstrangbrüche eingeführt werden können) eine Reverse-Transcription durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase hemmten. Das Vorhandensein von SDA-Primern, gekoppelt mit der verminderten Wirksamkeit der Reverse-Transcription (insbesondere bei den relativ geringen Konzentrationen an Polymerase, die in der SDA-Reaktion vorhanden ist), führte zu keiner nachweisbaren Amplifikation, und zwar gleichgültig, ob die Reaktion zur Denaturierung doppelsträngiger Moleküle zwischen dem Schritt der Reverse-Transcription und jenem der Amplifikation erhitzt wurde oder nicht. Anschließend wurde entdeckt, dass ein nachweisbarer Pegel einer RNA-Zielamplifikation unter typischen SDA-Reaktionsbedingungen erzielt werden konnte, indem PCR-artige oder Bumper-artige Reverse-Transcription-Primer durch die für eine SDA erforderlichen, spezialisierten Amplifikationsprimer ersetzt wurden und die Reverse-Transcription-Produkte einer doppelsträngigen Heteroduplex zwischen der Reverse-Transcription und der Amplifikation der cDNA erhitzt wurden.
  • Diese Versuche zeigten, dass Amplifikationsprimer für SDA eine Reverse-Transcription durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase hemmen können und dass die DNA-abhängige DNA-Polymerase im Wesentlichen unfähig ist, cDNA aus einer RNA-Matrize bei den relativ geringen Ziel-RNA-Konzentrationen, die in den meisten klinischen Proben zu finden sind, zu verdrängen. Sehr geringe Strangverdrängungspegel können bei sehr hohen Zielpegeln (etwa 1010 RNA-Kopien) auftreten, derart hohe Zielkonzentrationen sind in klinischen Proben jedoch wahrscheinlich selten. Die Strangverdrängung ist ein wesentliches Merkmal der herkömmlichen SDA-Reaktion.
  • AMV, MMLV, Superscript IITM, HIV-I und RetrothermTM sind herkömmliche Reverse-Transcriptasen, die in Hinblick auf SDA-bezogene Funktionen wie den Einbau von dNTPαS und die Strangverdrängungsaktivität bewertet wurden. Bei dieser Analyse wurden Amplifikations- und Bumperprimer für SDA, die mit den HIV gag-Transcripten hybridisierten, entworfen und synthetisiert. Das RNA-Ziel und ein Überschuss an kinasierten Amplifikations- und Bumperprimern wurden in jenem Puffer, der vom Hersteller für die Verwendung mit der ausgewählten Reverse-Transcriptase empfohlen wurde, denaturiert, und nach einem Äquilibrieren der Probe auf die gewünschte Reaktionstemperatur wurde die Reverse-Transcriptase hinzugefügt. Primer wurden in Gegenwart von dNTPs, wovon zumindest eines dNTPαS war, hybridisiert und verlängert. Die Reaktionsprodukte wurden auf Polyacrylamidgels analysiert, wobei die vorausberechneten Größen der Verlängerungsprodukte verwendet wurden, um zu bestimmen, welche Primer, wenn überhaupt, unter den Bedingungen der Reaktion verlängert wurden. Die erwarteten Größen der vollständig verlängerten Primerverlängerungsprodukte waren wie folgt: S1ext – 200 Nucleotide, B1ext – 238 Nucleotide, S2ext – 150 Nucleotide und B2ext – 190 Nucleotide. Das Unvermögen zur Verlängerung des Bumperprimers, welcher anfänglich mit der RNA hybridisierte, zeigte, dass das Enzym unfähig war, einen stromabwärts hybridisierten Primer zu verdrängen, oder dass es dNTPαS nicht einbauen konnte. Das Unvermögen zur Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers (welcher mit der RNA stromabwärts vom ursprünglichen Bumperprimer hybridisierte) zeigte entweder, dass die Polymerase keine Reverse-Transcriptase-Aktivität besaß oder dass sie zum Einbau von dNTPαS unfähig war. Das Unvermögen zur Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers, welcher mit dieser cDNA (d.h. dem verlängerten einzelsträngigen ersten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt) hybridisierte, zeigte, dass die Polymerase unter Verwendung der cDNA als Matrize keinen zweiten Strang synthetisieren konnte oder dass sie dNTPαS nicht einbauen konnte.
  • AMV, MMLV, Superscript IITM, HIV-I und RetrothermTM wurden in der Reverse-Transcriptase-Analyse untersucht. Davon bauten AMV, MMLV und Superscript IITM dNTPαS in die cDNA ein. Superscript IITM erwies sich im Allgemeinen als am aktivsten. Primerverlängerungsprodukte in voller Länge waren bei Verwendung einer HIV-I-Reverse-Transcriptase nicht nachweisbar, also wurden keine weiteren Studien zur Bewertung dieses Enzyms durchgeführt. AMV, MMLV und Superscript IITM wiesen Strangverdrängungsaktivität auf, wie sowohl durch S1- als auch durch B1-Verlängerungsprodukte (S1ext und B1ext) in ungefähr gleichen Mengen nachgewiesen. Bei RetrothermTM wurde wahrscheinlich aufgrund der zu diesem Enzym gehörigen 5'→3'-Exonucleaseaktivität keine Strangverdrängungsaktivität nachgewiesen. Eine Strangverdrängungsaktivität kann jedoch beobachtet werden, wenn die Exonucleaseaktivität eliminiert wird. Eine zweite Strangsynthese (die Fähigkeit, an der durch Reverse-Transcription produzierten cDNA eine Polymerisation auszulösen) wurde bei AMV nachgewiesen, wobei sowohl radiomarkierte dNTPs als auch ein endmarkierter S2-Primer verwendet wurden. Obwohl nicht bei allen der untersuchten Reverse-Transcriptasen eine zweite Strangsynthese experimentell nachgewiesen wurde, wurde über alle berichtet, dass sie diese Aktivität hätten. Weiters sollten jene mit einer bekannten RNase H-Aktivität sowohl das B1-Verlängerungsprodukt als auch das verdrängte S1-Verlängerungsprodukt für eine zweite Strangsynthese verfügbar machen. Wenn die Reverse-Transcriptase keine eigene RNase H-Aktivität besitzt, kann RNase H zur RT-Reaktion hinzugefügt werden, falls eine zweite Strangsynthese gewünscht wird. Eine zweite Strang-synthese ist jedoch kein wesentliches Merkmal, da der zweite Strang durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase in einer rtSDA synthetisiert werden kann.
  • Zur Verbesserung der Effizienz einer rtSDA für die diagnostische Anwendung wurde die Zusammensetzung der SDA-Reaktionsmischung im Bestreben untersucht, die hohe Reverse-Transcriptase-Aktivität und die Strangverdrängungsfähigkeit der herkömmlichen Reverse-Transcriptasen sowie die hohe Effizienz der DNA-abhängigen DNA-Polymerasen in einer DNA-Amplifikation auszunützen. Vorzugsweise würde eine solche Reaktion ermöglichen, dass beide Polymerasen vorhanden sind und ihre jeweiligen Funktionen in einer „Zwei-Polymerase/Einstufen"-Reaktion gleichzeitig ausüben. Da es schien, dass die DNA-abhängige DNA-Polymerase zur Strangverdrängung von cDNA aus der RNA-Matrize unfähig war, wurden mit der DNA-Amplifikation kompatible Reaktionsbedingungen untersucht, welche der Reverse-Transcriptase das Ausüben dieser Funktion ermöglichen könnten. Vorzugsweise würde die Reverse-Transcriptase die cDNA unter Verwendung derselben SDA-Amplifikations- und Bumperprimer, wie sie im Reaktionsabschnitt der DNA-Amplifikation zur Anwendung kommen, reverse-transcribieren und strangverdrängen. Unter Verwendung derselben SDA-Amplifikationsprimer würde die DNA-abhängige DNA-Polymerase dann die verdrängten cDNAs, so wie sie produziert werden, amplifizieren, und zwar ohne Bedarf an der Einführung eines Denaturierungsschritts zwischen den Reaktionen der Reverse-Transcription und der Amplifikation. Das heißt, die Reaktionen der Reverse-Transcription und der cDNA-Amplifikation würden gleichzeitig in einer einzigen Reaktionsmischung stattfinden.
  • Die Zwei-Polymerase/Einstufen-rtSDA-Reaktion ist in 1 schematisch dargestellt. Im Reaktionsabschnitt der Reverse-Transcription wird ein Amplifikationsprimer für SDA mit der RNA-Zielsequenz hybridisiert, und ein Bumperprimer wird stromaufwärts vom Amplifikationsprimer hybridisiert, so dass eine Verlängerung des Bumperprimers den verlängerten Amplifikationsprimer (das Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt) verdrängt. Dieses Verfahren ist der im U.S.-Patent Nr. 5,270,184 beschriebenen Ziel bildungsreaktion für SDA ähnlich, abgesehen davon, dass das amplifizierbare Ziel aus einer RNA-Matrize geschaffen wird, wobei für Primerverlängerung und Strangverdrängung die Reverse-Transcriptase eingesetzt wird. Die Unfähigkeit der DNA-abhängigen DNA-Polymerase zur Strangverdrängung aus RNA verhindert deren Teilnahme an diesem Teil der Zwei-Polymerase/Einstufen-rtSDA-Reaktion. Da die RNA einzelsträngig ist, hybridisieren nur ein SDA-Amplifikationsprimer und ein Bumperprimer und werden am ursprünglichen RNA-Ziel verlängert. Der entgegengesetzte SDA-Amplifikationsprimer und der entgegengesetzte Bumperprimer hybridisieren mit der durch Reverse-Transcription produzierten cDNA und werden auf dieser verlängert. Kurz gesagt, ein Amplifikationsprimer für SDA (z.B. S1) hybridisiert am 3'-Ende der RNA-Zielsequenz. Der Bumperprimer (z.B. B1) hybridisiert mit der Zielsequenz 5' (d.h. stromaufwärts) von S1. Die Reverse-Transcriptase verlängert gleichzeitig beide Primer in Gegenwart von Desoxynucleosidtriphosphaten, von denen mindestens eines ein modifiziertes Desoxynucleosidtriphosphat, beispielsweise thioliertes dATP (dATPαS) oder thioliertes dCTP (dCTPαS), ist. Das cDNA-Verlängerungsprodukt von S1 (S1ext) wird dabei durch die Reverse-Transcriptase aus der RNA-Matrize verdrängt, während B1 verlängert wird. Die verdrängte einzelsträngige cDNA, nun mit einer zusätzlichen Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle am 5'-Ende, dient als Matrize für die Hybridisierung des entgegengesetzten SDA-Amplifikationsprimers (S2) am 3'-Ende der Zielsequenz in der cDNA. Der zweite Bumperprimer (B2) hybridisiert 5' zum S2-Amplifikationsprimer (d.h. S1ext bindet S2 und B2). Dies kann ein Substrat entweder für die Reverse-Transcriptase oder für die DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. Eine Verlängerung von S2 und B2 am cDNA-Ziel durch die Reverse-Transcriptase oder die DNA-abhängige DNA-Polymerase (üblicherweise als „zweite Strangsynthese" bezeichnet) führt zur Verdrängung eines einzelsträngigen DNA-Verlängerungsprodukts, das mit der ursprünglichen RNA-Zielsequenz übereinstimmt, wobei die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle allerdings an jedem Ende hinzugefügt ist. Dieses Verlängerungsprodukt wird durch Hybridisierung und Verlängerung von S1 doppelsträngig gemacht. Da die Polymerisation in Gegenwart von mindestens einem modifizierten dNTP auftritt, werden bei diesem Verfahren die doppelsträngigen Restriktionsendonuclease-Erkennungs/Spaltstellen an jedem Ende hemimodifiziert. Die doppelsträngige DNA-Struktur ist daher ein geeignetes Substrat für die Amplifikation durch SDA. Bei idealen Bedingungen in der einstufigen Reaktion finden die einzelnen Schritte der Reverse-Transcription, Zielbildung und Amplifikation gleichzeitig und fortlaufend statt, bis alle RNA-Ziele reverse-transcribiert wurden, und danach geht die Amplifikation der cDNAs weiter, bis die Reaktion beendet wird. Sobald sie erzeugt werden, treten doppelsträngige DNA-Ziele mit den Erkennungs/Spaltsequenzen an den Enden automatisch in den SDA-Zyklus ein und werden amplifiziert.
  • Das SDA-Reaktionsmedium (insbesondere die Konzentration an DNA-abhängiger DNA-Polymerase, die bei der SDA verwendet wird) verhindert wirksam eine Reverse-Transcription durch die DNA-Polymerase. Dies ist wünschenswert, da eine DNA-Polymerase-initiierte Reverse-Transcription die Analyseempfindlichkeit verringert, weil cDNAs produziert werden, die aufgrund des Fehlens einer Strangverdrängung anschließend nicht amplifiziert werden können. Im Gegensatz dazu reverse-transcribiert und strangverdrängt die Reverse-Transcriptase die cDNAs wirksam aus den RNA-Matrizen. Die DNA-abhängige DNA-Polymerase amplifiziert wirksam diese DNA-Ziele in der herkömmlichen tSDA-Reaktion, wenn diese durch Reverse-Transcription produziert werden. Der Begriff „einstufig" bezeichnet die simultane Beschaffenheit der Schritte der Reverse-Transcription und der Amplifikation bei dieser Ausführungsform. Sowohl MMLV- als auch Superscript IITM- Reverse-Transcriptasen ergaben eine effiziente Amplifikation, wenn sie entweder mit exo– Bca- oder mit Klenow-DNA-Polymerasen gepaart wurden. Bei Verwendung von exo– Bca, Superscript IITM und BsoBI war rtSDA in der Lage, so wenig wie etwa 100 Kopien eines gag RNA-Transcripts nachzuweisen. Eine AMV-Reverse-Transcriptase mit exo– Bst und BsoBI wies ebenfalls so wenig wie etwa 100 gag RNA-Transcripte nach. Eine weitere routinemäßige Optimierung der Reaktion sollte die Empfindlichkeit steigern. Es war keine RNA-Amplifikation nachweisbar, wenn entweder die Reverse-Transcriptase oder die DNA-abhängige DNA-Polymerase weggelassen wurde, was bestätigt, dass keine der Polymerasen allein in der Lage war, die gesamte rtSDA-Reaktion (Reverse-Transcription und DNA-Amplifikation) unter diesen Reaktionsbedingungen in einem einstufigen Reaktionsformat durchzuführen.
  • Bei der vorhergehenden Beschreibung der Zwei-Polymerase/Einstufen-rtSDA-Reaktion werden SDA-Amplifikationsprimer und Bumperprimer als Anschauungsbeispiel verwendet. Da die Reverse-Transcriptase jedoch in der Lage ist, eine Strangverdrängung entweder mit SDA-Primern oder mit Reverse-Transcription-Primern durchzuführen, können Reverse-Transcription-Primer zusätzlich vorhanden sein, und zwar für die Verwendung durch die Reverse-Transcriptase im Reaktionsabschnitt der Reverse-Transcription. Der stromabwärts gelegene Reverse-Transcription-Primer fungiert als Reverse-Transcription-Primer, und der stromaufwärts gelegene Reverse-Transcription-Primer ist einem SDA-Bumperprimer ähnlich, da seine Verlängerung dazu dient, das Verlängerungsprodukt (die cDNA) des stromabwärts gelegenen Reverse-Transcription-Primers zu verdrängen.
  • Nach der Zielamplifikation können die produzierten Amplikone durch irgendeines der im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Detektion spezifischer Nucleinsäuresequenzen nachgewiesen werden. Amplifikationsprodukte können beispielsweise durch eine spezifische Hybridisierung mit einer Oligonucleotid-Detektorsonde nachgewiesen werden. Die Detektorsonde ist ein kurzes Oligonucleotid, welches eine nachweisbare Markierung einschließt, d.h., einen Rest, der ein nachweisbares Signal erzeugt oder dazu gebracht werden kann, ein solches zu erzeugen. Die Markierung kann durch eine Nick-Translation, eine Endmarkierung oder während der chemischen Synthese der Sonde in die Oligonucleotid-Sonde eingebaut werden. Viele direkt und indirekt nachweisbare Markierungen sind im Stand der Technik für die Verwendung mit Oligonucleotid-Sonden bekannt. Direkt nachweisbare Markierungen umfassen jene Markierungen, die keine weitere Reaktion benötigen, um nachweisbar gemacht zu werden, z.B. Radioisotope, fluoreszierende Reste und Farbstoffe. Indirekt nachweisbare Markierungen umfassen jene Markierungen, die mit zusätzlichen Reagentien umgesetzt werden müssen, um nachweisbar gemacht zu werden, z.B. Enzyme, die zur Produktion eines gefärbten Reaktionsprodukts (z.B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase) in der Lage sind, Biotin, Avidin, Digoxigenin, Antigene, Haptene oder Fluorochrome. Das Signal von Enzymmarkierungen wird im Allgemeinen entwickelt, indem das Enzym mit seinem Substrat und irgendwelchen zusätzlichen Reagentien, die zur Erzeugung eines gefärbten enzymatischen Reaktionsprodukts erforderlich sind, umgesetzt wird. Biotin- (oder Avidin)-Markierungen können durch Bindung an markierte Avidin- (oder markierte Biotin-) oder markierte anti-Biotin- (oder markierte anti-Avidin)-Antikörper nachgewiesen werden. Digoxigenin- und Hapten-Markierungen werden üblicherweise durch eine spezifische Bindung an einen markierten anti-Digoxigenin- (anti-Dig-) oder anti-Hapten-Antikörper nachgewiesen. Im Allgemeinen wird die Detektorsonde dahingehend ausgewählt, dass sie mit einer Nucleotidsequenz im Amplikon hybridisiert, die zwischen den Bindungsstellen der beiden Amplifikationsprimer gelegen ist. Eine Detektorsonde kann jedoch auch dieselbe Nucleotidsequenz wie einer der Amplifikationsprimer aufweisen. Verfahren zur in vitro- und in situ-Detektion durch Hybridisierung mit einer Detektorsonde sind im Stand der Technik bekannt.
  • Alternativ können Amplifikationsprodukte durch Verlängerung eines Detektorprimers nachgewiesen werden, wie von Walker et al. (1992b), siehe oben, beschrieben. Beim Verfahren der Detektorprimerverlängerung wird ein Oligonucleotid-Primer, der eine nachweisbare Markierung umfasst, mit den Amplifikationsprodukten hybridisiert und durch Hinzufügen von Polymerase verlängert. Für die Detektion kann der Primer 5'-endmarkiert werden, wobei beispielsweise eine 32P- oder eine fluoreszierende Markierung verwendet wird. Alternativ kann eine Verlängerung des hybridisierten Primers ein dNTP-Analogon einschließen, das eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung umfasst. Eine Verlängerung des Primers kann beispielsweise ein Dig-derivatisiertes dNTP einschließen, welches dann nach einer Verlängerung durch Reaktion mit AP-α-Dig und einem geeigneten AP-Substrat nachgewiesen wird. Der zu verlängernde Primer kann entweder gleich wie ein Amplifikationsprimer oder ein anderer Primer sein, der mit einer Nucleotidsequenz im Amplikon hybridisiert, die zwischen den Bindungsstellen der Amplifikationsprimer gelegen ist.
  • Die nachweisbare Markierung kann während einer Zielsequenz-Amplifikation auch direkt in Amplikone eingebaut werden. Beispielsweise kann eines der dNTPs bei der herkömmlichen SDA-Reaktion vollständig oder teilweise durch ein dNTP-Analogon ersetzt werden, das ein mit einer direkt oder indirekt nachweisbaren Markierung konjugiertes dNTP umfasst. Die Polymerase baut die Markierung dann in die durch Verlängerung des Amplifikationsprimers erzeugten Amplifikationsprodukte ein. Die Markierung kann direkt oder indirekt nachweisbar sein. Wenn die mit dem dNTP konjugierte Markierung eine fluoreszierende Markierung ist, kann sie durch Messung der Fluoreszenzintensität in den Amplikonen direkt nachgewiesen werden oder kann durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie in situ nachgewiesen werden. Wenn die mit dem dNTP konjugierte Markierung Biotin oder Digoxigenin ist, können durch Umsetzung der Biotin- oder Digoxigenin-Markierung mit Streptavidin/FITC und eine Detektion wie für eine direkt verknüpfte fluoreszierende Markierung Amplikone indirekt nachgewiesen werden.
  • Sekundäre Amplifikationsprodukte sind Kopien der Zielsequenz, die durch Hybridisierung und Verlängerung eines Signalprimers an der Zielsequenz erzeugt werden, wie im U.S.-Patent Nr. 5,547,861 beschrieben. Die sekundären Amplifikationsprodukte umfassen ein internes Segment der amplifizierten Zielsequenz und eine nachweisbare Markierung, die mit dem Signalprimer verbunden ist. Zumindest das 3'-Ende des Signalprimers umfasst eine Sequenz, die mit der Zielsequenz hybridisiert. Es kann auch Merkmale umfassen, die das Einfangen oder Immobilisieren der sekundären Amplifikationsprodukte ermöglichen, so dass diese für eine Detektion, quantitative Bestimmung oder weitere Manipulation isoliert werden können. Der Signalprimer umfasst nicht die in den Amplifikationsprimern vorgefundene Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle und fungiert in einer SDA daher nicht als Amplifikationsprimer. Die gleichzeitige Erzeugung von sekundären Amplifikationsprodukten in der rtSDA-Reaktion schafft ein weiteres Nachweisverfahren, das homogen ist und gleichzeitig mit einer Amplifikation durchgeführt werden kann. Der Schritt der Sondenhybridisierung wird eliminiert, und die Konzentrationen an Signalprimer sind im Allgemeinen geringer als bei Hybridisierungssonden. Die geringere Konzentration selbst verringert den Hintergrund und ermöglicht auch eine Waschung von höherer Stringenz, welche den Hintergrund weiter verringert. Zur Erzeugung sekundärer Amplifikationsprodukte wird zumindest ein Signalprimer in die rtSDA-Reaktionsmischung einbezogen. Bei der zweistufigen rtSDA kann der Signalprimer in beiden Reaktionen oder nur in der cDNA-Amplifikationsreaktion vorhanden sein. Der (die) Signalprimer hybridisiert bzw. hybridisieren mit der RNA-Zielsequenz oder einer cDNA-Kopie davon stromabwärts von der Hybridisierungsstelle eines Amplifikationsprimers und wird bzw. werden in einer Art und Weise, die der Verlängerung des Amplifikationsprimers ähnlich ist, durch Polymerase verlängert. Die Verlängerung des Amplifikationsprimers verdrängt dabei das Verlängerungsprodukt des Signalprimers aus der Zielsequenz. Der entgegengesetzte Amplifikationsprimer hybridisiert dann mit dem verlängerten, verdrängten Signalprimer und wird durch Polymerase verlängert, was zum Einbau des Signalprimers in einen längeren Doppelstrang führt, welcher auf die Zielamplifikation (das sekundäre Amplifikationsprodukt) schließen lässt. In situ sind die restlichen unverlängerten Signalprimer genügend klein, um aus der Zelle herausgewaschen zu werden, während die verlängerten Signalprimer in ihr zurückbehalten werden. Ein zielamplifikationsspezifisches Signal wird dabei mit jenen Zellen in Verbindung gebracht, in denen das Ziel vorhanden ist, und fehlt im Wesentlichen in Zellen, in denen es kein Ziel gibt.
  • Zusätzlich zum Signalprimer sind andere Alternativen, Modifikationen und Anpassungen der SDA-Reaktion für DNA für die Verwendung bei einer SDA von RNA-Zielen geeignet. Einzelsträngige DNA-bindende Proteine können beispielsweise zur RNA-Amplifikationsreaktion hinzugefügt werden, um die Gesamtwirksamkeit zu verbessern und um die Länge des Ziels, das wirksam amplifiziert werden kann, zu erhöhen. Kontaminierende Amplikone können behandelt werden wie im U.S.-Patent Nr. 5,536,649 gelehrt, um sie in der nachfolgenden RNA-Amplifikationsreaktion nicht amplifizierbar zu machen, und jedes/jede der für die SDA von DNA-Zielen verwendeten Restriktionsenzyme und Polymerasen kann in der RNA-Amplifikationsreaktion verwendet werden (z.B. die im U.S.-Patent Nr. 5,270,184; im U.S.-Patent Nr. 5,455,166; in der EP 0 684 315 geoffenbarten Enzyme). Weiters kann sowohl das einstufige als auch das zweistufige, obenstehend beschriebene Protokoll für die in vitro-Amplifikation von RNA-Zielen, wie obenstehend durch ein Beispiel veranschaulicht, oder für die in situ-Amplifikation von RNA-Zielen verwendet werden.
  • Die nachfolgenden Versuchsbeispiele sind vorgesehen, um bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen, sie sind jedoch nicht dazu bestimmt, die durch die angeschlossenen Ansprüche definierte Erfindung einzuschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Eine rtSDA wurde unter Verwendung einer Reverse-Transcriptase und einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase in einem Schritt durchgeführt, um die Reaktionsabschnitte der Reverse-Transcription und der DNA-Amplifikation gleichzeitig durchzuführen. Diese Reaktion kann in jeglichem geeigneten SDA-Puffersystem durchgeführt werden, wobei irgendeine DNA-abhängige DNA-Polymerase zur Anwendung kommt, die für die SDA von DNA-Zielen geeignet ist. Thermophile (d.h. thermostabile) DNA-Polymerasen werden bevorzugt (z.B. exo– Bca oder exo– Bst), da sie eine Durchführung der Reaktion unter strengeren Bedingungen ermöglichen. Jede strangverdrängende Reverse-Transcriptase kann verwendet werden, wobei die bevorzugten Reverse-Transcriptasen MMLV, AMV und Superscript IITM sind. In einem ersten Beispiel wurde das Puffersystem auf TRIS aufgebaut und enthielt die folgenden Komponenten: 100 μg/ml BSA, 50 mM TRIS pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 1,4 mM dCTPαS, 450 ng DNA der menschlichen Plazenta, 15% Glycerin, 1,2 μM SDA-Amplifikationsprimer und 0,5 μM SDA-Bumperprimer (unten dargestellt, Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenzen sind unterstrichen) in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
  • Amplifikationsprimer S1,8 (SEQ ID NO: 1)
    Figure 00150001
  • Amplifikationsprimer S2,9 (SEQ ID NO: 2)
    Figure 00150002
  • Bumperprimer GB1,1 (SEQ ID NO: 3)
    Figure 00150003
  • Bumperprimer B2,1 (SEQ ID NO: 4)
    Figure 00150004
  • Detektorprimer (SEQ ID NO: 5)
    Figure 00150005
  • Zur Bestimmung der Empfindlichkeit der Analyse wurde ein gag RNA-Ziel bei verschiedenen Konzentrationen in der Reaktionsmischung verdünnt, 30 Sekunden lang auf 70°C erhitzt und bei 48°C zwei Minuten lang platziert. Die Amplifikationsenzyme (BsoBI, Reverse-Transcriptase und DNA-Polymerase) wurden hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei etwa 48–52°C 30 Minuten lang inkubiert. In einem Beispiel waren 160 Einheiten BsoBI, 3 Einheiten exo– Bca und entweder 200 Einheiten Superscript IITM oder 2,5 Einheiten AMV-Reverse-Transcriptase in der Amplifikationsreaktion vorhanden. Nach Beendigung der Amplifikationsreaktion wurden die Amplifikationsprodukte durch Hybridisierung und Verlängerung eines markierten Detektorprimers nachgewiesen, wie von Walker, et al., 1992b, siehe oben, beschrieben. Im TRIS-System detektierte rtSDA ein Minimum von etwa 100 RNA-Kopien.
  • Die rtSDA-Reaktion kann auch in Phosphatpuffern durchgeführt werden, die jene Puffersysteme sind, die typischerweise für eine SDA von DNA-Zielen verwendet werden. Diese Reaktionen enthielten die folgenden Komponenten: 45 mM KPO4 (pH 7,6), 5 mM MgOAC, 15% Glycerin, 500 ng DNA der menschlichen Plazenta, 1,2 μM SDA-Amplifikationsprimer, 0,5 μM SDA-Bumperprimer, 1,4 mM dCTPαS, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 100 μg/Reaktion BSA und 160 Einheiten BsoBI in einer 50 μl- Reaktion. Exo– Bca (3 Einheiten), exo– Bst (16 Einheiten) und Klenow (15 Einheiten) wurden untersucht und erwiesen sich als funktionell in der rtSDA-Reaktion auf Phosphatbasis. AMV- (2,5 Einheiten), Superscript IITM- (200 Einheiten) und MMLV- (200 Einheiten)-Reverse-Transcriptasen wurden ebenfalls untersucht und erwiesen sich als kompatibel mit dem Phosphatsystem. Die empfindlichste Analyse wurde bei Verwendung von AMV und exo– Bst als die beiden Polymerasen erzielt, wobei ein Minimum von etwa 100 RNA-Zielmolekülen nachgewiesen wurde.
  • Es wurde bestätigt, dass das Einstufen/Zwei-Polymerase-rtSDA-System beide Polymerasen für eine nachweisbare Amplifikation von RNA benötigt. Das Weglassen von entweder der Reverse-Transcriptase oder der DNA-Polymerase verhinderte eine Amplifikation von gag RNA-Zielen, und zwar ungeachtet des verwendeten Puffers. Die Entdeckung, dass die Reverse-Transcriptase und die DNA-Polymerase unter denselben Reaktionsbedingungen gleichzeitig funktionieren können, ermöglichte die Entwicklung einer rtSDA-Reaktion, die weniger Manipulationen benötigt und eine Echtzeit-Detektion von Amplifikationsprodukten (d.h. gleichzeitig eine Detektion und eine Amplifikation) liefern kann, wobei Signalprimer-Nachweissysteme zur Anwendung kommen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001

Claims (8)

  1. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielsequenz, umfassend: a) das Hybridisieren eines ersten Amplifikationsprimers an einem 3'-Ende einer RNA-Zielsequenz, wobei der erste Amplifikationsprimer eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle 5' zu einer ersten Zielbindesequenz umfasst, und das Hybridisieren eines ersten Bumperprimers 5' zum ersten Amplifikationsprimer; b) das Verlängern des ersten Amplifikationsprimers und des ersten Bumperprimers unter Verwendung einer Reverse-Transcriptase, der eine 5'→3'-Exonucleaseaktivität fehlt und die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, in Gegenwart von Desoxynucleosidtriphosphaten und zumindest eines modifizierten Desoxynucleosidtriphosphats, wodurch ein einzelsträngiges erstes Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt produziert wird, das eine zur RNA-Zielsequenz komplementäre DNA-Zielsequenz umfasst; c) das Hybridisieren eines zweiten Amplifikationsprimers an einem 3'-Ende der DNA-Zielsequenz des ersten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukts, wobei der zweite Amplifikationsprimer die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle 5' zu einer zweiten Zielbindesequenz umfasst, und das Hybridisieren eines zweiten Bumperprimers 5' zum zweiten Amplifikationsprimer; d) das Verlängern des zweiten Amplifikationsprimers und des zweiten Bumperprimers in Gegenwart der Desoxynucleosidtriphosphate und des modifizierten Desoxynucleosidtriphosphats, wodurch ein einzelsträngiges zweites Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt produziert wird, das die DNA-Zielsequenz umfasst; e) das Doppelsträngig-Machen des zweiten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukts durch Hybridisierung und Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers, wodurch im doppelsträngigen zweiten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt eine doppelsträngige hemimodifizierte Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle produziert wird, und; f) das Amplifizieren der Zielsequenz durch i) das Einführen von Einzelstrangbrüchen an der doppelsträngigen hemimodifizierten Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle im doppelsträngigen zweiten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt mit einer Restriktionsendonuclease, ii) das Verlängern ab dem Einzelstrangbruch unter Verwendung einer thermostabilen DNA-abhängigen DNA-Polymerase, der eine 5'→3'-Exonucleaseaktivität fehlt und die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, wodurch eine einzelsträngige Kopie der Zielsequenz verdrängt wird, und iii) das Wiederholen der Schritte des Einführens von Einzelstrangbrüchen, Verlängerns und Verdrängens, so dass die Zielsequenz amplifiziert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-abhängige DNA-Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus exo– Bca und exo– Bst, und die Reverse-Transcriptase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Superscript IITM, AMV-Reverse-Transcriptase und MMLV-Reverse-Transcriptase.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Amplifikationsprimer in Schritt (d) durch die Reverse-Transcriptase verlängert wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Amplifikationsprimer in Schritt (d) durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase verlängert wird.
  5. Verfahren zum Amplifizieren einer Zielsequenz, umfassend: a) das Hybridisieren eines Reverse-Transcription-Primers, bestehend aus Zielbindesequenzen, an einem 3'-Ende einer RNA-Zielsequenz und das Hybridisieren eines ersten Bumperprimers 5' zum Reverse-Transcription-Primer; b) das Verlängern des Reverse-Transcription-Primers und des ersten Bumperprimers unter Verwendung einer Reverse-Transcriptase, der eine 5'→3'-Exonucleaseaktivität fehlt und die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, in Gegenwart von Desoxynucleosidtriphosphaten und zumindest eines modifizierten Desoxynucleosidtriphosphats, wodurch ein einzelsträngiges Reverse-Transcription-Primer-Verlängerungsprodukt produziert wird, das eine zur RNA-Zielsequenz komplementäre DNA-Zielsequenz umfasst; c) das Hybridisieren eines ersten Amplifikationsprimers an einem 3'-Ende der DNA-Zielsequenz, wobei der erste Amplifikationsprimer eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle 5' zu einer Zielbindesequenz umfasst, und das Hybridisieren eines zweiten Bumperprimers 5' zum ersten Amplifikationsprimer; d) das Verlängern des ersten Amplifikationsprimers und des zweiten Bumperprimers in Gegenwart der Desoxynucleosidtriphosphate und des modifizierten Desoxynucleosidtriphosphats, wodurch ein einzelsträngiges erstes Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt produziert wird, das die DNA-Zielsequenz umfasst; e) das Doppelsträngig-Machen des ersten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukts durch Hybridisierung und Verlängerung eines zweiten Amplifikationsprimers, wobei der zweite Amplifikationsprimer die Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle 5' zu einer zweiten Zielbindesequenz umfasst, wodurch im doppelsträngigen ersten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt eine doppelsträngige hemimodifizierte Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle produziert wird, und; f) das Amplifizieren der Zielsequenz durch i) das Einführen von Einzelstrangbrüchen an der doppelsträngigen hemimodifizierten Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle im doppelsträngigen ersten Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt mit einer Restriktionsendonuclease, ii) das Verlängern ab dem Einzelstrangbruch unter Verwendung einer thermostabilen DNA-abhängigen DNA-Polymerase, der eine 5'→3'-Exonucleaseaktivität fehlt und die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, wodurch eine einzelsträngige Kopie der Zielsequenz verdrängt wird, und iii) das Wiederholen der Schritte des Einführens von Einzelstrangbrüchen, Verlängerns und Verdrängens, so dass die Zielsequenz amplifiziert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die DNA-abhängige DNA-Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus exo– Bca und exo– Bst, und die Reverse-Transcriptase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Superscript IITM, AMV-Reverse-Transcriptase und MMLV-Reverse-Transcriptase.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der erste Amplifikationsprimer in Schritt (d) durch die Reverse-Transcriptase verlängert wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der erste Amplifikationsprimer in Schritt (d) durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase verlängert wird.
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