DE69917303T2

DE69917303T2 - Genomische Multi-Loci Analyse durch ein Verfahren der verbesserten zyklischen Sequenzierung

Info

Publication number: DE69917303T2
Application number: DE69917303T
Authority: DE
Inventors: Thuraiayah Vinayagamoorthy
Original assignee: Bio ID Diagnostic Inc
Current assignee: Bio ID Diagnostic Inc
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2019-10-02
Also published as: EP1117839A1; EP1117839B1; CA2344741A1; ID29579A; CN1195873C; CN1329673A; US6197510B1; ATE266738T1; CA2344741C; MXPA01004309A; AU765504B2; ES2221479T3; AU5963899A; NZ511415A; WO2000020628A1; DE69917303D1; AU765504C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Nukleinsäureanalyse, umfassend Verfahren die für die Sequenzanalyse und zur diagnostischen Differenzierung von Zelltypen wie die Identifikation von pathologischen Organismen nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Zur Sequenzierung von Nukleinsäuren ist eine Vielzahl von Verfahren bekannt. Die meisten DNA-Sequenzierungsverfahren die derzeit gebräuchlich sind, sind von Sangers Didesoxy-Kettenabbruchsmethode (Sanger, F., S. Nicklen und A. R. Coulson (1977 ("DNA Sequencing with chain-terminating inhibitors" PNAS USA 74: 5463 bis 5467) abgeleitet. Diese Verfahren starten eine Polymerase-katalysierte Verdoppelung eines markierten Primers, der zu einem Teil des zu sequenzierenden Stranges komplementär ist. Typischerweise werden vier Polymerasereaktionen durchgeführt, jede davon mit einem der vier Didesoxynukleotide (ddNTPs), die mit den normalen Desoxynukleotiden vermischt sind. ddNTPs können mit den nachfolgenden Nukleotiden keine Phosphordiesterbindung bilden, so dass in jedem Reaktionsgemisch die Kettenpolymerisation üblicherweise bei einer ddNTP abgebrochen wird, und so eine Serie von markierten Strängen erzeugt, deren Längen ein Hinweis auf die Stelle einer speziellen Base in der Sequenz ist. Die entstehenden markierten Fragmente können entsprechend ihrer Größe durch Polyacrylgelelektrophorese getrennt werden. Die Position der Fragmente im Gel kann durch den Nachweis des Markers bestimmt werden, beispielsweise kann Autoradiographie verwendet werden, um radioaktiv markierte Fragmente nachzuweisen. Abwandlungen der Sanger-Sequenzierungsverfahren wurden kürzlich für automatisiertes Sequenzieren im großtechnischen Maßstab adaptiert unter Verwendung von mehrfach fluoreszenten Markern und Kapillargelelektrophorese.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) kann zur Amplifizierung von Sequenzen vor dem Sequenzieren verwendet werden. Teile des PCR-Verfahren sind in den nachfolgenden US-Patenten offenbart: 4,683,195 erteilt am 28. Juli 1987 an Mullis et al. und 4,683,202 erteilt am 28. Juli 1987 an Mullis (siehe ebenfalls US-Patent Nr. 4,965,188; Saiki et al., (1988) Science 239: 487–491; und Mullis, K. B. et al. (Eds.) 1994, "The Polymerase Chain Reaction", Springer Verlag, ISBN 0817637508). Die PCR verwendet Primer, die an entgegengesetzte Stränge an jedem Ende einer dazwischenliegenden Sequenz binden, um die dazwischenliegende Sequenz zu amplifizieren. Die Gemische der Polymerasekettenreaktion werden zur Trennung der komplementären Stränge zwischen den Zyklen der aktiven Polymerisation erhitzt. Unter entsprechenden Bedingungen können derartige Zyklen in einer millionenfachen Amplifizierung der Zielsequenz resultieren. Die amplifizierte DNA kann anschließend sequenziert werden.
NukleinsäureAmplifizierungstechniken können zweckdienlicherweise dazu verwendet werden, eine große Anzahl von Pathogenen oder anderen Organismen nachzuweisen. In ähnlicher Weise, kann die Amplifizierung von variablen Regionen eines Genoms dazu verwendet werden, zwischen einem Organismus und einem anderen zu unterscheiden, ein Verfahren, das manchmal als DNA Fingerprinting bezeichnet wird. Es ist jedoch möglich, ein falsch-positives Ergebnis aus Amplifizierungsreaktionen zu erhalten, wenn nicht spezifische Amplifizierung auftritt. Ein Ansatz zur Verbesserung dieses Problems bestand in der Verwendung von mehrfachen Amplifizierungsreaktionen auf einer einzigen Probe, das manchmal auch unter dem Begriff MultiplexAmplifizierung bekannt ist, wie sie beispielsweise im US Patent Nr. 5,582,989, erteilt am 10. Dezember 1996 an Caskey et al., dem US-Patent Nr. 5,552,283, erteilt an Diamandis et al. am 03. September 1996 und dem US-Patent Nr. 5,403,707 erteilt am 04. April 1995 an Atwood et al. offenbart sind. Das US-Patent 5,582,989 lehrt, dass die ursprünglichen PCR-Verfahren, die in dem vorstehend aufgeführten Patenten von Mullis und Mullis et al. offenbart sind, nicht für simultane MultiplexAmplifizierungsreaktionen geeignet sind. Das US-Patent Nr. 5,403,707 lehrt, dass es bei gemultiplexten Amplifizierungsreaktionen nützlich ist, Primer zu verwenden, die in ihrer Länge sehr ähnlich sind und daher ähnliche Schmelztemperaturen aufweisen.
NukleinsäureAmplifizierungstechniken können mit einer Sequenzierungsreaktionschemie adaptiert und kombiniert werden, um Sequenzinformationen zu liefern. Ein derartiges System kann als "Zyklische Sequenzierung" bezeichnet werden und beinhaltet typischerweise die Verwendung eines Paars von Primern, in Analogie zu Amplifizierungsprimern, die an entgegengesetzte Stränge an jedem Ende der Sequenz von Interesse binden. Die übliche Amplifizierungsreaktionschemie wurde dahingehend modifiziert, dass sie ein Kettenabbruchsnukleotid (wie ddNTP) im Reaktionsgemisch enthält, so dass einige der Primerverlängerungsprodukte an den Stellen in der Sequenz von Interesse abbrechen, wenn dieses Nukleotid auftritt. Jedoch werden einige der Primerverlängerungsprodukte, die entgegengesetzte Primeranlagerungsstelle erreichen, so dass sie als Templat für die Primerverlängerung in der nächsten Runde der Amplifizierung dienen können. Bei einer Adaptierung dieses Verfahrens, kann gleichzeitiges bidirektionales Sequenzieren beider Stränge einer doppelsträngigen DNA unter Verwendung von zwei strangspezifischen Primern durchgeführt werden, wobei jeder davon eine eindeutige Markierung trägt. Es sind eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits erhältlich, die entsprechende Reagenzien und Anweisungen zur Durchführung derartiger Reaktionen unter Verwendung thermostabiler Polymerase zur Verfügung stellen: SequiTherm Long-Read Cycle Sequencing Kit-LC (Cat # S36100LC), Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin, USA; SequiTherm Excel Long-Read DNA Sequencing Kit-LC (Cat. # SE6100LC), Epicentre Technologies, Madison, Wisconsin, USA; Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP (Cat. #RPN2438), Amersham Life Science, Cleveland, Ohio, USA; und CircumVent Thermal Cycle Sequencing Kit (Cat. # 430–100), New England Biolabs, Beverly, Mass. U SA.
Mucosal Disease (MD) ist eine der häufigsten Virenkrankheiten bei Rindern, die bedeutende wirtschaftliche Verluste hervorruft. MD wird durch Fieber, Speicheln, Schnupfen, Durchfall, Anorexie, Dehydrierung und Abtreibung charakterisiert. Die Krankheit wird durch ein RNA-Virus verursacht, der als der Bovine Virusdiarrhöe-Virus (BVDV) bekannt ist. Die Sequenzen einiger Varianten des BVDV-Genoms sind bekannt (Collet, M. S. et al., 1988, "Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of the Pestivirus Bovine Diarrhoea Virus" Virology 165: 191–199; Pellerin et al., 1994, "Identification of a New Group of Bovine Viral Diarrhoea Virus Strains Associated with Severe Outbreaks and High Mortalities", Virology 203: 260–268). BVDV gehört zu einer Familie von Pestiviren, die viele Ähnlichkeiten mit Viren teilen, die Border Disease und Virusschweinepest verursachen. BVDV tritt sowohl bei nichtzytopathogenen (ncp) und zytopathogenen (cp) Strängen auf. Der ncp-Strang über lebt in Tiergewebe ohne Zerstörung als eine latente Gefahr. Der cp-Strang verursacht die zelluläre Zerstörung und Krankheiten.
Als polymorpher RNA-Virus, ist BVDV ein Beispiel aus dem großen Anzahl von Organismen, für die verlässliche diagnostische Protokolle erforderlich sind und bei denen es erwünscht wäre, Techniken zur Verfügung zu haben, um effizient Polymorphismen zu testen, die abweichende Pathologien anzeigen, die mit verschiedenen Organismensträngen verbunden sind. Effiziente Techniken zur Bestimmung der evolutionären Abstammung eines bestimmten Pathogens, wie sie durch seine vollständige oder teilweise Nukleinsäuresequenz gegeben ist, können ebenso beim Bereitstellen von epidemologischen Informationen über den Organismus von Nutzen sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur simultanen Analyse multipler Nukleinsäureregionen in einer einzigen Reaktion zur Verfügung zu stellen. Die Verfahren können beispielsweise ausgelegt sein, um Sequenzen zu analysieren, die aus gemultiplexten Amplifizierungsreaktionen stammen. Derartige Informationen können für die verlässliche Diagnose und die Differenzierung pathologischer Organismen nützlich sein. Derartige Information können ebenso bei der genomischen Differenzierung von Individuen durch Verfahren von Nutzen sein, die im Allgemeinen als "DNA-Fingerprinting" bezeichnet werden.
In einer Ausführungsform, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure in einem Reaktionsgemisch zur Verfügung, das eine erste und zweite Nukleinsäurezielsequenz umfasst. Die Zielsequenzen können in gleichen oder in verschiedenen Nukleinsäuremolekülen vorhanden sein. Erste und zweite markierte Sequenzierungsprimer werden bereitgestellt, die an die ersten bzw. zweiten Nukleinsäurezielsequenzen hybridisierbar sind. Der zweite Sequenzierungsprimer ist mindestens so lang wie die Gesamtlänge des ersten Sequenzierungsprimers zuzüglich der Länge der ersten Zielsequenz. Das Reaktionsgemisch wird mit einer DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosiden und einem Ketten-terminierenden Desoxyribonukleotid unter Bedingungen, die eine Verdopplung der ersten und zweiten Zielse quenzen durch die Polymerase ermöglichen, bereitgestellt, um durch eine Verlängerung ausgehend von den ersten bzw. zweiten Sequenzierungsprimern fortzufahren. Wie in einer typischen Sanger-Sequenzierungsreaktion, erlaubt das periodische Einbauen des Ketten-terminierenden Nukleotids durch die Polymerase die Beendigung der Polymerisation, um einen Pool von Primerverlängerungsprodukten verschiedener Länge zu erzeugen. Erfindungsgemäß beginnt jedes der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool, der mit dem zweiten Sequenzierungsprimer beginnt und ist länger als die Primerverlängerungsperiode in dem Pool, die mit dem ersten Sequenzierungsprimer beginnen. Sobald die Sequenzierungsreaktionen vollständig sind, können die Längen der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool durch bekannte Mittel wie beispielsweise Gelelektrophorese nachgewiesen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann so ausgelegt sein, dass es mit zusätzlichen Nukleinsäurezielsequenzen funktioniert. In derartigen Ausführungsformen, können zusätzliche markierte Sequenzprimer zur Verfügung gestellt werden, die an die zusätzlichen Zielsequenzen hybridisierbar sind. Die zusätzlichen Sequenzierungsprimer sind wenigstens so lang wie die längste Sequenz in dem Pool der Primerverlängerungsprodukte.
Einer oder mehr der Sequenzierungsprimer kann ein mit einem Anhang versehener Sequenzierungsprimer sein, umfassend einen Teil, der zu den Zielnukleinsäuresequenzen nicht homolog ist. Die nicht homologen Teile der mit einem Anhang versehenen Sequenzierungsprimer können in 5'-Stellung zu den Regionen der mit einem Anhang versehenen Sequenzierungsprimer sein, die an die Zielsequenzen hybridisierbar sind. In alternativen Ausführungsformen, kann der „Anhang" des Sequenzierungsprimers nichtlineare DNA-Moleküle umfassen, wie verzweigte DNA oder dendritische Nukleinsäuren. Alternativ dazu können nicht DNA-Moleküle den "Anhang" der Sequenzierungsprimer bilden, um den Primer ein geeignetes Molekulargewicht zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Verfügung zu stellen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können den Schritt der Amplifizierung der ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung einer Amplifizierungsreaktion umfassen. Eine Vielzahl von Amplifizierungsreaktionen kann verwendet werden, umfassend eine Polymerasekettenreaktion. Beispielsweise kann die Amplifizierungs reaktion das Bereitstellen von ersten und zweiten doppelsträngigen Nukleinsäurereaktionen die Nukleinsäureregionen, die amplifiziert werden sollen, in dem Reaktionsgemisch umfassen, wobei jede komplementäre Stränge aufweisen, die entgegengesetzte 3'-Enden aufweisen, die die zu amplifizierende Region definieren. Ein erstes Amplifizierungsprimerpaar kann bereitgestellt werden, wobei ein Element des ersten Amplifizierungsprimerpaars an jedes der 3'-Enden der komplementären Stränge der ersten zu amplifizierenden Region hybridisierbar ist. Die erste zu amplifizierende Reaktion umfasst oder ist die gleiche wie die erste Nukleinsäurezielsequenz, die den Gegenstand der erfindungsgemäßen Sequenzierungsreaktion bildet. Ein zweites Paar von Amplifizierungsprimern kann bereitgestellt werden, wobei ein Element des zweiten Amplifizierungsprimerpaars an jedes Ende der 3'-Enden der komplementären Stränge der zweiten zu amplifizierenden Region hybridisierbar ist. Die zweite zu amplifizierende Region umfasst oder ist die gleiche wie die zweite Nukleinsäurezielsequenz, die wenigstens teilweise sequenziert werden soll. Das Reaktionsgemisch wird mit einer DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphaten und Bedingungen, die die Verdoppelung der DNA-Polymerase an den ersten und zweiten zu amplifizierenden Regionen ermöglichen, zur Verfügung gestellt, um durch die Verlängerung der ersten und zweiten Amplifizierungsprimer fortgeführt zu werden. Da in einer typischen Polymerasekettenreaktion die Nukleinsäureregionen anschließend durch zyklisches Durchlaufen des Reaktionsgemisches zwischen einer ersten Temperatur, bei der die komplementären Stränge der zu amplifizierenden Reaktion schmelzen und einer zweiten Temperatur, bei der die Amplifizierungsprimer an die 3'-Enden der komplementären Stränge der zu amplifizierenden Reaktionen binden, und bei dem die Polymerase-katalysierte Verdoppelung der ersten und zweiten zu amplifizierenden Reaktionen durch Verlängerung der ersten und zweiten Amplifizierungsprimer durchgeführt wird.
Die erfindungsgemäßen Sequenzierungs- und Amplifizierungsreaktionen können in einer zyklischen Sequenzierungsreaktionen kombiniert werden, wobei ein Mitglied der ersten und zweiten Amplifizierungsprimerpaare das gleiche ist wie die ersten bzw. die zweiten markierten Sequenzierungsprimer.
In einer alternativen Ausführungsform, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiter den Schritt der Sequenzverlängerung während der Amplifizierung (was auch als „step-up" Amplifizierung bezeichnet werden kann). In einer derartigen Ausführungsform, umfasst ein Mitglied des ersten Paares von Amplizierungsprimern Sequenzen, die an das 3' Ende eines der komplementären Stränge der zu amplifizierenden Region binden. Der step-up Amplifizierungsprimer hat ebenso zusätzliche Sequenzen, die nicht an das 3' Ende dieses komplementären Stranges hybridisierbar sind. Diese zusätzlichen Sequenzen werden zur Verlängerung der Sequenz während der Amplifizierung verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verlängerung einer Sequenz während der Amplifizierung kann das Bereitstellen eines Reaktionsgemisches umfassen, das eine zu amplifizierende doppelsträngige Nukleinsäureregion umfasst. Die zu amplifizierende Region hat erste und zweite komplementäre Stränge. Die zu amplifizierende Region ist über ein 3'-Ende an jedem der ersten und zweiten komplementären Stränge definiert. Ein erster Amplifizierungsprimer wird bereitgestellt, der Sequenzen aufweist, die komplementär zum 3'-Ende des ersten komplementären Strangs sind und weitere Sequenzen aufweist, die nicht komplementär zum 3'-Ende des ersten komplementären Stranges ist. Diese weiteren Sequenzen des ersten Amplifizierungsprimers können in 5'-Stellung zu den Sequenzen des ersten Amplifizierungsprimers sein, die zum Ziel komplementär sind. Ein zweiter Amplifizierungsprimer wird bereitgestellt, der Sequenzen aufweist, die komplementär zum 3'-Ende des zweiten Stranges der Zielsequenz sind. Das Reaktionsgemisch wird mit einer DNA-Polymerase versehen, Desoxyribonukleosidtriphosphate und Bedingungen, die für die Polymerase geeignet sind, um die Verlängerung der Amplifizierungsprimer zu katalysieren. Die zu amplifizierende Region wird amplifiziert und durch zyklisches Durchlaufen des Reaktionsgemisches zwischen einer ersten Temperatur, bei der die komplementären Stränge der Zielnukleinsäuresequenz schmelzen und einer zweiten Temperatur, bei der die Amplifizierungsprimer an die 3'-Enden der komplementären Stränge binden, verlängert und die Polymerase katalysiert die Verlängerung ausgehend von Amplifizierungsprimern.
Es versteht sich, dass die Verfahren zur Verlängerung der Amplifizierung einer Sequenz so angepasst werden können, dass sie mit Serien von Primern funktionieren, wobei jeder Primer zusätzliche Sequenzen aufweist und dadurch weiterhin die Größe der zu amplifizierenden Region vergrößern. Aufbauend auf dem vorstehenden Bei spiel, kann die zu amplifizierende Region weiter amplifiziert und verlängert werden, indem ein dritter Amplifizierungsprimer bereitgestellt wird, der Sequenzen aufweist, die komplementär zu den zusätzlichen Sequenzen in dem ersten Amplifizierungsprimer sind. Der dritte Amplifizierungsprimer umfasst anschließend weitere "ergänzende" Sequenzen, die zum ersten Amplifizierungsprimer oder zu der Nukleinsäuresequenz amplifiziert werden soll, nicht komplementär sind. Diese ergänzenden Sequenzen bilden die Grundlage für die weitere Verlängerung der zu amplifizierenden Region. Die ergänzenden Sequenzen können in 5'-Stellung zu den Sequenzen auf dem dritten Amplifizierungsprimer sein, die komplementär zu den zusätzlichen Sequenzen auf den zweiten Amplifizierungsprimer sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Anicht eines Multi-Loci Genomanalyseprotokolls, das eine Analyse dreier Genomregionen zeigt: α, β und δ. Jede der drei Regionen wird unter Verwendung von gepaarten PCR-Primern amplifiziert, wobei die Region α mit den Primern i und i' amplfiziert wird, die Region β mit den Primern ii und ii' amplifiziert wird und die Region δ mit den Primern iii und iii' amplifiziert wird. Sobald die Regionen α, β und δ amplifiziert sind, können sie sequenziert werden. Der Sequenzierungsprimer α wird dazu verwendet, das Sequenzsegment A auf der Region α zu sequenzieren, der Sequenzierungsprimer b wird verwendet, das Segment B auf der Region β zu sequenzieren, der mit einem Anhang versehene Sequenzierungsprimer d wird verwendet, um das Sequenzsegment D auf der Region δ zu sequenzieren. Die Länge der Sequenzierungsprimer b ist größer als die kombinierte Länge des Sequenzierungsprimers α plus dem Segment A. Die Länge des Sequenzierungsprimers d ist größer als die kombinierte Länge des Sequenzierungsprimers b plus Segment B. Eine schematische Darstellung eines Sequenzierungsgels 10 ist ebenfalls gezeigt.
2 ist ein schematisches Schaubild, das die bidirektionale Sequenzierung mit den Primern e und e' und die alternative Verwendung eines Sequenzierungsabbrechers t zeigt. Die T_m des Kettenabbrechers ist höher als die T_m der Primer e und e'.
3 ist ein schematisches Schaubild, das eine "Step-up"-Amplifizierung des Segments F zur Sequenzierung mit dem Sequenzierungsprimer f zeigt. Die erste Runde der Amplifizierung verwendet PCR-Primer v und v' zur Herstellung des Polynukleotids F', die zweite Runde der Amplifizierung verwendet die Sequenzierungsprimer vi und v' zur Herstellung des Polynukleotids F'', die dritte Amplifizierungsrunde verwendet PCR-Primer vii und v' zur Herstellung des Polynukleotids F'''.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäure wie DNA oder RNA zur Verfügung, die erste und zweite zu sequenzierende Regionen aufweisen. Die zu sequenzierenden Regionen können im gleichen Nukleinsäuremolekül (oder Genom) gefunden werden oder in verschiedenen Molekülen der gleichen Probe.
Es werden Sequenzierungsprimer ausgewählt, die unter geeigneten Bedingungen an die Regionen, die sequenziert werden sollen, hybridisierbar sind, wobei die Primer an das 3'-Ende der Regionen zur Primerpolymerisation gebunden werden. Die Primer sind so ausgewählt, dass jeder einen verschiedenen Satz von Fragmenten in den Sequenzierungsreaktionen erzeugt. Beispielsweise würde der zweite der zwei Primer so ausgewählt werden, dass er wenigstens so lang wie die gesamte Länge des ersten Sequenzierungsprimers zuzüglich der Länge der ersten zu sequenzierenden Reaktion ist. Damit werden die Produkte der am zweiten Primer initiierten Sequenzierungsreaktionen immer länger sein als die Produkte der Sequenzierungsreaktion, die am ersten Primer initiiert worden ist.
Die Sequenzierungsreaktion kann unter Verwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden, indem die Sequenzierungsprimer mit den zu sequenzierenden Nukleinsäuren in Gegenwart von Polymerase, Nukleotiden und einem Kettenabbruchsnukleotid. Es werden Bedingungen verwendet, die Verdoppelung der Regionen von Interesse durch die Polymerase erlauben, die von den Sequenzierungsprimern initiiert werden sollen. Die periodische Einlagerung des kettenabbrechenden Nukleotids beendet die Polymerisation, um einen Pool von Sequenzen mit verschiedenen Längen zu erzeugen. Die Auswahl von Primern einer geeigneten Länge erfordert, dass jede der Sequenzen in dem Pool, die mit einem Primer beginnen, in ihrer Länge verschieden ist von den Sequenzen, die mit einem anderen Primer beginnen. Geeignete Bedingungen können in bestimmten Ausführungsformen zur Verwendung der Sequenzierungsprimer ausgewählt werden, die eine Länge von vorzugsweise zwischen 10 und 600 Basenpaaren (bp) aufweisen oder noch mehr bevorzugt zwischen 16 und 600 bp. Beispielsweise werden alle Sequenzen im Falle, dass zwei Primer vorhanden ist, wobei der zweite Primer länger als die kombinierte Länge des ersten Primers und der ersten zu sequenzierenden Region des ersten Primers ist, und die vom zweiten Primer hergestellt werden sollen, länger sein als die Sequenzen im Pool, der mit dem ersten Primer beginnt. Die Differenzierung der Länge der Sequenzierungsreaktionsprodukte ist in 1 als schematisches Sequenzierungsgel 10 dargestellt. Zusätzliche Regionen können selbstverständlich in ähnlicher Weise von Primern sequenziert werden, die länger sind, als die Produkte der Sequenzierungsreaktion von jedem anderen Primer.
Die Länge der Produkte der Sequenzierungsreaktionen kann eingeschränkt sein, indem die Sequenzierung einer Nukleinsäure mit einer definierten Länge gewählt wird. Restriktionsfragmente (die unter Verwendung bekannter Techniken subkloniert werden können) oder Amplifizierungsprodukte mit definierter Länge können beispielsweise sequenziert werden, um einen Pool von Sequenzierungsreaktionsprodukten zu erzeugen, die in ihrer Länge zwischen minimal der Länge des Sequenzierungsprimers und maximal der Länge des Nukleinsäurefragments, das sequenziert werden soll, variieren.
Alternativ dazu, kann die Länge der Sequenzierungsreaktionsprodukte begrenzt sein unter Verwendung eines Sequenzierungsabbrechers, der ein Oligonukleotid umfasst, das an das 5'-Ende der zu sequenzierenden Reaktion hybridisiert, wobei der Sequenzierungsabbrecher ein 3'-Ende aufweist, bei dem die Polymerisation nicht initiiert werden kann, wie ein 3'-terminales ddNTP. 2 illustriert die alternative Verwendung des Sequenzierungsabbrechers t zur Definition der Länge der Sequenzierungsprodukte, die von einem Sequenzierungsprimer e verlängert wurden. Ein Abbrecher t könnte beispielsweise ein Polynukleotid mit einem 3-Didesoxynukleotid sein, oder jedes andere Nukleotid oder eine andere Einheit, von dem aus gesehen eine weitere 3-Strangverlängerung nicht möglich war.
Die Verwendung der Sequenzierungsprimer mit einer verlängerten Länge gemäß der vorliegenden Erfindung vergrößert daher das Mokulargewicht der Primerververlängerungsprodukte, die durch die Sequenzierungsreaktion hergestellt wurden, so dass die Sequenzierungsreaktionsprodukte von einem Primer von den Sequenzierungsreaktionsprodukten eines anderen Primers unterscheidbar sind. In alternativen Ausführungsformen kann das Molekulargewicht der Sequenzierungsprimerverlängerungsprodukte ähnlich geändert werden, so dass die Primerverlängerungsprodukte unter Verwendung von Sequenzierungsprimern mit anderen chemischen Modifikationen voneinander unterscheidbar sind. Alternative Modifikationen umfassen die Verwendung von bekannten Typen nichtlinearer DNA-Moleküle wie verzweigte DNA und dendritische Nukleinsäuren. Verzweigte DNA-Technologien sind beispielsweise in den nachfolgenden Literaturstellen beschrieben: Cao Y., et al., 1995 "Clinical Evaluation of Branched DNA Signal Amplification for Quantifying HIV Type 1 in Human Plasma", AIDS Research and Human Retroviruses 11(3): 353–361; Collins M. L. et al., 1995, "Preparation and characterization of RNA standards for use in quantitative branched DNA hybridization assays", Analytical Biochemistry 226 (1): 120–129; Dewar R. et al., 1994, "Application of Branched DNA Signal Amplification to Monitor Human Immunodeficiency Virus Type 1 Burden in Human Plasma"; Journal of Infectious Diseases 170: 1172–1179. Dendritische Nukleinsäuren sind hochverzweigte Moleküle, die durch kontrollierte Hybridisierung und Quervernetzung von Einzelstrangnukleinsäuren hergestellt werden können wie es in den nachfolgenden Literaturstellen beschrieben ist: Nilsen, T. W. et al., 1997, "Dendritic nucleic structures", J. Theor. Biol. 187(2): 273–84. Ein alternativer Zugang dazu besteht in der Modifikation der Primer mit Phosphoramidit zur entsprechenden Erhöhung ihres Molekulargewichts. Diese alternativen chemischen Modifikationen des Sequenzierungsprimers können ausgelegt sein, um die offensichtlichen Molekulargewichte der Sequenzierungsreaktionsprodukte zu verschieben, so dass die Fragmente, die mit einem Primer beginnen, alle verschiedene offensichtliche Molekulargewichte haben als die Sequenzierungsreaktionsprodukte, die mit anderen Primern beginnen.
Entsprechend sind Sequenzierungsprimer vorgesehen, so dass das offensichtliche Molekulargewicht nach Gelelektrophorese eines "zweiten" Primers wenigstens so groß ist wie das offensichtliche Molekulargewicht eines verlängerten "ersten" Se quenzierungsprimers, d. h. der erste Sequenzierungsprimer ist so verlängert, dass er die erste Zielsequenz umfasst, und wobei der erste und der zweite Sequenzierungsprimer an erste bzw. zweite Zielsequenzen hybridisieren, um die Sequenzanalyse der Ziele zu erleichtern.
Die Produkte der Sequenzierungsreaktion können gemäß bekannter Sequenzierungstechniken analysiert werden, wie beispielsweise durch Trennung der Sequenzen in dem Pool entsprechend ihrer Länge und dem Nachweis der Länge der Sequenzen im Pool. Autoradiographien der Sequenzen, die von den radiomarkierten Sequenzierungsprimern stammen und die auf Polyacrylamidgelen getrennt werden, ist eine derartige Technik. Alternative Verfahren umfassen den Nachweis von fluoreszenzmarkierten Sequenzreaktionsprodukten, die durch Kapillargelelektrophorese voneinander getrennt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung, wird nur ein Kettenabbruchnukleotid in der Sequenzierungsreaktion verwendet. In dieser Ausführungsform, wird eine Sequenzinformation nur für eins der vier Nukleotide in der Region von Interesse erhalten. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass sie nur eine einzige Sequenzierungsreaktion erfordert, deren Resultate in einem einzigen Nachweisverfahren getestet werden können, so wie eine einzelne Spur auf einem Polyacrylamidsequenzierungsgel. Diese Technik kann insbesondere dann nützlich sein, wenn die normale Sequenz der Region bekannt ist und die Bestimmung, ob die Region die in der Probe von Interesse enthalten ist, mit dieser bekannten Sequenz übereinstimmt erwünscht ist. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, dass eine Amplifizierungreaktion genau eine Zielsequenz amplifiziert hat, um die Möglichkeit einer falschen positiven Amplifizierungsreaktion auszuräumen und dies zu bestätigen. Eine partielle Sequenzinformation kann ebenfalls zur Unterscheidung von Untersets eines Organismus von Interesse nützlich sein. Beispielsweise können verschiedene Varianten eines Pathogens wie eines Virus durch partielles Sequenzieren unterschieden werden, oder allele Formen eines Gens, das mit einer Krankheit oder einer Neigung zu dieser Krankheit in Verbindung gebracht wird.
In einer alternativen Ausführungsform kann bidirektionales Sequenzieren der Regionen von Interesse verwendet werden wie es in 2 dargestellt ist. Bidirektionale Sequenzierungsprimer e und e' sind in 2 gezeigt, worin die eingeklammerte Region E zu sequenzieren ist. In einer Variante der Erfindung, wo die bidirektionalen Sequenzierungsreaktionen mit unterscheidbaren Markierungen durchgeführt werden, wie fluoreszenzmarkierten Primern, die bei verschiedenen Wellenlängen absorbieren oder emittieren, kann anschließend eine einzelne Spur auf einem Sequenzierungsgel dazu verwendet werden, die Sequenzierungsreaktionsprodukte der zwei bidirektionalen Sequenzierungsreaktionen durchzulaufen. Diese Techniken können erfindungsgemäß an verschiedenen Regionen von Interesse angewendet werden.
In einem Aspekt der Erfindung können die sequenzierenden Regionen zuerst amplifiziert werden. Die Polymerasekettenreaktion kann beispielsweise dazu verwendet werden, die zu sequenzierenden Regionen zu amplifizieren. Die zu sequenzierende Region kann alle oder nur einen Teil der amplifizierten Sequenzen umfassen. Wenn nur ein Teil der amplifizierten Regionen zu sequenzieren ist, werden die Sequenzierungsprimer in die amplifizierten Regionen eingebettet. Wenn die gesamte amplifizierte Region zu sequenzieren ist, können die Sequenzierungsprimer aus den Amplifizierungsprimern ausgewählt werden, wobei ein Sequenzierungsprimer ausgewählt wird für jede der amplifizierten Regionen. 1 zeigt in schematischer Weise ein Multi-Loci Genomanalyseprotokoll gemäß diesem Aspekt der Erfindung, und zeigt die Analyse von drei Genomreaktionen: α, β und δ. Jede dieser drei Regionen in dieser Ausführungsform wird unter Verwendung gepaarter PCR-Primer amplifiziert: Region α wird mit dem Primern i und i' amplifiziert, Region β wird mit den Primern ii und ii' amplifiziert und Region δ wird mit den Primern iii und iii' amplifiziert. Sobald die Regionen α, β und δ amplifiziert sind, können sie sequenziert werden. In den dargestellten Ausführungsformen wird die Sequenzierung des Primers α dazu verwendet, das Segment A in der Region α zu sequenzieren, der Sequenzierungsprimer b wird dazu verwendet, das Segment B in der Region β zu sequenzieren, der mit Anhang versehene Sequenzierungsprimer d wird verwendet, das Segment B in der Region δ zu sequenzieren. Wie es in 1 durch die Formel "b > a + A" gezeigt ist, ist die Länge des Sequenzierungsprimers b größer als die kombinierte Länge des Sequenzierungsprimers a plus des Segments A. In ähnlicher Weise wie es in 1 durch die Formel "d > b + B" gezeigt ist, ist die Länge des Sequenzierungsprimers d größer als die kombinierte Länge des Sequenzierungsprimers b plus des Segments B. Eine schematische Darstellung eines Sequenzierungsgels 10 ist ebenfalls gezeigt, und zeigt die Fragmente, die aus der Sequenzierung der Region a als die Banden zwischen a und a + A gezeigt werden, wobei die Fragmente, die vom Sequenzieren der Region β erzeugt werden als die Banden zwischen b und b + B gezeigt sind, und die Fragmente, die aus dem Sequenzieren der Region δ erhalten werden als die Banden zwischen d und d + D gezeigt sind.
Verfahren zur Durchführung der PCR sind beispielsweise bei Innis et al. (Eds.) 1995 "PCR Strategies" Academic Press, Inc., San Diego und Erlich (Ed.) 1992, "PCR Technology", Oxford University Press, New York, beschrieben.
Im Allgemeinen tritt PCR-Amplifizierung in gepufferten wässrigen Lösungen auf, vorzugsweise beim pH 7–9, am meisten bevorzugt von ungefähr 8. Die Primerpaare werden in geeigneten Mengen (in einem geeigneten molaren Verhältnis zum Ziel zugegeben). Die Desoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden ebenfalls zum Synthesegemisch in geeigneten Mengen zugeben, und die entstehende Lösung wird auf ungefähr 85°C bis 100°C für ungefähr 1 bis 10 Minuten erhitzt, vorzugsweise von 1 bis 4 Minuten. Nach diesem Erhitzen wird die Reaktion abkühlen gelassen, im Allgemeinen bis ungefähr 20°C bis 40°C, d. h. zu einer Temperatur die für die Primerhybridisierung geeignet ist. Die Polymerisation wird in dem gekühlten Gemisch initiiert, typischerweise durch Zugabe eines Enzyms wie DNA-Polymerase. Geeignete Enzyme für diesen Zweck können in speziellen Ausführungsformen beispielsweise E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, T₄DNA-Polymerase oder andere DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase oder andere Enzyme umfassend hitzestabile Enzyme umfassen, die eine Kombination der Desoxyribonukleosidtriphosphate in der geeigneten Weise erleichtern zur Bildung von Primerverlängerungsprodukten, die zu jedem Nukleinsäurestrangtemplat komplementär sind. Im Allgemeinen wird die Synthese am 3'-Ende des Primers initiiert und verläuft entlang des Templatstrangs bis die Synthese beendet wird. Die neu synthetisierten komplementären Stränge bilden die Template, die in dem nachfolgenden Schritt des Amplifizierungsverfahrens verwendet werden. Beim nächsten Schritt werden die komplementären Stränge wie vorstehend beschrieben getrennt, um einzelsträngige Moleküle bereitzustellen, an die Primer für die Strangverlängerung hybridisiert werden. Die Schritte der Strangtrennung und der Verlängerung können so oft wie notwendig zur Herstellung der gewünschten Menge der Ziel nukleinsäuresequenzen wiederholt werden. Die Menge der Zielnukleinsäuresequenz, die so hergestellt wird, wird dadurch exponentiell zunehmen.
Geeignete Bedingungen zur Amplifizierung können von einem Durchschnittsfachmann gemäß bekannter Techniken aufgestellt werden. Beispielsweise können geeignete Bedingungen in einigen Ausführungsformen folgendes umfassen: 0,2 mM dNTP, 2,2 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9,0, 0,1% Triton X-100.
Geeignete Amplifizierungsprimer können für eine besondere Analyse gemäß der Erfindung ausgewählt werden und unter Verwendung von an sich bekannten Kriterien, wie die Kriterien, die in den allgemeinen Amplifizierungsliteraturstellen, die vorstehend erwähnt wurden, aufgeführt sind. Für eine PCR-Amplifizierung, sind die Primer im Allgemeinen so ausgelegt, dass die Position, bei der jeder Primer entlang einer Zielduplexsequenz hybridisiert, derart ist, dass ein Verlängerungsprodukt, das von einem Primer synthetisiert wurde, als Templat für die Verlängerung des anderen Primers dient, wenn es von dem Templat getrennt wurde. Typischerweise beträgt die Länge der Amplifizierungsprimer ungefähr 10 bis 30 Nukleotide, typischerweise 14 bis ungefähr 24 Nukleotide. Bei "zyklisch sequenzierenden" Reaktionen und "Step-up" Amplifizierungsreaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung, kann es jedoch bevorzugt sein, längere Primer zu verwenden.
Alternative Verfahren zur Amplifizierung von Sequenzen können ebenfalls gemäß verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können geeignete Verfahren von einem Durchschnittsfachmann aus folgenden Techniken angepasst werden: Strangverdrängungs-Amplifizierung (siehe beispielsweise Persing et al. (Eds). "Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications", American Society for Mikrobiology, Washington, D. C.); The Ligase Chain Reaction (siehe z. B. Wu (1989) Genomics 4: 560, oder Landegrin (1988) Science 241: 1077, oder Barringer (1990) Gene 89: 117); transkriptionsbasierte Amplifizierung (siehe z. B. Kwoh Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989)); selbsterhaltende Sequenzreplikation (siehe Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874); Q Beta Replikaseamplifizierung; oder andere RNA-Polymerase vermittelte Techniken (beispielsweise NASBA, Cangene Corporation, Mississauga, Ontario). Alternative Literaturstellen, die für den Durchschnittsfachmann zur Durchführung derartiger erfin dungsgemäßer Verfahren nützlich sein können, sind wie folgt: Berger und Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology 152: 307–316, Academic Press, Inc., San Diego, California USA; Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2. Ed.), Vol 1 bis 3, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Press, New York.
Die Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Quellen zur Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine Vielzahl von bekannten Mitteln oder Äquivalenten dazu oder Verbesserungen davon durchgeführt werden. Beispielsweise sind Verfahren bei Rothbart et al. (1989), "PCR Technology" Stockton Press, New York und Han et al. (1987) Biochemistry 26: 1617–1625 beschrieben. Im Handel erhältliche Kits können ebenfalls in bequemer Weise für diese Zwecke verwendet werden, gemäß den Anleitungen die von ihren Herstellern zur Verfügung gestellt werden, derartige Kits sind beispielsweise von den folgenden Herstellern erhältlich: Invitrogen, San Diego, California USA; Strategene, La Jolla, California, USA.
In alternativen Ausführungsformen wie sie in 3 gezeigt sind, verwendet die Erfindung ein "Step-up"-Amplifizierungsprotokoll zur Vergrößerung der Länge der Region, die einer Sequenzanalyse unterzogen wird. Diese Step-up-Amplifizierung ist zur Herstellung einer synthetisierten Region durch sukzessive Iterationen der Amplifizierung von Nutzen, wie sie als s und s' in 3 gezeigt ist, das heißt an einem (wie dargestellt) oder an beiden (nicht dargestellt) Enden der geomischen Region von Interesse, dargestellt als F, F', F'' und F''' in 3, und dargestellt als 1 PCR, 2 PCR und 3 PCR. Die lineare Darstellung des zu amplifizierenden Moleküls wird durch eine eine Linie in 3 aus Gründen der Einfachheit dargestellt, in der Praxis würde ein doppelsträngiges Molekül im allgemeinen das Substrat für die Amplifizierung sein wie es im Falle einer Standard-PCR-Reaktion der Fall ist. Wie in 3 gezeigt, verwendet die erste Amplifizierungsrunde die Primer v und v' zur Herstellung von Polynukleotiden, die aus der Region F' bestehen. Die zweite Amplifizierungsrunde (gezeigt als 2 PCR in 3) verwendet Sequenzprimer vi und v' zur Herstellung von Polynukleotiden, die die Region F'' umfassen und die neu synthetisierte Region s, die der Region des vi Primers entspricht, die nicht zu der F'-Region komplementär ist. Die dritte Runde der Amplifizierung, 3 PCR, verwendet PCR-Primer viii und v' zur Herstellung von Polynukleotiden, die die Region F'' und die synthetische Region s' umfassen, die zu den Amplifizierungsprimern vi und vii Regionen bestehen. Die Step-up-Amplifizierung kann dazu verwendet werden, synthetische Regionen an einem Ende der Region von Interesse zu erzeugen, wie es in 3 dargestellt ist oder an beiden Enden mit den geeigneten Adaptionen des Verfahrens wie es in 3 gezeigt wird. Die Verwendung einer Step-up-Amplifizierung zur Herstellung von einer oder mehrerer synthetischer Regionen s für die Hybridisierung an einen Sequenzprimer f kann als Alternative zur Verwendung von "mit einem Anhang versehenen" Sequenzprimern sein, wie beispielsweise d, oder wo die Sequenz der genomischen Region 5' oder 3' an Regionen von Interesse, wie 3' an F in 3 nicht bekannt ist. Die Step-up-Amplifizierung an beiden Enden der Region erleichtert die Verwendung der Amplifizierungsprimerpaare mit sequenziell sich erhöhender T_ms.
In einer Ausführungsform, kann eine Step-up-Amplifizierung eines Teils des BVDV-Genoms (Sequenzen 6941 bis 7255 des BVDV-Genoms) unter Verwendung der folgenden Amplifizierungsprimersets durchgeführt werden. In einer Ausführungsform, kann "zyklisches Sequenzieren" (simultane Amplifizierungs- und Sequenzierungsreaktion, d. h. die Amplifizierung in Gegenwart einer ddNTP und einem markierten Primer) durchgeführt werden unter Verwendung von einem Mitglied des Primer Sets 3 als einem markierten Sequenzprimer:
Primer Set 1

5'-GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3'
(komplementär zu den Sequenzen 6941–6961 des BVDV-Genoms und analog zum Amplifizierungsprimer v in 3).
5'-CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3'
(komplementär zu den Sequenzen 7255–7245 des BVDV-Genoms).

Primer Set 2:

5'-(dG)₃₀GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3'
(analog zum Amplifizierungsprimer vi in 3).
5'-(dG)₃₀CGG GAC CTG GAC TTC ATA GG-3'

Primer Set 3:

5'-(dA)₃₀(dG)₃₀GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3'
(analog zum Amplifizierungsprimer vii in 3).
5'-(dA)₃₀(dG)₃₀CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3'

In einem weiteren Aspekt der Erfindung, sind die Step-up-Amplifizierungsprimer so ausgewählt, dass der Schmelzpunkt des verwendeten Primers bei jeder aufeinanderfolgenden Amplifizierung höher ist als in der vorhergehenden Amplifizierung. Das Primerpaar mit der niedrigsten T_ms kann zuerst zugegeben werden und Primerpaare mit der höheren T_ms können nacheinander zugegeben werden. Damit kann jede Verlängerungsreaktion bei einer ausreichend hohen Temperatur durchgeführt werden, um zu verhindern, dass der Primer der in der vorhergehenden Amplifizierungsreaktion verwendet wurde, bindet. Dies ermöglicht die Durchführung von aufeinanderfolgenden Step-up-Amplifizierungsreaktionen, ohne einen Zwischenschritt der Entfernung der Amplifizierungsprimer von früheren Amplifizierungsreaktionen und ermöglicht weiter das Sicherzustellen, dass die Amplifizierung bei jedem Schritt nur mit dem kürzesten zugegebenen Amplifkationsprimer durchgeführt wird. Beispielsweise betragen die Schmelzpunkte in 3 der Primer in der Reihenfolge v < vi < vii.
In einer anderen alternativen Ausführungsform, kann jeder der nachfolgenden Step-up-Amplifizierungsprimer zu Beginn der Amplifizierungsreaktion zugegeben werden, wobei der zweite und die nachfolgenden Primer in Materialien wie Wachs mit zunehmenden Schmelztemperaturen eingekapselt sind. Sobald es erwünscht ist, den nächsten der Primer freizusetzen, kann die Temperatur des Reaktionsgemischs auf die nächsthöheren Temperatur erhöht werden, bei der der Primer freigesetzt wird. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit der Zugabe von aufeinanderfolgenden Primern in das Reaktionsgemisch während der Amplifizierung.
In einem Aspekt der Erfindung, können ein oder mehrere der Sequenzierungsprimer Regionen umfassen, die nicht homolog zu der Region sind, die von diesen Primer sequenziert wird. Primer dieser Art sind als "mit Anhang" versehene Sequenzprimer bekannt. Die nicht homologen Regionen eines Primers mit einem Anhang können an dem 5'-Ende des Primers lokalisiert sein, so dass das homologe 3'-Ende des Primers an die Region von Interesse bindet um die Polymerisation zu primen, wie es in 1 für den Sequenzprimer d gezeigt ist. In alternativen Ausführungsformen kann der nicht homologe Teil des Primers mit Anhang zwischen dem 3'-Ende des Primers der homolog zur Region von Interesse ist und einer 5'-Region des Primers mit Anhang, der ebenfalls homolog zur Region von Interesse ist, gelegen sein. Jede Anordnung von nicht homologen Sequenzen in einem Primer mit Anhang kann dafür geeignet sein (was natürlich selbstverständlich nicht passende Segmente zur Folge hat, die nicht wirklich einen "Anhang" formen), vorausgesetzt, dass der Primer in der Lage bleibt, die Polymerisation der Region von Interesse zu initiieren. Die Gegenwart von nicht homologen Sequenzen in dem mit einem Anhang versehenen Primer wird eine Auswirkung auf die Schmelztemperatur haben und damit auch auf die Bedingungen unter denen die Sequenzierungsreaktion durchgeführt wird, wie es gemäß den allgemein bekannten Sequenzierungsprimerhybridisationsparametern bestimmt wird.
Die Verwendung der Sequenzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann zweckmäßigerweise mit Nukleinsäureamplifizierungstechniken kombiniert werden, um das Auftauchen von falschpositiven Resultaten aus den Amplifkationsreaktionen zu reduzieren. Beispielsweise kann eine PCR (bei der davor eine reverse Transkription für RNA-Viren durchgeführt wird, das heißt die Herstellung einer cDNA-Kopie unter Verwendung eines RNA-Moleküls als Templat und eines Oligonukleotids als Primer, was auch als "RT PCR" bekürzt werden kann) verwendet werden, um das Vorhandensein einer Zielnukleinsäure in einer Probe nachzuweisen, wie beispielsweise eine virale Nukleinsäure. Dieser Ansatz hat den anerkannten Vorteil, sehr kleine Mengen der Zielnukleinsäure nachweisen zu können. Jedoch kann die Amplifizierungsreaktion falsche positiver Resultate erzeugen, wenn Zielnukleinsäuren irrtümlicherweise amplifiziert werden. Die Zuverlässigkeit des Amplifizierungsassay kann erhöht werden, indem mehr als ein Target einer Nukleinsäure von Interesse amplifiziert wird, wie beispielsweise zwei Regionen des viralen Genoms, wobei eine dieser Verfahren als Multiplex-PCR bekannt ist. Jedoch können falsche positive Resultate noch im Falle von nichtspezifischer Amplifkation von mehr als einer Region vorkommen. Die Sequenzierungsmethoden der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, das Auftauchen von derartigen falschpositiven Resultaten nachzuweisen, indem ein Teil oder die gesamte Sequenz der amplifizierten Region zur Verfügung gestellt wird. Die Sequenzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung sind demgemäß spezifisch dahingehend ausgelegt, dass sie wenigstens auf zwei nicht homologen Regionen gleichzeitig durchgeführt werden, unter Verwendung einer einzigen Sequenzierungsreaktion.
Die Sequenzdaten, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werden, können nützlich sein, um Informationen über den Subtyp eines Organismus zu liefern. Beispielsweise kann die Gegenwart einer Zielnukleinsäure eines Organismus in einer Probe durch eine positive Amplifizierungsreaktion angezeigt werden und die Verlässlichkeit dieses Nachweises kann durch eine Sequenzierung gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Die so erzeugte Sequenzinformation kann von einem Subtyp des Zielorganismus zu einem anderen variieren. Beispielsweise zeigen virale Nukleinsäuren oft eine bedeutende Variabilität von einem Strang zu einem anderen, insbesondere RNA-Viren wie HIV. Die Amplifizierungsprimer können zum Nachweis einer großen Menge derartiger Stränge ausgewählt sein, indem Primer, die homolog zu den Sequenzen sind, die im allgemeinen unter allen Strängen des Organismus konserviert sind, ausgewählt werden. Die Variation zwischen den Strängen kann anschließend getestet werden, indem die Sequenzdaten, die gemäß der Erfindung erzeugt wurden, beurteilt werden.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel offenbart einen Aspekt der vorliegenden Erfindung, der nützlich für den Nachweis des Virus der Bovinen Virusdiarrhöe (BVDV) ist. Die Verfahren dieses Beispiels können für den Nachweis und die Differenzierung von Nukleinsäuren anderer Organismen, wie anderen RNA-Viren angepasst werden.
In diesem Beispiel wird ein Zweifarbstoffsystem für die Sequenzanalyse verwendet. Bei diesem System werden zwei Laser verwendet, um die markierten Produkte der Sequenzierungsreaktion nachzuweisen. Ein Laser regt bei einer Wellenlänge von 700 nm an und der andere bei 800 nm. Die Sequenzierungsreaktionsprimer sind mit zwei verschiedenen, in nahen infraroten Bereich fluoreszierenden Farbstoffen markiert (wie diese die von LI-COR Inc. of Lincoln, Nebraska, USA erhältlich sind), von denen der eine bei einer Belichtung durch den 700 nm Laser reagiert und dieser Farbstoff als IRD700 bezeichnet wird, und der andere Farbstoff bei einem 800 nm Laser antwortet und als IRD800 bezeichnet wird. Unter Verwendung dieses Systems, können zwei verschiedene DNA-Fragmente der gleichen molekularen Größe, die durch verschiedene Sequenzierungsreaktionen hergestellt werden und daher auch mit verschiedenen Farbstoffen markiert sind, durch ihre Emissionen unter Laserbestrahlung bei verschiedenen Wellenlängen unterschieden werden. Farbstoffmarkierte DNA-Fragmente können automatisch während der Elektrophorese mit einem Rasterfluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. Die zwei Primersets, die in diesem Beispiel verwendet werden sind:
Primer Set 1

[markierter IRD700] 5'GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG
(der zu einem ersten Strang des BVDV-Genoms an den Positionen 6941–6961 hybridisiert)
[markierter IRD800] 5'000 GAC CTG GAC TTC ATA GC
(der zu einem Komplementärstrang des BVDV-Genoms an den Positionen 7255–7245 hybridisiert)

Der Primer Set 1 amplifiziert eine Region von 314 Basenpaaren, d. h von Position 6941 bis Position 7255.
Primer Set 2

[markierter IRD700] 5'(dG)₃₀₀ AGG CTA GCC ATG CCC TTA GT
(der an das BVDV-Genom an Positionen 99 bis 118 hybridisiert).
[markierter IRD700] 5'(dG)₃₀₀ TCT GCA GCA CCC TAT CAG G
(der an einen Komplementärstrang des BVDV-Genoms an Positonen 324–342 hybridisiert).

Das Primer Set 2 amplifiziert eine Region von 243 Basenpaaren, d. h. von Position 99 bis Position 342 und eine synthetische Sequenz von 300 bp an jedem Ende bei einer Gesamtlänge des gesamten Fragments von 843.
In diesem Beispiel wird die Genomanalyse wie folgt durchgeführt:
1. Herstellung von Gesamt-RNA
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des TRIZOL^TM Reagens und der Verfahren, die für seine Verwendung vom Hersteller, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, USA empfohlen wurden, extrahiert. Alternativ dazu kann eine ganze RNA durch jede einem Fachmann geeignete Methode, hergestellt werden (ein alternatives Kit ist das RNA-Isolationskit das von Stratagene Corp., La Jolla, CA, USA erhältlich ist, siehe ebenfalls Chomczynski, et al. (1987) Analytical Biochemistry 162, 156. "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction."). Ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform ist wie folgt:

a. 250 μl Zellsuspension wurde zu 750 μl Trizolreagens zugegeben.
b. Belassen bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
c. 200 μl Chloroform wurden zugegeben und für 15 Sekunden gut gemischt.
d. Das Gemisch wurde bei 12800 rpm bei +4°C während 10 Minuten zentrifugiert.
e. Die obere wässrige Lage wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen transferiert.
f. 500 μl Isopropanol wurden zugegeben und damit vermischt.
g. Belassen bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
h. Die Gemisch wurde bei 12800 rpm bei +4°C während 10 Minuten zentrifugiert.
i. Das Überstehende wurde entfernt und es wurden 200 μl 85% Alkohol zugegeben.
j. Die Gemisch wurde bei 12800 rpm bei +4°C während 10 Minuten zentrifugiert.
k. Das Überstehende wurde entfernt und die Röhrchen wurden an Luft getrocknet.
l. Die gesamte RNA wurde in 20 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser suspendiert.

2. Herstellung von cDNA
cDNA kann aus isolierter RNA gemäß aus dem Stand der Technik gut bekannter Methoden isoliert werden. Eine Ausführungsform ist wie folgt:

a. Die nachfolgenden Bestandteile wurden in einem 1,5 ml Zentrifugierröhrchen gemischt: Gesamt RNA 1 μg 2 μl; Abwärtsprimer (10 pM/ml) 2 μl; Wasser 8 μl.
b. Das Gemisch wurde auf 70°C während 10 Minuten erhitzt.
c. Zum erhitzten Gemisch wurde das nachfolgende zugegeben: 5 × 1st Strangsynthesepuffer 4 μl; dNTP (10 mM) 1 μl 0,1 MDTT 2 μl;
d. Das Gemisch wurde auf 42°C für 2 Minuten erhitzt.
e. 1 μl SUPERSCRIPT II (eine reverse Transkriptase die von Life Technologies, Inc., Gaitherburg, Maryland, USA erhältlich ist) wurde zum vorstehenden Gemisch zugegeben.
f. Inkubieren bei 42°C für 50 Minuten.
g. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 70°C während 10 Minuten gestoppt.

3. Amplifizierung spezifischer Regionen
Die Amplifizierung von cDNA kann durch jegliche geeignete Methode, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, durchgeführt werden. In der Ausführungsform dieses Beispiels war das Verfahren wie folgt:
Unter Verwendung von 2 μl des reversen Transkriptionsgemisches wurden zwei Regionen der cDNA auf einen GeneAmp^TM 2400 Thermocycler unter Verwendung der in diesem Beispiel nachgewiesenen Primerpaare gemäß den Verfahren, die vom Hersteller, Perkin Elmer Corporation, angegeben sind amplifiziert:

a. Die Reaktion wurde in 20 μl Reaktionsgemisch wie folgt durchgeführt: dH₂O 16,0 μl Templat 2,0 μl
b. Das Gemisch wurde auf 95°C für 10 Minuten erhitzt.
c. Der Mastermix wurde wie folgt hergestellt: Primer 1 (10 pmol/μl) 5 μl Primer 2 (10 pmol/μl) 5 μl dNTP (10 mM) 2,5 μl 10 × Puffer 2,5 μl MgCl₂ 25 mM 7,5 μl Tag 5 U/μl 2,5 μl 7,0 μl Mastermix wurden zugegeben.
d. Die PCR kann in einem GeneAmp^TM 2400 Thermocycler (Perkin-Eimer Corporation) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.

4. Reinigung von PCR-Produkten
Optional kann zur Trennung der Amplifizierungsprodukte von den nicht reagierten Primern Gelfiltration verwendet werden. In diesem Beispiel wird das amplifizierte Material unter Verwendung von Sephadex^TM G-50 Gelfiltrationsmedium (erhältich von Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) gereinigt. Andere aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren können ebenfalls zur Reinigung der Amplifizierungsprodukte verwendet werden oder dieser Schritt kann auch ausgelassen werden.
5. Sequenzierung
Die amplifizierten Segmente können unter Verwendung von markierten (fluoreszenten) Primer Sets 1 und 2 für die bidirektionale multilocicycische Sequenzierung zyklisch sequenziert werden. Bei jedem Set von Primern wird ein Primer mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der bei 700 nm absorbiert, und der andere Primer wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, der bei 800 nm absorbiert. In dieser Ausführungsform wurde nur ein Didesoxynukleotid verwendet (Einzeltraktsequenzierung). Alternativ dazu, können vier Röhrchen hergestellt werden, wobei jedes von ihnen eine der vier möglichen Desdioxynukleotide enthält, damit eine volle Sequenz erhalten werden kann.
Die zyklisch sequenzierten Produkte werden auf einem 0,25 mm dicken 6% Polyacrylamidgel bei 1500 Volt auf einem automatisierten Sequenzer (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA) getrennt.
Die Einzeltaktsequenz kann unter Verwendung geeigneter Computersoftware analysiert werden, und mit einer BVDV DNA-Subtypen Datenbank verglichen werden. Diese Analyse kann dazu verwendet werden, den Subtyp von BVDV in der Probe zu identifizieren.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel ermöglicht die Analyse an vier Regionen des BVDV-Genoms unter Verwendung von Primern mit verschiedenen Molekulargewichten und verschiedenen fluoreszenten Markern. Bei dieser Ausführungsform, wird ein Zweifarbstoffsequenzierungssystem, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde verwendet, um die mitlaufenden Sequenzierungreaktionsprodukte von den Primer Sets 1 und 2 aufzulösen und die mitlaufenden Sequenzierungsreaktionsprodukte von den Primer Sets 3 und 4 aufzulösen, während die Verlängerungsprodukte aus beiden Sets 1 und 2 durch ihr Molekulargewicht von den Verlängerungsprodukten der Primer Sets 3 und 4 aufgelöst werden. In diesem Beispiel werden die folgenden Primer verwendet:
Primer Set 1

[markierter IRD 700) 5' GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG
(das an den ersten Strang des BVDV-Genoms an Positionen 6941–6961 hybridisiert)
[nicht markiertes] 5' CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC
(das an den komplementären Strang des BVDV-Genoms an den Positionen 7255–7245 hybridisiert)

Primer Set 1 amplifiziert eine Region von 314 Basenpaaren, d. h. von der Position 6941 an die Position 7255.
Primer Set 2

[markierter IRD 800] 5' AGG CTA GCC ATG CCC TTA GT
(das an das BVDV-Genom an den Positionen 99–118 hybridisiert)
[nicht markiert] 5' TCT GCA GCA CCC TAT CAG G
(das an den komplementären Strang des BVDV-Genoms an Positionen 7255–7245 hybridisiert)

Primer Set 2 amplifiziert eine Region von 243 Basenpaaren, d. h. von der Position 99 bis zur Position 342.
Mit Anhang versehenes Primer Set 3

[markierter IRD 700] 5'(dG)₃₀₀GCA GAT TTT GAA GAA AGA CA
(das an das BVDV-Genom an den Positionen 4937–460 hybridisiert)
[nicht markiert] 5'(dG)₃₀₀ TTG GTG TGT GTA AGC CCA
(das an den komplementären Strang des BVDV-Genoms an Positionen 5591–5609 hybridisiert)

Mit Anhang versehenes Primer Set 4

[markierter IRD 800] 5'(dG)₃₀₀ ACG TGG ACG AGG GCA TGC CC
(das an das BVDV-Genom an den Positionen 234–253 hybridisiert)
[nicht markiert] 5'(dG)₃₀₀ TGT GCC ATG TAC AGC AGA GA
(das an den komplementären Strang des BVDV-Genoms an den Positionen 365–384 hybridisiert)

Die Genomanalyse kann unter Verwendung bekannter Methoden gemäß den ähnlichen Verfahren die in Beispiel 1 offenbart sind oder mit bekannten Alternativen zu diesen Verfahren durchgeführt werden.

Claims

Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure, umfassend a. das Bereitstellen von ersten und zweiten Nukleinsäurezielsequenzen in einem Reaktionsgemisch, b. das Bereitstellen von ersten und zweiten markierten Sequenzierungsprimern, die an die ersten beziehungsweise zweiten Nukleinsäurezielsequenzen hybridisierbar sind, in dem Reaktionsgemisch, wobei der zweite Sequenzierungsprimer mindestens so lang wie die Gesamtlänge des ersten Sequenzierungsprimers zuzüglich der Länge der ersten Zielsequenz ist, c. das Bereitstellen von einer DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosiden, einem Ketten-terminierenden Desoxyribonukleotid und Bedingungen, die eine Verdopplung der ersten und zweiten Zielsequenzen durch die Polymerase ermöglichen, um durch eine Verlängerung ausgehend von den ersten beziehungsweise zweiten Sequenzierungsprimern fortzufahren, in dem Reaktionsgemisch, wobei das periodische Einbauen des Kettenterminierenden Nukleotids durch die Polymerase die Polymerisation beendet, um einen Pool von Primerverlängerungsprodukten verschiedener Länge zu erzeugen, wobei jedes der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool, das mit dem zweiten Sequenzierungsprimer beginnt, länger ist als die Primerverlängerungsprodukte in dem Pool, die mit dem ersten Sequenzierungsprimer beginnen, und d. das Nachweisen der Längen der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter den Schritt des Amplifizierens der ersten und zweiten Nukleinsäurezielsequenzen unter Verwendung einer Amplifikationsreaktion umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikationsreaktion eine Polymerasekettenreaktion ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikationsreaktion a. das Bereitstellen von ersten und zweiten doppelsträngigen zu amplifizierenden Nukleinsäureregionen in dem Reaktionsgemisch, wobei jede komplementäre Stränge umfaßt, die entgegengesetzte 3'-Enden aufweisen, welche die zu amplifizierende Region definieren, b. das Bereitstellen von einem ersten Amplifikationsprimerpaar in dem Reaktionsgemisch, wobei ein Element des ersten Amplifikationsprimerpaars an jedes der 3'-Enden der komplementären Stränge der ersten zu amplifizierenden Region hybridisierbar ist, wobei die erste zu amplifizierende Region die erste Nukleinsäurezielsequenz umfaßt, c. das Bereitstellen von einem zweiten Amplifikationsprimerpaar in dem Reaktionsgemisch, wobei ein Element des zweiten Amplifikationsprimerpaars an jedes der 3'-Enden der komplementären Stränge der zweiten zu amplifizierenden Region hybridisierbar ist, wobei die zweite zu amplifizierende Region die zweite Nukleinsäurezielsequenz umfaßt, d. das Bereitstellen von einer DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphaten und Bedingungen, die eine Verdopplung der ersten und zweiten zu amplifizierenden Regionen durch die DNA-Polymerase ermög lichen, um durch eine Verlängerung ausgehend von den ersten beziehungsweise zweiten Amplifikationsprimerpaaren fortzufahren, in dem Reaktionsgemisch, e. das Amplifizieren von Nukleinsäureregionen durch Zyklisieren des Reaktionsgemisches zwischen einer ersten Temperatur, bei der die komplementären Stränge der zu amplifizierenden Region schmelzen, und einer zweiten Temperatur, bei der die Amplifikationsprimer an die 3'-Enden der komplementären Stränge der zu amplifizierenden Region binden, und bei der die Polymerase die Verdopplung der ersten und zweiten zu amplifizierenden Regionen durch eine Verlängerung ausgehend von den ersten beziehungsweise zweiten Amplifikationsprimerpaaren katalysiert, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4, welches weiter eine zyklische Sequenzierungsreaktion umfaßt, worin ein Element der ersten und zweiten Amplifikationsprimerpaare jeweils das gleiche wie die ersten und zweiten markierten Sequenzierungsprimer ist.
Verfahren nach Anspruch 4, welches weiter den Schritt der Verlängerung einer Sequenz während der Amplifikation umfaßt, worin ein Element des ersten Amplifikationsprimerpaars Sequenzen, die hybridisierbar sind, und zusätzliche Sequenzen, die an das 3'-Ende von einem der komplementären Stränge der ersten zu amplifizierenden Region nicht hybridisierbar sind, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiter den Schritt des Auftrennens der Sequenzen in dem Pool nach der Länge durch eine Gelelektrophorese umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Zielnukleinsäuresequenzen auf verschiedenen Nukleinsäuremolekülen vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Reaktionsgemisch weiter a. eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz und b. ein zusätzlicher markierter Sequenzierungsprimer, der an die zusätzliche Zielsequenz hybridisierbar ist, wobei der zusätzliche Sequenzierungsprimer mindestens so lang ist wie die längste Sequenz in dem Pool der Primerverlängerungsprodukte, bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens einer der Sequenzierungsprimer ein mit einem Anhang versehener Sequenzierungsprimer ist, der einen Teil umfaßt, der nicht homolog zu den Zielnukleinsäuresequenzen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die nicht-homologen Teile des mit einem Anhang versehenen Sequenzierungsprimers 5' zu den Regionen des mit einem Anhang versehenen Sequenzierungsprimers angeordnet sind, die an die Zielsequenzen hybridisierbar sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Sequenzierungsterminator in dem Reaktionsgemisch bereitgestellt wird, um die maximale Länge der Primerverlängerungsprodukte von einer der Nukleinsäurezielsequenzen zu begrenzen.
Verfahren zum Verlängern einer Sequenz während einer Amplifikation, umfassend a. das Bereitstellen von einer doppelsträngigen zu amplifizierenden Nukleinsäureregion mit ersten und zweiten komplementäre Strängen in einem Reaktionsgemisch, wobei die zu amplifizierende Region durch ein 3'-Ende an jedem der ersten und zweiten komplementären Stränge definiert ist, b. das Bereitstellen von einem ersten Amplifikationsprimer mit Sequenzen, die komplementär zum 3'-Ende des ersten komplementären Strangs sind, und mit zusätzlichen Sequenzen, die nicht komplementär zum 3'-Ende des ersten komplementären Strangs sind, in dem Reaktionsgemisch, c. das Bereitstellen von einem zweiten Amplifikationsprimer mit Sequenzen, die komplementär zum 3'-Ende des zweiten Strangs der Zielsequenz sind, in dem Reaktionsgemisch, d. das Bereitstellen von einer DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphaten und Bedingungen, die für die Polymerase geeignet sind, eine Verlängerung der Amplifikationsprimer zu katalysieren, in dem Reaktionsgemisch, e. die Amplifizierung und Verlängerung der zu amplifizierenden Region durch Zyklisieren des Reaktionsgemischs zwischen einer ersten Temperatur, bei der die komplementären Stränge der Zielnukleinsäuresequenz schmelzen, und einer zweiten Temperatur, bei der die Amplifikationsprimer an die 3'-Enden der komplementären Stränge binden und die Polymerase eine Verlängerung ausgehend von den Amplifikationsprimern katalysiert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die zu amplifizierende Region durch das Bereitstellen eines dritten Amplifikationsprimers mit Sequenzen, die komplementär zu den zusätzlichen Sequenzen in dem ersten Amplifikationsprimer sind, weiter amplifiziert und verlängert wird, wobei der dritte Amplifikationsprimer weiter ergänzende Sequenzen umfaßt, die nicht komplementär zu dem ersten Amplifikationsprimer oder zu der zu amplifizierenden Region sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die zusätzlichen Sequenzen des ersten Amplifikationsprimers 5' zu den zum Ziel komplementären Sequenzen auf dem ersten Amplifikationsprimer angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die ergänzenden Sequenzen auf dem dritten Amplifikationsprimer 5' zu den Sequenzen auf dem dritten Amplifikationsprimer angeordnet sind, die komplementär zu den zusätzlichen Sequenzen auf dem zweiten Amplifikationsprimer sind.
Verfahren zum Sequenzieren einer Nukleinsäure, umfassend a. das Bereitstellen von ersten und zweiten Nukleinsäurezielsequenzen in einem Reaktionsgemisch, b. das Bereitstellen von ersten und zweiten markierten Sequenzierungsprimern, die an die ersten beziehungsweise zweiten Nukleinsäurezielsequenzen hybridisierbar sind, in dem Reaktionsgemisch, wobei der zweite Sequenzierungsprimer ein scheinbares Molekulargewicht in der Gelelektrophorese aufweist, das mindestens so groß ist wie das scheinbare Molekulargewicht des ersten Sequenzierungsprimers, wenn der erste Sequenzierungsprimer unter Beinhalten der ersten Zielsequenz verlängert ist, c. das Bereitstellen von einer DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosiden, einem Ketten-terminierenden Desoxyribonukleosid und Bedingungen, die eine Verdopplung der ersten und zweiten Zielsequenzen durch die Polymerase ermöglichen, um durch eine Verlängerung ausgehend von den ersten beziehungsweise zweiten Sequenzierungsprimern fortzufahren, in dem Reaktionsgemisch, wobei das periodische Einbauen des Kettenterminierenden Nukleotids durch die Polymerase die Polymerisation beendet, um einen Pool von Primerverlängerungsprodukten verschiedener Länge zu erzeugen, wobei jedes der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool, das mit dem zweiten Sequenzierungsprimer beginnt, ein scheinbares Molekulargewicht in der Gelelektrophorese aufweist, das mindestens so groß ist wie das scheinbare Molekulargewicht der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool, die mit dem ersten Segenzierungsprimer beginnen, und d. das Nachweisen der scheinbaren Molekulargewichte der Primerverlängerungsprodukte in dem Pool.