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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Analyse spezifischer Nucleinsäuresequenzen,
die in DNA oder RNA enthaltenden Gengemischen zu erwarten sind,
und ist zur Gendiagnose im Bereich der klinischen Diagnostik nützlich.
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Zum
hochempfindlichen Nachweis von Nucleinsäuren kann die Amplifikation
von Ziel-Nucleinsäuren verwendet
werden. Ein bekanntes Verfahren zur Amplifikation von spezifischen
DNA-Sequenzen ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Notwendigkeit
der raschen Erhitzung und Abkühlung
in der PCR sind die Haupthindernisse, die einer kürzeren Reaktionszeit
und einer Automatisierung der PCR im Wege stehen. Auf der anderen
Seite sind als Verfahren zur isothermischen Nucleinsäureamplifikation
NASBA und 3SR bekannt, welche spezifische RNA-Sequenzen durch das Zusammenwirken einer
reversen Transkriptase und einer RNA-Polymerase amplifizieren. Diese Verfahren
schliessen die Kettenreaktion ein, welche umfasst: Die Synthese
einer doppelsträngigen
DNA mit einer Promotorsequenz von der Ziel-RNA als Matrize unter
Verwendung eines Primers mit einer Promotorsequenz, einer reversen
Transkriptase und von Ribonuclease H sowie die Synthese einer RNA
mit der spezifischen Basensequenz in der Ziel-RNA durch eine RNA-Polymerase,
welche sodann als Matrize für
die Synthese der oben genannten doppelsträngigen DNA mit der Promotorsequenz
verwendet wird. Diese Verfahren erlauben eine isothermische Amplifikation
und sind zu einem kontinuierlichen Ablauf sowie zur Automatisierung
geeignet.
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In
jedem Fall wird das Amplifikationsprodukt meist durch Auftrennungsverfahren
wie Elektrophorese oder andere bekannte, auf Hybridisierungsmethoden
basierende Verfahren des Nucleinsäurenachweises ermittelt. Insbesondere
werden zum selektiven Nachweis von Amplifikationsprodukten Hybridisierungsmethoden verwendet,
die eine Oligonucleotidsonde gebrauchen, die mit einer ein nachweisbares
Signal abgebenden Substanz markiert ist.
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Bei
den Hybridisierungsverfahren wird die als PCR- oder NASBA-Amplifikationsprodukt
gewonnene Nucleinsäure
meist nach der Trennung aus der Reaktionslösung mit der Oligonucleotidsonde
in Kontakt gebracht. Bei den Hybridisierungsverfahren, die eine
mit einem fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff (hierin manchmal
als Interkalator-markierte Sonde bezeichnet) markierte Oligonucleotidsonde
verwenden, kann PCR oder NASBA in Gegenwart der Oligonucleotidsonde
durchgeführt
werden, wobei der Unterschied in der Fluoreszenz der Reaktionslösung gemessen
wird. Die Interkalator-markierte Sonde ist ein Oligonucleotid mit einem
fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff, der über einen
Linker mit einem Phosphoratom im Oligonucleotid verknüpft ist.
Sie verändert
ihre Fluoreszenz, wenn sie mit der Ziel-Nucleinsäure ein komplementäres Duplexmolekül bildet,
indem die Interkalatoreinheit in das Duplexmolekül interkaliert. Dies ermöglicht es,
die Ziel-Nucleinsäure
ohne Auftrennungsverfahren nachzuweisen (Ishiguro, et al. (1996)
Nucleic Acids Res. 24 (24): 4992–4997). Demnach ermöglicht die
Kombination einer fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoff-markierten
Sonde mit dem oben erwähnten
Verfahren zur Amplifizierung spezifischer RNA-Sequenzen die selektive
Messung des Amplifikationsprodukts ohne Auftrennungsanalyse des
Amplifikationsprodukts oder Erhitzen und Abkühlen.
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Die
Kombination einer mit Interkalator markierten Sonde mit dem oben
erwähnten
Verfahren zur Amplifizierung spezifischer RNA-Sequenzen liefert
ein Testsystem, das zur Automatisierung geeignet ist. Es treten jedoch
gewisse Probleme auf, die zum gleichzeitigen Nachweis von zwei oder
mehreren Nucleinsäuren
behoben werden müssen.
Es gibt in anderen Worten Probleme hinsichtlich der Schwierigkeit,
aus einer großen
Vielzahl fluoreszierender, interkalierender Farbstoffe, die als
Marker erhältlich
sind, diejenigen fluoreszierenden, interkalierenden Farbstoffe auszuwählen, die
gleichzeitig voneinander unterscheidbar nachgewiesen werden können, und
es besteht die Notwendigkeit einer multispektralen Fluoreszenzmessung,
in manchen Fällen
bei mehr als einer Exzitations-Wellenlänge, was die Verfügbarkeit
von Messgeräten,
wenn es überhaupt
solche gibt, auf komplizierte und teuere beschränkt. Daneben tritt beim gleichzeitigen
Nachweis von mindestens drei Nucleinsäuren ein weiteres Problem auf,
da es nämlich
sehr zeitaufwändig
ist, mindestens drei interkalatormarkierte Sonden durch Verknüpfen von
mindestens drei vorläufig
ausgewählten
und einzeln von einander unterscheidbaren fluoreszierenden interkalierenden
Farbstoffen mit Oligonucleotiden herzustellen. Das Fehlen der raschen Anpassung
an die Zunahme von nachzuweisenden Nucleinsäuren stellt während des
tatsächlichen
Ablaufs ein weiteres Problem dar.
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Es
gibt einige Möglichkeiten,
die oben genannten Schwierigkeiten mit einem fluoreszierenden interkalierenden
Farbstoff zu umgehen. Es ist beispielsweise möglich, zwei oder mehr Nucleinsäuren mit
einem einzigen fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff nachzuweisen,
indem genauso viele Ansätze
(Gefäße) an Reaktionslösung hergestellt
werden wie nachzuweisende Nucleinsäuren vorhanden sind, und Interkalator-markierte
Sonden mit Oligonucloetiden, die zu den nachzuweisenden Nucleinsäuren komplimentär sind, zugegeben
werden. Sollen zwei oder mehr Nucleinsäuren in einer Probe nachgewiesen
werden, so zieht in diesem Fall allerdings die Notwendigkeit, wenigstens
genauso viele Ansätze
an Reaktionslösung
herzustellen wie Nucleinsäuren
nachzuweisen sind, einen höheren
Kostenaufwand und dergleichen nach sich, wie zum Beispiel eine hohe
Anforderung an die Durchlaufkapazität der Amplifikations- und Nachweisegeräte. Darüber hinaus
führt die
Notwendigkeit, zwei oder mehr Reaktionslösungen herzustellen, zu einem
erhöhten
Bedarf an Probenmenge, die zum Nachweis verwendet wird.
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WO 00/18965 offenbart ein
Verfahren zum Nachweis zweier Nucleinsäuren in einer Probe (d.h. an
Positionen, die C282Y oder H63D in den Hämochromatose-Genen entsprechen)
(Beispiel 8,
20), das umfasst (1)
das Hinzufügen
mehrerer Nucleinsäuresonden,
die komplementär
zu den entsprechenden Nucleinsäuren
sind, und die mit der gleichen fluoreszierenden Substanz markiert
sind, zu der Probe, (2) einen Schritt des Durchführens von Nucleinsäureamplifikation
(Multiplex-PCR-Reaktionen,
die zwei Primer-Paare umfassen, d.h. die Primer von SEQ ID Na: 16–18), und
(3) den gleichzeitigen Nachweis der entsprechenden Nucleinsäuren in
einem Gefäß auf der
Basis der unterschiedlichen Tm-Werte der Duplexmoleküle.
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Dementsprechen
besteht ein Bedarf an einem Nachweisverfahren, welches die oben
erwähnten
Probleme nicht aufweist, auch wenn nur ein fluoreszierender interkalierender
Farbstoff verwendet wird.
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Die
vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis
von mindestens zwei Ziel-Nucleinsäuren in einem Gefäß bei einer
einzigen fluoreszierenden Wellenlänge. Namentlich liefert die
Erfindung, wie unter Anspruch 1 definiert, ein Verfahren zum Nachweis
von mindestens zwei Nucleinsäuren
in einer Probe, das umfasst (1) einen Schritt des Hinzufügens mehrerer
Nucleinsäuresonden,
die komplementär zu
den entsprechenden Nucleinsäuren
sind und die mit der gleichen fluoreszierenden Substanz markiert
sind, zu der Probe, (2) einen Schritt des Durchführens isothermischer Nucleinsäureamplifikation
unter Bedingungen, die eine Kettenreaktion erlauben, die die Synthese
von doppelsträngigen
DNAs mit Promotorsequenzen am Ende unter Verwendung der Nucleinsäuren als
Matrizen, die Transkription der doppelsträngigen DNAs in RNA-Transkripte
und die Synthese der doppelsträngigen
DNAs unter Verwendung der sich ergebenden RNA-Transkripte umfasst,
(3) Ermöglichen,
dass die sich ergebenden RNA-Transkripte mit den mehreren Nucleinsäuresonden
Duplexe ausbilden, und (4) das gleichzeitige Nachweisen der sich
ergebenden RNA-Transkripte in einem Gefäß, auf der Basis der unterschiedlichen
Tm-Werte der Duplexe,
wobei die mehreren Nucleinsäuresonden
so gestaltet sind, dass sie ihre Floureszenzintensitäten ändern, wenn
sie Duplexe mit den sich ergebenden Transkripten ausbilden.
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Die
Erfindung, wie unter Anspruch 2 definiert, liefert ein Verfahren
zum Nachweis von mindestens zwei Nucleinsäuren in einer Probe gemäß Anspruch
1, umfassend (1) einen Schritt des Messens der Fluoreszenzintensität, während die
Temperatur der Probe kontinuierlich geändert wird, und (2) einen Schritt
des gleichzeitigen Nachweisens der sich ergebenden RNA-Transkripte
durch das Ermitteln der Tm-Werte aus dem sich ergebenden Fluoreszenzprofil.
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Die
Erfindung, wie unter Anpruch 3 definiert, liefert die Erfindung
gemäß Anspruch
1 oder 2, wobei die mehreren Nucleinsäuresonden durch Verknüpfen eines
fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs über Linker an Oligonucleotide
hergestellt werden.
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1 stellt
die Fluoreszenz-Schmelzkurven dar, die durch Verändern der Temperaturen der
durch die getrennte Amplifikation der entsprechenden Standard-RNAs gewonnen RNAs
erhalten wurden (in Anwesenheit von interkalatormarkierten Sonden).
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2 stellt
die negative erste Ableitung der in 1 gezeigten
Fluoreszenz-Schmelzkurven
dar, wobei die Peaks (Tm-Werte) der negativen ersten Ableitung der
Fluoreszenzintensität(-dF/dT)
gekennzeichnet sind.
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3 stellt
die negative erste Ableitung der Fluoreszenz-Schmelzkurve dar, die
durch die Veränderung
der Temperaturen der Amplifikationsprodukte erhalten wurden, welche
durch die gleichzeitige Amplifikation der drei Standard-RNAs in
einem Röhrchen
gewonnen worden waren. Die Peaks (Tm-Werte) der negativen ersten
Ableitung der Fluoreszenzintensität(-dF/-dT) sind gekennzeichnet.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen beschrieben.
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Wie
in den Ansprüchen
ausgeführt,
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis
von mindestens zwei nachzuweisenden Nucleinsäuren (nachstehend als Ziel-Nucleinsäuren bezeichnet)
bereit, insbesondere ein Verfahren, das umfasst das Hinzufügen von
interkalatormarkierten Sonden, die komplementär zu den Ziel-Nucleinsäuren sind,
die Duplexe mit verschiedenen Tm-Werten ausbilden und den gleichen
fluoreszierenden Farbstoff, vorzugsweise den gleichen fluoreszierenden
interkalierenden Farbstoff, als den Marker aufweisen, zu einer einzigen
Reaktionslösung
(in einem einzigen Gefäß) und das
Messen der Fluoreszenzintensität,
während
die Temperatur geändert
wird.
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Es
ist allgemein bekannt, dass Hybriddoppelstränge von Nucleinsäuren in
Einzelstränge
denaturieren, wenn sie in einer Lösung erhitzt werden. Die Temperatur,
bei der 50% der Nucleinsäure-Doppelstränge in Einzelstränge zerfallen,
wird Tm genannt und ist ein Maß für die Stabilität der doppelsträngigen Nucleinsäure. Da man
weiss, dass der Tm-Wert von der Länge der komplementären Sequenz
des Hybrids und vom Guanin (G)- und Cytosin (C)-Gehalt der Sequenz
abhängt,
ist es möglich,
beliebige Sonden, die Duplexe mit verschiedenen Tm-Werten ausbilden,
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung masszuschneidern.
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Die
Sonden werden vorzugsweise so hergestellt, dass große Unterschiede
in den Tm-Werten sichergestellt sind. In der vorliegenden Erfindung
bedeutet "große Unterschiede", dass die entsprechenden
Tm-Werte von einander unterscheidbar sind, wenn die Temperatur auf
gleiche Weise und mit derselben Erhitzungsrate (die Geschwindigkeit,
mit der die Temperatur pro Zeiteinheit erhöht wird) geändert wird, wie sie in der
vorliegenden Erfindung angewendet werden. Im Allgemeinen genügt die Kombination
aus hochempfindlichem Detektor und gleichmäßigem langsamen Temperaturanstieg über einen
langen Zeitraum, um so geringfügige
Unterschiede im Tm-Wert wie etwa 3°C nachzuweisen, wie in den nachstehenden
Beispielen beschrieben wird. Im Gegensatz dazu ist es notwendig,
dass, wenn ein wenig empfindlicher Detektor verwendet wird, die
Temperatur periodisch geändert
wird (zum Beispiel um jeweils 5°C)
oder Sonden verwendet werden, die Duplexe mit weitgehend unterschiedlichen
Tm-Werten ausbilden, während
die Temperatur über
einen kurzen Zeitraum geändert
wird.
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In
der vorliegenden Erfindung können
die Ziel-Nucleinsäuren
einzelsträngige
oder doppelsträngige RNAs
oder DNAs sein. Als einzelsträngige
RNAs seien beispielhaft mRNA, tRNA, rRNA und die genomische RNA
eines RNA-Virus genannt. Im Fall einer einzelsträngigen DNA ist es möglich, eine
einzelsträngige
DNA in einen M13- Vektor
einzuschleusen, den Phagen zu propagieren und sie aus den propagierten
Phagenteilchen durch Extrahieren der Nucleinsäure zu gewinnen. Ist die Ziel-Nucleinsäure eine
doppelsträngige
Nucleinsäure,
so ist es nötig,
sie mittels Hitze- oder alkalischer Denaturierung in Einzelstränge zu zerlegen
und dann, wenn nötig,
die Einzelstränge
aufzutrennen. Hierin wird die Amplifikation einer Ziel-Nucleinsäure mittels
Methoden zur Amplifikation spezifischer RNA-Sequenzen wie zum Beispiel
NASBA und 3SR und die Verwendung der so erhaltenen einzelsträngigen RNA
offenbart. Die Amplifikation spezifischer RNA-Sequenzen mittels
dieser Methoden wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen ein Primerpaar,
von denen wenigstens ein Primer eine Promotorsequenz aufweist, eine
reverse Transkriptase und eine RNA-Polymerase (wenn nötig, und Ribonuclease
H) wirken können,
und verwendet eine Kettenreaktion, die die Synthese einer doppelsträngigen DNA
mit einer Promotorsequenz unter Verwendung der Ziel-Nucleinsäure als
Matrize, die Synthese einer RNA mit einer spezifischen RNA-Sequenz
unter Verwendung der doppelsträngigen
DNA als Matrize durch die RNA-Polymerase und die anschließende Synthese
einer doppelsträngigen
DNA mit der Promotorsequenz unter Verwendung der RNA als Matrize
umfasst. Die doppelsträngige
DNA mit der Promotorsequenz wird nicht nur aus einer RNA als Ziel-Nucleinsäure mittels
einer reversen Transkriptase durch DNA-Synthese erhalten, sondern
auch unter Verwendung bekannter gentechnischer Methoden. Das RNA-Amplifikationsprodukt
kann zur anschließenden
Tm-Wert Messung ohne Modifikationen verwendet werden.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Sonden sind mit der gleichen
fluoreszierenden Substanz markiert, um so die Fluoreszenzintensitäten zu verändern, wenn
sie mit den Ziel-Nucleinsäuren
Duplexe ausbilden, und werden durch interkalatormarkierte Sonden,
die durch Verknüpfen
von fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffen über Linker
an Oligonucleotide erhalten wurden, verkörpert. Da in Anwesenheit von Sonden,
die dahingehend markiert wurden, dass sie bei der Ausbildung von
Duplexen mit den Ziel-Nucleinsäuren
ihre Fluoreszenzintensitäten ändern, verschiedene
Fluoreszenzsignale sowohl dann nachgewiesen werden, wenn die Sonden
mit der Ziel-Nucleinsäure
hybridisiert werden wie auch wenn sie unhybridisiert bleiben, ist
eine Trennung von mit der Ziel-Nucleinsäure hybridisierten Sondenmolekülen von
den nicht-hybridisierten Sondenmolekülen unnötig, und es ist möglich, während die
Temperatur verändert
wird, die Tm-Werte zu messen. Sind die Sonden auf der anderen Seite
nicht dahingehend gestaltet, dass sich die Fluoreszenzintensitäten bei
der Ausbildung von Duplexen mit den Ziel-Nucleinsäuren ändern, kann,
wie hierin offenbart wird, dem Nachweis die Auftrennung von sowohl
einem der mit der Ziel-Nucleinsäure
hybridisierten wie auch der nicht-hybridisierten Sondenmoluküle (oder
beider) bei konstanten Temperaturen vorausgehen. Das Auftrennungsverfahren
kann beispielsweise das Abfangen der Ziel-Nucleinsäuren auf
einer Festphase mittels auf der Festphase immobilisierter Oligonucleotide
und Hybridisierung der Sonde mit den abgefangenen Ziel-Nucleinsäuren und
Entfernen der flüssigen
Phase umfassen. Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung in Bezug auf
Ausführungsformen
beschrieben, die Interkalator-markierte Sonden verwenden.
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Bei
der Verwendung der oben erwähnten
interkalatormarkierten Sonden und der oben erwähnten RNA-Amplifikation werden
die interkalatormarkierten Sonden im Voraus der RNA-Amplifikations-Reaktionslösung zugegeben
und die RNA-Amplifikation wird durchgeführt, während die Fluoreszenzintensität gemessen wird,
um die Menge an Amplifikationsprodukt zu überwachen. Anschließend wird
das RNA-Amplifikationsprodukt
unter Temperaturkontrolle stufenweise erhitzt, nach einer vorläufigen Hitzedenaturierung
stufenweise abgekühlt
oder nach einer vorläufigen
Hitzedenaturierung mit anschließendem
Abschrecken stufenweise abgekühlt,
um so die Schmelzkurven der Nucleinsäuren zu erhalten.
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Der
Tm-Wert wird als der Mittelpunkt zwischen den Wendepunkten der Schmelzkurve
beziehungsweise am höchsten
Punkt (in Bezug auf den Absolutbetrag) der ersten Ableitungen der
Schmelzkurven erhalten. Der Vergleich von gemessenen Tm-Werten und
den beabsichtigten Tm-Werten der aus den Sonden resultierenden Duplexe
zeigt an, ob die beobachteten Fluoreszenzsteigerungen dem Vorhandensein
von Amplifikationsprodukten von den spezifischen RNAs zugeschrieben
werden können.
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Das
oben erwähnte
Verfahren erlaubt den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Nucleinsäuren in
einem Gefäß durch
Unterscheidung der Tm-Werte unter Verwendung mehrerer, mit dem gleichen
fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff markierten Sonden. Anders
ausgedrückt
wird die oben erwähnte
Amplifikation einer spezifischer RNA unter Bedingungen durchgeführt, die
die Amplifikation von mindestens zwei Ziel-Nucleinsäuren erlauben. Nucleinsäuresonden,
die zu den entsprechenden Amplifikationsprodukten komplementär sind und
Duplexe mit verschiedenen Tm-Werten mit den entsprechenden Amplifikationsprodukten
ausbilden, und die mit dem gleichen fluoreszierenden interkalierenden
Farbstoff markiert sind, werden vor der Amplifikationsreaktion hinzugefügt. Daraufhin
wird, wie oben erläutert,
die Temperatur verändert,
während
die Fluoreszenzintensität
mit der Zeit gemessen wird. Auf diese Art wird eine Schmelzkurve
erhalten. Mittels der oben beschriebenen Analyse der Schmelzkurve
ist es möglich,
an Hand der Peaks der ersten Ableitung der Schmelzkurve bei den
Tm-Werten, die für
die Duplexe beabsichtigten wurden, die sich aus den entsprechenden
Sonden ergebend, nachzuweisen, ob die Ziel-Nucleinsäuren vorhanden
sind. Ein jegliches Fluorometer, das Fluoreszenzintensität unter
Temperaturkontrolle messen oder überwachen
kann, wie zum Beispiel das LightCycler Quick System 330 (Roche Diagnostics
Co., Ltd.) sind für
das Verfahren der vorliegenden Erfindung ohne besondere Einschränkungen
verwendbar.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die
Beispiele in weiteren Einzelheiten dargelegt. Die vorliegende Erfindung
ist jedoch keineswegs auf diese spezifischen Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1 Amplifikation der Ziel-RNA
und Messung der Tm-Werte
-
- (1) Als Standard-RNAs wurden invA (eine 1954-nt-RNA,
die die Sequenz eines invasionsassoziierten Gens von Salmonella
spp. enthält),
VT2 (eine 1361-nt-RNA, die die Sequenz des Verotoxin Typ 2-Gens
aus E. coli O-157 enthält)
und tdh2 (eine 616-nt RNA, die die Sequenz des thermostabilen Hämolysin-Gens
in Vibrio parahaemolyticus enthält)
verwendet.
-
Die
Standard-RNAs mit diesen Sequenzen wurden mit einem RNA-Verdünnungsmittel
(10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 E/μl RNase-Inhibitor)
auf jeweils 10.000 Kopien/10 μl
zur Verwendung als RNA-Probe verdünnt.
- 2)
Die Reaktionslösung
zur Amplifikation von invA, VT2 und tdh2 mit folgender Zusammensetzung
wurde in 0,5-ml-PCR-Röhrchen
(GeneAmp-Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin-Elmer) gegeben (in jedes
20 μl) und
5 μl der
RNA-Proben wurden hinzugegeben. Die Sequenzen des ersten Oligonucleotids
(Sense-Primer, der die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz
enthielt), des zweiten Oligonucleotids (Antisense-Primer), des dritten
Oligonucleotids (Scissor-Oligonucleotid mit einem 3'-Ende, das mit einer
Aminogruppe (NH2) modifiziert war, zur Spaltung
der Standard-RNAs) und der Interkalator-markierten Sonden waren SEQ
ID NO: 1, 4, 7 und 10 für
invA, SEQ ID NO: 2, 5, 8, und 11 für VT2 und SEQ ID NO: 3, 6,
9 und 12 für tdh2.
Zusammensetzung
der Reaktionslösung
(Konzentrationen im Endvolumen von 30 μl) | 60
mM | Tris-HCl
Puffer (pH 8,0) |
| 18,7
mM | Magnesiumchlorid |
| 120
mM | Kaliumchlorid |
| 6 E | RNase-Inhibitor |
| 1 mM | DTT |
| je
0,25 mM | dATP,
dCTP, dGTP und dTTP |
| 3,6
mM | ITP |
| je
3,0 mM | ATP,
CTP, GTP und UTP |
| 1,0 μM | erste
Oligonucleotide (SEQ ID NO: 1, 2 und 3) |
| 1,0 μM | zweite
Oligonucleotide (SEQ ID NO: 4, 5 und 6) |
| 0,16 μM | dritte
Oligonucleotide (SEQ ID NO: 7, 8 und 9) |
| 13% | DMSO |
| 25
nM | interkalatormarkierte
Sonden (SEQ ID NO: 10, 11 und 12) |
-
Destilliertes Wasser zum Volumenausgleich
-
- (3) Die interkalatormarkierten Sonden, die
zu den entsprechenden Standard-RNAs
komplementär
waren, wurden durch Verknüpfung
von Oxazol-Gelb als fluoreszierender interkalierender Farbstoff über Linker
an das Phosphoratom im 13. "A" der für invA verwendeten
Sequenz (SEQ ID NO: 10), an das Phosphoratom im 12. "T" der für VT2 verwendeten Sequenz (SEQ
ID NO: 11) sowie an das Phosphoratom im 16.
- "G" der für tdh2 verwendeten
Sequenz (SEQ ID NO: 12) hergestellt, gemäß Ishiguro et al. (Nucleic
Acids Res., 24 (24) 4992–4997
(1996)).
- (4) Die so erhaltenen Reaktionsgemische wurden bei 41°C für 5 Minuten
inkubiert und daraufhin 5 μl
einer Enzymlösung
mit der folgenden Zusammensetzung zugegeben.
-
Zusammensetzung
der Enzymlösung
(Konzentrationen im Endvolumen von 30 μl)
| 1,7
% | Sorbit |
| 3,6 μg | Rinderserumalbumin |
| 142
E | T7-RNA-Polymerase
(Gibco) |
| 8 E | reverse
AMV-Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) |
| 1 E/ml | RNase
H |
-
Destilliertes Wasser zum Volumenausgleich
-
- (5) Daraufhin wurden die PCR-Röhrchen bei
41°C für 30 Minuten
inkubiert, um die RNAs zu amplifizieren.
- (6) Die Lösungen
wurden in ein Fluoreszenzspektrometer mit einer thermostatischen
Probenkammer gegeben, und die Fluoreszenzintensität wurde
gemessen (bei einer Exzitations-Wellenlänge von 470 nm und einer Emissions-Wellenlänge von
520 nm), wobei die Reaktionslösungen
bei 95°C
für 1 Sekunde
erhitzt wurden, dann auf 41°C
abgekühlt
und dann von 41°C
auf 85°C
mit einer Erhitzungsrate von 0,1 °C/Sekunde erhitzt
wurden. Die Tm-Werte wurden aus dem Fluoreszenzprofil (Schmelzkurve)
erhalten.
- (7) 1 zeigt die Schmelzkurven der
entsprechenden Standard RNAs, und 2 zeigt
die ersten Ableitungen der Schmelzkurven. Die ersten Ableitungen
der Schmelzkurven von allen drei Amplifikationsprodukten (einschließlich der
Sonden) zeigten Peaks bei spezifischen Tm-Werten ohne Überschneidungen.
Die unterscheidbar nachgewiesenen Tm-Werte zeigen die Anwesenheit
der entsprechenden Amplifikationsprodukte dieser Gene und der Standard
RNAs, die als Matrizen in den Amplifikationen verwendet wurden.
-
Beispiel 2 Gleichzeitige Amplifikation
und gleichzeitiger Nachweis von drei Ziel-RNAs
-
- (1) Es wurden dieselben Standard-RNAs (invA,
VT2 und tdh2), wie sie in Beispiel 1 verwendet wurden, gebraucht.
Die Standard-RNAs mit den oben erwähnten Sequenzen wurden mit
einem RNA-Verdünnungsmittel
(10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 E/μl RNase-Inhibitor)
auf 10.000 Kopien/10 μl
zur Verwendung als RNA-Proben verdünnt.
- (2) 20 μl
einer Reaktionslösung
der folgenden Zusammensetzung (zur gleichzeitigen Amplifikation
von invA, VT2 und tdh2) wurden in 0,5-ml-PCR-Röhrchen (GeneAmp-Thin-Walled
Reaction Tubes, Perkin-Elmer) gegeben und 5 μl der RNA-Proben dazu gegeben.
-
Zusammensetzung
der Reaktionslösung
(Konzentrationen im Endvolumen von 30 μl)
| 60
mM | Tris-HCl
Puffer (pH 8,0) |
| 18,7
mM | Magnesiumchlorid |
| 120
mM | Kaliumchlorid |
| 6 E | RNase-Inhibitor |
| 1 mM | DTT |
| je
0,25 mM | dATP,
dCTP, dGTP und dTTP |
| 3,6
mM | ITP |
| je
3,0 mM | ATP,
CTP, GTP und UTP |
| 1,0 μM | erste
Oligonucleotide (die gleichen wie die in Beispiel 1 verwendeten) |
| 1,0 μM | zweite
Oligonucleotide (die gleichen wie die in Beispiel 1 verwendeten) |
| 0,16 μM | dritte Oligonucleotide
(die gleichen wie die in Beispiel 1 verwendeten) |
| 13% | DMSO |
| 25
nM | Interkalator-markierte
Sonden (die gleichen wie die in Beispiel 1 verwendeten) |
-
Destilliertes Wasser zum Volumenausgleich
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- (3) Die so erhaltenen Reaktionsgemische wurden
bei 41°C
für 5 Minuten
inkubiert, und sodann 5 μl
einer Enzymlösung
der folgenden Zusammensetzung dazugegeben.
-
Zusammensetzung
der Enzymlösung
(Konzentrationen im Endvolumen von 30 μl)
| 1,7
% | Sorbit |
| 3,6 μg | Rinderserumalbumin |
| 142
E | T7
RNA-Polymerase |
| 8 E | reverse
AMV-Transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.) |
| 1 E/ml | RNase
H |
-
Destilliertes Wasser zum Volumenausgleich
-
- (4) Daraufhin wurden die PCR-Röhrchen bei
41°C für 30 Minuten
zur RNA Amplifizierung inkubiert.
- (5) Die Lösungen
wurden in ein Fluoreszenzspektrometer mit einer thermostatischen
Probenkammer gegeben und die Fluoreszenzintensität wurde gemessen (bei einer
Exzitations-Wellenlänge
von 470 nm und einer Emissions-Wellenlänge von
520 nm), wobei die Reaktionslösungen
bei 95°C
für 1 Sekunde
erhitzt, dann auf 41°C
abgekühlt
und dann von 41°C
auf 85°C
mit einer Erhitzungsrate von 0/1°C/Sekunde
erhitzt wurden. Die Tm-Werte wurden aus dem Fluoreszenzprofil (Schmelzkurve)
erhalten.
-
3 stellt
die negative erste Ableitung der Schmelzkurven der RNAs dar, die
durch gleichzeitige Amplifikation der drei Standard-RNAs erhalten
wurden, und Tabelle 1 zeigt die Tm-Werte, die aus den Ergebnissen
von Beispielen 1 und 2 (
2 und
3) gewonnen
wurden. Die drei Produkte der gleichzeitigen Amplifikation konnten
durch die Tm-Werte, bei denen die Ableitung der Kurve Peaks aufweist,
unterschieden werden. Es konnte somit gezeigt werden, dass die vorliegende
Erfindung den gleichzeitigen Nachweis von mehreren Substanzen in
einem einzigen Gefäß mit Nucleinsäuresonden,
die mit dem gleichen fluoreszierenden interkalierenden Farbstoff
markiert worden waren, ermöglicht.
Die unterscheidbar nachgewiesenen Tm-Werte zeigen das Vorhandensein
der entsprechenden Gen-Amplifikationsprodukte aus diesen Genen und
der Standard-RNAs, die als Matrizen während der Amplifikation verwendet
wurden. Tabelle 1 Tm-Werte, die durch getrennte Amplifikation
und gleichzeitige Amplifikation erhalten wurden
| Nucleinsäure | Getrennte
Amplifikation | Gleichzeitige
Amplifikation |
| invA | 59 | 59 |
| VT2 | 51 | 51 |
| tdh2 | 56 | 54 |
-
Wie
oben diskutiert, ermöglicht
es die vorliegende Erfindung, mindestens zwei Nucleinsäuren gleichzeitig
mit einem einzigen Fluoreszenzfarbstoff-Marker nachzuweisen. Folglich
besteht keine Notwendigkeit, eine Vielzahl von Oligonucleotidsonden
mit Fluoreszenzfarbstoffen herzustellen, die dahingehend ausgewählt wurden,
dass sie einzeln unterscheidbar sind, und damit ist die Problematik
der zeitaufwändigen
Sondenherstellung und dem Fehlen einer raschen Anpassung an eine
Zunahme an nachzuweisenden Nucleinsäuren im tatsächlichen
Arbeitsablauf gelöst.
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In
der vorliegenden Erfindung werden Ziel-Nucleinsäuren auf der Basis ihrer Tm-Werte nachgewiesen. Demanch
besteht – trotz
der Verwendung eines einzigen Fluoreszenzfarbstoffs als Marker – keine
Notwendigkeit, dieselbe Anzahl an Reaktionslösungsansätzen wie Ziel-Nucleinsäuren herzustellen.
Weiterhin weist die vorliegende Erfindung nicht die Problematik
des Bedarfs an Amplifikations- und Nachweisegeräten mit einer hohen Durchlaufkapazität auf, und
es besteht keine Notwendigkeit, die zum Nachweis verwendete Probenmenge
zu erhöhen.
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Mit
der Verwendung eines fluoreszierenden interkalierenden Farbstoffs
in der vorliegenden Erfindung wird die Notwendigkeit, die mit den
Ziel-Nucleinsäuren
hybridisierte Sonde und die unhybridisierte Sonde zur Bestimmung
der Tm-Werte aufzutrennen, umgangen. Demnach ist die Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, die interkalatormarkierte Sonden verwendet,
vorzuziehen, um ein leicht automatisierbares Messverfahren bereitzustellen.
Das bedeutet, dass es den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Ziel-Nucleinsäuren ermöglicht,
ohne die Notwendigkeit mehrfacher Thermoregultoren oder (optischer)
Detektoren zum Nachweis mehrfacher Ansätze einer Reaktionslösung. Somit
ist die vorliegende Erfindung zur Vereinfachung des Geräts, Senkung
der Kosten als auch zur Reduzierung der Automatisierung von Nutzen. Sequenzprotokoll
Sequenzprotokoll
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